专利名称：生产2-酮基-l-古洛糖酸的方法
技术领域：
本发明涉及到用于生产2-酮基-L-古洛糖酸的一种发酵方法，该酸可用作合成L-抗坏血酸的一种中间体。
用作合成L-抗坏血酸中间体的2-酮基-L-古洛糖酸己用称为Reichstein方法的工业化方法生产出来(见HelveticaChimicaActa，17，311(1934))。然而，该方法包括许多步骤，需用大量溶剂，因此不能应用于现代工业技术。
另一方面，代替Reichstein方法，已提出数种主要采用微生物的方法来生产该酸。例如有一种方法是，将D-葡萄糖进行微生物学的氧化产生5-酮基-D-葡糖酸，进行化学还原或微生物学还原，得到L-艾杜糖酸，然后用微生物学方法氧化产物得到2-酮基-L-古洛糖酸(见美国专利No.2，421，611);另一种方法包括，用微生物学方法氧化D-葡萄糖得到2，5-二酮基-D-葡糖酸，用微生物学或化学方法还原得到2-酮基-L-古洛糖酸(见日本专利公开No.39-14493，No.53-25033，No.56-15877，和No.59-35920)。
然而，这些方法中采用的化学还原步骤，即将5-酮基-D-葡糖酸还原为艾杜糖酸(前一方法中)和将2，5-二酮基-D-葡糖酸还原为2-酮基-L-古洛糖酸(后一方法中)伴有立体专一性问题，并且所产生的D-葡糖酸和2-酮基-D-葡糖酸是副产物，从而造成产率低。此外，当上述还原反应用微生物学方法进行时，需要向微生物加过量糖及糖苷作为还原能量来源，其结果也降低了产率。因此，当用L-山梨糖作起始物时，只能通过一步氧化反应生产2-酮基-L-古洛糖酸。
事实上，利用这一点已做了几种试验，所用细菌属于下列属葡糖杆菌属，假单胞菌属，沙雷氏菌属，醋杆菌属，和产碱菌属(见BiotechnologyandBioengineering(生物技术与生物工程)，14，799(1972);日本专利公开No.41-159和No.41-160;美国专利No.3，043，749;苏联专利No.526，660;日本专利公开No.49-39838;ActaMicrobiologicalSinica，20，246(1980)和21，185(1981);日本专利公开公告No.62-48389)。
然而，所公布的菌种给出的产率低，无法应用于工业生产。
最近，报导了一种从D-葡萄糖中生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法，采用的菌种是这样得到的，采用DNA重组技术，将属于棒杆菌属的一种微生物的2，5-二酮基-D-葡糖酸还原酶基因引入属于欧文氏菌属的一种微生物内(见Science，230，144(1985))。然而，就2-酮基-L-古洛糖酸的产量来讲，这种方法也不能实现工业化生产。
在这些情况下，本文发明人深入研究了具有工业生产优势的一种生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法，结果我们发现，从土壤中分离得到并称之为酮基氧化假葡糖杆菌(即pseudogluconobactersaccharoketogenes)的细菌可从L-山梨糖生产大量的2-酮基-L-古洛糖酸(见欧洲专利申请公开No.221，707)。然而，在对该方法进行改进研究中，我们意外地发现，将该菌在加了某种稀土元素的培养基中培养时，发酵时间缩短，并且从L-山梨糖中生产2-酮基-L-古洛糖酸的产率有显著提高。还未发现一种稀土元素有如此促进发酵的效应。我们对此现象进行了大量研究，从而得到了本发明。
本发明主要目的是提供从L-山梨糖中生产2-酮基-L-古洛糖酸的一种改进方法。
对于本领域的普通技术人员来讲，本发明的此目的以及其它的目的和优势从下面的叙述中是很显然的。
