用于浮游动物、浮游植物和浮游动植物物种组成和群落结构的dna分析方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于浮游动物、浮游植物和浮游动植物物种组成和群落结构的DNA分析方法，包括以下步骤：步骤(1)：采集环境样品，从中提取出浮游动物和植物的DNA；步骤(2)：对所述的浮游动物和植物DNA进行PCR扩增，得到浮游动物和植物DNA的PCR产物；步骤(3)：对所述的浮游动物和植物DNA的PCR产物进行凝胶电泳，得到带有浮游动物和植物DNA的凝胶；步骤(4)：对所述的带有浮游动物和植物的DNA的凝胶进行二代测序，得到环境样品中浮游动物和植物物种的rDNA序列；步骤(5)：将所述的浮游动物和植物物种的rDNA序列在数据库中进行物种比对，进行浮游动物和植物结构的统计和分析。此方法简便高效准确，设计巧妙，十分具有实用价值。
【专利说明】用于浮游动物、浮游植物和浮游动植物物种组成和群落结 构的DNA分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生态学领域，特别涉及物种鉴定方面，具体是指一种用于浮游动 物、浮游植物和浮游动植物物种组成和群落结构的DNA分析方法
【背景技术】
[0002] 浮游动植物的鉴定和群落结构研宄，是水域生态学调查和环境监测当中的一项重 要工作；同时，在对浮游生物食性的水生生物的生态学研宄当中，类似的研宄也被经常用 到。在传统的研宄当中，都是以显微镜镜检作为手段对上述内容进行研宄的。显微镜作为传 统的研宄手段，被广泛用于该领域的研宄，但是，却存在这如下问题：1、动植物样品由于体 积差异大，难以在同一个样品中被同时进行分析，虽然可以通过换算将动植物的比例关系 进行计算，但是转换过程中产生的误差较大。2、镜检需要依赖完整的动植物样品进行鉴定， 对于采集过程中导致的镜检生物的破坏产生的残体往往无法鉴定，尤其是在鉴定浮游生物 食性的水生生物的消化道的时候，残体更多，会给需要依赖完整个体的检测镜检方法带来 极大的困难。3、在物种鉴定上面，需要通过对形态的判断进行定种，虽然有很多的定种依据 和检索表，但是想要准确判断物种的难度较大。
[0003] 通过查阅文献和专利，还发现，对于浮游动植物的群落结构或组分的鉴定研宄较 为少见，目前国内外文献提供的真核生物的通用引物的通用性也较差，同时，由于藻类包括 了真核藻类和原核藻类（蓝藻）两个类群，真核生物的通用引物也无法对蓝藻类生物进行 鉴定。
[0004] 所以一种能够用于浮游动物、浮游植物和浮游动植物物种组成和群落结构的分析 方法是十分具有实用价值的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供一种能够用于浮游动物、 浮游植物和浮游动植物物种组成和群落结构的DNA分析方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种用于浮游动物的物种组成和群落 结构的DNA分析方法，其特点在于，包括以下步骤：步骤（1):采集环境样品，从中提取出浮 游动物DNA ;
[0007] 步骤（2):对所述的浮游动物DNA采用核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的SSU F04和 SEQ ID NO: 2的SSU R22作为通用引物进行PCR扩增，该通用引物为后生动物基因组18s rDNA的通用引物，其扩增片段在400?450bp，得到浮游动物DNA的PCR产物；
[0008] 步骤（3):对所述的浮游动物DNA的PCR产物进行凝胶电泳，得到带有浮游动物 DNA的凝胶；
[0009] 步骤⑷：对所述的带有浮游动物的DNA的凝胶进行二代测序，得到环境样品中浮 游动物物种的rDNA序列；
[0010] 步骤（5):将所述的浮游动物物种的rDNA序列在数据库中进行物种比对，进行浮 游动物结构的统计和分析。
[0011] 较佳地，PCR 扩增的反应体系为：25 y 1 体系中：lmmol/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 1.5U DNA 聚合酶、300nmol/L 通用引物、2.5yl 10XPCR buffer，灭菌 H2O 补足至 25yl。
[0012] 较佳地，PCR扩增的反应条件为：95°C预变性2min ;95°C变性30s，55°C退火30s， 72°C延伸45s，30个循环；72°C延伸lOmin。
