一种调控植物白粉病抗性的r基因tn2的克隆及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种调控植物白粉病抗性的R基因TN2的克隆及应用。本发明提供了一种调控植物对白粉菌抗性的方法。所述TN2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2，其中7个位点发生单个氨基酸的改变和2个位点突变造成翻译提前终止，都能抑制exo70B1突变体对白粉菌的抗性以及白粉菌诱导的细胞死亡。但是对植物的生长发育不产生明显影响。TN2可以应用到基因工程【技术领域】，调控植物对白粉菌的抗性反应。
【专利说明】一种调控植物白粉病抗性的R基因 TN2的克隆及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种调控植物白粉病抗性的R基因 TN2的克 隆及应用。
【背景技术】
[0002] 在自然环境中，植物不断受到各种病原菌的侵染，包括细菌、真菌以及病毒等。 为了抵御病原菌的入侵，植物进化出复杂的防御系统，分为两个层次：病原菌相关分子模 式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)引发的免疫反应 PTI 和效应子 (effector)引发的免疫反应ETI。首先，病原菌通过气孔，表皮间隙甚至是受伤部位进入植 物体内，病原菌相关分子模式，例如鞭毛蛋白、延伸因子和几丁质等，被位于细胞膜上的模 式识别受体（pattern recognition receptor，PRR)识别，触发PTI免疫反应；但是，病原菌 在长期进化过程中，进化出新的机制来抑制PTI。如细菌通过三型分泌系统，向植物体内释 放效应子，抑制植物的基础抗性。同时，植物又进化出R蛋白，能识别病原菌分泌的效应子， 引发植物的ETI免疫反应。
[0003] 植物体中，最大的一类R蛋白是NBS-LRR类，根据N端的结构不同，又分为 CC-NB-LRR和TIR-NB-LRR。R蛋白在植物体内起着十分重要的作用，它可以直接与病原菌 的效应子相互作用，或通过监视目标蛋白的修饰或变化来激活R蛋白而引发ETI。ETI导致 的抗病反应是植物入侵部位的超敏反应（Hypersensitive Response,·)，造成植物在病原 菌入侵部位发生活性氧的积累（oxidative burst)，胼胝质的沉积和细胞程序性死亡（POT) 等。PCD切断了病原菌的营养来源，同时释放抗菌物质，从而限制病原菌的生长和扩散。研 宄表明，在植物体内导入外源抗病基因能够提高植物对病原菌的抗性。例如：RPW8是在拟 南芥上克隆的一个非典型的R基因，在烟草中过表达RPW8基因能提高烟草对白粉病菌的抗 性。Xa21是水稻中第一个被克隆的抗白叶枯病的R基因，将Xa21基因转入水稻主栽品种表 现对白叶枯病的高度抗性和广谱抗性。因此，寻找更多的抗病基因，通过基因工程改良植物 的抗病性变得十分重要。
[0004] 白粉菌是一种活体营养型真菌，能侵染大麦、小麦、葡萄、番茄等多个植物种的叶 片、茎部、花朵和果实等部位。在全世界范围内，大概有500多种白粉菌小种侵染10, 000多 种植物，给农业生产带来巨大的经济损失。
[0005] 在研宄植物对白粉菌的抗病机制中，发现，拟南芥胞吐复合体的亚基成员EX070B1 突变后，对白粉菌表现增强的抗性，而且与野生型相比，PRl基因的表达增强，水杨酸的含量 升高，胼胝质和过氧化氢的积累增加。以上说明，EX070B1是调控植物对白粉菌抗性的重要 因子。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的是提供一种抑制植物过度激活抗性的方法。
[0007] 本发明提供的方法，包括如下步骤：突变植物中的TN2蛋白编码基因，实现抑制植 物抗性的过度激活；
[0008] 所述TN2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
[0009] 上述方法中，所述抑制植物抗性的过度激活体现在促进植物叶片表面白粉菌的菌 丝生长、增加植物叶片表面白粉菌分生孢子梗数的产生、抑制植物中PRl基因的表达和/或 抑制植物中游离水杨酸的积累。
[0010] 上述方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述植物具体为拟南芥突变 体 exo70Bl ;
[0011] 所述ex〇70Bltn2突变植物中的TN2蛋白编码基因为突变的TN2基因。利用拟南 芥 eX〇70Bl突变体与拟南芥tn2突变体杂交，获得杂交后代ex〇70Bltn2。
[0012] 本发明另一个目的是提供一种TN2突变蛋白。
[0013] 本发明提供的TN2突变蛋白，其为如下1)-9):
[0014] 1)TN2突变蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2第1-43位氨基酸残基组成的序 列；
