一种嗜热链球菌的特异性分子标记dna序列及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的特异性分子标记DNA序列及其用途以及嗜热链球菌的检测方法。该特异性分子标记DNA序列如SEQ ID NO.6所示。该检测方法包括步骤：(1)提取待测样本的基因组DNA；(2)以步骤(1)所得的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.1所示的半随机引物为扩增引物进行单引物PCR扩增；(3)对步骤(2)所得扩增产物进行克隆测序，并将测序结果与SEQ ID NO.6所示序列进行比对，若同源度大于99％，则表明待测样本中含有嗜热链球菌。
【专利说明】一种嗜热链球菌的特异性分子标记DNA序列及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)的特异性分子标记DNA序列及其用途。
【背景技术】
[0002] 要对一种细菌进行分子水平的检测需要获知该细菌的特异性序列，而获得一种细 菌的特异性序列，往往需要对网上大量的已知序列进行分析比对；但有些细菌已测的序列 较少，分析起来非常困难，难以得到其特异性序列。当然，也可以收集某一种细菌的所有菌 株，进行测序比对，但该方法实验时间较长、费用高昂。
[0003] 嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)是益生菌的一种，广泛应用于各种功 能性食品中，尤其是在乳制品的开发研宄中，日益受到重视。目前，在网上可以获取的嗜热 链球菌已经经过测序的序列较少，因而难以分析得到嗜热链球菌的特异性序列，这给嗜热 链球菌的分子检测带来不便。因此，有必要研宄开发获知嗜热链球菌的特异性序列，以方便 对其进行分子检测。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题就是针对目前对嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)进行分子检测不方便的现状，而提供一种嗜热链球菌的特异性分子标记 DNA序列及其用途。本发明的嗜热链球菌的特异性分子标记DNA序列与已经测过序的嗜热 链球菌的基因同源性大于99 %，可以方便地用于对嗜热链球菌进行分子检测。此前，该分子 标记未经报道过，是一个新发现的嗜热链球菌的特异性序列。
[0005] 本发明通过下述技术方案解决上述技术问题。
[0006] 本发明提供的技术方案之一是：一种嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus) 的特异性分子标记DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0007] 本发明提供的技术方案之二是：核苷酸序列组成如SEQ ID NO. 6所示的嗜热链球 菌（Streptococcus thermophilus)的特异性分子标记DNA在检测嗜热链球菌中的用途。
[0008] 核苷酸序列组成如SEQ ID NO. 6所示的嗜热链球菌的特异性分子标记DNA，是嗜热 链球菌的种特异性序列，可以作为分子遗传学标记，用于嗜热链球菌的分子检测。
[0009] 本发明提供的技术方案之三是：一种嗜热链球菌的检测方法，其包括如下步骤：
[0010] (1)提取待测样本的基因组DNA ;
[0011] ⑵以步骤⑴所得的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO. 1所示的半随机引物为扩 增引物进行单引物PCR扩增；
[0012] (3)对步骤（2)所得扩增产物进行克隆测序，并将测序结果与SEQ ID NO. 6所示的 核苷酸序列进行比对，若同源度大于99%，则表明待测样本中含有嗜热链球菌。
[0013] 本发明中，步骤（1)为提取待测样本的基因组DNA。所述的提取待测样本的基因 组DNA的方法为本领域常规，如可以采用液氮冻融-CTAB法，也可以采用溶菌酶法，还可以 使用市售的各种基因组DNA提取试剂盒进行操作。
[0014] 本发明中，步骤（2)为以步骤（1)所得的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO. 1所 示的半随机引物为扩增引物进行单引物PCR扩增。所述的单引物PCR扩增为本领域常规 所指的含义，即扩增体系中只加入一条扩增引物进行DNA片段的合成。较佳地，所述的单 引物PCR扩增的反应体系包括如下组分：0. 5?2. 0 μ mol/L半随机引物，0. 2?I. Ommol/L dNTP，I. 0 ?2. 5mmol/L 的 Mg2+，0· 02 ?0· IOU/ μ LTaq DNA 聚合酶，以及 0· 5 ?2. Ong/ μ L 基因组DNA模板。所述的单引物PCR扩增的反应程序包括：①93-96°C，4-6min ;②93-96°C， 20-40s ;③ 45-58°C，20-40s ;④ 70-72°C，30-120s ;⑤ 70 ?72°C，5 ?IOmin ;其中，步骤 ②至④的循环数为25-40。更佳地，所述的单引物PCR扩增的反应体系包括如下组分： 1. 0 ymol/L 半随机引物，0· 5mmol/L dNTP，I. 5mmol/L 的 Mg2+，0. 05U/yLTaq DNA 聚合酶， 以及l.Ong/yL基因组DNA模板。所述的单引物PCR扩增的反应程序包括：①95°C，5min ; ②95°C，30s ;③50°C，30s ;④72°C，2min ;⑤72°C，5min ;其中，步骤②至④的循环数为35。
[0015] 本发明中，步骤（3)为对步骤（2)所得扩增产物进行克隆测序，并将测序结果与 SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列进行比对，若同源度大于99%，则表明待测样本中含有嗜热 链球菌。其中，所述的对步骤（2)所得扩增产物进行克隆测序较佳地按下述方式进行：将步 骤（2)所得扩增产物进行电泳（优选琼脂糖凝胶电泳，也可以是聚丙烯酰胺凝胶电泳），若 在ISOObp位置存在扩增条带，则将该条带进行克隆测序。