[0013] 本发明第二方面提供了一种用于浮游植物物种组成和群落结构的DNA分析方法， 其特点在于，包括以下步骤：
[0014] 步骤（1):采集环境样品，从中提取出浮游植物DNA ;
[0015] 步骤（2):对所述的浮游植物DNA采用核苷酸序列为SEQ ID NO:3的p23SrV fl和 SEQID NO:4的p23SrV rl作为通用引物进行PCR扩增，该通用引物为真核藻类叶绿体23s rDNA和原核藻类23s rDNA的共同通用引物，扩增产物也在400?450bp左右，得到浮游植 物DNA的PCR产物；
[0016] 步骤（3):对所述的浮游植物DNA的PCR产物进行凝胶电泳，得到带有浮游植物 DNA的凝胶；
[0017] 步骤⑷：对所述的带有浮游植物的DNA的凝胶进行二代测序，得到环境样品中浮 游植物物种的rDNA序列；
[0018] 步骤（5):将所述的浮游植物物种的rDNA序列在数据库中进行物种比对，进行浮 游植物结构的统计和分析。
[0019] 较佳地，PCR 扩增的反应体系为：25 y 1 体系中：lmmol/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 1.5U DNA 聚合酶、300nmol/L 通用引物、2.5yl 10XPCR buffer，灭菌 H2O 补足至 25yl。
[0020] 较佳地，PCR扩增的反应条件为：95°C预变性2min ;95°C变性30s，55°C退火30s， 72°C延伸45s，30个循环；72°C延伸lOmin。
[0021] 本发明第三方面提供了一种用于浮游动植物物种组成和群落结构的DNA联合分 析方法，其特点在于，包括以下步骤：
[0022] 步骤（1):采集环境样品，从中提取出浮游动植物DNA ;
[0023] 步骤（2):对所述的浮游动植物DNA采用两端增加接头的核苷酸序列为SEQ ID NO:8的UT-p23SrV rl作为复合引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:9的UT作为通用引物进行 PCR扩增，得到浮游动植物DNA的PCR产物；
[0024] 步骤（3):对所述的浮游动植物的DNA的PCR产物进行凝胶电泳，得到带有浮游动 植物DNA的凝胶；
[0025] 步骤（4):对所述的带有浮游动植物的DNA的凝胶进行二代测序，得到环境样品中 浮游动植物物种的rDNA序列；
[0026] 步骤（5):将所述的浮游动植物物种的rDNA序列在数据库中进行物种比对，进行 浮游动植物结构的统计和分析。
[0027] 较佳地，PCR 扩增的反应体系为：1. 8mmoI/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 I. 5U DNA 聚合酶、300nmol/L通用引物UT、2nmol/L每个复合引物、2.5ul 10XPCR buffer，灭菌H2O 补足至25y 1。
[0028] 较佳地，PCR扩增的反应条件为：94°C预变性2min ;94°C变性30s，56°C退火30s， 72°C延伸50s，30个循环；72°C延伸lOmin。
[0029] 上述的二代测序可使用Illumina公司开发的HiSeq 300PE测序平台或其他二代 测序平台，进行二代测序，采用的数据库可为GENBANK数据库。采用的凝胶电泳均一般采用 1.2%的琼脂糖进行凝胶电泳。
[0030] 采用本发明的用于浮游动物、浮游植物和浮游动植物物种组成和群落结构的DNA 分析方法，其选用的后生动物的18s rDNA的通用引物是一种非常理想的浮游动物的鉴定 的通用引物，其通用性良好，已被广泛用于后生动物的多样性鉴定；选用的浮游植物的23s rDNA的引物，很好的解决了真核浮游植物和原核浮游植物共同鉴定的难点，为评价监测浮 游植物的群落结构和种群动态提供了极大的便利。上述两个引物的通用性要好于常用的真 核生物ISsrDNA通用引物，且两个引物的退火温度和PCR产物的片段长度都一致，这为对上 述两对引物的联合分析提供了可能性。在添加接头序列UT形成复合引物后，通过控制复合 引物的含量，使得复合引物在PCR前5-10个循环被消耗完，余下的循环则由UT作为引物 进行扩增，扩增产物为带有UT序列的目的片段，且扩增产物因为是由一对引物UT合成出来 的，因此不同组分（浮游动物和浮游植物）的基因片段的扩增效率是相等的，扩增产物的组 分能够很好地反应样品中各组分的组成。