从海参生长环境中分离硝化细菌及微生态制剂的制备方法
【专利摘要】本发明提供从海参生长环境中分离硝化细菌及微生态制剂的制备方法，包括以下步骤(1)选取试样；(2)富集硝化细菌培养；(3)配置纯化分离培养基板；(4)分离纯化硝化细菌培养；(5)菌种鉴定；(6)一次扩大培养；(7)二次扩大培养；(8)制备硝化细菌的微生物制剂。本发明制备过程简便、经济、灵活。本发明直接采用海参生长环境的海水进行富集、纯化硝化细菌。本发明制成硝化细菌微生态制剂有效地解决生化系统中硝化细菌生长缓慢、世代周期长、在传统生化体系与异养菌竞争不占优势、易流失等问题。此外，针对废水中污染物的多样性，菌种来自海参生长环境的生化系统中，自身具有多样性及较强的适应能力。
【专利说明】从海参生长环境中分离硝化细菌及微生态制剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物菌剂制备【技术领域】，尤其是涉及从海参生长环境中分离硝化细菌及微生态制剂的制备方法。
【背景技术】
[0002]氨氮废水来源于化工、冶金、钢铁等多个行业，大量的氨氮废水的直接排放会刺激藻类等水生植物过度生长，出现赤湖、赤潮等富营养化的污染现象，其中一些藻类蛋白质毒素可富集在水产生物体内，并通过食物链使人中毒。目前国内对氨氮废水的处理方法主要是通过生物脱氮，利用硝化细菌的硝化作用以及反硝化细菌的脱氮作用实现废水中氮的去除。然而，硝化细菌生长缓慢、世代周期长、在传统生化体系与异养菌竞争不占优势而易被淘汰，在常规生化处理系统中硝化细菌所占比例往往较低，因此，当水体中硝化菌含量较低时，仅调节污水的供养和PH值等环境仍无法在较短的时间内使硝化菌自然生长繁殖，在工业上通常的做法是直接向污水中投放培养好的高浓度硝化菌种，如投入含有高浓度硝化菌的活性污泥。这种投加高浓度污泥的方法，虽然能在短期内保证硝化作用顺利进行，但在处理过程中氨氮转化为硝基氮的转化率并不是很高，抗冲击性负荷不强。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的问题是提供从海参生长环境中分离硝化细菌及微生态制剂的制备方法，该方法制备的微生物制剂可以直接投放到水产养殖的水体中，大大改善了水生植物的养殖环境，避免出现富营养化的污染现象。
[0004]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
[0005]从海参生长环境中分离硝化细菌的方法，包括以下步骤:
[0006](I)选取试样:选取海参生长水域的水作为试样，放入容器中；
[0007](2)富集硝化细菌培养:首先制备牛肉膏-蛋白胨固体培养基，高压蒸汽灭菌，将试样与无菌蒸馏水按体积比为1:9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密闭后振荡稀释，得到稀释10倍的样品，然后取稀释后的样品与无菌蒸馏水按同样的比例再次进行振荡稀释，共进行10次，每次稀释倍数为10倍，得到10种不同稀释度的样品，然后将梯度稀释的试样涂布到牛肉膏-蛋白胨固体培养基上，然后将放置于生化培养箱30°C下培养7-10天，形成多个菌落；
[0008](3)配置纯化分离培养基板:将硫酸铵0.5_2g、氯化钠0.3-lg、硫酸亚铁
0.03-0.05g、磷酸二氢钠l_3g、氯化钙7.5-9.0g、亚硝酸钠l_3g、硫酸镁0.03-0.05g、硫酸锰0.01-0.04g、磷酸氢二钾0.70-0.95g、无水碳酸钠l-2g、蒸馏水100mL加入到容器中，溶解，pH的范围7.3-7.5，加入5%琼脂，加热溶解，待培养基冷却至45-50°C后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成纯化培养基板；
