一种非诊断目的检测ApoA5生物学活性的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及蛋白活性检测领域，特别涉及一种非诊断目的检测ApoA5生物学活性的方法及试剂盒。该方法包括：将饥饿培养后的HL-1心肌细胞与ApoA5、油酸混合，孵育，裂解细胞，释放TG，检测获得第一TG浓度；将饥饿培养后的HL-1心肌细胞与油酸混合，孵育，裂解细胞，释放TG，检测获得第二TG浓度；比较第一TG浓度和第二TG浓度，获得ApoA5生物学活性。本发明提供的检测方法可以准确检测ApoA5是否具有生物学活性。
【专利说明】一种非诊断目的检测AP〇A5生物学活性的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白活性检测领域，特别涉及一种非诊断目的检测Ap〇A5生物学活性 的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 随着现代生活水平的提高和生活方式的改变，肥胖的发生率越来越高，同时肥胖 所伴随的脂质增加，异位沉积增多使得肥胖相关的疾病发病率逐年增高。因此，有效的降低 肥胖伴随的脂质沉积是当今医学面临的重要挑战。
[0003] 肥胖是由于能量摄入与能量消耗不平衡导致脂肪细胞储存过多甘油三酯（TG)，细 胞体积异常增大的结果，其根源是脂代谢异常。而脂代谢异常的实质是指脂蛋白和载脂蛋 白的异常，载脂蛋白作为脂蛋白中的蛋白质部分，不仅在结合和转运脂质、稳定脂蛋白的结 构上发挥重要作用，而且还具有调节脂蛋白代谢关键酶的活性，参与脂蛋白受体的识别的 作用，它参与了人体脂类代谢的全过程。目前已发现多个与脂代谢中有重要作用的载脂蛋 白，如 ApoAl、ApoA2、ApoA4、ApoB48、ApoBlOO、ApoCl、ApoC2、ApoC3 和 ApoE 等。
[0004] Ap〇A5是2001年发现的一种载脂蛋白，目前的研宄证实其与肥胖及代谢综合征的 发生有着密切的关系。已有的研宄证实，Ap 〇A5能显著降低血液中TG，同时Ap〇A5能够被脂 肪细胞摄取，滞留于脂滴表面，并降低脂肪细胞中的TG，因此，Ap 〇A5被认为是能够有效调 节脂质沉积的载脂蛋白，未来有可能运用于肥胖患者，达到降低血液中的脂质的目的。而目 前Ap 〇A5主要是通过质粒转染来获得，因此检测合成的Ap〇A5的生物学活性至关重要，可为 进一步研宄Ap 〇A5对脂质的调控奠定基础，为其将来运用于临床有重要的意义。
[0005] 目前，Ap〇A5对生物体中的TG具有调节作用的研宄主要集中在其能够降低血液及 脂肪细胞中的TG，同时能够升高肝脏中的TG，目前还未发现其它细胞可用于Ap 〇A5对TG具 有调节作用的研宄。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种非诊断目的检测Ap〇A5生物学活性的方法及试剂 盒。该检测方法可以通过检测Ap 〇A5干预HL-I心肌细胞后TG浓度来准确检测Ap〇A5是否 具有生物学活性，可为进一步研宄Ap 〇A5对脂质的调控奠定基础，对应用于临床具有重要 意义。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种非诊断目的检测Ap〇A5生物学活性的方法，包括如下步骤：
[0009] 将饥饿培养后的HL-I心肌细胞与Ap〇A5、油酸混合，孵育，裂解细胞，释放TG，检测 获得第一 TG浓度；
[0010] 将饥饿培养后的HL-I心肌细胞与油酸混合，孵育，裂解细胞，释放TG，检测获得第 二TG浓度；
[0011] 比较第一 TG浓度和第二TG浓度，获得Ap〇A5生物学活性。
[0012] HL-I心肌细胞为小鼠心房肌瘤细胞，该细胞能够稳定传代，具有收缩性，同时保留 了正常小鼠心肌细胞的形态学、电生理学、生物化学特征，是心肌细胞实验研宄较好的细胞 模型。
[0013] 在本发明中，研宄发现HL-I心肌细胞能够摄取Ap〇A5和油酸，过多的油酸摄入后 在HL-I心肌细胞中可转化为TG沉积在细胞中，摄取的ApoA5可降低HL-I心肌细胞内的 TG含量。本发明的检测原理为：HL-I心肌细胞摄取油酸并产生TG沉积在细胞内，然后利用 摄取的Ap〇A5调节TG的含量。与未加入Ap 〇A5的对照组相比，TG的含量有显著降低，表明 Ap〇A5具有生物学活性；TG的含量无显著变化，表明Ap〇A5没有生物学活性。
[0014] 作为优选，ApoA5的浓度为600?3000ng/mL。