[0015] 2) TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第27位精氨酸突变为组氨酸， 序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列；
[0016] 3)TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第82位丙氨酸突变为苏氨酸， 序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列；
[0017] 4)TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第82位丙氨酸突变为缬氨酸， 序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列；
[0018] 5) TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第1-218位氨基酸残基组成的 序列；
[0019] 6) TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第222位甘氨酸突变为精氨酸， 序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列；
[0020] 7) TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第310位谷氨酸突变为赖氨酸， 序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列；
[0021] 8) TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第318位甘氨酸突变为精氨酸， 序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列；
[0022] 9) TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第333位丙氨酸突变为缬氨酸， 序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列。
[0023] 上述蛋白的编码DNA分子，为如下1)-9):
[0024] 1)上述蛋白中的1)的编码DNA分子为序列A第1-132位核苷酸，所述序列A为将 序列表中序列1自第130位C突变为T，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序 列；
[0025] 2)上述蛋白中的2)的编码DNA分子为将序列表中序列1第80位G突变为A，序 列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列；
[0026] 3)上述蛋白中的3)的编码DNA分子为将序列表中序列1第244位G突变为A，序 列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列；
[0027] 4)上述蛋白中的4)的编码DNA分子为将序列表中序列1第245位C突变为T，序 列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列；
[0028] 5)上述蛋白中的5)的编码DNA分子为序列B第1-657位核苷酸，所述序列B为将 序列表中序列1第656位G突变为A，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序 列；
[0029] 6)上述蛋白中的6)的编码DNA分子为将序列表中序列1第664位G突变为A，序 列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列；
[0030] 7)上述蛋白中的7)的编码DNA分子为将序列表中序列1第928位G突变为A，序 列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列；
[0031] 8)上述蛋白中的8)的编码DNA分子为将序列表中序列1第952位G突变为A，序 列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列；
[0032] 9)上述蛋白中的9)的编码DNA分子为将序列表中序列1第998位C突变为T，序 列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列。
[0033] 上述蛋白或上述的编码DNA分子或含有其编码基因的重组载体在调控植物对白 粉病抗性中的应用也是本发明保护的范围；
[0034] 所述调控植物对白粉病抗性具体为抑制植物对白粉病抗性；
[0035] 所述植物具体为单子叶植物或双子叶植物，所述植物进一步具体为拟南芥。