[0009](4)分离纯化硝化细菌培养:将步骤(2)中得到的多个菌落的单个菌落接种到纯化分离培养基板上，30°C、通气条件下培养3-5天，然后，用接种环挑取一菌环细菌菌苔放到无菌水中，充分振荡，将此细菌悬液，按照活菌数测定方法在平板上涂布，使其在培养皿上形成30-50个孤立的菌落，然后将孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，如此反复3-4次；
[0010](5)菌种鉴定:对菌株的细胞形态特征、生理生化特征进行测定；并且用二苯胺检测后出现蓝色，该菌株属于硝化细菌菌种；
[0011](6) 一次扩大培养:将步骤(6)得到的纯化的硝化细菌的菌种接种于1L的种子发酵罐培养，一次扩大培养液为5L，130°C灭菌30分钟，培养温度为30°C，通气，培养2-3天，得到一次扩大培养的硝化细菌的菌体；其中，一次扩大培养液的配料为:硫酸铵0.7-2g、氯化钠0.1-0.5g、磷酸二氢钠l_3g、硫酸亚铁0.03-0.05g、氯化钙7.0-8.0g、亚硝酸钠2-5g、硫酸锰0.02-0.06g、磷酸氢二钾0.50-0.75g、无水碳酸钠l_2g、酵母膏
1.0-2.0g,蒸馏水 100mL, PH 值为 7 ；
[0012](7) 二次扩大培养:将一次扩大培养的硝化细菌的菌体接种于100L种子发酵罐培养，二次扩大培养液为100L，二次扩大培养液的组分与步骤(6)相同，130°C灭菌30分钟，培养温度为30°C，通气，培养48h，得到二次扩大培养的硝化细菌的菌体。
[0013]从海参环境中分离硝化细菌的微生物制剂的制备方法，包括以下步骤:固态发酵培养基上首先接种二次扩大培养的硝化细菌的菌体液，接种量为5-10% (v/w)，控制发酵温度300C，湿度50-75 %，通气，培养24h ；发酵结束干燥、粉碎，制备成活的干菌粉，即得到芽孢杆菌的微生态制剂。
[0014]所述固态发酵培养基组成为豆柏、鱼粉、葡萄糖和玉米粉，所述豆柏、鱼粉、葡萄糖和玉米粉的组成和质量比例为1:2:1:1.5。
[0015]本发明制备过程简便、经济、灵活。本发明直接采用海参生长环境的海水进行富集、纯化硝化细菌，制备过程简便、经济且灵活。本发明制成硝化细菌微生态制剂不仅使得活性硝化细菌保存，并且在使用时可增加其在生化系统中的停留时间，有效地解决生化系统中硝化细菌生长缓慢、世代周期长、在传统生化体系与异养菌竞争不占优势、易流失等问题。此外，针对废水中污染物的多样性，菌种来自海参生长环境的生化系统中，自身具有多样性及较强的适应能力，其对废水中氨氮以外的其他污染物也有较好的去除能力。
【具体实施方式】
[0016]实施例1
[0017]从海参生长环境中分离硝化细菌的方法，包括以下步骤:
[0018](I)选取试样:选取海参生长水域的水作为试样，放入容器中；
[0019](2)富集硝化细菌培养:首先制备牛肉膏-蛋白胨固体培养基，高压蒸汽灭菌，将试样与无菌蒸馏水按体积比为1:9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密闭后振荡稀释，得到稀释10倍的样品，然后取稀释后的样品与无菌蒸馏水按同样的比例再次进行振荡稀释，共进行10次，每次稀释倍数为10倍，得到10种不同稀释度的样品，然后将梯度稀释的试样涂布到牛肉膏-蛋白胨固体培养基上，然后将放置于生化培养箱30°C下培养7-10天，形成多个菌落；
[0020](3)配置纯化分离培养基板:将硫酸铵0.5g、氯化钠0.3g、硫酸亚铁0.03g、磷酸二氢钠lg、氯化妈7.5g、亚硝酸钠lg、硫酸镁0.03g、硫酸猛0.0lg、磷酸氢二钾0.70g、无水碳酸钠lg、蒸馏水100mL加入到容器中，溶解，pH的范围7.3-7.5，加入5%琼脂，加热溶解，待培养基冷却至45-50°C后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成纯化培养基板；
[0021](4)分离纯化硝化细菌培养:将步骤(2)中得到的多个菌落的单个菌落接种到纯化分离培养基板上，30°C、通气条件下培养3-5天，然后，用接种环挑取一菌环细菌菌苔放到无菌水中，充分振荡，将此细菌悬液，按照活菌数测定方法在平板上涂布，使其在培养皿上形成30-50个孤立的菌落，然后将孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，如此反复3-4次；
