专利名称：1-去氧麦诺吉利霉素的制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及作为α-甘露糖苷酶的强力的抑制剂的1-去氧麦诺吉利霉菌素的制法。
更为详尽地叙述，本发明涉及一种1-去氧麦诺吉利霉素制法，其特征在于，将属于链霉菌属的具有产生1-去氧麦诺吉利霉素能力的微生物在培养基中培养，并从由此而得到的培养液中收集用一般式[Ⅰ]表示的1-去氧麦诺吉利霉素。
由于1-去氧麦诺吉利霉素对糖蛋白生物合成产生影响，抑制、糖链过程，因此，被期待作为免疫调节剂。此外，又由于将成为具有同样作用的1-去氧麦诺吉利霉素的N取代衍生物或施旺索宁(swainsonine)，及其衍生物的合成原料，人们可期望它的有用性。
1-去氧麦诺吉利霉素为公知的化合物，关于其从豆类中分离的方法(J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1979，977)及用合成制得的方法(CarbohydrateResearch164(1987)141-148)等已经为人们所了解。
由上述的方法来取得本发明的化合物，存在收率差及经过步骤太多等许多经济上不利的方面。本发明的发明者们以解决这些问题为目的反复进行了种种研究。
本发明的发明者们，对依据发酵法的1-去氧麦诺吉利霉素的制造法广泛而持续地进行研究，结果发现链霉菌属的微生物能产生1-去氧麦诺吉利霉素这一事实，从而完成了本发明。
作为本发明涉及的微生物的代表，可以举出本发明者们在札幌市内土壤中分离的链霉菌灰紫色菌(lavendulae)SEN-158(以下称为SEN-158株)菌株。
SEN-158株，在工业技术院微生物工业技术研究所中以微工研菌寄第4301号(FERMP-4301)被保藏，关于其菌学性质，已为特开昭54-084094号公报所记载。此外，还委托美国典型培养物保藏中心以ATCC31434号保藏。
即使是SEN-158株以外的属于链霉菌属的其它菌株，只要产生1-去氧麦诺吉利霉素本发明也都可使用。此外，对这些菌株因用紫外线，或者Co60等进行照射处理，或用氮芥、偶氮丝氨酸、亚硝酸、亚硝基胍，或用2-腺嘌呤等变异诱发剂作变异处理，或用形质导入、形质转换或细胞融合等通常采用的变异处理手段而获得的人工突变株、及自然发生的变异株，也适用于本发明。
本发明采用1-去氧麦诺吉利霉素产生菌，可通过通常的放线菌的培养方法进行培养而得以实施。
培养基既可为液体也可为固体，但通常，可采用依靠液体培养基的振荡培养或进行通气搅拌培养。
培养基只要适合放线菌的生长，并可产生1-去氧麦诺吉利霉素，无论何种均可适用。
作为炭源，葡萄糖、半乳糖、甘露糖醇、蔗糖、麦芽糖、甘油、糊精、淀粉等可以采用。
作为氮源，大豆粉、蛋白胨、酵母抽提物、肉类抽提物、(コ-ソ·スティ-プ·リカ-)、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、尿素等可以采用。
此外，适量地加入氯化钠、氯化钾、炭酸钙、各种磷酸盐可以得到良好的结果。另外，也可以再加入适量的铁、镁等。
必要时可加入促进使用菌生长或1-去氧麦诺吉利霉素产生的有机物、无机物、维生素类等。
除此之外，如发酵过程中发泡显著，可以适量地加入消泡剂。
培养基的pH值、培养温度等培养条件可在1-去氧麦诺吉利霉素产生的范围内作适当地变动，但例如，在液体振荡或通气搅拌培养的情鱿拢琾H为6-9、培养温度在20-35℃左右为宜，以25-30℃为佳。
培养时间随培养规模及其它条件而异，通常2-20天已足够。
培养后将菌体分离，从所得培养液中提纯目的物，并进行精制。要将本发明物质从培养液中提纯并精制，可以使用通常将微生物代谢产物从其培养液中提纯并精制时所采用的方法。
例如，可以单独地采纳用各种吸附剂(例如，硅胶、氧化铝、活性炭、离子交换树脂等)进行的脱吸附层析法、分配层析法等，或者经适宜地组合后使用。
在本发明的实施中，在放线菌培养液里有结构式[Ⅱ]表示的莫拉诺灵(モラノリン)与本发明物质共存的情况较多。
在此情况下，既可以用前述的差示方法将本发明物质提出，在本发明物质与莫拉诺灵(モラノリン)混合的状态下，施加不与莫拉诺灵(モラノリン)反应而仅与本发明物质反应的化学处理，使之转化为衍生物，用溶剂萃取等方法而仅仅将本发明的物质以衍生物的形式分离，随后施加适当的化学处理，取得本发明物质。