[0036] R蛋白TN2或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在调控植物对白粉病抗性 中的应用也是本发明保护的范围；所述R蛋白TN2的氨基酸序列为序列表中序列2 ;
[0037] 所述调控植物对白粉病抗性具体为提高植物对白粉病抗性；
[0038] 所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述植物具体为拟南芥。
[0039] ex〇70Bl突变体植物对白粉菌的抗性依赖于TN2。TN2基因表达的蛋白在植物抗白 粉病中的应用也是本发明保护的范围；所述TN2蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
[0040] 上述应用中，exo70Bl植物抗白粉病依赖于TN2。TN2缺失后促进植物叶片表面白 粉菌的菌丝生长、增加植物叶片表面白粉菌分生孢子梗数的产生、抑制植物中PRl基因的 表达和/或抑制植物中游离水杨酸的积累，表明TN2在抗白粉病中发挥重要作用。
[0041] 上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体为拟南 芥，上述拟南芥具体为拟南芥突变体ex 〇70Bl。
[0042] 上述植物中TN2蛋白编码基因表达的物质为突变的丧失功能的TN2蛋白。
[0043] 本发明的实验证明，突变了 TN2编码基因，能抑制ex〇70Bl突变体对白粉菌的抗性 以及白粉菌诱导的细胞死亡，但是对植物的生长发育不产生明显影响。TN2可以应用到基因 工程【技术领域】，调控植物对白粉菌的抗病反应。TN2的突变不仅抑制了 eX〇70Bl介导的所有 抗病表型，而且受白粉菌诱导表达，暗示R基因 TN2在调控植物抗病反应中的重要作用。这 为将来通过基因工程技术，把TN2基因应用到作物中，改良作物的不良性状，提供宝贵的基 因资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0044] 图1为TN2基因的突变抑制了 ex〇70Bl突变体对白粉菌的抗性和白粉菌诱导的细 胞死亡
[0045] 图2为TN2基因的突变抑制了 exo70Bl突变体中PRl基因的表达
[0046] 图3为TN2基因的突变抑制了 ex〇70Bl突变体中游离水杨酸的积累
[0047] 图4为TN2基因的克隆
[0048] 图5为TN2基因受白粉菌诱导表达
【具体实施方式】
[0049] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0050] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0051] 实施例1、TN2突变抑制eX〇70Bl突变体白粉菌抗性
[0052] 1、突变体exo70Bltn2的获得
[0053] 通过EMS诱变，获得exo70Bl的突变体库。在M2代，筛选到能抑制exo70Bl介导 的白粉菌抗性的突变体ex 〇70Bltn2。
[0054] 突变体exo70Bltn2也可以按照如下方法制备：将突变体exo70Bl (N717829)与突 变体tn2杂交，得到杂交Fl代，Fl代自交获得的F2代中通过筛选可获得纯合的双突变体 exo70Bltn2〇
[0055] 野生型拟南芥Col-O (下文中简称野生型拟南芥），记载在如下文献中：Catherine A. Frye, Dingzhong Tang, and Roger ff. Innes (2001). Negative regulation of defense responses in plants by a conserved MAPKK kinase. PNAS 98(1) :373-378;公众可从中 国科学院遗传与发育生物学研宄所获得。
[0056] 突变体exo70Bl(N717829，EX070Bl的等位突变体，均为T-DNA插入突变）购自The European Arabidopsis Stock Centre, NASC)，与野生型拟南芥 Col-O 相比，仅 EX070B1 基 因（核苷酸序列为序列3,其编码的蛋白氨基酸序列为序列4)有突变，其余核苷酸序列均与 野生型拟南芥相同；
[0057] 突变体tn2,购自ABRC，SALK_204239 ;与野生型拟南芥Col-O相比，仅tn2基因（核 苷酸序列为序列1，其编码的蛋白氨基酸序列为序列2)有突变，其余核苷酸序列均与野生 型拟南芥相同。
[0058] 经过基因组学检测和测序，双突变体exo70Bltn2与野生型拟南芥Col-O相比， 仅EX070B1基因和TN2基因有突变，其余核苷酸序列均与野生型拟南芥相同；双突变 体ex 〇70Bltn2与突变体ex〇70Bl相比，仅TN2基因有突变，其余核苷酸序列均与突变体 exo70Bl 相同。
[0059] 2、TN2突变抑制exo70Bl突变体白粉菌抗性
[0060] 1)表型观察
