OsmiR156f基因在增加水稻有效分蘖中的应用的制作方法
【专利摘要】一种OsmiR156f基因在增加水稻有效分蘖中的应用，通过从miR156家族中筛选出对水稻分蘖发育具有重要调控作用的OsmiR156f基因，并对其前前体pri-miR156f序列进行克隆，通过采用茎杆特异启动子载体构建方法，将能够增加分蘖的OsmiR156f基因导入水稻中，在水稻的茎杆中特异表达，以调控水稻分蘖的发育。使得转基因水稻能够适当增加水稻早期的分蘖能力，而高节位上的蘖芽及后期分蘖仍旧受到抑制，从而可以提高单株水稻的有效分蘖数量，而不增加无效分蘖数，使转基因株系的稻穗数量适当增加而稻穗长度、千粒重等产量相关性状受到的影响小，最终达到实现单株增产的目的。
【专利说明】OsmiR156f基因在增加水稻有效分蘖中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业生物【技术领域】，尤其涉及一种〇smiR156f基因在增加水稻有效分 蘖中的应用，具体地说是涉及利用特异启动子将分蘖相关0smiR156f基因在茎杆中特异表 达的载体构建方法。
【背景技术】
[0002] 分蘖是水稻品种选育的重要指标之一，分蘖能力直接影响稻穗的数目进而影响水 稻产量。水稻只有主茎和早期发生的初生和次生分蘖才具备成穗能力，属于有效分蘖；而后 期的次生分蘖因生育期短等因素造成不能成穗，属于无效分蘖。在生产中，只有有效分蘖对 水稻产量具有贡献，而无效分蘖不仅不能形成稻穗，而且还会影响稻穗的长度而导致水稻 产量减低，且过多的无效分蘖除造成生物学上的物质浪费，还会导致田间环境恶化、易滋生 病虫害等问题。目前普遍认为高产水稻应具有较强的有效分蘖能力，在水稻生产过程中增 加早期有效分蘖、控制后期高节位无效分蘖有利于提高产量。
[0003] 水稻分蘖的形成过程可分为两个主要步骤，即分蘖芽的形成和分蘖芽的伸长。目 前，已经克隆了许多与水稻分蘖相关的功能基因，如已知M0C1参与了叶腋分生组织、分蘖 芽的形成和分蘖伸长过程，OsTBl则作为负调节因子控制着分蘖芽的伸长，HTD1控制分蘖 芽形成，LAZY1、TAC1、PR0G1控制分蘖角度，05111、0141^10 [控制蘖芽萌发，D53负调控独脚 金内酯信号转导进而影响分蘖，OsPINl、D3、D27等基因均直接影响水稻的分蘖。除上述功 能基因外，microRNA也可调控水稻分蘖的发育，如在水稻中过表达0sMIR156d和0sMIR156h 导致株高变矮分蘖增多，而增加0smiR156的靶基因0sSPL14的表达具有减少分蘖、增加小 穗数或穗长的功能。
[0004] 由于通过传统育种手段选育的具有多分蘖特性的水稻品种（材料）增产效果不理 想。迄今为止，生产上主要通过提高单位面积内秧苗播种密度来提高水稻的有效穗数，但常 常由于难以把握适当的播种数量而导致增产效果不佳。随着分子生物学和基因工程技术的 迅猛发展，利用水稻分蘖相关基因来调控分蘖发育为水稻生产开辟了一个全新的途径，并 取得了一些重要进展。但现有的通过转基因技术获得的多分蘖转基因水稻材料存在无效分 蘖数比例过高造成穗形变小而导致减产的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是，针对现有技术中在水稻过表达miR156家族成员可显著增加水 稻的分蘖能力但无效分蘖数目太多、比例过高的问题，提供一种0smiR156f基因在增加水 稻有效分蘖中的应用。
[0006] 为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种增加水稻有效分蘖的 0smiR156f基因在调控水稻分蘖发育中的应用，其中，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种重组表达载体，是将0smiR156f基因和驱动该基因 的启动子插入表达载体得到，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。含有上述表达载 体的转基因水稻也是本发明的保护范围。
[0008] 本发明的再一目的是提供一种培育转基因水稻的方法，是将水稻分蘖相关 0smiR156f基因导入水稻愈伤组织进行培育，获得有效分蘖数目增加的转基因水稻，该基因 的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0009] 本发明从miR156家族中筛选出对水稻分蘖发育具有重要调控作用的0smiR156f 基因，并对其前前体pri_miR156f序列（如SEQ ID No. 1所示，序列长度为382bp)进行克 隆，并通过采用茎杆特异启动子载体构建方法，将能够增加分蘖的0smiR156f基因导入水 稻中，在水稻的茎杆中特异表达，以调控水稻分蘖的发育。使得转基因水稻能够适当增加水 稻早期的分蘖能力，而高节位上的蘖芽和后期分蘖仍旧受到抑制，从而可以提高单株水稻 的有效分蘖数量，降低无效分蘖比例，使转基因株系的稻穗数量适当增加而稻穗长度、千粒 重等产量相关性状受到的影响小，最终达到实现单株增产的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1是不同启动子驱动〇sMIR156f转化水稻后对分蘖的影响。