[0016] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0017] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0018] 相比于现有技术，本发明的积极进步效果在于：
[0019] 本发明中的嗜热链球菌的特异性分子标记DNA序列与已经测过序的嗜热链球菌 的基因同源性大于99 %，可以方便地用于对嗜热链球菌进行分子检测。本发明的检测方法 操作简单、方便快速、特异性强，不需要特别设计PCR引物即可对待测样本进行检测，成本 较低，实验时间短，具有十分广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1为不同嗜热链球菌菌株的特异性PCR条带的筛选结果。图中编号 "M" 为 DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co, Ltd. 1-4" 分别 为：Streptococcus thermophilusTA40、Streptococcus thermophiIus St-body 3、 Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364的PCR 结果。
[0021] 图2为不同嗜热链球菌菌株的特异性PCR条带的获取结果。图中编号"Μ" 为 DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co, Ltd.。"1-6" 分别为： Streptococcus thermophiIusCICC20379> Streptococcus thermophiIusCICC6222> Streptococcus thermophiIusCICC6072> Streptococcus thermophiIusCICC20378> Streptococcus thermophilusCICC20364、Streptococcus thermophilusCICC20389 的 PCR 结果。
[0022] 图3为嗜热链球菌菌株的特异性PCR条带的获取结果。图中编号"M"为DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd. 〇 ul_2" 分别 为：Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364 的 PCR 结果〇
[0023] 图4为嗜热链球菌菌株的特异性PCR条带的获取结果。图中编号"M"为DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd. 〇 ul_2" 分别 为：Streptococcus thermophilusCICC20379、 Streptococcus thermophilusCICC6222、 Streptococcus thermophilusCICC6072、Streptococcus thermophiIusCICC20378λ Streptococcus thermophiIusCICC20364λ Streptococcus thermophiIusCICC20389λ Streptococcus thermophilusTA40、 Streptococcus thermophilus St-body 3、 Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364 的 PCR 结果〇
[0024] 图5为不同半随机引物的效果比较。图中"M"为DL2,000DNA(Marker Takara Biotechnology (Dalian) Co, Ltd)，编号 "1-3" 为半随机引物 "AP2-AP4" 分别对应的 PCR 结 果，编号4为半随机引物APl对应的PCR结果，编号5为半随机引物AP5对应的PCR结果。
【具体实施方式】
[0025] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0026] 下述实施例中，如非特别说明，所用试剂和材料均为常规市售可得。
[0027] 下述实施例中，下述实验材料的来源为：
[0028] 嗜热链球菌：
[0029] Streptococcus thermophiles TA40 购自丹尼斯克有限公司；
[0030] Streptococcus thermophilus St-body 3 购自丹尼斯克有限公司；
[0031] Streptococcus thermophiles CICC20174购自上海北诺生物科技有限公司；
[0032] Streptococcus thermophilus CICC20364购自上海北诺生物科技有限公司；
[0033] Streptococcus thermophiles CICC20379购自北京北纳凯创生物技术有限公司；
[0034] Streptococcus thermophiles CICC6222购自北京北纳凯创生物技术有限公司；
[0035] Streptococcus thermophiles CICC6072购自北京北纳凯创生物技术有限公司；
[0036] Streptococcus thermophiles CICC20378购自北京北纳凯创生物技术有限公司；
[0037] Streptococcus thermophiles CICC20364购自北京北纳凯创生物技术有限公司；
[0038] Streptococcus thermophiles CICC20389购自北京北纳凯创生物技术有限公司D
[0039] 实施例1不同嗜热链球菌菌株的特异性PCR条带的筛选 [0040] (1)模板制备