[0061] 将拟南芥野生型植株Col-O (WT)、突变体exo70Bl和双突变体exo70Bltn2 种植在22 °C，9小时光照的温室中，生长4周后，大量接种白粉病菌Golovinomyces Cichoracearum(Yiping Wang1Marc T. Nishimura, Ting Zhao and Dingzhong Tang (2011) ATG2, an autophagy-related protein, negatively affects powdery mildew resistance and mildew-induced cell death in Arabidopsis. The Plant Journal 68, 74 - 87,100个 孢子/mm2)。接菌7天后，进行抗病表型鉴定。对有代表性的整株和单个叶片进行照相，并 进行台盼蓝（sigma)染色（Trypan Blue Staining)。
[0062] 结果如图1A-1C所示，IA和IB为接种白粉病菌7天后的有代表性的整株和叶片 的表型图片，IC为接种白粉病菌后进行台盼兰染色的图片。可以看出，白粉菌接菌7天 后，野生型拟南芥的叶片表面有大量的白粉菌；ex〇70Bl突变体的叶片只有少量白粉菌 的生长，并且出现明显的细胞死亡，说明其与野生型拟南芥相比，具有抗白粉病抗性；而 ex〇70Bltn2双突变体与野生型相似，叶片表面有大量的菌丝和孢子，没有产生细胞死亡 (1A，1B)，表明其与ex 〇70Bl突变体相比，白粉病抗性降低。台盼兰能把白粉病菌的菌丝结 构和死亡的细胞染成蓝色，台盼兰染色的结果（1C)也证明了 TN2突变抑制ex〇70Bl介导的 植物白粉病抗性。
[0063] 2)过氧化氢的积累检测
[0064] 为进一步分析exo70Bltn2对白粉菌的反应，将拟南芥野生型植株Col-O(WT)、突 变体exo70Bl和双突变体exo70Bltn2种植在22°C，9小时光照的温室中，生长4周后，每个 株系均小量接种白粉病菌Golovinomyces Cichoracearum(l个孢子/mm2)。接菌2天后，对 叶片进行DAB染色，检测过氧化氢的积累。DAB染剂能与细胞内产生的过氧化氢结合，形成 不可溶、肉眼可辨认的红棕色物质。
[0065] 结果如图ID所示，可以看出，突变体exo70Bl产生了大量的过氧化氢，exo70Bltn2 双突变体与野生型相似，只有少量的过氧化氢的积累。
[0066] 在接菌后5天，对各个株系单个叶片进行台盼蓝染色后镜检，对单孢子分生孢子 梗进行计数，并对计数结果进行统计分析。
[0067] 结果如图IE所示，exo70Bl突变体显著低于野生型，exo70Bltn2双突变体恢复到 野生型的水平。
[0068] 上述结果表明，抑制植物中tn2基因的表达使其突变，导致该植物的白粉病抗性 降低。
[0069] 实施例2、TN2突变抑制exo70Bl突变体中PRl基因（AY064023,2001年11月19 日提交）的表达
[0070] 为了验证TN2基因是否参与植物的抗病反应，用实时定量PCR的方法，检测Col-ο、 突变体ex 〇70Bl和双突变体ex〇70Bltn2在接种白粉菌前后PRl基因的表达模式。所用仪 器为德国 Eppendorf Mastercyclereprealplex 4S，具体如下：
[0071] 将生长4周的拟南芥野生型植株Col-O (WT)、突变体exo70Bl和双突变体 ex〇70Bltn2大量接种白粉菌3天后，分别取未接菌和接菌3天的植株叶片，放入液氮中速 冻，然后在-70 °C储存，提RNA备用。
[0072] 用 Trizol (Invitrogen)试剂提取叶片的总 RNA，用 DNase I (Promega)消化污染 的DNA半小时，再用反转录酶M-MLV (Invitrogen)，在20 μ L反应体系反转2 μ g总RNA获 得第一链cDNA ;稀释5倍留作PCR模板备用。PCR反应体系包括：SYBR Green supermix reagent (Takara) :10 μ L，cDNA 模板：2 μ L，10 μ M 引物：1 μ L，用重蒸水把体系补至 20 μ L0 PCR反应程序：95 °C预变性2min，进入循环后，95 °C变性15s，55 °C退火15s，72 °C延伸 20s，运行40个循环，每个样品重复3次。引物序列：PR1F:5-CGGAGCTACGCAGAACAACT_3 ; R:5-CTCGCTAACCCACATGTTCA-3 ；
[0073] ACT2 作为内标，ACT2 F :5-TCTCCCGCTATGTATGTCGCC-3, ACT2 R :5-GTCACGT CCAGCAAGGTCAAGA--3〇
[0074] 结果如图2所示，接种白粉菌前后，exo70Bl突变体中PRl基因的表达显著高于野 生型，TN2基因突变后，exo70Bltn2双突变体中PRl基因的表达恢复到野生型的水平，表明 TN2基因参与了植株对白粉病菌的抗性反应。
[0075] 实施例3、TN2突变抑制了 ex〇70Bl突变体中游离水杨酸的积累
[0076] 水杨酸是调控植物抗病反应的中心分子。依赖水杨酸的信号传导对植物建立局部 和系统性抗性至关重要。检测了 Col-Ο、突变体exo70Bl和双突变体exo70Bltn2在接种白 粉菌前后的游离水杨酸的含量。