根据本发明，提供了一种生产2-酮基-L-古洛糖酸的改进方法，它包括，在一种含有L-山梨糖并加有某稀土元素的培养基中培养一种属于假葡糖杆菌的微生物，它能将L-山梨糖氧化为2-酮基-L-古洛糖酸。
在有某种稀土元素存在下培养一种属于假葡糖杆菌属的、具有将L-山梨糖氧化为2-酮基-L-古洛糖酸能力的微生物，可有效地生产2-酮基-L-古洛糖酸，其为合成L-抗坏血酸的一种重要的起始物。
用于本发明的假葡糖杆菌属的微生物包括，例如，在欧洲专利申请公开No.221，707中所述的下列菌株酮基氧化假葡糖杆菌K591sFERMBP-1130，IFO14464，CCTCC86-121;
酮基氧化假葡糖杆菌12-5FERMBP-1129，IFO14465，CCTCC86-122;
酮基氧化假葡糖杆菌TH14-86FERMBP-1128，IFO14466，CCTCC86-123;
酮基氧化假葡糖杆菌12-15FERMBP-1132，IFO14482，CCTCC86-124;
酮基氧化假葡糖杆菌12-4FERMBP-1131，IFO14483，CCTCC86-125;
酮基氧化假葡糖杆菌22-3FERMBP-1133，IFO14484，CCTCC86-126此处及以后各处，这些酮基氧化假葡糖杆菌细菌被称为氧化细菌。
用于本发明的稀土元素包括，例如钪(Sc)，钇(Y)，镧(La)，铈(Ce)，镨(Pr)，钕(Nd)，钐(Sm)，铕(Eu)，钆(Gd)，铽(Tb)，镝(Dy)，钬(Ho)，铒(Er)，铥(Tm)，镱(Yb)及镥(Lu)。这些稀土元素可以金属粉或片状形式加入。或可采用化合物形式使用，如它们的氯化物，碳酸盐，硫酸盐，硝酸盐，氧化物及草酸盐。它们可以单独使用，或两个或多个结合使用，例如碳酸铈和氯化镧可同时使用。此外，在各个稀土元素的分离和纯化步骤所得到的粗产物也可使用。
加入培养基的稀土元素的量可在其不妨碍所用微生物的生长的范围内选择。通常，有效用量范围为0.000001至0.1%(W/V)，优选为0.0001至0.05%(W/V)。
至于加入稀土元素至培养基的方法，可采用提前加入，间歇加入或连续加入。
本发明的方法中，当起始物L-山梨糖加入培养基时，其总量可在开始培养时加入，或分成几个部分间歇加入，也可连续加入液体培养基。培养基中L-山梨糖的浓度可为2至40%(W/V)，优选为5至30%(W/V)，基于培养基而定。
在用于培养上述氧化细菌的培养基中，可采用可被菌种利用的营养源即碳源，氮源，无机盐，有机盐和能被该菌种利用的痕量营养物。
L-山梨糖可作为碳源，另外，作为附加碳源，例如，可采用葡萄糖，果糖，甘油，蔗糖，乳糖，麦芽糖，糖浆及类似物。
氮源包括，例如，各种铵盐(如硫酸铵，硝酸铵，氯化铵，硫酸铵)，含氮的无机或有机化合物，如玉米浆(此处及以后各处称之为CSL)，胨，肉提取物，酵母提取物，干酵母，大豆粉，棉籽粉，尿素及其类似物。
无机盐类，除了上述稀土元素外，还可使用钾盐，钠盐，钙盐，镁盐，铁盐，锰盐，钴盐，锌盐，铜盐和磷酸盐。
作为痕量营养物，可加入CoA(辅酶A)，泛酸，生物素，硫胺素和核黄素，这些物质是上述细菌生长的基本物质。此外可适量加入对细菌的生长和2-酮基-L-古洛糖酸的生产有促进活性的黄素单核苷酸(此处及以后各处简称为FMN)，含有其它维生素，L-半胱氨酸，L-谷氨酸和硫代硫酸钠及其类似物的化合物或天然产物。
培养基的这些成份可预先一次加入培养基中。或者，这些成份的一部分或全部可间歇地或连续地加入液体培养基中。
培养方式可采用静态培养，摇荡培养，搅拌培养或其它方法。然而，对大量生产来说，优选为浸没培养。
当然，培养条件随菌种不同而变，也随培养基成份的变化等而有所不同。简而言之，可根据每种具体情况选择，从而以最高效率生产目标产物。例如，培养温度优选为25至35℃，培养基pH值约于5至9。
