专利名称：谷氨酸产生菌t6-13溶源性的测定的制作方法
技术领域：
本发明属于仪器发酵技术。
在味精生产中，一个重要的威协是遇到噬菌体的感染，给生产造成相当严重的损失。防止噬菌体的关键，是测定产生菌是否溶源性，具溶源性的菌种在发酵中有很多因素，如发酵培养基、通气搅拌以及不正确的PH控制，皆能引起溶源噬菌体的释放。
在味精发酵生产过程中，关于溶源噬菌体的释放特点，发生的条件以及如何检查产生菌是否溶源性，尚未被生产厂家所了解及掌握，因此不易达到正常生产。如周显兰在1987年《发酵科技通讯》第一期中“溶源性噬菌体的探讨”一文提到“……1983年曾有一段时间，发酵上出现了一些很象烈性噬菌体造成的‘三高一低’现象，但用通常的平板检查又没出现噬菌斑的现象，我们做了一些实验之后，认为这些现象有可能是溶源性噬菌体在发酵上的表现。……目前在我国溶源性噬菌体(溶源菌)的问题还是一个崭新的研究课题”。周显兰的报告，是我国各味精生产厂家普遍用于生产的菌种，天津短杆菌T6-13(此菌种对钝齿棒状杆菌AS.1.542专一性很强的噬菌体也敏感，关于此菌的分类有待探讨)在发酵中释放溶源噬菌体的某些表现的报告，但是该文对所产生的现象推测是溶源噬菌体引起的，由于原因不能明确加以肯定，对生产不能起指导作用。
我国味精生产的几个菌种是否溶源菌，只有杭州味精厂分离的钝齿棒状杆菌HU7251变株B-9(CorynebacteriumCrenatumHU7251VarB-9)，于1979年翁绳周等作过报告(厦门大学学报(自然科学版)，18(1979)158-159)。检查这一溶源菌，作者等是用土壤中分离的尚未定名的棒状杆菌(CorynebacteriumSP)为测定的指示菌，自B-9菌株诱导出来的噬菌体在此指示菌上可形成噬斑，但不能传代，所以不能做进一步的研究，关于B-9菌株，在生产上也证明是溶源菌，许多厂家皆放弃使用这菌株了。
Momose，H.等公开的是乳糖短杆菌为对象，以紫外线方法诱导溶源噬菌体(J.Gen.Appl.Microbiol.，22(1976)119-129)。
Shapiro，J.A.的工作主要也是短杆菌，其指示菌系统不适用于我国普遍用于生产的菌种。
本发明的目的是测定现在国内味精生产上的菌种天津短杆菌T6-13的溶源性，以避免味精生产中产生菌发生噬菌体感染所造成的损失。
其测定的方法是用诱变剂诱导溶源噬菌体，再用敏感的指示菌测定噬菌体释放特性。诱变剂为丝裂霉素C，浓度控制在0.8～2.0r/ml。指示菌可用天津短杆菌T6-13或是杭州味精厂的钝齿棒状杆菌HU7251经氯化锂处理后选育在生产上使用的变株B-9。
本发明的具体方法是将待测的菌株经培养后加入诱变剂丝裂霉素C，再继续培养并将诱导后的菌体收集起来种入新鲜营养肉汤中培养，取其上清液与上述指示菌经过培养即可得可传代的噬斑。
诱变剂丝裂霉素C的浓度控制在0.8～2.0r/ml。
待测菌株的培养可接种于普通营养肉汤中常温培养过夜，取此菌液以1%接种量接入新鲜营养肉汤培养基中，培养至对数期。
诱导后收集起来的菌体其培养时间最好为8～12小时。制成双层平板后的培养时间最好为12～24小时。
味精生产是我国食品发酵工业中的一个重要行业。本发明解决了久已需要检查的国内味精生产的各厂家所使用的菌种是否溶源性问题。解决这问题，才有可能培育一个无溶源的菌株在生产上应用，避免经常发生噬菌体感染，使生产受到损失。另外知道了生产菌种是否溶源菌，就能分析在发酵罐中发生不正常现象的特征，也能指导如何掌握避免溶源噬菌体释放的工艺控制条件。不同厂家来源的T6-13菌株，对诱导释放溶源噬菌体的特性不一，有的菌株较易释放噬菌体，有的菌株不易释放噬菌体，这特性在生产上也能同样的表现，如某厂的生产菌种，经测定很易释放噬菌体，在生产上于二级罐就常有噬菌体出现。而另一比较不易诱导释放噬菌体者，在二级罐中从不表现，而在发酵罐中表现，同时发生噬菌体感染的情况也比较少。这就提出，工厂中选用菌种必须注意选择。应用本发明就能够分离谷氨酸产生菌的溶源噬菌体，这种噬菌体有许多方面可以开发利用，如产生菌的遗传学研究以及作为菌种改良的遗传载体等等。由此可见，本发明为工业生产提供一种有效的测定方法。