[0011] 图中：1-野生型水稻；2-组成型过表达0sMIR156f转基因水稻，水稻分蘖数显著 增多、株高变矮；3-茎杆特异表达0sMIR156f转基因水稻，水稻分蘖数目适当增多。
[0012] 图2是不同启动子驱动0sMIR156f转化水稻后对稻穗长度的影响。
[0013] 图中：1-野生型水稻；2-组成型过表达0sMIR156f转基因水稻，水稻稻穗长度显 著缩短；3-茎杆特异表达0sMIR156f转基因水稻，对稻穗长度影响不大。
【具体实施方式】
[0014] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0015] 下述实施例中所实验的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业公司购买。
[0016] 实施例1 0sMIR156f基因片段的扩增
[0017] 根据网上已公布的日本晴基因组序列，采用Primer 3.0软件设计引物（由生物公 司合成），引物序列为：正向引物5 ' -CGCCCACCTTTCTTCTCCCA-3 '（见SEQ ID No. 2)，反向引 物5'-AAGGAGCAGTTAGATAATGGAG-3'（见SEQ ID No. 3)。将合成引物用双蒸水配置成浓度 为10 ii mol吨4的溶液。采用CTAB法从水稻日本晴叶片中提取基因组DNA。以提取的DNA 为模板，利用高保真的pfu Taq酶进行PCR扩增，获得0smiR156家族中的0sMIR156f对应 的前前体pri_miR156f序列，其中PCR扩增的反应体系为50 ii L :DNA模板1. 0 ii L，正向引 物0.5111，反向引物0.51^，1011111〇1*171的(1阶130.5111，10父缓冲液5.0111，口包丁&9酶 〇? L，双蒸水 42. L。扩增条件为：94°C 3min ;94°C 30s, 58°C30s, 72°C lmin, 32 个循环； 72°C延伸5min。将PCR扩增产物经1 %的凝胶电泳后，切下含目标片段的凝胶利用试剂盒回 收产物，将回收产物利用T4 ligase酶连接到由EcoR V酶切后的pBluescriptSK+(pBS)载 体片段上得到中间载体pBS-〇sMIR156f，将连接产物用热激发转化大肠杆菌DH 5 a菌株感 受态细胞，并均勻涂布在含50 y mol ? I71氨节抗生素的LB固体培养基上进行蓝白斑筛选。 挑选白色单菌落放入10mL液体LB培养基中，置于37°C、200rpm条件下培养10h。利用试剂 盒从2-5mL的扩繁菌液中提取质粒，并送生物公司进行测序分析，将测序结果用NCBI数据 库进行比对分析，如果有碱基错误则必须重新挑选单菌落提取质粒后再送测序分析，只有 所得测序结果中的目标序列pri_miR156f的碱基与数据库中的序列碱基完全一致才可进 行后续步骤操作。
[0018] 实施例 2 构建组成型过表达载体 pWM-UBQpr〇-0sMIR156f (UbiPr〇-0sMIR156f)
[0019] 组成型启动子选优采用Ubiquitinl启动子。分别采用HindIII/sal I酶切 载体pWMIOl、HindIII/BamH I酶切中间载体pBS-pUbq、BamH I/sal I酶切中间载体 pBS-〇sMIR156f后，将所需酶切片段产物分别回收并利用T41igase进行三片段连接而获得 载体。中间载体pBS-pUbq的相关信息参考文献报道（Wei等.PLoSONE. 2013, 8:e59720)。 将构建好的UbiPr〇-0sMIR156f载体采用冻融法导入农杆菌EHA105菌株中。该载体的细菌 抗性为卡那霉素，植物抗性为潮霉素。
[0020] 实施例 3 构建茎杆特异表达载体 pWM-D18p-〇sMIR156f (D18Pr〇-0sMIR156f)
[0021] 茎杆特异性型启动子选优采用0sGA3ox2基因的启动子。利用酶切连接方法 将0sGA3ox2基因的长约2. 1Kb的启动子（D18启动子）替换UbiPr〇-0sMIR156f载体中 的Ubiquitinl启动子而成的，其中D18启动子序列相关信息参考文献报道（Sakamoto 等? Nature Biotechnology. 2003, 21:909-913)。将构建好的 D18Pr〇-0sMIR156f 载体采用 冻融法导入农杆菌EHA105菌株中。该载体的细菌抗性为卡那霉素，植物抗性为潮霉素。
[0022] 实施例4水稻愈伤组织的外源基因（0sMIR156f基因）的导入及遗传转化