上述条件下培养10至120小时，2-酮基-L-古洛糖酸可以最高浓度积累。在此情形下，由于在目标产物浓集过程中pH值通常降低，故可加入一种合适的碱性物质如氢氧化钠，氢氧化钾或氨水以一直保持微生物法生产2-酮基-L-古洛糖酸的最佳pH值。或，可往培养基中加入适当的缓冲液以保持最佳pH值。
本发明中，当属于假葡糖杆菌属的微生物是在某种稀土元素的存在下在含有L-山梨糖的液体培养基中培养，以在培养基中生产和浓集2-酮基-L-古洛糖酸时，与单独只用该氧化细菌，即属于假葡糖杆菌属的微生物的情形相比，如果将该氧化细菌与另一种微生物混合培养，则所收集的2-酮基-L-古洛糖酸的量会大大增加。
所混合微生物包括，例如，属于下列属的细菌芽孢杆菌，假单胞菌，变形菌，柠檬酸细菌，肠杆菌，欧文氏菌，黄单胞菌，黄杆菌，微球菌，埃希氏菌等等。
更确定地说，包括下列菌种。
蜡状芽孢杆菌IFO3131;
地衣芽孢杆菌IFO12201;
巨大芽孢杆菌IFO12108;
短小芽孢杆菌IFO12090;
解淀粉芽孢杆菌IFO3022;
枯草芽孢杆菌IFO13719;
环状芽孢杆菌IFO3967;
三叶草假单胞菌IFO12056;
嗜麦芽假单胞菌IFO12692;
无恒变形菌IFO12930;
弗氏柠檬酸细菌IFO13544;
阴沟肠杆菌IFO3320;
草生欧文氏菌IFO12686;
豌豆黄单胞菌IFO13556;
柑桔黄单胞菌IFO3835;
脑膜脓毒性黄杆菌IFO12535;
变易微球菌IFO3765;
大肠杆菌IFO3366在某种适当培养基中培养上述菌种的任何一种，温度20至40℃，时间1至4天而得到的液体培养物可作为要进行混合的微生物的种子培养物。通常，接种量应为该氧化细菌(即假葡糖杆菌)用量的1/10至1/1000。将要混合的微生物与氧化细菌以接种量混合而进行混合培养，则该氧化菌的生长能得到促进，并且高浓度的L-山梨糖可在比单用氧化细菌培养更短的时间内氧化成为2-酮基-L-古洛糖酸。用作混合微生物的细菌需不具有或只有微弱的与L-山梨糖或2-酮基-L-古洛糖酸同化的性质，其中L-山梨糖是本发明的起始物，2-酮基-L-古洛糖酸是本发明的目标产物。其它培养条件与单独培养氧化细菌时相同。
此外，上述氧化细菌之外的某几种特定细菌的灭菌培养物可有效地用作该培养基的一种成份。这些可利用的细菌菌种包括，例如，芽孢杆菌，假单胞菌，柠檬酸细菌，埃希氏菌和欧文氏菌属的菌种。更具体地说，包括下列菌种蜡状芽孢杆菌IFO3131;
枯草芽孢杆菌IFO3023;
短小芽孢杆菌IFO12089;
巨大芽孢杆菌IFO12108;
解淀粉芽孢杆菌IFO3022;
三叶草假单胞菌IFO12056;
弗氏柠檬酸细菌IFO12681;
大肠杆菌IFO3546草生欧文氏菌IFO12686;
这些细菌可在一种培养基中，温度20至40℃下，生长2至4天。得到的培养物可灭菌，然后加入该氧化细菌的培养基中，加入量为0.5至5.0%(V/V)，以促进该氧化菌的生长。
如此在培养基中产生并浓集的2-酮基-L-古洛糖酸，可利用其性质，采用已知方法进行分离纯化。
2-酮基-L-古洛糖酸可以游离酸的形式得到分离。或者，其可以例如钠盐，钾盐，钙盐或铵盐得到分离。
至于分离方法，可采用例如下述方法，其中细菌细胞经过滤或离心(若需要的话)从培养基中除去，然后，在不加活性炭处理，或者加活性炭处理后浓集该溶液，用过滤方法收集分离后的晶体，并再次结晶得到目标产物;还可采用溶剂萃取;层析，盐析等相似方法，这些方法可单独使用，适当结合使用，或可重复使用。
当2-酮基-L-古洛糖酸以游离的形式得到后，可转变为例如，钠盐，钾盐，钙盐，铵盐或其它盐类，并且当其以盐的形式得到时，其可以适当方法转化为游离形式或其它盐类。