[0077] 将拟南芥野生型植株Col-O(WT)、突变体exo70Bl和双突变体exo70Bltn2的幼苗 大量接种白粉菌，在22°C，9小时光照/15小时黑暗条件下正常生长4周后，分别取每个材 料的叶片，液氮中速冻，然后在-70 °C储存，提水杨酸备用。
[0078] 用高效液相色谱测定水杨酸的含量，参考文献所述方法Xin Li, Yuelin Zhang, Joseph D Clarke, Yan Li, Xinnian Dong(1999)Identification and cloning of a negative regulator of systemic acquired resistance，SNI1，through a screen for suppressors of nprl-l. Cell 98:329_339〇
[0079] 结果如图3所示，接种白粉菌前后，exo70Bl突变体中游离水扬酸的含量显著高于 野生型，TN2基因突变后，ex 〇70Bltn2双突变体中游离水扬酸的含量下降到野生型的水平。 表明TN2基因调控了植株对白粉病菌的抗性反应。
[0080] 实施例4、TN2基因的获得
[0081] 为了克隆TN2基因，将exo70Bltn2突变体与拟南芥野生型Landsberg生态型植 株进行杂交，获得的Fl代自交产生F2代。从F2代植株中选择含有ex 〇70Bl突变但与 tn2eX〇70Bl突变体表型相似的40个单株，从5条染色体上分别选5个均匀分布在染色体的 定位标记（http://signal. salk. edu/genome/SSLP_info/SSLPsordered.html)进行基因 型鉴定。粗定位的结果将TN2定位在1号染色体。TN2基因的核苷酸序列为序列表中序列 1，其编码的蛋白的氣基酸序列为序列表中序列2。
[0082] 随后，利用精细定位的标记，对2000株左右的F2植株进彳丁基因型鉴定，把TN2定 位到BAC克隆F1L3。对该区域内所有基因进行测序，寻找有意义的突变基因。同时，对 ex〇70Bltn2基因组进行重测序，与野生型基因组进行比较，寻找定位区域内的基因突变。
[0083] 经测序发现，有9个等位突变体的突变位点发生在TN2(AT1G17615)基因的⑶S， 重测序结果与之相同。TN2基因包括TIR和NBS两个结构域（图4A)，是一个非典型的R基 因。这9个TN2基因的等位突变体，有3个在TIR结构域发生错义突变，4个发生在NBS结 构域，有2个突变导致翻译提前终止（图4B)。
[0084] 9个tn2突变体具体如下：
[0085] tn2突变体1为序列表中序列2第1-43位氨基酸残基组成的序列；其编码基因核 苷酸序列为序列A第1-132位核苷酸，序列A为将序列表中序列1自第130位C突变为T， 序列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列；与TN2相比，将序列表中序列1第 130位C突变为T，提前终止蛋白表达；
[0086] tn2突变体2氨基酸序列为将序列表中序列2第27位R (精氨酸）突变为H (组氨 酸），序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列；tn2突变体2编码基因核 苷酸序列为将序列表中序列1第80位G突变为A，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到 的核苷酸序列；
[0087] tn2突变体3氨基酸序列为将序列表中序列2第82位A (丙氨酸）突变为T (苏氨 酸），序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列；tn2突变体3编码基因核 苷酸序列为将序列表中序列1第244位G突变为A，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到 的核苷酸序列；
[0088] tn2突变体4氨基酸序列为将序列表中序列2第82位A (丙氨酸）突变为V (缬氨 酸），序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列；tn2突变体4编码基因核 苷酸序列为将序列表中序列1第245位C突变为T，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到 的核苷酸序列；
[0089] tn2突变体5氨基酸序列为将序列表中序列2第1-218位氨基酸残基组成的序列； tn2突变体5编码基因核苷酸序列为序列B第1-657位核苷酸，序列B为将序列表中序列1 第656位G突变为A，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列；
[0090] tn2突变体6氨基酸序列为将序列表中序列2第222位G (甘氨酸）突变为R(精 氨酸），序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列；tn2突变体6编码基因 核苷酸序列为将序列表中序列1第664位G突变为A，序列表中序列1的其它核苷酸不变得 到的核苷酸序列；