利用二代测序的平台进行测序后，可以得到大量 的生物条形码序列的数据，利用数据库的比对，即可确定物种种类并进行数据统计分析。同 时，由于本技术体系测定出来的浮游动植物的组成情况是反应了动植物细胞的蛋白质合成 的功能单位，且rDNA在基因组中往往是串联存在的，因此，该类基因可以在某种程度上反 应出生物物种的生物量之间的比例关系，且这种比例关系反应的是样品中所有浮游动植物 细胞（而不是个体，包括了残破的肢体），因此有效地规避了镜检中必须依赖完整的个体形 态计数而产生的误差，对于样品的要求降低了，尤其是在浮游生物食性的水生生物消化道 的分析上，更具有优势。最后，由于本技术是依靠生物的基因序列作为生物条形码进行物种 鉴定，因此在定种上面实现了完全的数字化，而比传统的形态学分类更为客观和准确。而且 由于分子生物学的序列数据的数字化保存形式，随着数据库资源的完善，该种方法产生的 序列结果也具有可追溯性，可以对该数据进行再挖掘，数据可以永久留存和反复比较。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为本发明实施例浮游生物通用引物的扩增效果验证图。
[0032] 图2为本发明实施例浮游动物通用引物的扩增效果验证图。
[0033] 图3为本发明实施例PCR联合分析浮游动植物群落的原理图。
[0034] 图4为本发明实施例浮游动物、真核浮游植物、原核浮游植物等比例混合样品联 合分析的扩增效果验证图。
【具体实施方式】
[0035] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，下面对本发明的具体实施方法作进一 步说明。
[0036] 实施例1
[0037] 对浮游动物18s rDNA引物SSU F04和SSU R22和浮游植物23s rDNA引物p23SrV fl和p23SrV rl的扩增效果进行验证：
[0038] 使用CTAB法分别提取培养的真核浮游植物小球藻和原核浮游植物微囊藻的DNA， 使用SDS法提取培养的浮游动物透明潘的DNA。
[0039] 使用浮游植物23s rDNA引物p23SrV fl和p23SrV rl对小球藻和微囊藻的DNA 进行扩增，凝胶电泳分别得到条带1、2 (小球藻）和3、4 (微囊藻），如图1所示，扩增效果良 好。
[0040] 使用浮游动物18s rDNA引物SSU F04和SSU R22对透明潘的DNA进行扩增，凝胶 电泳分别得到条带5、6，如图2所示，扩增效果良好。
[0041] 实施例2
[0042] 对复合引物结合接头引物联合扩增浮游动植物的扩增效果验证，其原理如图3所 不O
[0043] 将上述的小球藻、微囊藻、透明潘的DNA等浓度混合，形成一个等浓度的混合DNA 样品，由数据库查阅可知，小球藻23s rDNA和透明潘18s rDNA的目的片段在395bp左右， 而微囊藻23s rDNA的目的片段为420bp左右。
[0044] 反应体系为 25 y 1 体系中：1. 8mmoI/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 I. 5U DNA 聚合 酶、300nmol/L 通用引物 UT、2nmol/L 每个复合引物（UT-SSU F04 和 UT-SSU R22 ;UT-p23SrV 打和讥12351^1'1)、2.511110\?〇?131^€61'，灭菌1120补足至25111。反应的温度条件 ：94°C预变性 2min ;94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 50s，30 个循环；72°C延伸 lOmin。
[0045] 使用2.4%的高浓度琼脂糖凝胶分析PCR产物，平行样品7、8分别出现两条带，一 条带约在425bp左右，另外一条带在400bp左右，且两条带经图谱分析后显示出的亮度比 为1:2. 01，可知425bp左右的条带为微囊藻的PCR产物，400bp左右则是小球藻和透明潘的 PCR产物，且产物的浓度与样品DNA的初始浓度一致，如图4所示，扩增效果良好。
[0046] 实施例3
[0047] 千岛湖鲢鳙鱼的食性比较
[0048] 步骤一：样品采集：取千岛湖鲢、鳙各5条，取其前肠内含物混匀，取0. Ig放 入-20 °C冰箱保存备用。
[0049] 步骤二DNA提取
[0050] 使用Qiagen公司的粪便基因组提取试剂盒，对前肠内含物进行DNA提取。
[0051 ] 步骤三DNA浓度测定
