一种载玻片原位培养羊水细胞及核型处理分析的方法
【专利摘要】本发明提供了一种载玻片原位培养羊水细胞及核型处理分析的方法，本发明在以前的研究基础上进一步提高，采用特定浓度和种类的低渗液、预固定液，严格控制染色体分散时分散环境的温度和湿度，以获得丰富的优质分裂相，此技术将为高通量自动扫描捕获体系提供了基础技术平台，建立自动化阅片流程，提升临床工作效率。
【专利说明】一种载玻片原位培养羊水细胞及核型处理分析的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种羊水细胞培养领域，具体涉及一种载玻片原位培养羊水细胞及核 型处理分析的方法。
【背景技术】
[0002] 羊水细胞培养及核型分析是产前诊断的关键技术，该技术需要历经羊水细胞贴 壁、收获(低渗、预固定)、制片（染色体分散)、显微镜下拍取核型以及核型分析等诸多步骤， 以完成最终的临床报告。随着产前筛查不断普及和产前诊断需求量急速增加的状况，传统 的羊水细胞培养(耗时、耗力）无法满足临床需求，且传统的羊水细胞培养步骤繁多，制片质 量不稳定，不宜于产前诊断质量控制。为了缩短培养时间，提高工作效率，研究人员成功研 制自动核型扫描仪，即将显微镜与自动进片的轨道相连接，以实现24小时无人值守全自动 换片、取片、扫描、滴油、采集核型。该仪器在外周血及FISH核型捕获中显示快速、省力的极 好效果，但羊水原位培养的细胞贴壁于4X6cm 2的塑料培养瓶，塑料瓶底片不平整、厚度太 高，显微镜无法自动调节焦距自动扫描捕获。国外普遍采取盖玻片法，该法将细胞贴壁在盖 玻片，以培养平皿为载体，收获细胞后移出盖玻片到载玻片上，再用胶粘附实现核型分析， 但由于粘附剂关系，厚度不适合显微镜调节聚焦，或以反面自动阅片，效果局限。载玻片原 位培养羊水细胞可以解决上述两种方法的不足。Tabor等使用NUNC公司的载玻片培养皿进 行羊水细胞原位培养，但分析成本太高，国内不易普及。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种载玻片原位培养羊水细胞 及核型处理分析的方法。
[0004] 本发明采用的技术解决方案是：一种载玻片原位培养羊水细胞的方法，包括以下 步骤： (1) 接种：将每个羊水细胞标本取18-22ml，无菌分入尖底离心管2管，9-1 Iml/管，平 衡离心lOmin，转速为1200rpm，各管留取0. 5ml细胞悬液，各加入I. 5ml羊水培养基，充分 混匀，平铺于载玻片的细胞贴壁面，在37°C，5% CO2的条件下培育2天，2天后在载玻片内 再缓慢添加3ml羊水培养基，新添加的培养基与旧培养基混合均匀，重新置于37°C，5% CO2 的条件下培育5天； (2) 换液：待羊水细胞培养至7-8天，倒置于显微镜下观察生长进展，待克隆细胞群增 殖，用2ml/瓶新鲜的羊水培养基替换旧培养基，待第二天即收获包含原位培养的羊水细胞 载玻片。
[0005] 所述的一种载玻片原位培养羊水细胞的方法，所述的步骤（1)中细胞悬液为羊水 细胞沉淀和羊水。
[0006] 一种羊水细胞核型处理分析的方法，包括以下步骤： (1)收获、制片：在含原位培养的羊水细胞载玻片中加入秋水仙素，摇匀，再置入5% C02, 37°C培养箱25min，弃去上清液； (2)低渗：羊水细胞载玻片中缓慢加入预温37°C的低渗液6ml，室温平置25min ; (3 )预固定：缓慢抽取载玻片的上清液，弃之，后缓慢加预固定液6ml，7min之后，弃上 清液，再加入4ml新鲜固定液，冲洗细胞壁，弃上清液； (4) 固定：再在载玻片中加如新鲜固定液6ml，室温静置lOmin，弃上清液； (5) 重复第（4)步步骤2次，静置时间缩短为Imin ; (6) 用镊子取出载玻片，用纱布吸去多余的固定液，放入染色体分散仪器中，设定温度 为21 °C，湿度为30或33%，待载玻片完全干燥； (7) 将载玻片置于烘箱65°C下烤片2h，取出载玻片后，lmg/ml胰酶浸泡处理16-20s， Giemsa染液浸泡处理IOmin ; (8) 拍取核型：采用显微镜拍取羊水细胞载玻片：，GLS-120自动核型扫描仪捕获采集 染色体核型。
[0007] 所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的秋水仙素浓度为 20ug/ml。