[0015] 优选地，ApoA5 的浓度为 600 ?1800ng/mL。
[0016] 更优选地，ApoA5的浓度为1800ng/mL。
[0017] 在本发明提供的一些实施例中，孵育的时间为20?30小时，孵育的温度为 36. 5°C ?37. 5°C。
[0018] 作为优选，孵育的时间为24小时，孵育的温度为37. (TC。
[0019] 在本发明提供的一些实施例中，裂解采用的试剂为TritonX-100。
[0020] 在本发明提供的一些实施例中，裂解的温度为80?100°C，裂解的时间为4?10 分钟。
[0021] 在本发明提供的一些实施例中，裂解后，TG还存在某种程度的聚团现象，加入脂酶 使TG呈游离状态，会更有利于TG的检测。
[0022] 在本发明提供的一些实施例中，油酸的浓度为0. 1?I. Ommol/L。
[0023] 作为优选，油酸的浓度为0. 5mmol/L。
[0024] 本发明还提供了一种检测Ap〇A5生物学活性的试剂盒，包括HL-1心肌细胞、 ApoA5、油酸、TritonX-100、TG标准品、脂酶和TG检测试剂。
[0025] 在本发明提供的一些实施例中，甘油三酯标准品的浓度为ImM。
[0026] 在本发明提供的一些实施例中，TG检测试剂包括缓冲液、甘油三酯探针和甘油三 酯酶混合物。
[0027] 在本发明提供的一些实施例中，甘油三酯酶混合物可为市售产品，其作用为将TG 分解形成的甘油氧化，氧化产物再与反应混合液中的TG探针反应）。
[0028] 本发明通过TG检测试剂盒，先将TG水解转化成游离脂肪酸和甘油，再将甘油氧化 后与试剂盒中的TG探针反应，反应产物在λ = 570nm处有强吸收，从而可以通过测定吸光 度来检测TG浓度。
[0029] 本发明提供了一种非诊断目的检测Ap〇A5生物学活性的方法及试剂盒。该方法， 包括：将饥饿培养后的HL-I心肌细胞与Ap 〇A5、油酸混合，孵育，裂解细胞，释放TG，检测获 得第一 TG浓度；将饥饿培养后的HL-I心肌细胞与油酸混合，孵育，裂解细胞，释放TG，检测 获得第二TG浓度；比较第一 TG浓度和第二TG浓度，获得Ap〇A5生物学活性。通过检测实 例可知，本发明提供的检测方法可以通过检测ApoA5干预HL-I心肌细胞后TG浓度准确检 测Ap 〇A5是否具有生物学活性，可为进一步研宄Ap〇A5对脂质的调控奠定基础，对应用于临 床具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1示实施例1中TG标准曲线；
[0031 ] 图2示实施例1中各待测样品的TG浓度；
[0032] 图3示实施例3中各待测样品的TG浓度。
【具体实施方式】
[0033] 本发明公开了一种非诊断目的检测ApoA5生物学活性的方法及试剂盒，本领域技 术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和 改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及 应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围 内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0034] 本发明提供的非诊断目的检测Ap〇A5生物学活性的方法及试剂盒中所用原料药 或辅料均可由市场购得。TG检测试剂盒购自Biovision公司。ApoA5的来源为湖南远泰生 物生物技术有限公司。
[0035] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0036] 实施例I ApoA5生物学活性的检测
[0037] 待测样品准备：试验分为试验组和对照组，各组处理如下：
[0038] (1)试验组处理：将接种于12孔培养板的HL-I心肌细胞（小鼠心房肌细胞）， 以IX IOfVcm2的密度种板，待细胞达到90 %融合后，用含1 %血清claycomb培养基饥 饿12小时后，分为3个处理，分别加入含有600ng/mL ApoA5+0. 5mmol/L油酸、1200ng/mL ΑροΑ5+0· 5mmol/L油酸、1800ng/mL ΑροΑ5+0· 5mmol/L 油酸的 1%血清 claycomb 培养基解育 24小时。