[0052] 测定提取的DNA浓度和纯度，调整DNA浓度至IOng/ y 1。
[0053] 步骤四PCR扩增
[0054] 25yl 体系中：L8mmoI/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 1.5U DNA 聚合酶、300nmol/ L 通用引物 UT、2nmol/L 每个复合引物（UT-SSU F04 和 UT-SSU R22 ;UT-p23SrV f 1 和 UT-p23SrVrl)、2.5yl IOXPCR buffer，灭菌 H2O 补足至 25yl。反应的温度条件：94°C 预 变性 2min ;94°C变性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 50s，30 个循环；72°C延伸 lOmin。
[0055] 步骤五PCR产物检测
[0056] 使用1. 2%凝胶电泳检测PCR结果，结果得到一条在500bp左右的亮带。PCR成功。
[0057] 步骤六PCR产物的测序
[0058] 采用Illumina公司的HiSeq 300PE测序平台进行测序，每个样品得到20000+条 序列。
[0059] 步骤七序列比对和数据分析
[0060] 将上述序列在GENBANK数据库中进行大规模比对，得到样品序列的物种信息和物 种组成比例信息，利用这些信息分析千岛湖鲢鳙鱼之间的食性差异。
[0061] 采用本发明的用于浮游动物、浮游植物和浮游动植物物种组成和群落结构的DNA 分析方法，其选用的后生动物的18s rDNA的通用引物是一种非常理想的浮游动物的鉴定 的通用引物，其通用性良好，已被广泛用于后生动物的多样性鉴定；选用的浮游植物的23s rDNA的引物，很好的解决了真核浮游植物和原核浮游植物共同鉴定的难点，为评价监测浮 游植物的群落结构和种群动态提供了极大的便利。上述两个引物的通用性要好于常用的真 核生物ISsrDNA通用引物，且两个引物的退火温度和PCR产物的片段长度都一致，这为对上 述两对引物的联合分析提供了可能性。在添加接头序列UT形成复合引物后，通过控制复合 引物的含量，使得复合引物在PCR前5-10个循环被消耗完，余下的循环则由UT作为引物 进行扩增，扩增产物为带有UT序列的目的片段，且扩增产物因为是由一对引物UT合成出来 的，因此不同组分（浮游动物和浮游植物）的基因片段的扩增效率是相等的，扩增产物的组 分能够很好地反应样品中各组分的组成。利用二代测序的平台进行测序后，可以得到大量 的生物条形码序列的数据，利用数据库的比对，即可确定物种种类并进行数据统计分析。同 时，由于本技术体系测定出来的浮游动植物的组成情况是反应了动植物细胞的蛋白质合成 的功能单位，且rDNA在基因组中往往是串联存在的，因此，该类基因可以在某种程度上反 应出生物物种的生物量之间的比例关系，且这种比例关系反应的是样品中所有浮游动植物 细胞（而不是个体，包括了残破的肢体），因此有效地规避了镜检中必须依赖完整的个体形 态计数而产生的误差，对于样品的要求降低了，尤其是在浮游生物食性的水生生物消化道 的分析上，更具有优势。最后，由于本技术是依靠生物的基因序列作为生物条形码进行物种 鉴定，因此在定种上面实现了完全的数字化，而比传统的形态学分类更为客观和准确。而且 由于分子生物学的序列数据的数字化保存形式，随着数据库资源的完善，该种方法产生的 序列结果也具有可追溯性，可以对该数据进行再挖掘，数据可以永久留存和反复比较。
[0062] 在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出 各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书应被认为是说明性的而非限 制性的。
【权利要求】
1. 一种用于浮游动物物种组成和群落结构的DNA分析方法，其特征在于，包括以下步 骤： 步骤（1):采集环境样品，从中提取出浮游动物DNA; 步骤（2):对所述的浮游动物DNA采用核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的SSU F04和SEQ ID NO: 2的SSU R22作为通用引物进行PCR扩增，得到浮游动物DNA的PCR产物； 步骤（3):对所述的浮游动物DNA的PCR产物进行凝胶电泳，得到带有浮游动物DNA的 凝胶； 步骤（4):对所述的带有浮游动物的DNA的凝胶进行二代测序，得到环境样品中浮游动 物物种的rDNA序列； 步骤（5):将所述的浮游动物物种的rDNA序列在数据库中进行物种比对，进行浮游动 物结构的统计和分析。