[0091] tn2突变体7氨基酸序列为将序列表中序列2第310位E (谷氨酸）突变为K (赖 氨酸），序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列；tn2突变体7编码基因 核苷酸序列为将序列表中序列1第928位G突变为A，序列表中序列1的其它核苷酸不变得 到的核苷酸序列；
[0092] tn2突变体8氨基酸序列为将序列表中序列2第318位G (甘氨酸）突变为R(精 氨酸），序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列；tn2突变体8编码基因 核苷酸序列为将序列表中序列1第952位G突变为A，序列表中序列1的其它核苷酸不变得 到的核苷酸序列；
[0093] tn2突变体9氨基酸序列为将序列表中序列2第333位A (丙氨酸）突变为V (缬 氨酸），序列表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列；tn2突变体9编码基因 核苷酸序列为将序列表中序列1第998位C突变为T，序列表中序列1的其它核苷酸不变得 到的核苷酸序列。
[0094] 实施例5、TN2基因受白粉菌诱导表达
[0095] 作为一个植物R基因，TN2的突变抑制ex〇70Bl介导的白粉菌的抗性和白粉菌诱 导的细胞死亡。为了查明TN2基因是否直接受白粉菌诱导表达，用实时定量PCR的方法，检 测野生型Col-O在接种白粉菌1天、3天和5天后TN2基因的表达。
[0096] 将生长4周的野生型Col-O植株大量接种白粉菌，分别在接菌前、接菌1天、3天和 5天后剪取植株叶片，放入液氮中速冻，然后在_70°C储存，提RNA备用。RNA提取方法、PCR 反应液和PCR反应程序如前所述。引物序列：TN2 F :5GGCTCATGAGTCAGAAAG3 ；TN2 R ： 5GAAGATTCAGTCCCGGAT-3。
[0097] 结果如图5所示，接种白粉菌3天和5天后，TN2基因的表达大约是未接菌的9倍 和25倍，表明TN2基因受白粉菌诱导表达。
[0098] 实施例6、拟南芥白粉菌抗性相关基因 TN2在作物抗病改良中的应用
[0099] 拟南芥中Col-O生态型共有21个TIR-NBS类基因，已经报导其中一些TN基因在 植物免疫中起作用。AtTNlO, AtTNll, AtTN2和AtTN3在感染白粉菌（Blumeriagraminis, Er ysiphecichoracearum)和丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae)后大量诱导表达。在 烟草中瞬时过表达一些TN基因，能发生超敏反应，导致细胞死亡。
[0100] TN2基因，作为其中一个TIR-NBS类R基因，不仅受白粉菌诱导表达，而且抑制胞吐 复合体亚基突变体ex〇70Bl的所有白粉菌的抗病表型，说明它在调控植物对白粉菌抗性中 的重要作用。利用基因工程技术，通过在植物中过表达TN2,有希望获得具有优良抗病性状 的种质材料。
【权利要求】
1. 一种抑制植物过度激活抗性的方法，包括如下步骤：突变植物中的TN2基因，实现抑 制植物抗性的过度激活； 所述TN2基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抑制植物过度激活抗性体现在促进 植物叶片表面白粉菌的菌丝生长、增加植物叶片表面白粉菌分生孢子梗数的产生、抑制植 物中PR1基因的表达和/或抑制植物中游离水杨酸的积累。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述植物具体为拟南芥突变体ex〇70Bl ; 所述ex〇70Bltn2突变植物中的TN2蛋白编码基因为突变的TN2基因； 所述eX〇70Bltn2突变植物为用拟南芥突变体eX〇70Bl与拟南芥tn2突变体杂交，获得 杂交后代exo70Bltn2。
4. 一种TN2突变蛋白，其为如下1)-9): 1. TN2突变蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2第1-43位氨基酸残基组成的序列； 2. TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第27位精氨酸突变为组氨酸，序列 表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列； 3. TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第82位丙氨酸突变为苏氨酸，序列 表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列； 4. TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第82位丙氨酸突变为缬氨酸，序列 