[0041] 将各菌株活化分离培养，获得的菌落挑选单菌落，接种于Iml MRS培养基，37°C 厌氧培养24小时，离心获得菌体。提取细菌基因组，使用的试剂盒为：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver. 2. 0 (Takara Biotechnology (Dalian) Co. , Ltd.) 〇
[0042] (2) PCR 扩增
[0043] PCR扩增的体系组成为：lumol/L半随机引物（其序列如SEQ ID N0.1所示）， 0.5mmol/L dNTP，1.5mmol/L 的 Mg2+，0.05U/uLTaq DNA 聚合酶，以及 Ing/uL 基因组 DNA 模 板，总体积50 μ L。
[0044] PCR 扩增的程序为：① 95 °C，5min ;② 95 °C，30s ;③ 50 °C，30s ;④ 72 °C，2min ; ⑤72°C，5min ;其中，步骤②至④的循环数为35。
[0045] (3)特异性条带的获得
[0046] 将PCR产物进行电泳，结果见图1，图中编号"M"为DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co,Ltd·。 "1-4" 分别为〖Streptococcus thermophilusTA40、 Streptococcus thermophilus St-body 3、 Streptococcus thermophilusCICC20174、 Streptococcus thermophiIus CICC20364 的 PCR 结果。
[0047] 将泳道1-4中共有的位置大约在1800bp的条带（箭头所指处）回收纯化并克隆 测序，测序结果如SEQ ID NO. 6所示。
[0048] 实施例2不同嗜热链球菌菌株的特异性PCR条带的获取
[0049] (1)模板制备
[0050] 将各菌株活化分离培养，获得的菌落挑选单菌落，接种于Iml MRS培养基，37°C 厌氧培养24小时，离心获得菌体。提取细菌基因组，使用的试剂盒为：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver. 2. 0(Takara Biotechnology(Dalian) Co. , Ltd. ) 〇
[0051] (2) PCR 扩增
[0052] PCR扩增的体系组成为：2 μπιοΙ/L半随机引物（其序列如SEQ ID NO. I所示）， lmmol/L dNTP，2.5mmol/L 的 Mg2+，0.10U/yLTaq DNA 聚合酶，以及 2ng/yL 基因组 DNA 模 板，总体积50 μ L。
[0053] PCR 扩增的程序为：① 95 °C，4min ;② 95 °C，20s ;③ 50 °C，20s ;④ 72 °C，60s ; ⑤72°C，5min ;其中，步骤②至④的循环数为40。
[0054] (3)特异性条带的获得
[0055] 将PCR产物进行电泳，结果见图2,图中编号"M"为DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co, Ltd.。"1_6"分别为〖Streptococcus thermophilusCICC20379、 Streptococcus thermophiIusCICC6222> Streptococcus thermophiIusCICC6072> Streptococcus thermophiIusCICC20378> Streptococcus thermophilusCICC20364、 Streptococcus thermophilusCICC20389 的 PCR 结果。
[0056] 将泳道1-6中共有的位置大约在1800bp的条带（箭头所指处）回收纯化并克隆 测序，测序结果都如SEQ ID NO. 6所示。
[0057] 实施例3嗜热链球菌菌株的特异性PCR条带的获取
[0058] (1)模板制备
[0059] 将菌株活化分离培养，获得的菌落挑选单菌落，接种于Iml MRS培养基，37°C 厌氧培养24小时，离心获得菌体。提取细菌基因组，使用的试剂盒为：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver. 2. 0(Takara Biotechnology(Dalian) Co. , Ltd. ) 〇
[0060] (? PCR 扩增
[0061] PCR扩增的体系组成为：0. 5 μ mol/L半随机引物（其序列如SEQ ID NO. I所示）， 0· 2mmol/L dNTP，I. Ommol/L 的 Mg2+，0· 02U/ μ LTaq DNA 聚合酶，以及 0· 5ng/ μ L 基因组 DNA 模板，总体积50 μ L。
[0062] PCR 扩增的程序为：① 96°C，4min ;② 93°C，40s ;③ 45°C，40s ;④ 70°C，120s ; ⑤70°C，IOmin ;其中，步骤②至④的循环数为25。
[0063] (3)特异性条带的获得
[0064] 将PCR产物进行电泳，结果见图3,图中编号"M"为DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co, Ltd.。"1_2"分别为〖Streptococcus thermophilusCICC20174、 Streptococcus thermophiIus CICC20364 的 PCR 结果。
[0065] 将泳道中共有的位置大约在ISOObp的条带（箭头所指处）回收纯化并克隆测序， 测序结果都如SEQ ID NO. 6所示。
[0066] 实施例4嗜热链球菌菌株的特异性PCR条带的获取
[0067] (1)模板制备
[0068] 将菌株活化分离培养，获得的菌落挑选单菌落，接种于Iml MRS培养基，37°C 厌氧培养24小时，离心获得菌体。提取细菌基因组，使用的试剂盒为：TaKaRaminibest bacterial genomic DNA extraction kit ver. 2. 0(Takara Biotechnology(Dalian) Co. , Ltd. ) 〇
