专利名称：胃动素样多肽的制备及表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备胃动素样多肽、有关的重组DNA及插入了重组ONA的质粒的方法。
此多肽可用作药剂，特别是用于医治胃肠病。
胃动素是一种肽激素，最早由BrownJ.C.等从猪的上部小肠粘膜分离到，并测得其氨基酸顺序〔“Gastroenterology”Vol.62，pages401-404(1972)和“Can.J.Biochem.”Vol.52，pages7-10(1974)〕。猪的胃动素由22个氨基酸组成，分子量约为2700。
而本发明的发明者已成功地分离出编码人胃动素前体的克隆CDNA，其核酸序列中有一段编码3与猪胃动素相同的氨基酸序列。因此，显然，人与猪的胃动素具有相同的氨基酸序列〔Jap.Pat.No.Sho63-276489(A)，相应于UnitedstatesPat.Appln.Ser.No.07/190849以及EUropeanPat.Appln.No.88107108.8〕。
作为胃动素的生理作用，已知其对消化道的高促动作用和对胃十二指肠、结肠平滑肌的收缩作用。作为高促动作用，有报导胃排空时间被缩短〔“Gastroenterology”Vol.80，pages456-460(1981)〕;作为对消化道平滑肌的收缩作用，已知胃动素能独立于神经系统对兔和人的胃十二指肠显示很强的收缩作用。而且，没有关于特别的付作用的报导。故可考虑将胃动素用作治疗术后发生的胃肠道疾病及其诊断。与此相关，请注意，前列腺素被广泛用于胃肠病的治疗，而此药物治疗显示相当强的付作用。
还有报导，化学合成的胃动素类似物-13位上的蛋氨酸被亮氨酸或正亮氨酸取代，具有与纯天然猪胃动素同样的生物活性〔“Scand.J.Gastroenterology”Vol.11，pages119-203(1976)等〕。据此认为，13位上的蛋氨酸对胃动素的活性几乎没有什么影响。
按广泛接受的工艺方法，胃动素从猪的器官组织中抽提而得，此法很难得到大量胃动素。由于胃动素是由22个氨基酸组成的多肽，即使用化学合成法，也很难大批量生产。换句话说，尽管期望它成为有效的胃肠病治疗剂，但由于产量低，胃动素实际上并未用于临床。
因此，有各种各样的实验研究，借所谓“生物技术”来制备具有胃动素样活性，且价格合理的多肽〔Jap.Pat.Nos.63-71195(A)and1-102096(A)〕。
本发明的基本目的在于提供一个制备胃动素样多肽的方法，它比此发明之前的所有方法更为简单易行。
本发明另一个而且是更重要的目标是提供一个极为高效的胃动素样多肽制备法。
本发明的另一个目的是为实施这一方法提供一新的重组DNA。
本发明的再一个目的是提供一表达质粒，重组DNA插于其中。
根据本发明，借助一制备式(1)中胃动素样多肽的方法，即可达到上述的基本目标，Phe-Val-Pro-lle-Phe-Thr-Gly-Glu-Leu-Gln-Alg-X-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly-Gln式(Ⅰ)其中X是一除蛋氨酸和天冬氨酸以外的氨基酸残基。
这一制备方法包括合成一含有至少6个不带电的极性氨基酸残基，且未端为蛋氨酸的单链DNA、它的互补单链DNA，一编码(1)式氨基酸序列的单链DNA、它的互补单链DNA;用所得的四条单链合成双链DNA，以编码不带电、极性氨基酸残基的DNA片段及其互补链作前导序列;在每一所得的双链DNA未端加特异性限制酶识别位点;以所述限制酶裂解一具有另一蛋白遗传信息的质粒;将上述双链DNA片段接于裂解质粒的每一切点上，以重建一含重组DNA的质粒;用重建质粒转化一微生物;培养所得转化菌株，生产作为嵌合蛋白的一部分的、具有式(1)所示氨基酸顺序的多肽;破细胞，用溴化氰和肽链内切酶处理，分离(1)式多肽;分步纯化多肽。
13位上标为X的氨基酸残基之所以申明不能是蛋氨酸和天冬氨酸其原因在于如果X是蛋氨酸，则不能得到具有胃动素样活性的所需多肽，因为，当用溴化氰处理嵌合蛋白时，13位上的蛋氨酸将发生裂解;如果X是天冬氨酸，也不能得到所需的多肽，在用肽链内切酶处理时，13位的天冬氨酸也将裂解。肽链内切酶是用来除去多余的氨基酸残基的，其因在于为了合成的方便，相应于式(1)所示多肽的单链DNA是分别合成的，它有一编码天冬氨酸的密码子(GAC)，此天冬氨酸位于氨基酸序列C未端的Lys-Gly-Glu后。依发明所述方法所得的每一多肽皆具胃动素样生物活性，其活性水平因记号X所表示的氨基酸残基的不同而异。作为13位上的氨基酸残基X，以亮氨酸、缬氨酸及诸如此类的氨基酸为好。13位上的氨基酸残基是甘氨酸或脯氨酸的多肽不尽人意，因为，以空间结构推测，它们显示较低的活性。已经发现，天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸和丝氨酸可作为合适的不带电、极性氨基酸。因为，具有这些氨基酸残基的多肽，表达效率增高。前导序列的未端氨基酸是蛋氨酸的原因在于前导序列可容易地用溴化氰处理除去。根据本发明中的方法，式(1)所示的单链DNA可分别合成，以使合成易行。
可将合成的、在13位上被取代了的、具有胃动素基因的双链DNA分子用传统方法插入诸如质粒等载体中。例如，从大肠杆菌中取质粒，纯化之，用限制酶在特异位点酶切。用DNA连接酶把双链DNA接于所切质粒的裂解位点上，重建一含重组DNA的质粒。进一步，根据本发明，可制备两个或多个13取代胃动素样基因串联插入了的质粒，方法是用两种限制酶处理一插入了13取代胃动素样基因的质粒，在13取代胃动素样基因上游处和质粒上的另一处酶切，得一片段;另一含重组DNA的同种质粒，用在内部切第一个质粒相同的限制酶处理，并用另一酶处理，该酶使13取代胃动素基因的下游处与前述上游处有相同的裂点。用DNA连接酶以串联形式将所收集的片段在切点处相接，重建一质粒。如果需要，重复此过程。在此情况中，13取代胃动素基因间最好与肽基因相连，如那些由天冬氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸组成的肽，因为，在用溴化氰从嵌合蛋白中分离出13取代胃动素样多肽时，蛋氨酸位点将发生裂解，而在用肽链内切酶(Asp-N)处理所得产物时，N未端的天冬氨酸也会发生裂解，于是便可得到不含多余肽残基的13-位取代胃动素样多肽。
用插入了一个或几个胃动素样基因的质粒转化一微生物或真核细胞，培养此微生物或真核细胞，可大量生产胃动素样多肽。
由上可清楚看到，根据本发明的重组DNA其特征在于至少含6个不带电的极性氨基酸残基的前导多肽，在其C端与蛋氨酸相连，再在蛋氨酸后与13取代胃动素相连，胃动素13位上的氨基酸残基不能是蛋氨酸和天冬氨酸。在此情况中，相应于13取代胃动素的多肽，最好有复数个并以串联形式连接，而且每一13取代胃动素多肽间以具有天冬氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸序列的肽相连。
根据本发明的表达质粒其特征在于，上述重组DNA是插于其中的。
图1是一个说明，表明了制备含重组DNA的质粒的步骤，质粒中插入了一个胃动素基团。
图2是与图1相似的说明;但质粒中以串联形式插入了两个胃动素样基因。
图3是一图，显示了用Magnus法测按本发明的方法所得的13-亮氨酸-胃动素(以下称〔亮氨酸13〕-胃动素)、和按传统方法所得纯胃动素的消化道收缩活性，所得的结果。
现在，参照实例进一步在药理活性上说明本发明。下面的例子涉及一胃动素样多肽的制备方法，胃动素13位上的蛋氨酸被亮氨酸取代。但请注意，13位上氨基酸残基不为蛋氨酸和天冬氨酸的其它13-取代胃动素样多肽，都可用与例中类似的方法制备。
实施例(1)合成编码具胃动素样药理活性的多肽的DNA。
已知人的胃动素有以下氨基酸序列
5101315Phe-Val-Pro-lle-Phe-Thr-Gly-Glu-Leu-Gln-Arg-Met-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly-Gln并且已知13位上的蛋氨酸对胃动素的活性几乎没有影响。
由此，下面式(2)所示的双链DNA片断包含了编码〔亮氨酸13〕-胃动素氨基酸序列的核酸序列;编码由一些不带电的极性氨基酸残基(蛋氨酸-苏氨酸-蛋氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺-天冬酰胺-谷氨酰胺-天冬酰胺-谷氨酰胺-天冬酰胺-谷氨酰胺-天冬酰胺-谷氨酰胺-天冬酰胺-谷氨酰胺-异亮氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸)组成的前导肽序列的核酸序列，此前导肽的编码核酸经蛋氨酸接于〔亮氨酸13〕-胃动素的编码核酸的N端;以及编码氨基酸序列(天冬氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-亮氨酸)的核酸序列，这最后一个核酸序列，是接在〔亮氨酸13〕-胃动素的编码核酸的C末端上的。
式(2)5′AATTCATGACCATGATTACGAACTCAAACCAAAACCAAAACCAAAACCAAACCA3′GTACTGGTACTAATGCTTGAGTTTGGTTTTGGTTTTGGTTTTGGTTTTGGAAACCAGTCTTCATGTTCGTTCCGATCTTCACCTACGGCGAACTGCAGCGTCTTTTTGGTCTAGAAGTACAAGCAAGGCTAGAAGTGGATGCCGCTTGACGTCGAGGCAAGAAAAAGAGCGCAACAAAGGCCAGGACGGGATCCTTGTGATAACGTTCTTTTTCTCGCGTTGTTTCCGGTCCTGCCCTAGGACACTATTCGA
式(2)所示的双链DNA的合成如下所述。
首先，用来自Pharmacia，瑞典，商品名为GeneAsembteu的DNA合成系统合成具有下列核酸序列的六条单链DNA。其中，DNA(3)与(8)、(4)与(7)、以及(5)与(6)，互为互补链，末端例外。
式(3)5′-AATTCATGACCATGATTACGAACTCAAACCAAAACCAAAACCAAAACCAAAACCAAAACCA式(4)5′-GATCTTCATGTTCGTTCCGATCTTCACCTACGGCGAACTGCAG式(5)5′-CGTCTGCAAGAAAAAGAGCGCAACAAAGGCCAGGACGGGATCCTGTGATA式(6)5′-AGCTTATCACAGGATCCCGTCCTGGCCTTTGTTGGGCTCTTTTTCTTG式(7)5′-CAGACGCTGCAGTTCGCCGTAGGTGAAGATCGGAACGAACATGAA式(8)5′-GATCTGGTTTTGGTTTTGGTTTTGGTTTTGGTTTTGGTTTGAGTTCGTAATCATGGTCATG用多聚核苷酸激酶处理(3)-(8)式所示的每一单链DNA，使其5′末端磷酸化。然后使(3)与(8)、(4)与(7)以及(5)与(6)的每对互补DNA退火，制备三个双链DNA。所得的双链DNA用DNA连接酶以串联形式相接，以制备上述(2)式所表示的DNA片段。
(2)将DNA片断插入表达载体。
把按第(1)项中所述方法合成的DNA片断插入表达载体的操作方法将参照图1加以说明。
用限制酶HindⅢ和EcoRⅠ酶切可购到的、用于在大肠杆菌中表达的质粒(-pkk223-3-，由瑞典Pharmacia出售)。在所得质粒片段的端点上用DNA联接酶接上合成的DNA片段，将质粒片段重建成名为pkmol的环形质粒。重建的质粒被设计成能在Tac启动子下游SD-序列的10个残基后启动一蛋白质的合成，因而，如果将质粒插入大肠杆菌，并以异丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)或其类似物培养，就可能产生蛋白。
请注意，重组载体上有限制酶BglⅡ和BamHⅠ的识别位点。
(3)建立有2个或多个〔亮氨酸13〕-胃动素基因的表达质粒。
这点将参照图2加以说明。
首先，用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ处理一按第(2)项中所述方法制得的质粒(pKMO1)，在〔亮氨酸13〕-胃动素基因的上游、以及载体上酶切质粒，得一片段。然后，用限制酶EcoRⅠ和BglⅡ处理另一质粒(pKMO1)，使载体上的切点与第一个质粒上的相同，另一切点在第一质粒的〔亮氨酸13〕-胃动素基因的下游。用DNA连接酶将前述得自第一个质粒的片段接于第二个质粒片段的端点上，以重建一含两个〔亮氨酸13〕-胃动素基因的质粒，我们称之为-pKMO2-。在此情况中，〔亮氨酸13〕-胃动素基因间通过编码氨基酸序列天冬氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-蛋氨酸的基因相连。
请注意，限制酶BamHⅠ形成的切点和限制酶BglⅡ形成的另一切点是用DNA连接酶连接起来的，因此，所得的连接部分即成为两种限制酶均不可识别的位点。于是，通过重复进行前述酶切、连接操作，即可得一重组质粒，它具有任意个数的〔亮氨酸13〕-胃动素基因，以串联方式排列，且基因上游有经蛋氨酸连接的前导多肽序列。
(4)生产含13-亮氨酸-胃动素的嵌合蛋白。
使用一个有插入子为四个串联排列的〔亮氨酸13〕-胃动素基因的质粒(PKMO4)。质粒被大肠杆菌(JM105)摄入，所得转化株用发酵器(D-型，由Able Co.制造)于30℃下在含氨苄青霉素(50μg/ml)的培养基中(例如，加入了0.5%围涎皮氨酸的M9培养基)通气培养。当AC60变为0.6～0.8时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，使之终浓度为1.5mM。
随后，继续培养16小时以上，并离心(8000rpm，4℃，5分钟)收集细胞。取部分细胞用SDS聚丙烯酰胺凝胶(15%)电泳分析，发现所要的嵌合蛋白占总蛋白的30%。推测，这一良好的结果是由于插在质粒中的合成DNA中的前导多肽序列极为有效地加速了包涵体的形成，这些包涵体对蛋白酶极其稳定。
(5)〔亮氨酸13〕-胃动素的分离和纯化将第(4)项所述方法得到的细胞团(100ml)悬浮在300ml 10mM的PBS-EDTA(pH8.0)中，超声处理悬液以破碎细胞，细胞残渣通过离心处理(18000rpm，30分钟)使之沉淀，所得沉淀中包含了具有前导多肽和〔亮氨酸13〕-胃动素四聚体的合蛋白。
因此，将碎片(蛋白量约100mg)溶于30ml7%的甲酸中。向溶液里加入30mg溴化氰，在低于37℃的条件下反应一夜。随后，加入(200ml)蒸馏水，并冷冻干燥除去甲酸和溴化氰。所得干粉溶于0.1%的三氟乙酸中，并除去不溶物。所得溶液在下面条件下进行高压液相层析。
柱MicropondasphereC-18(3.9mm×15cm，WatersCo制造)流速0.8ml/min洗脱溶解在0.1%三氟乙酸中的乙酰亚硝酸的线性浓度梯度为从5%到70%(40min)分段收集高压液相层析所得主峰部分，冷冻干燥之。取一部分干粉(100μg)溶于50mM磷酸缓冲液中(pH8.0，100μl)，向其中加入0.1μg蛋白内切酶Asp-N(西德Behringer Manheim GmbH售)后，溶液在37℃下反应16小时以上。反应液在前述条件下进行高压液相层析，得到作为主峰成份的所需〔亮氨酸13〕-胃动素。
这一〔亮氨酸13〕-胃动素的核酸序列以Bio-System Co.售的肽序列仪进行检测发现它的序列是正确的。
通过上述过程发现，培养1升大肠杆菌可得到400～500mg所需的胃动素样多肽。
生物活性试验(测定肠道收缩活性)按Magnus法，用兔十二指肠测试验样品和对照样品的肠道收缩活性〔“J.Pharm.Pharmac.”Vol.28，pages650-651(1976)〕，以例中所得的〔亮氨酸13〕-胃动素作为待测样品，以传统提取方法所得的纯胃动素作为对照样品。结果如图3所示。
从图中清楚地看到，已证实，当把乙酰胆碱(10-6M)引起的收缩定为100%时，由本发明中的方法所得的〔亮氨酸13〕-胃动素具有与纯胃动素相同的肠道收缩活性。
权利要求
1.制备式(1)胃动素样多肽的方法，Phe-Val-Pro-lle-Phr-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Gln-Alg-X-Gln-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly-