一种基因联合检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种联合检测基因突变的方法，以20－50ng DNA为样本，同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突变。本发明的方法包括：设计特异性探针、建立MLPA扩增突变基因序列的反应体系、通过PCR反应大量扩增目的基因序列。本发明特异性强，10～100ng的野生型DNA不会产生非特异性干扰信号；选择性强，可在99～99.9％的野生型DNA背景下检测出0.1％～1.0％的突变型。
【专利说明】一种基因联合检测方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种联合检测基因突变的方法，特别涉及 一种以MLPA法为技术平台，同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突变的方 法。
【背景技术】
[0002] RAS基因包括KRAS、HRAS和NRAS三种，与肺癌相关的主要是KRAS基因，位于12号 染色体上，编码P21蛋白，通过接受和传递细胞外生长刺激信号影响细胞内核酶等大生物 分子合成，进而对细胞的生长和分化进行调控。当KRAS基因外显子2、3号发生突变时，突 变的KRAS基因可以持续激活RAF-MEK-ERK-MAPK信号传导通路，导致细胞恶性增殖、分化及 调控紊乱。在白血病、肺癌、大肠癌和胰腺癌等肿瘤中均发现了 KRAS基因有较高的突变率。
[0003] 磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol-3_kinase，PI3K)是一个重要的信号 传导通路分子，由一个催化亚基PllO和一个调节亚基P85构成。根据PI3K的pllO结构特 点和底物分子不同可将其分为I型、II型和III型等3个亚型。PI3K介导的信号转导通路在 细胞的增殖、转化、凋亡和肿瘤的发生中起重要作用，调节肿瘤细胞的增殖和存活。研宄发 现，PI3K-AKT信号通路失调可导致肺癌、卵巢癌、乳癌、恶性胶质瘤、子宫内膜癌和鼻咽癌等 恶性肿瘤的发生。
[0004] BRAF是人类最重要的原癌基因之一，大约8 %的人类肿瘤发生BRAF突变。BRAF绝 大部分突变发生在BRAF蛋白激酶激活区或其附近，其中约70 %?90 %是BRAF基因外显子 15的第1799位核苷酸T突变为A，导致其编码的缬氨酸被谷氨酸取代（即BRAF V600E突 变）。BRAF基因位于7号染色体，是细胞促分裂素原活化蛋白激酶（MPK)信号通路中的丝 氨酸/苏氨酸激酶，一旦该基因表达改变，就会使生物学功能发生紊乱，从而使其介导的信 号通路失调并最终导致细胞转化甚至恶变。
[0005] 表皮生长因子受体（EGFR)是一种酪氨酸激酶受体（RTK)，位于第7号染色体，由 28个外显子组成，编码1186个氨基酸，其糖蛋白分子量约170kDa。EGFR是I型酪氨酸激酶 受体基因家族成员之一，是传递细胞外信号到细胞核内的重要途径蛋白。EGFR的主要信号 转导途径有：RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路、PI3K-PDK 通路、PLC-γ 通路、JAK-STAT 通路等。 通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生 长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。EGFR的突变主要发生在胞内TK区域的前四个外显子上 (18?21)，目前发现的TK区域突变有30多种。其中外显子19的缺失突变（delE746-A750) 和外显子21上的替代突变（L858R)又叫经典突变或热点突变，约占突变的90%。此外发生 在外显子20上的替代突变T790M为耐药突变，在分子检测中同样具有重要的参考价值。
[0006] 多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)是由Schouten等首先报道的一种针对待检DNA序列进行定性和半定 量分析的多重检测技术。在MLPA反应中，扩增每个靶序列都需要一对探针，每个探针都包 括一段引物序列和一段特异性序列。这一对探针与靶序列进行杂交后，再用连接酶连接成 为一条寡核苷酸链。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探 针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶 序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，也会导致杂交不完全，使连接反应 无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长 度都是唯一的，范围在130?480bp之间。MLPA技术可用于多重检测，通过合理的探针设 计，在一次反应中可以同时检测多个靶序列。在采用毛细管电泳对扩增产物进行分离、分析 的情况下，同时检测的靶序列可达到45个。多重检测方法有利于提高检测效率，减少模板 的使用量，尤其适用于模板量少且待测靶点较多的情况。如果检测的靶序列发生点突变或 缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就 可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。