[0023] 1.水稻成熟胚愈伤组织的诱导：将水稻谷粒（日本晴或中花11)人工去颖壳后的 米粒分别用3%的次氯酸钠与70 %的酒精消毒后，置于含2. Omg ? L_' 4-D的N6固体培养 基上，培养基制备于直径为l〇cm的培养皿中，每次试验需用米粒约200粒，酶培养皿中放置 米粒20-30粒，放置在温度为26-28°C的光照条件诱导10-14天以获得胚性愈伤组织。
[0024] 2.含转化载体菌液的培养与制备：将前面获得的pWM-UBQpr〇-0sMIR156f和 pWM-D18p-〇sMIR156f表达载体转化到根癌农杆菌EHA105菌株中，然后从含有卡那霉素 和利福平的固体筛选培养基上挑选单菌落放入相同抗生素的YEB液体培养基中，28°C、 200rpm过夜培养至0D600值约为0. 8,4000-5000rpm离心后弃上清，用N6液体培养基重悬 沉淀。
[0025] 3.将诱导的胚性愈伤组织用解剖刀从外植体上剥离后，用制备好的菌液在50mL 的三角瓶中侵染愈伤组织10_30min，将愈伤组织转移到无菌滤纸上吸干水分，转入含 100 y M的乙酰丁香酮的N6培养基上培养3天。
[0026] 4.用无菌水将愈伤组织清洗干净后转入含有2. Omg ? 1^2, 4-D、25-50mg ? I71潮 霉素与200-400mg ? I71羧变青霉素钠的N6固体培养基（筛选培养基）上，放置在温度为 26-28°C的光照条件下筛选2周，将未褐化的抗性愈伤组织挑选出来，转入新的筛选培养基 中继续筛选2周。
[0027] 5.将具有活性的抗性愈伤组织转入含有2. Omg ? Llinetin、1. Omg ? PNAA， 25-50mg ? L-1潮霉素与200-400mg ? L-1羧变青霉素钠的MS培养基（分化培养基）上，放置 在温度为26-28°C的光照条件进行分化培养2-3周。
[0028] 6.待分化培养基上的愈伤形成再生植株后，将再生植株转移到MS培养基上，放置 在温度为26-28°C的光照条件进行生根培养，2-3周后将已经生根的转化植株移栽至盆钵 中进行常规水稻栽培。
[0029] 实施例5转0sMIR156f基因植株的检测及分析
[0030] 从盆钵栽培的代转化植株按单株去水稻叶片，采用CTAB法提取DNA样品，利用 所携带的潮霉素抗性基因序列对应的引物
[0031] 5' -ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC-3'（见 SEQ ID No. 4)与
[0032] 5' -TTCCGGAAGTGCTTGACAITGGGGA-3'（见 SEQ ID No. 5)进行 PCR 检测分析，其 中 PCR 反应的扩增条件为 94°C 3min ;94°C 30s，56°C 30s，72°C lmin，30 个循环；72°C延伸 5min。检测到阳性条带的即为代转基因株系。
[0033] 分别将组成型过表达转基因株系水稻（UbiPr〇-0sMIR156f)、本发明的茎杆中特异 表达转基因株系水稻（D18p-〇sMIR156f)及野生型对照水稻（wild-type)在盆钵中进行单 本种植，分别比较分蘖数目、稻穗长短、千粒重等产量相关性状。结果表明：与野生型相比 较，在茎杆特异表达的D18pr〇-0sMIR156f转基因株系水稻中，0sMIR156f基因特异过表达 在茎杆中，有效分蘖数目增加2-5个，而穗长、千粒重等性状差异不明显，因此单株的产量 明显提高。而组成型过表达的UbiPr 〇-0sMIR156f株系水稻中虽然分蘖数显著比对照多，但 稻穗长度等性状比对照差，导致其单株产量远远小于对照，结合参见图1、图2及下表1。
[0034] 表1不同水稻株系材料与产量相关性状的变化
[0035]
【权利要求】
1. 一种增加水稻有效分蘖的0smiR156f基因在调控水稻分蘖发育中的应用，其中，该 基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2. -种重组表达载体，是将0smiR156f基因和驱动该基因的启动子插入表达载体得 至IJ，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
3. 含有权利要求2所述表达载体的转基因水稻。
4. 一种培育转基因水稻的方法，是将水稻分蘖相关0smiR156f基因导入水稻愈伤组织 进行培育，获得有效分蘖数目增加的转基因水稻，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所 /_J、i 〇
【文档编号】C12N15/84GK104450711SQ201410850645
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】肖浪涛, 刘清, 王若仲, 彭克勤, 李合松, 童建华, 苏益 申请人:湖南农业大学