培养基中产生的2-酮基-L-古洛糖酸在下列条件下用高效液相层析检验。
高效液相层析测定条件HPLC655A系统(日本HitachiSeisakusho生产)柱SCR101H(磺酸化聚苯乙烯凝胶)，300×7.9mm(日本SimadzuSeisakusho生产)。
流速0.8毫升/分钟(压力50公斤/平方厘米)流动相稀硫酸(pH2.1)检测器紫外(214nm)及差示折光计。
保留时间对2-酮基-L-古洛糖酸为7.20分钟，对L-山梨糖为8.33分钟。
下述实例进一步详细描述了本发明，但并不限制本发明的范围。如未加说明，所用的培养基百分比均为%(W/V)。例中培养产率用2-酮基-L-古洛糖酸的量占所用L-山梨糖的量之摩尔转化率来表示。
例1表1斜面培养基(克/升)D-山梨醇25胨10酵母提取物10碳酸钙2琼脂20pH7.0将含有D-葡萄糖2.0%，胨1.0%，干酵母1.0%和CaCO(日本Akadama，ShiraishiCalciumK.K.生产)2.0%的种子培养基(20毫升)置于一个200毫升的锥形瓶中，并于120℃高压下灭菌20分钟。用一铂环在表1所示斜面培养基中30℃下已生长3天的酮基氧化假葡糖杆菌K591S菌株接种于该瓶中，30℃下摇荡培养(200转/分)2天。所得到的培养物(2毫升)转移至表1所示同样培养基中，在同样条件下培养得到二次种子培养物。
将含有CSL 2.0%，干酵母0.5%，硫酸铵0.3%，Na2S2O3·5H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.1%，CeCl3·7H2O 0.005%，CaCO3(Akadama)3.5%和L-山梨糖9.5%(单独灭菌)的发酵培养基(25ml)，置于一只200毫升锥形瓶中，120℃高压下灭菌20分钟。
此发酵培养基用上述二次种子培养物(1.25毫升)接种，30℃下摇荡培养2天。这样得到的发酵液含有浓度为86.4毫克/毫升的2-酮基-L-古洛糖酸(产率84.4%)，浓度由高效液相色谱测定。按同样方法只是没加氯化铈培养所得的发酵溶液所含2-酮基-L-古洛糖酸浓度为51.0毫克/毫升(产率49.8%)。
例2用例1中所述同样方法培养下列菌株以得到二次种子培养物酮基氧化假葡糖杆菌12-4(IFO14483，FERMBP-1131)，12-5(IFO14465，FERMBP-1129)，12-15(IFO14482，FERMBP-1132)和22-3(IFO14484，FERMBP-1133)。
将含CSL 2.0%，干酵母0.5%，硫酸铵0.3%，Na2S2O3·5H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.01%，Ce2(CO3)3·8H2O 0.05%，CaCO3(Akadama)3.5%和L-山梨糖9.5%(分别灭菌)的发酵培养基(25ml)，置于一个200毫升锥形瓶中并于120℃高压下灭菌20分钟。
将上述每种二次种子培养物(1.25毫升)转移至含有发酵培养基的锥形瓶中，30℃下摇荡培养3天。这样得到的发酵液用高效液相层析测定。结果示于表2，其中给出了加与不加Ce2(CO3)3·8H2O的情形中所产生的2-酮基-L-古洛糖酸的量(毫克/毫升)。
表2菌株碳酸铈不加加12-451.0(49.8%)63.0(61.5%)12-575.9(74.1%)87.6(85.6%)12-1545.2(44.1%)67.3(65.7%)22-369.8(68.1%)88.1(86.1%)括号中的数据表示产率。
例3根据例1中所述方法培养酮基氧化假葡糖杆菌TH14-86(IFO14466，FERMBP-1128)得到二次种子培养物。