[0039] (2)对照组处理：将接种于12孔培养板的HL-I心肌细胞（小鼠心房肌细胞），以 IX IOfVcm2的密度种板，待细胞达到90%融合后，用含1 %血清claycomb培养基饥饿12小 时后，加入含有0. 5mmol/L油酸的1 %血清claycomb培养基孵育24小时。
[0040] 将上述各组处理弃去HL-I细胞培养上清液，用PBS液洗3遍，每孔加入lmL5 % Triton-XlOO溶液，用移液枪反复吹打至细胞完全脱落后，收集至I. 5mL EP管中，600g离心 2分钟，吸取30 μ L上清液用于检测细胞蛋白浓度。将EP管充分震荡混匀后，置于水浴中缓 慢加热至80°C，维持5分钟，至Triton-XlOO溶液呈云雾状。然后缓慢冷却至室温。按上述 步骤重复加热一次，以使所有TG均溶解并释放至溶液中。置微量离心机以最大速度离心2 分钟，以去除所有不溶物质。小心吸取上清液至新的EP管中，-2°C保存。检测前待测样品 用蒸馏水稀释10倍。将稀释后的待测样品加入96孔板，每孔加入50 μ L。每孔加入2 μ L 脂酶，混匀后室温孵育20分钟，以使TG呈游离状态。
[0041 ] TG标准品稀释液的配制：按照每160 μ L检测缓冲液（Triglyceride Assay Buffer)加入40 μ LlmM TG标准品（Triglyceride Standard)的比例配制标准品稀释液，得 到浓度为〇. 2mM的标准品稀释液；在96孔板中分别加入0、10、20、30、40、50 μ L标准品稀释 液，再分别加入50、40、30、20、10、0 μ L检测缓冲液，保证每孔液体总体积为50 μ L，由此得 到浓度梯度〇、2、4、6、8、IOnmol/孔的TG标准品稀释液。每孔加入2 y L脂酶，混勾后室温 孵育20分钟，以使TG呈游离状态。
[0042] TG浓度的检测：采用TG检测试剂盒检测试验组、对照组中TG的浓度。具体操作 步骤如下：
[0043] 在加入TG标准品稀释液和待测样品的各孔中分别加入50 μ L反应混合液，混匀。 反应混合物的组分见表1。37°C避光孵育60分钟。检测A570nm的各OD值，绘制标准曲线 (见图1)，校正清除背景的影响后根据标准曲线计算待测样品的TG浓度。用所测得的细胞 蛋白浓度校正各待测样品的TG浓度。结果见图2、表2。
[0044] 表1反应混合液配制
[0045]
【权利要求】
1. 一种非诊断目的检测Ap〇A5生物学活性的方法，其特征在于，包括如下步骤： 将饥饿培养后的HL-1心肌细胞与Ap〇A5、油酸混合，孵育，裂解细胞，释放TG，检测获得 第一 TG浓度； 将饥饿培养后的HL-1心肌细胞与油酸混合，孵育，裂解细胞，释放TG，检测获得第二TG 浓度； 比较所述第一 TG浓度和所述第二TG浓度，获得Ap〇A5生物学活性。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ApoA5的浓度为600?3000ng/mL。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育的时间为20?30小时，所述孵 育的温度为36. 5°C?37. 5°C。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解采用的试剂为TritonX-100。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解的温度为80?100°C，所述裂解 的时间为4?10分钟。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述油酸的浓度为0. 1?1. Ommol/L。
7. -种检测ApoA5生物学活性的试剂盒，其特征在于，包括HL-1心肌细胞、ApoA5、油 酸、TritonX-100、TG标准品、脂酶和TG检测试剂。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述TG标准品的浓度为ImM。
9. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述TG检测试剂包括缓冲液、甘油三酯 探针和甘油三酯酶混合物。
【文档编号】C12Q1/02GK104498587SQ201510002731
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月5日 优先权日:2015年1月5日
【发明者】赵水平, 罗俊, 郑小燕, 聂赛, 赵旺 申请人:中南大学湘雅二医院