实施例根据味精生产厂家提供的谷氨酸产生菌天津短杆菌T6-13置于肉汤中常温培养过夜，取培养液接于新鲜肉汤培养基中培养至对数期。加入诱变剂丝裂霉素C。(其浓度见表1)，继续培养约一小时后离心处理，取其沉淀的菌体接入与原培养相同体积的新鲜培养基中培养8-12小时，最后取其上清液与指示菌制成双层平板，即可显示如表1的结果。
显然，诱导后培养的培养基的PH值和二价阳离子如Ca++等对诱导形成有活性的噬菌体和噬斑的数量有关。不同PH值对形成噬斑的比较结果如表2所示，其中诱变剂采用丝裂霉素C，浓度为1.0r/ml。
不同钙离子浓度对形成噬斑的比较结果如表3所示，其中诱变剂及其浓度与表2相同。
表1天津短杆菌T6-13噬菌体释放实验丝裂霉素C的浓度 0.8 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0T6-13(1)有有有有有无噬菌体释放T6-13(2)无无无无有有T6-13(3) 无无 无有 有有表2不同PH值形成的噬班量比较PH 值 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6菌T6-13(1)--+++++株 T6-13(2) - - - ++ -表3不同钙离子浓度形成的噬班量比较钙高子浓度 mM 3 30 50 100菌T6-13(1)--+++++株 T6-13(2) - - - ++
权利要求
1.一种测定谷氨酸产生菌T6-13溶源性的方法，用诱变剂将产生菌中溶源噬菌体诱导出来，再用指示菌测定噬菌体的释放特性，本发明的特征在于将待测的菌株经培养后加入诱变剂丝裂霉素C，经第二次培养后将诱导后的菌体收集起来继续培养，取其上清液与指示菌经培养至获得可传代的噬斑，所说的指示菌可用天津短杆菌T6-13或变株B-9，所说的诱变剂丝裂霉素C的浓度控制在0.8～2.0r/ml。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于待测菌株的第一次培养可接种于普通营养肉汤中常温培养过夜，取此菌液以1%接种量接入新鲜营养肉汤培养基中，培养至对数期。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于诱导后收集起来的菌体其培养时间最好为8～12小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于与指示菌一起的培养时间最好为12～24小时。
全文摘要
谷氨酸(味精)产生菌溶源性的测定，属于食品发酵技术。本发明提出测定目前国内味精生产上常用菌种天津短杆菌T6—13溶源性的一种方法，它采用诱变剂丝裂霉素C诱导产生菌中的溶源噬菌体，再用敏感的指示菌测定噬菌体的释放特性。味精生产是食品发酵工业中的重要行业，由于生产上常感染噬菌体，给生产造成重大的损失。本发明解决味精生产中噬菌体发生的原因和途径，为工业生产提供有效的测定方法。
文档编号C12N1/20GK1039443SQ8910622
公开日1990年2月7日 申请日期1989年7月23日 优先权日1989年7月23日
发明者翁绳周, 吴宗伟 申请人:厦门大学