将含CSL 2.0%，干酵母0.5%，硫酸铵0.3%，NaSO·5HO 0.05%，FeSO4·7H2O 0.1%，CaCO3(Akadama)5%及L-山梨糖10.5%(分别灭菌)的发酵培养基(25ml)置于一个200毫升锥形瓶中，120℃下高压下灭菌20分钟。
将上述二次种子培养物(1.25毫升)转移至该含有发酵培养基的锥形瓶中，30℃下摇荡培养2天。在这些条件下，加入0.01%的下述元素的氯化物钇，镧，铈，钕，钐，铕，钆，铥，镝，钬，铒或镱，或氧化镨，或0.05%氧化钪，30℃下摇荡培养2天，这样得到的发酵溶液进行高效液相层析检验。培养基中产生的2-酮基-L-古洛糖酸的量(毫克/毫升)示于表3。
表3稀土元素2-酮基-L-古洛糖酸的产量未加78.5(69.4%)三氯化钇(YCl3·6H2O) 86.9(76.8%)三氯化镧(LaCl3·7H2O) 97.6(86.3%)三氯化铈(CeCl3·7H2O) 97.6(86.3%)三氯化钕(NdCl3·6H2O) 90.1(79.6%)三氯化钐(SmCl3·6H2O) 84.1(74.3%)三氯化铕(EuCl3·6H2O) 83.0(73.4%)三氯化钆(GdCl3·6H2O) 81.9(72.4%)三氯化铽(TbCl3·xH2O) 82.0(72.5%)三氯化镝(DyCl3·6H2O) 82.1(72.6%)三氯化钬(HoCl3·6H2O) 81.9(72.4%)三氯化铒(ErCl3·6H2O) 82.2(72.6%)三氯化镱(YbCl3·6H2O) 82.2(72.6%)氧化镨(Pr6O11) 94.6(83.6%)三氧化二钪(Sc2O3) 80.6(71.2%)括号中的数据为产率。
例4根据例1中所述同样方法，用同样的发酵培养基培养酮基氧化假葡糖杆菌TH14-86菌株，其中加入氧化镧，氯化镧，硝酸镧或草酸镧，或氧化铈，氯化铈，硫酸铈或碳酸铈，加入量示于表4，此情形下，培养时间为30小时。用高效液相层析检测发酵液中产生的2-酮基-L-古洛糖酸的产量(毫克/毫升)，结果与未加稀土元素时的情况一并列于表4。
表4稀土元素加入量2-酮基-L-古洛糖酸(%)的产量未加060.8(59.4%)氯化镧(LaCl3·7H2O) 0.002 74.3(72.6%)碳酸镧(La(CO3)3) 0.002 74.0(72.3%)硝酸镧(La(NO3)3·6H2O) 0.002 73.6(71.9%)草酸镧(La2(C2O4)3·9H2O) 0.002 73.1(71.4%)三氧化二镧(La2O3) 0.05 74.5(72.8%)三氯化铈(CeCl3·7H2O) 0.002 73.1(71.4%)碳酸铈(Ce2(CO3)3·8H2O) 0.002 73.8(72.1%)硫酸铈(Ce2(SO4)3·nH2O) 0.002 73.2(71.5%)硫酸亚铈(Ce(SO4)2·NH2O) 0.002 75.1(73.4%)二氧化铈(CeO2) 0.05 64.5(63.0%)括号内数据为产率。
例5将在表1中所述斜面培养基中于28℃下生长2天的巨大芽孢杆菌(IFO12108)微生物细胞悬浮于10毫升已灭菌的水中，并全部转移到含有例1中的种子培养基(500毫升)的一只Sakaguchi烧瓶中，于28℃下交互振荡(85spm)培养2天，得到巨大芽孢杆菌的种子培养物。将一种含有蔗糖4.0%，棉籽粉4.0%，磷酸氢二钾0.65%，磷酸二氢钾0.55%，硫酸铵0.05%，氯化钠0.05%，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05%及泛酸钙0.05%的培养基(30升，pH7.0)置于一个50升的发酵器中，125℃下高压灭菌20分钟。发酵器用巨大芽孢杆菌种子培养物(1升)接种，在下列条件下培养4天搅拌200转/分，通气24升/分，内压1.0公斤/平方厘米，温度28℃。所得培养物于120℃下高压灭菌20分钟，低温贮存，巨大芽孢杆菌的灭菌培养基(此处及以后简称为巨大菌肉汤)用作该发酵培养基的一种成份。