[0007] 在制定临床治疗方案之前，应用分子诊断技术准确地检测病人肿瘤细胞中各基 因突变状态，从而选择合适的靶向治疗药物，是应用靶向药物对癌症实行个性化治疗的前 提和基础，同时亦可为临床评判病人的预后提供帮助。目前专门针对EGFR、PIK3CA、BRAF 的靶向药物已进入临床使用，而针对KRAS的靶向药物亦在研发中。在肺癌病人中，KRAS、 PIK3CA、BRAF和EGFR基因最常见的突变形式有16种，若使用荧光定量PCR的方法进行检 测，则需要大量的临床样本，不但增加了临床取样的难度，也使病人支付更高的检测费用。 为了降低临床样本的使用量，简化检测操作，本发明提供了一种基于MLPA技术，高效、高灵 敏度的检测方法，可在20 - 50ng的DNA样本中同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因 共16种突变，为临床个体化用药提供依据。
【发明内容】
[0008] 为了提高临床检验能力，现提供一种基于MLPA技术、可同时检测KRAS、PIK3CA、 BRAF和EGFR基因总共16种突变的方法，该方法可在20 - 50ng的DNA样本中同时检测出 16种突变。
[0009] 本发明的技术方案包含以下步骤：
[0010] 1.检测基因突变位点
[0011] 根据人类KRAS基因2号、3号外显子的野生型基因序列和相对应的突变型基因序 列，设计出多对特异性探针，检测以下位点的突变情况：
[0012]
【权利要求】
1. 一种基因联合检测方法，可同时检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突 变。
2. 如权利要求1所述的基因联合检测方法，其特征在于，检测的突变包括： KRAS基因突变：
BRAF基因突变：V600E(CosmicID476) EGFR基因突变：19号外显子的缺失突变、L858R(CosmicID6224,c. 2573T>G)和T790M(CosmicID6240，c.2369C>T)〇
3. 如权利要求1所述的基因联合检测方法，其特征在于，包含了表1中P-SEQ-1? P-SEQ-34特异性探针。
4. 一种基因联合检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求3所述特异性探针。
5. 如权利要求4所述的一种基因联合检测试剂盒，包括以下操作步骤： 模板变性：将模板DNA加入PCR管中，置于PCR仪上，设置温度为95?100°C，维持3?lOmin，再冷却至25°C; 杂交：在变性后的模板中加入MLPABuffer和探针的混合物，其中探针的浓度为0. 5? 10nM;MLPABuffer中含有Tris-HCl(50 ?500mM，pH8. 2 ?9. 0)，KC1 (2 ?5M)，MgC12 (0? 5 ? 5M)，EDTA(0. 5 ?5mM);在PCR仪上运行杂交程序：95°Clmin;60°C16 ?24h; 连接：杂交反应结束后，在每个PCR管中加入超纯水和连接酶，在PCR仪上运行连接程 序：50 ?58°C10 ?30min;95 ?100°C10 ?30min;冷却至 20°C; PCR扩增：连接反应结束后进行PCR扩增，在每个PCR管中加入PCR通用引物、dNTPs和Taq酶，在PCR仪上运行PCR程序； 检测：可以采用琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺电泳及毛细管电泳等方法检测扩增的核酸片 段。
6. 如权利要求4所述的一种基因联合检测试剂盒，待检测样品包括新鲜病理组织、石 蜡包埋病理组织、石蜡切片、唾液、痰液、尿液和血液。
7. -种用于检测KRAS、PIK3CA、BRAF和EGFR基因总共16种突变的探针，其特征在于， 由P-SEQ-1?P-SEQ-34的寡核苷酸探针或序列与其有至少70%同一性的寡核苷酸组成。
【文档编号】C12N15/11GK104480215SQ201410849552
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月30日 优先权日:2014年12月30日
【发明者】唐涛, 周细武 申请人:宁波有成生物医药科技有限公司