[0069] (2) PCR 扩增
[0070] PCR扩增的体系组成为：1 μπιοΙ/L半随机引物（其序列如SEQ ID NO. I所示）， 0· 5mmol/L dNTP，I. 5mmol/L 的 Mg2+，0. 05U/ μ LTaq DNA 聚合酶，以及 2ng/ μ L 基因组DNA模 板，总体积50 μ L。
[0071] PCR 扩增的程序为：① 93 °C，6min ;② 96 °C，20s ;③ 58 °C，30s ;④ 72 °C，30s ; ⑤70°C，IOmin ;其中，步骤②至④的循环数为35。
[0072] (3)特异性条带的获得
[0073] 将PCR产物进行电泳，结果见图4,图中编号"M"为DL2, 000DNA Marker Takara Biotechnology(Dalian)Co，Ltd·。 "1-10" 分别为：Streptococcus thermophiIusCICC20379> Streptococcus thermophiIusCICC6222> Streptococcus thermophiIusCICC6072> Streptococcus thermophiIusCICC20378> Streptococcus thermophiIusCICC20364> Streptococcus thermophiIusCICC20389> Streptococcus thermophilusTA40、 Streptococcus thermophiIus St-body 3、 Streptococcus thermophilusCICC20174、Streptococcus thermophilus CICC20364 的 PCR 结果。
[0074] 将泳道中共有的位置大约在1800bp的条带（箭头所指处）回收纯化并克隆测序， 测序结果都如SEQ ID NO. 6所示。
[0075] 实施例5序列特异性验证
[0076] 将实施例1?4所获得的特异性序列（如SEQ ID NO. 6所示）在NCBI网站进行 BLAST，结果显示获得的特异性序列与嗜热链球菌的基因同源性大于99%，与其它物种的同 源性都不高，或者极低，具体结果参见表1，由此确定所得的序列为嗜热链球菌的特异性序 列。
[0077]表 1 [0078]
【权利要求】
1. 一种嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)的特异性分子标记DNA，其特征在 于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。 2?核苷酸序列组成如SEQ ID NO. 6所示的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus) 的特异性分子标记DNA在检测嗜热链球菌中的用途。
3. -种嗜热链球菌的检测方法，其特征在于，其包括如下步骤： (1) 提取待测样本的基因组DNA; (2) 以步骤⑴所得的基因组DNA为模板，以SEQ ID NO. 1所示的半随机引物为扩增引 物进行单引物PCR扩增； (3) 对步骤（2)所得扩增产物进行克隆测序，并将测序结果与SEQ ID NO. 6所示的核苷 酸序列进行比对，若同源度大于99%，则表明待测样本中含有嗜热链球菌。
4. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的提取待测样本的基因组DNA的方 法为液氮冻融-CTAB法或溶菌酶法。
5. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的单引物PCR扩增的反应体系包 括如下组分：〇. 5 ?2. 0 y mol/L 半随机引物，0. 2 ?1. Ommol/L dNTP，1. 0 ?2. 5mmol/L 的 Mg2+，0? 02 ?0? 10U/ y LTaq DNA 聚合酶，以及 0? 5 ?2. Ong/ y L 基因组 DNA 模板。
6. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的单引物PCR扩增的反应程序包 括：① 93-96 °C，4-6min ;② 93-96 °C，20-40s ;③ 45-58 °C，20-40s ;④ 70-72 °C，30-120s ; ⑤70?72°C，5?lOmin ;其中，步骤②至④的循环数为25-40。
7. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的单引物PCR扩增的反应体系包括 如下组分：1. 0 y mol/L 半随机引物，0? 5mmol/L dNTP，1. 5mmol/L 的 Mg2+，0? 05U/ y LTaq DNA 聚合酶，以及1. 〇ng/ y L基因组DNA模板。
8. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的单引物PCR扩增的反应程序包 括：① 95°C，5min ;② 95°C，30s ;③ 50°C，30s ;④ 72°C，2min ;⑤ 72°C，5min ;其中，步骤②至 ④的循环数为35。
9. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的对步骤（2)所得扩增产物进行克 隆测序按下述方式进行：将步骤（2)所得扩增产物进行电泳，若在1800bp位置存在扩增条 带，则将该条带进行克隆测序。
10. 如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳。
【文档编号】C12Q1/68GK104498491SQ201410838715
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月26日 优先权日:2014年12月26日
【发明者】张红发, 任婧, 郭本恒, 刘振民 申请人:光明乳业股份有限公司