将例1的种子培养物(20毫升)置于一只200毫升锥形瓶中，120℃下高压灭菌20分钟。取一铂环28℃下于表1所示的斜面培养基中生长4天的酮基氧化假葡糖杆菌TH14-86菌株的细胞接种于该锥形瓶中，30℃下摇荡培养2天。将所得培养物(20毫升)置于一只1升的锥形瓶中，瓶中装有一种含有D-葡萄糖2.0%，巨大菌肉汤3.0%(V/V)，CSL1.0%，酵母提取物0.5%，胨0.1%，硫酸铵0.3%，及碳酸钙(Akadama)2.0%的培养基(200毫升)，30℃下摇荡培养2天，得到TH14-86菌株的二次种子培养物。
另外，用一铂环于一种斜面培养基中28℃下生长2天的巨大芽孢杆菌IFO12108的微生物细胞接种置于一只200毫升锥形瓶中的例2中的种子培养物(20毫升)中，在28℃下摇荡培养2天得到为混合用的该微生物的种子培养物。
将L-山梨糖(72克)溶于水，体积达300毫升。然后，将CSL(60克)，干酵母(6克)，硫酸铵(9克)，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)(3克)，FMN(3毫克)，硫胺素(3毫克)，生物素(1.5毫克)及actocol(日本Takeda Chemical Industries，Ltd.生产)(0.5克)溶解或悬浮于水中，体积800毫升。另外，将碳酸钙(Akadama，240克)和碳酸铈(Ce2(CO3)3·8H2O(150毫克)悬浮于水中至1，000毫升。120℃下高压灭菌各个培养基20分钟，将它们置于一个预先灭菌的5升发酵器中。
将上述TH14-86菌株的二次种子培养物(300毫升)与用于混合的微生物的种子培养物(4毫升)接种于此发酵器中，在下述条件下开始培养温度30℃，通风2.4升/分，搅拌800转/分。
另外，将L-山梨糖(528克)和三氯化镧(LaCl3·7H2O)(150毫克)溶于水，使体积达900毫升。将硫酸铵(6克)和硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)(3克)溶于水，体积到100毫升。这两种溶液分别于120℃下高压灭菌20分钟，然后在无菌条件下混合。从培养开始后第6小时开始，将此混合物连续加入发酵器，持续24小时，加完该混合物后，再行培养8小时(总共培养38小时)，如此，培养物中L-山梨糖被完全消耗，得到3.16升发酵溶液。该发酵溶液含176.0毫克/毫升2-酮基-L-古洛糖酸(产率86.0%)。
另外，在上述相同条件只是不加碳酸铈(Ce2(CO3)3·8H2O)和三氯化镧(LaCl3·7H2O)下进行培养。在此情形下，在混合物加入后又进行了22小时的培养，L-山梨糖被完全消耗(总共培养52小时)，如此得到的发酵溶液(3.09升)中产生的2-酮基-L-古洛糖酸为161.4毫克/毫升(产率为77.1%)。
例6将约260毫升6N硫酸搅拌加入例5中得到的含176.0毫克/毫升的2-酮基-L-古洛糖酸的发酵液(1升)中，通过离心除去如颗粒和细胞等不溶物。所得的上清液(1，150毫升)通过一装有阳离子交换树脂IR 120 B(H+型，美国Rnhm and Haas生产)(200毫升)的柱，柱子用蒸馏水(150毫升)冲洗，合并洗脱液和冲洗液，通过一根装有Shirasagi碳的层析柱(日本TakedaChemicalIndustriesLtd.生产)(200毫升)，用蒸馏水(150毫升)冲洗该柱子。洗脱液与冲洗液合并(1，450毫升)在约50℃减压下浓集至250毫升。浓集液于5℃下放置过夜，以分离出2-酮基-L-古洛糖酸。过滤收集所得晶体，并用少量冷水，50%冷甲醇和冷甲醇洗涤。在减压条件下用五氧化二磷干燥所得产物，得到156克一水合2-酮基-L-古洛糖酸无色结晶。