2. 根据权利要求1所述的用于浮游动物物种组成和群落结构的DNA分析方法，其特征 在于，PCR 扩增的反应体系为：25yl 体系中：lmmol/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 1.5U DNA 聚合酶、300nmol/L 通用引物、2.5yl 10XPCR buffer，灭菌 H20 补足至 25yl。
3. 根据权利要求1所述的用于浮游动物物种组成和群落结构的DNA分析方法，其特 征在于，PCR扩增的反应条件为：95°C预变性2min ;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸 458,30个循环；72°0延伸1〇111111。
4. 一种用于浮游植物物种组成和群落结构的DNA分析方法，其特征在于，包括以下步 骤： 步骤（1):采集环境样品，从中提取出浮游植物DNA; 步骤（2):对所述的浮游植物DNA采用核苷酸序列为SEQ ID N0:3的p23SrV fl和SEQ ID NO: 4的p23SrV rl作为通用引物进行PCR扩增，得到浮游植物DNA的PCR产物； 步骤（3):对所述的浮游植物DNA的PCR产物进行凝胶电泳，得到带有浮游植物DNA的 凝胶； 步骤（4):对所述的带有浮游植物的DNA的凝胶进行二代测序，得到环境样品中浮游植 物物种的rDNA序列； 步骤（5):将所述的浮游植物物种的rDNA序列在数据库中进行物种比对，进行浮游植 物结构的统计和分析。
5. 根据权利要求4所述的用于浮游植物物种组成和群落结构的DNA分析方法，其特征 在于，PCR 扩增的反应体系为：25yl 体系中：lmmol/lMgCl2、200ummol/l dNTPs 和 1.5U DNA 聚合酶、300nmol/L 通用引物、2.5yl 10XPCR buffer，灭菌 H20 补足至 25yl。
6. 根据权利要求4所述的用于浮游植物物种组成和群落结构的DNA分析方法，其特 征在于，PCR扩增的反应条件为：95°C预变性2min ;95°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸 458,30个循环；72°0延伸1〇111111。
7. -种用于浮游动植物物种组成和群落结构的DNA联合分析方法，其特征在于，包括 以下步骤： 步骤（1):采集环境样品，从中提取出浮游动植物DNA; 步骤（2):对所述的浮游动植物DNA采用核苷酸序列为SEQ ID N0:5的UT-SSU R)4、 SEQ ID N0:6 的 UT-SSU R22、SEQ ID N0:7 的 UT-p23SrV fl 和 SEQ ID N0:8 的 UT-p23SrV rl作为复合引物、核苷酸序列为SEQ ID NO: 9的UT作为通用引物进行PCR扩增，得到浮游 动植物DNA的PCR产物； 步骤（3):对所述的浮游动植物的DNA的PCR产物进行凝胶电泳，得到带有浮游动植物 DNA的凝胶； 步骤（4):对所述的带有浮游动植物的DNA的凝胶进行二代测序，得到环境样品中浮游 动植物物种的rDNA序列； 步骤（5):将所述的浮游动植物物种的rDNA序列在数据库中进行物种比对，进行浮游 动植物结构的统计和分析。
8. 根据权利要求7所述的用于浮游动植物物种组成和群落结构的DNA分析方法，其特 征在于，PCR扩增的反应体系为：1. 8mmoI/lMgCl2、200ummol/l dNTPs和1. 5U DNA聚合酶、 300nmol/L通用引物UT、2nmol/L每个复合引物、2.5ul 10XPCR buffer，灭菌H20补足至 25 y 1〇
9. 根据权利要求7所述的用于浮游动植物物种组成和群落结构的DNA分析方法，其特 征在于，？〇?扩增的反应条件为：941：预变性2111111;941：变性3〇8,561：退火3〇8,721：延伸 5〇8,30个循环；72°0延伸1〇111111。
【文档编号】C12Q1/68GK104450950SQ201510003909
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2015年1月6日 优先权日:2015年1月6日
【发明者】刘其根, 罗衡, 赵良杰, 胡忠军, 王烽竹 申请人:上海海洋大学