表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列； 5. TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第1-218位氨基酸残基组成的序 列； 6. TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第222位甘氨酸突变为精氨酸，序列 表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列； 7. TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第310位谷氨酸突变为赖氨酸，序列 表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列； 8. TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第318位甘氨酸突变为精氨酸，序列 表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列； 9. TN2突变蛋白的氨基酸序列为将序列表中序列2第333位丙氨酸突变为缬氨酸，序列 表中序列2的其它氨基酸残基不变得到的氨基酸序列。
5. 权利要求4所述蛋白的编码DNA分子，为如下1) -9): 1) 权利要求4所述蛋白中的1)的编码DNA分子为序列A第1-132位核苷酸，所述序列 A为将序列表中序列1自第130位C突变为T，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核 苷酸序列； 2) 权利要求4所述蛋白中的2)的编码DNA分子为将序列表中序列1第80位G突变为 A，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列； 3) 权利要求4所述蛋白中的3)的编码DNA分子为将序列表中序列1第244位G突变 为A，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列； 4) 权利要求4所述蛋白中的4)的编码DNA分子为将序列表中序列1第245位C突变 为T，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列； 5) 权利要求4所述蛋白中的5)的编码DNA分子为序列B第1-657位核苷酸，所述序列 B为将序列表中序列1第656位G突变为A，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷 酸序列； 6) 权利要求4所述蛋白中的6)的编码DNA分子为将序列表中序列1第664位G突变 为A，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列； 7) 权利要求4所述蛋白中的7)的编码DNA分子为将序列表中序列1第928位G突变 为A，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列； 8) 权利要求4所述蛋白中的8)的编码DNA分子为将序列表中序列1第952位G突变 为A，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列； 9) 权利要求4所述蛋白中的9)的编码DNA分子为将序列表中序列1第998位C突变 为T，序列表中序列1的其它核苷酸不变得到的核苷酸序列。
6. 权利要求4所述蛋白或权利要求5所述的编码DNA分子或含有其编码基因的重组载 体在调控植物对白粉病抗性中的应用； 所述调控植物对白粉病抗性具体为抑制植物抗性的过度激活； 所述植物具体为单子叶植物或双子叶植物，所述植物进一步具体为拟南芥ex〇70Bl。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述抑制植物过度激活的抗性体现在促 进植物叶片表面白粉菌的菌丝生长、增加植物叶片表面白粉菌分生孢子梗数的产生、抑制 植物中PR1基因的表达和/或抑制植物中游离水杨酸的积累。 8. R蛋白TN2或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在调控植物对白粉病抗性中 的应用；所述R蛋白TN2的氣基酸序列为序列表中序列2 ; 所述TN2蛋白调控植物对白粉病抗性具体为提高植物对白粉病抗性； 所述植物为单子叶植物或双子叶植物，所述植物具体为拟南芥。
【文档编号】C12N15/82GK104497115SQ201510008986
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月8日 优先权日:2015年1月8日
【发明者】芮璐, 赵婷, 唐定中 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所