产率81.1%熔点171℃(分解)C6H10O7·H2O的元素分析(%)计算值含碳33.97;氢5.62实测值含碳33.91;氢5.65比旋度[α]18D＝-48°(水中C＝1.0)例7取一铂环酮基氧化假葡糖杆菌TH14-86菌株的微生物细胞，接种于一个200毫升锥形瓶中，其含有一种培养基(20毫升)，组成为D-葡萄糖2.0%，巨大菌肉汤3.0%(V/V)，CSL1.0%，酵母提取物0.5%，胨0.1%，硫酸铵0.3%，碳酸钙(Super＃1700，日本MaruoCalciumK.K.生产)2.0%，30℃下摇荡培养2天。将得到的培养物(2毫升)，转移至一含有上述同样培养基(20毫升)的200毫升锥形瓶中，用同样方法培养，得到该氧化细菌的二次种子培养物。
将含有CSL2.0%，干酵母0.5%，硫酸铵0.3%，硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)0.05%，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.01%，碳酸钙(Super ＃ 1700，日本Maruo Calcium K.K.生产)5%及L-山梨糖12.5%(分别灭菌)的发酵培养基(25毫升)置于一只200毫升锥形瓶中，120℃下高压灭菌20分钟，将以表5所示用量单独灭菌的三氯化铈(CeCl3·7H2O)加入该锥形瓶，用上述二次种子培养物(1.25毫升)和例5中得到的混合用的该微生物的种子培养物(0.1毫升)接种。
30℃下摇荡培养3天得到的发酵液中所含2-酮基-L-古洛糖酸的量(毫克/毫升)示于表5。
表5三氯化铈加入量(%)2-酮基-L-古洛糖酸产生量0105.3(78.2%)0.002116.3(86.3%)0.01119.7(88.9%)0.05118.2(87.8%)括号中数据为产率。
例8按例7中描述的同样方法培养得到该氧化菌TH14-86菌株的二次种子培养物。将含CSL2.0%，干酵母0.5%，硫酸铵0.3%，硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)0.05%，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.01%，碳酸钙(日本Wako Pure Chemical Industries生产的保证试剂)2.5%和L-山梨糖7.5%(分别灭菌)的发酵培养基(25毫升)，置于一个200毫升锥形瓶中并灭菌。单独灭菌的三氯化铈(CeCl3·7H2O)以表6所示的量加入该锥形瓶，并用上述二次种子培养物(1.25毫升)接种。30℃下摇荡培养3天在发酵液中所得的2-酮基-L-古洛糖酸的量(毫克/毫升)示于表6。
表6三氯化铈加入量(%)2-酮基-L-古洛糖酸产生量030.0(37.1%)0.0000161.2(75.7%)0.000167.1(83.0%)0.00170.7(87.5%)0.0170.6(87.4%)0.170.5(87.2%)括号中数据为产率。