例如，在本发明物质与莫拉诺灵(モラノリン)混合状态下，将之转化为N-叔-丁氧基羰基衍生物、或N-苯衍生物，随后，再转化为2，3-异丙叉衍生物，因为莫拉诺灵(モラノリン)不会成为异丙叉衍生物，而本发明物质单独成为异丙叉衍生物故可在它们的混合状态用氯仿及水进行分配，结果仅本发明物质的N-叔丁氧基羰基-2，3-异丙叉衍生物被分配于氯仿中。随后，将此保护基除去，而能单独地得到本发明的目的物。
实施例以下举出本发明的实施例，以对本发明作更为详细的说明。
实施例1在500ml容量的迈耶(マィャ-)中，加入培养基(可溶性淀粉8%、大豆粉1%、酵母抽提物1%、氯化钾10.05%、硫酸镁0.05%、氯化钠0.5%、硝酸钠0.2%、pH7.2)100ml，进行了灭菌。将SEN-158株(数白金耳)接种于其中，在27℃振荡培养三天，得到种培养液。将此种培养液300ml(接种入30l容量的盛有15l发酵培养基(与种培养基同一组成的培养基)的发酵罐中，27℃下通气搅拌培养11天。
消泡剂采用日产(ディスホ-ム)CB-442，通气量为20升/分钟，搅拌速度为300rpm。
将所得的培养液12.9升在9000rpm进行20分钟离心分离，使得到的上清液通过强酸性离子交换树脂(ダウエックス)50W×2(H+)(11)柱，经充分水洗后，用1N氨水进行洗脱。
在减压下浓缩洗脱液，使之通过强碱性离子交换树脂(ダイァイオソ)SA-11A(OH-)(500ml)，并用水洗。合并流过液和洗液，减压浓缩，再次使之通过(ダウエックス)50W×2(H+)(300ml)柱，水洗后，用0.5N氨水洗脱。
将含有目的物的组分减压浓缩干固，并用甲醇溶解。对此以葡聚糖LH-20柱(200ml)，用甲醇进行层析。将含目的物的组分减压浓缩使之干固，残留物用甲醇加温溶解，静置，收集生成的结晶。从甲醇再结晶，得到1-去氧麦诺吉利霉素结晶140mg。
熔点187-188℃。
元素分析值(C6H13NO4)计算值(%)C44.16H8.03N8.58实测值(%)C44.17H8.08N8.63比旋光度[α]24D＝-45.49°(C＝1.02水)1-去氧麦诺吉利霉素的盐酸盐13C-NMRppm;(D2O，内部标准;甲醇49.8ppm)48.458.961.266.566.773.21H-NMRppm;(D2O，内部标准;DSS)2.87(1H，m)，3.04(1H，dd，J＝1.0，15Hz)，3.25(1H，dd，J＝3.0，15Hz)，3.60-3.95(4H，m)，4.14(1H，m)实施例2使含莫拉诺灵和1-去氧麦诺吉利霉素的培养液11通过强酸性离子交换树脂(ダウエックス)50W×2(H+)(100ml)柱，充分水洗后用0.5N氨水洗脱。减压蒸馏除去溶剂后，用水溶解，使之通过强碱性离子交换树脂(ダィァィォン)SA-11A(OH-)(100ml)，用水充分洗脱。减压蒸馏除去溶剂后，溶解于2ml水中，加入三乙胺(3.2ml)(及预先溶于2ml二噁烷的2-叔丁氧基羰基-4，6-二甲基嘧啶23.2g，在60℃下使之彻夜反应。
反应液经冷冻干燥除去二噁烷，将获得的糖浆状物供给硅胶层析柱(ワコ-ゲル)C-200，溶出液;a100∶1，b50∶1，c20∶1;甲叉氯∶甲醇)，从洗脱液中得到莫拉诺灵的N-Boc衍生物与1-去氧麦诺吉利霉素的N-Boc衍生物的混合物。
减压蒸馏去除溶剂，溶于10ml甲醇，加入干燥丙酮200ml，再加入无水氯化亚铁2g，室温下使之反应2天。
在其中加入10%碳酸钾水溶液，将反应液pH调整为7-8后，加入100ml水，用氯仿萃取。
收集氯仿层，减压下蒸馏除去溶剂后，溶解于40ml甲醇中，加入1N盐酸20ml，回流5小时。蒸馏去除甲醇后，使之通过(ダィァイオソ)SA-11A(OH-)(100ml)，并充分水洗。合并流过液与洗液，使之通过(ダウエックス)50W×2(H+)(100ml)柱，充分用水洗后，用0.5N氨水洗脱，减压下蒸馏去除溶剂，用甲醇进行重结晶，得到1-去氧麦诺吉利霉素0.5g。
权利要求
1.一种1-去氧麦诺吉利霉素(1-デオキシマンノジリマイシン)的制法，其特征在于，该制法包括在培养基中培养属于链霉菌属的有产生1-去氧麦诺吉利霉素能力的微生物；并从得到的培养液中取得1-去氧麦诺吉利霉素。
全文摘要
本发明涉及一种1-去氧麦诺吉利霉素制法，其特征在于，将属于链霉菌属的具有产生1-去氧麦诺吉利霉素能力的微生物在培养基中培养，并从培养基中收集由此得到的用一般式(I)表示的1-去氧麦诺吉利霉素。
文档编号C12P17/12GK1033395SQ8810823
公开日1989年6月14日 申请日期1988年11月28日 优先权日1987年11月28日
发明者杉山信, 江连洋治, 小岛信敏, 今野请隆, 濑户隆志, 中村辉也, 井东学 申请人:日本新药株式会社