[0022](5)菌种鉴定:对菌株的细胞形态特征、生理生化特征进行测定；并且用二苯胺检测后出现蓝色，该菌株属于硝化细菌菌种；
[0023](6) 一次扩大培养:将步骤(6)得到的纯化的硝化细菌的菌种接种于1L的种子发酵罐培养，一次扩大培养液为5L，130°C灭菌30分钟，培养温度为30 °C，通气，培养2_3天，得到一次扩大培养的硝化细菌的菌体；其中，一次扩大培养液的配料为:硫酸铵0.7g、氯化钠0.lg、磷酸二氢钠lg、硫酸亚铁0.03g、氯化1? 7.0g、亚硝酸钠2g、硫酸猛0.02g、磷酸氢二钾0.50g、无水碳酸钠lg、酵母膏1.0g,蒸饱水lOOOmL，PH值为7 ；
[0024](7) 二次扩大培养:将一次扩大培养的硝化细菌的菌体接种于100L种子发酵罐培养，二次扩大培养液为100L，培养液的组分与步骤(6)相同，130°C灭菌30分钟，培养温度为300C，通气，培养48h，得到二次扩大培养的硝化细菌的菌体。
[0025]从海参环境中分离硝化细菌的微生物制剂的制备方法，其步骤为:固态发酵培养基上首先接种二次扩大培养的硝化细菌的菌体液，接种量为5-10% (v/w)，控制发酵温度300C，湿度50-75%，通气，培养24h ;发酵结束干燥、粉碎，制备成活的干菌粉，即得到芽孢杆菌的微生态制剂。
[0026]固态发酵培养基组成为豆柏、鱼粉、葡萄糖和玉米粉，所述豆柏、鱼粉、葡萄糖和玉米粉的组成和质量比例为1:2:1:1.5。
[0027]实施例2
[0028]从海参生长环境中分离硝化细菌的方法，包括以下步骤:
[0029](I)选取试样:选取海参生长水域的水作为试样，放入容器中；
[0030](2)富集硝化细菌培养:首先制备牛肉膏-蛋白胨固体培养基，高压蒸汽灭菌30-40分钟，将试样与无菌蒸馏水按体积比为1:9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密闭后振荡稀释，得到稀释10倍的样品，然后取稀释后的样品与无菌蒸馏水按同样的比例再次进行振荡稀释，共进行10次，每次稀释倍数为10倍，得到10种不同稀释度的样品，然后将梯度稀释的试样涂布到牛肉膏-蛋白胨固体培养基上，然后将放置于生化培养箱30°c下培养7-10天，形成多个菌落；
[0031](3)配置纯化分离培养基板:将硫酸铵2g、氯化钠lg、硫酸亚铁0.05g、磷酸二氢钠3g、氯化妈9.0g、亚硝酸钠3g、硫酸镁0.05g、硫酸猛0.(Mg、磷酸氢二钾0.95g、无水碳酸钠2g、蒸馏水100mL加入到容器中，溶解，pH的范围7.3-7.5，加入5%琼脂，加热溶解，待培养基冷却至45-50°C后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成纯化培养基板；
[0032](4)分离纯化硝化细菌培养:将步骤(2)中得到的多个菌落的单个菌落接种到纯化分离培养基板上，30°C、通气条件下培养3-5天，然后，用接种环挑取一菌环细菌菌苔放到无菌水中，充分振荡，将此细菌悬液，按照活菌数测定方法在平板上涂布，使其在培养皿上形成30-50个孤立的菌落，然后将孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，如此反复3-4次；
[0033](5)菌种鉴定:对菌株的细胞形态特征、生理生化特征进行测定；并且用二苯胺检测后出现蓝色，该菌株属于硝化细菌菌种；
[0034](6) 一次扩大培养:将步骤(6)得到的纯化的硝化细菌的菌种接种于1L的种子发酵罐培养，一次扩大培养液为5L，130°C灭菌30分钟，培养温度为30 °C，通气，培养2_3天，得到一次扩大培养的硝化细菌的菌体；其中，一次扩大培养液的配料为:硫酸铵2g、氯化钠0.5g、磷酸二氢钠3g、硫酸亚铁0.05g、氯化1? 8.0g、亚硝酸钠5g、硫酸猛0.06g、磷酸氢二钾0.75g、无水碳酸钠2g、酵母膏2.0g,蒸馏水lOOOmL，PH值为7 ；
[0035](7) 二次扩大培养:将一次扩大培养的硝化细菌的菌体接种于100L种子发酵罐培养，二次扩大培养液为100L，培养液的组分与步骤(6)相同，130°C灭菌30分钟，培养温度为300C，通气，培养48h，得到二次扩大培养的硝化细菌的菌体。
[0036]从海参环境中分离硝化细菌的微生物制剂的制备方法，其步骤为:固态发酵培养基上首先接种二次扩大培养的硝化细菌的菌体液，接种量为5-10% (v/w)，控制发酵温度300C，湿度50-75%，通气，培养24h ;发酵结束干燥、粉碎，制备成活的干菌粉，即得到芽孢杆菌的微生态制剂。
[0037]所述固态发酵培养基组成为豆柏、鱼粉、葡萄糖和玉米粉，所述豆柏、鱼粉、葡萄糖和玉米粉的组成和质量比例为1:2:1:1.5。
[0038]实施例3
[0039]从海参生长环境中分离硝化细菌的方法，包括以下步骤:
[0040](I)选取试样:选取海参生长水域的水作为试样，放入容器中；
[0041](2)富集硝化细菌培养:首先制备牛肉膏-蛋白胨固体培养基，高压蒸汽灭菌，将试样与无菌蒸馏水按体积比为1:9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密闭后振荡稀释，得到稀释10倍的样品，然后取稀释后的样品与无菌蒸馏水按同样的比例再次进行振荡稀释，共进行10次，每次稀释倍数为10倍，得到10种不同稀释度的样品，然后将梯度稀释的试样涂布到牛肉膏-蛋白胨固体培养基上，然后将放置于生化培养箱30°C下培养7-10天，形成多个菌落；
[0042](3)配置纯化分离培养基板:将硫酸铵1.5g、氯化钠0.7g、硫酸亚铁0.04g、磷酸二氢钠2g、氯化1? 8.0g、亚硝酸钠2g、硫酸镁0.(Mg、硫酸猛0.03g、磷酸氢二钾0.85g、无水碳酸钠lg、蒸馏水100mL加入到容器中，溶解，pH的范围7.3-7.5，加入5%琼脂，加热溶解，待培养基冷却至45-50°C后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成纯化培养基板；
[0043](4)分离纯化硝化细菌培养:将步骤(2)中得到的多个菌落的单个菌落接种到纯化分离培养基板上，30°C、通气条件下培养3-5天，然后，用接种环挑取一菌环细菌菌苔放到无菌水中，充分振荡，将此细菌悬液，按照活菌数测定方法在平板上涂布，使其在培养皿上形成30-50个孤立的菌落，然后将孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，如此反复3-4次；
[0044](5)菌种鉴定:对菌株的细胞形态特征、生理生化特征进行测定；并且用二苯胺检测后出现蓝色，该菌株属于硝化细菌菌种；
[0045](6) 一次扩大培养:将步骤(6)得到的纯化的硝化细菌的菌种接种于10L的种子发酵罐培养，一次扩大培养液为5L，130°C灭菌30分钟，培养温度为30 °C，通气，培养2_3天，得到一次扩大培养的硝化细菌的菌体；其中，一次扩大培养液的配料为:硫酸铵1.3g、氯化钠0.3g、磷酸二氢钠2g、硫酸亚铁0.(Mg、氯化1? 7.5g、亚硝酸钠3g、硫酸猛0.(Mg、磷酸氢二钾0.60g、无水碳酸钠lg、酵母膏1.5g，蒸饱水lOOOmL，PH值为7 ；
[0046](7) 二次扩大培养:将一次扩大培养的硝化细菌的菌体接种于100L种子发酵罐培养，二次扩大培养液为100L，培养液的组分与步骤(6)相同，130°C灭菌30分钟，培养温度为300C，通气，培养48h，得到二次扩大培养的硝化细菌的菌体。
[0047]从海参环境中分离硝化细菌的微生物制剂的制备方法，其步骤为:固态发酵培养基上首先接种二次扩大培养的硝化细菌的菌体液，接种量为5-10% (v/w)，控制发酵温度300C，湿度50-75%，通气，培养24h ;发酵结束干燥、粉碎，制备成活的干菌粉，即得到芽孢杆菌的微生态制剂。
[0048]所述固态发酵培养基组成为豆柏、鱼粉、葡萄糖和玉米粉，所述豆柏、鱼粉、葡萄糖和玉米粉的组成和质量比例为1:2:1:1.5。
[0049]以上对本发明的三个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【权利要求】
1.从海参生长环境中分离硝化细菌的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)选取试样:选取海参生长水域的水作为试样，放入容器中； (2)富集硝化细菌培养:首先制备牛肉膏-蛋白胨固体培养基，高压蒸汽灭菌，将试样与无菌蒸馏水按体积比为1:9的比例放入盛有玻璃珠的容器中，密闭后振荡稀释，得到稀释10倍的样品，然后取稀释后的样品与无菌蒸馏水按同样的比例再次进行振荡稀释，共进行10次，每次稀释倍数为10倍，得到10种不同稀释度的样品，然后将梯度稀释的试样涂布到牛肉膏-蛋白胨固体培养基上，然后将放置于生化培养箱30°C下培养7-10天，形成多个菌落； (3)配置纯化分离培养基板:将硫酸铵0.5-2g、氯化钠0.3-lg、硫酸亚铁0.03-0.05g、磷酸二氢钠l_3g、氯化钙7.5-9.0g,亚硝酸钠l_3g、硫酸镁0.03-0.05g、硫酸锰0.01-0.04g、磷酸氢二钾0.70-0.95g、无水碳酸钠l_2g、蒸馏水100mL加入到容器中，溶解，pH的范围7.3-7.5，加入5%琼脂，加热溶解，待培养基冷却至45-50°C后倾倒至灭菌的培养皿中，静置冷凝成纯化培养基板； (4)分离纯化硝化细菌培养:将步骤(2)中得到的多个菌落的单个菌落接种到纯化分离培养基板上，30°C、通气条件下培养3-5天，然后，用接种环挑取一菌环细菌菌苔放到无菌水中，充分振荡，将此细菌悬液，按照活菌数测定方法在平板上涂布，使其在培养皿上形成30-50个孤立的菌落，然后将孤立的菌落按照上述方法再挑菌一次，如此反复3-4次； (5)菌种鉴定:对菌株的细胞形态特征、生理生化特征进行测定；并且用二苯胺检测后出现蓝色，该菌株属于硝化细菌菌种； (6)一次扩大培养:将步骤(6)得到的纯化的硝化细菌的菌种接种于1L的种子发酵罐培养，一次扩大培养液为5L，130°C灭菌30分钟，培养温度为30°C，通气，培养2_3天，得到一次扩大培养的硝化细菌的菌体； (7)二次扩大培养:将一次扩大培养的硝化细菌的菌体接种于100L种子发酵罐培养，二次扩大培养液为100L，二次扩大培养液的组分与步骤(6)相同，130°C灭菌30分钟，培养温度为30°C，通气，培养48h，得到二次扩大培养的硝化细菌的菌体。
2.根据权利要求1所述的从海参生长环境中分离硝化细菌的方法，其特征在于:所述一次扩大培养液的配料:硫酸铵0.7-2g、氯化钠0.1-0.5g、磷酸二氢钠l_3g、硫酸亚铁0.03-0.05g、氯化钙7.0-8.0g、亚硝酸钠2_5g、硫酸锰0.02-0.06g、磷酸氢二钾0.50-0.75g、无水碳酸钠l-2g、酵母膏1.0-2.0g，蒸馏水100mL, PH值为7。
3.制备如从海参环境中分离硝化细菌的微生物制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤:固态发酵培养基上首先接种二次扩大培养的硝化细菌的菌体液，接种量为5-10% (v/w)，控制发酵温度30 0C，湿度50-75 %，通气，培养24h ;发酵结束干燥、粉碎，制备成活的干菌粉，即得到芽孢杆菌的微生态制剂。
4.根据权利要求4所述的海参环境中分离硝化细菌的微生物制剂的制备方法，其特征在于:所述固态发酵培养基组成为豆柏、鱼粉、葡萄糖和玉米粉，所述豆柏、鱼粉、葡萄糖和玉米粉的组成和质量比例为1:2:1:1.5。
【文档编号】C12N1/20GK104498406SQ201410841427
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月30日 优先权日:2014年12月30日
【发明者】季延滨, 李涛 申请人:天津振邦水产养殖有限公司