例9按例7中所述的同样方法培养得到氧化细菌TH14-86菌株的二次种子培养物。将含CSL2.0%，干酵母0.5%，硫酸铵0.3%，硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)0.05%，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.1%，碳酸钙(Super ＃ 1700)5.0%，L-山梨糖12.0%(分别灭菌)的发酵培养基(25毫升)，及表7中所示量的添加物置于一个200毫升锥形瓶中并灭菌。用上述二次种子培养物(1毫升)接种于该锥形瓶，30℃下摇荡培养2天，所得培养物中产生的2-酮基-L-古洛糖酸的量(毫克/毫升)用高效液相层析测定，结果示于表7，未加添加物所得的结果也示于表7。
表7添加物加入量2-酮基-L-古洛糖酸(%)产量未加085.1(65.8%)三氯化镧(LaCl3·7H2O) 0.005 105.4(81.5%)三氯化钕(NdCl3·6H2O) 0.005 105.4(81.5%)三氯化铈(CeCl3·7H2O) 0.005 105.8(81.8%)三氯化钕(NdCl3·6H2O) 0.005 105.8(81.8%)三氯化钬(HoCl3·6H2O) 0.005 105.8(81.8%)镧(1)(块) 0.005 102.9(79.6%)钕(2)(金属) 0.005 99.4(79.6%)粗的稀土元素氯化物(3)0.005 103.6(80.1%)混合的稀土元素氯化物(4)0.005 101.9(78.8%)注(1)和(2)由日本WakoPureChemicalIndustries生产;
(3)粗稀土元素氯化物(日本MitsubishiKaseiK.K.生产，含稀土元素铈(18.3%)，镧(10.0%)，钕(7.1%)和镨(2.0%))。
(4)混合稀土元素氧化物(日本Santoku Kinzoku Kogyo K.K.生产，组成为三氧化二镧29.5%，二氧化铈50.0%，氧化镨(Pr6O11)4.9%，三氧化二钕16.0%，三氧化二钐不超过0.03%)。
括号中数据为产率。
权利要求
1.一种生产2-酮基-L-古洛糖酸的方法，包括培养一种属于假葡糖杆菌属的微生物，其能在有L-山梨糖存在的加有某种稀土元素的培养基中将L-山梨糖氧化成2-酮基-L-古洛糖酸。
2.权利要求1所述的方法，其中稀土元素为下列元素中的一种钪、钇、镧、铈、镨、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱和镥。
3.权利要求1所述的方法，其中一种或多种该稀土元素以金属粉，金属块，氯化物，碳酸盐，硫酸盐，硝酸盐，氧化物和草酸盐的形式加入。
4.权利要求1所述的方法，其中稀土元素以0.000001到0.1%(W/V)的量加入，基于培养基体积定。
5.权利要求4所述的方法，其中加入量为0.0001至0.05%(W/V)。
6.权利要求1所述的方法，其中微生物是酮基氧化假葡糖杆菌。
7.权利要求6所述的方法，其中微生物是酮基氧化假葡糖杆菌K591s(FERM BP-1130;CCTCC86-121)，12-5(FERM BP-1129;CCTCC86-122)，TH14-86(FERM BP-1128;CCTCC86-123)，12-15(FERM BP-1132;CCTCC86-124)，12-4(FERM BP-1131;CCTCC86-125)或22-3(FERM BP-1133;CCTCC86-126)。
全文摘要
一种生产2-酮基-L-古洛糖酸的改进方法，包括培养一种属于假葡糖杆菌属的微生物，该微生物能在有L-山梨糖存在下，并加有一种稀土元素的培养基中，将L-山梨糖氧化成2-酮基-L-古洛糖酸。
文档编号C12N1/38GK1030789SQ8810367
公开日1989年2月1日 申请日期1988年6月18日 优先权日1987年6月19日
发明者野上昱雄, 山口高正, 冈正秀, 白藤英夫 申请人:武田药品工业株式会社