[0008] 所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的低渗液为浓度1% 的枸橼酸钠。
[0009] 所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的预固定液为浓度 5%的冰醋酸。
[0010] 所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的固定液为甲醇： 冰乙酸=3 :1的卡诺固定液。
[0011] 所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的Giemsa染液成份 为1 :10的Giemsa原液与PH6. 8的磷酸缓冲液。
[0012] 本发明得到的有益效果是：本发明提供了一种载玻片原位培养羊水细胞及核型处 理分析的方法，本发明在以前的研究基础上进一步提高，采用特定浓度和种类的低渗液、低 渗时间、预固定液、预固定时间、固定液、固定时间以及严格控制染色体分散时分散环境的 温度和湿度，以获得丰富的优质分裂相，此技术将为高通量自动扫描捕获体系提供了基础 技术平台，建立自动化阅片流程，提升临床工作效率，本发明的有益效果主要体现在：（1) 本发明不干扰产前诊断程序，不增加羊水穿刺次数及羊水量，不存在伦理问题；（2)本发明 所涉及的试剂为自配试剂，原材料均可国内购买，无需额外增加试剂，不增加成本；（3)本 发明建立的羊水原位培养方法可以用于自动显微镜扫描，解决了产前诊断自动化关键技 术，且建立规范化流程，达到制片质量稳定，获得培养克隆丰富、分裂相优质，成功率高等特 点；（4)本发明可采用国产载玻片，获得细胞克隆数和有效分裂相数能力不亚于进口载玻 片，且国产载玻片价格低。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为本发明的国产载玻片无菌培养盒。
[0014] 图2:为本发明载玻片示意图。
[0015] 图3为本发明羊水细胞生长图。
[0016] 图4为染色体核型分散质量评估对照图。
[0017] 其中图2中：a为载玻片标记处；b为载玻片细胞贴壁面。
[0018]
【具体实施方式】： 下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明做进一步说明。
[0019] 下面结合具体实施例对本技术进行进一步描述(本发明的试剂除特殊说明外，国 产载玻片购自杭州宝荣公司；进口载玻片为意大利Euroclone ;羊水培养基为以色列的 BI0AMF-2 培养基）： 实施例1 :国产载玻片与进口载玻片同步培养羊水细胞 (1)接种：选取10个羊水标本，每个标本取18-22ml。无菌分入尖底离心管2管， 9-llml/管，平衡离心lOmin，转速为1200rpm，各管留取0. 5ml细胞悬液(羊水细胞沉淀+少 许羊水)，各加入1.5ml羊水培养基，分别平铺于国产载玻片、进口原装载玻片培养瓶的细胞 贴壁面（图2b)，在37°C，5% CO2的条件下培育2天，最少的机械干扰，2天后在载玻片的标 记处（图2a)再添加3ml羊水培养基，新添加的培养基与旧培养基混合均匀，重新置于37°C， 5% CO2的条件下培育5天。
[0020] (2)换液：待羊水细胞培养至7-8天，倒置于显微镜下观察生长进展，待克隆细胞 群增多，面积大，透亮细胞多时，用2ml/瓶新鲜的羊水培养基替换旧培养基，待第二天即收 获包含原位培养的羊水细胞载玻片。原来的培养物传代到对应组织细胞培养瓶中，继续生 长，待出报告后，弃之。
[0021] (3)收获、制片：在含原位培养的羊水细胞载玻片中加入秋水仙素，摇匀，再置入 5% C02 , 37°C培养箱25min，弃去上清液； (4) 低渗：羊水细胞载玻片中的标记处（图2a)缓慢加入预温37°C的低渗液6ml，低渗 液为浓度1%的枸橼酸钠，室温平置25min ; (5) 预固定：在载玻片的标记处（图2a)缓慢抽取载玻片的上清液，弃之，后缓慢加预固 定液6ml，预固定液为浓度5%的冰醋酸，7min之后，弃上清液，再加入4ml新鲜固定液，冲洗 细胞壁，弃上清液； (6) 固定：再在载玻片中加如新鲜固定液6ml，固定液为甲醇：冰乙酸=3 :1的卡诺固 定液，室温静置lOmin，弃上清液； (7) 重复固定步骤2次，静置时间缩短为Imin ; (8) 用镊子取出载玻片，玻片边缘靠在纱布上，吸去多余的固定液，放入染色体分散仪 器中，设定温度为21 °C，湿度为30或33%，待载玻片完全干燥； (9) 将载玻片置于烘箱65°C下烤片2h，取出载玻片后，lmg/ml胰酶浸泡处理16-20s， Giemsa染液浸泡处理lOmin，Giemsa染液成份为I : 10的Giemsa原液与PH6. 8的磷酸缓冲 液； (10) 拍取核型：采用GLS-120自动扫描捕获体系捕获染色体核型。染色体分散质量采 用数字评分：1)分散(不是所有染色体都在一个视野中);2)优质(所有染色体都在一个视野 中，且染色体交叉少于或等于5条）；3)差(染色体交叉大于5条)。
[0022] (11)临床报告：分析染色体核型，15个核型/人。
[0023] 上述步骤中所用的秋水仙素浓度为20ug/ml。
[0024] 3)计算载玻片上贴壁的细胞克隆数及优质分裂相。载玻片上细胞克隆成片生长， 细胞计为60个。
【权利要求】
1. 一种载玻片原位培养羊水细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 接种：将每个羊水细胞标本取18_22ml，无菌分入尖底离心管2管，9-1 lml/管，平 衡离心lOmin，转速为1200rpm，各管留取0. 5ml细胞悬液，各加入1. 5ml羊水培养基，充分 混匀，平铺于载玻片的细胞贴壁面，在37°C，5% C02的条件下培育2天，2天后在载玻片内 再缓慢添加3ml羊水培养基，新添加的培养基与旧培养基混合均匀，重新置于37°C，5% C02的条件下培育5天； (2) 换液：待羊水细胞培养至7-8天，倒置于显微镜下观察生长进展，待克隆细胞群增 殖，用2ml/瓶新鲜的羊水培养基替换旧培养基，待第二天即收获包含原位培养的羊水细胞 载玻片。
2. 根据权利要求1所述的一种载玻片原位培养羊水细胞的方法，其特征在于：所述的 步骤（1)中细胞悬液为羊水细胞沉淀和羊水。
3. -种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 收获、制片：在含原位培养的羊水细胞载玻片中加入秋水仙素，摇匀，再置入5% C02, 37°C培养箱25min，弃去上清液； (2) 低渗：羊水细胞载玻片中缓慢加入预温37°C的低渗液6ml，室温平置25min ; (3 )预固定：缓慢抽取载玻片的上清液，弃之，后缓慢加预固定液6ml，7min之后，弃上 清液，再加入4ml新鲜固定液，冲洗细胞壁，弃上清液； (4) 固定：再在载玻片中加如新鲜固定液6ml，室温静置lOmin，弃上清液； (5) 重复第（4)步步骤2次，静置时间缩短为lmin ; (6) 用镊子取出载玻片，用纱布吸去多余的固定液，放入染色体分散仪器中，设定温度 为21 °C，湿度为30或33%，待载玻片完全干燥； (7) 将载玻片置于烘箱65°C下烤片2h，取出载玻片后，lmg/ml胰酶浸泡处理16-20s， Giemsa染液浸泡处理lOmin ; (8) 拍取核型：采用显微镜拍取羊水细胞载玻片：，GLS-120自动核型扫描仪捕获采集 染色体核型。
4. 根据权利要求3所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的秋 水仙素浓度为20ug/ml。
5. 根据权利要求3所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的低 渗液为浓度1%的枸橼酸钠。
6. 根据权利要求3所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的预 固定液为浓度5%的冰醋酸。
7. 根据权利要求3所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的固 定液为甲醇：冰乙酸=3 :1的卡诺固定液。
8. 根据权利要求3所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的 Giemsa染液成份为1 :10的Giemsa原液与PH6. 8的磷酸缓冲液。
【文档编号】C12N5/071GK104498431SQ201510034434
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月23日 优先权日:2015年1月23日
【发明者】唐少华, 林小玲, 郑义 申请人:温州市中心医院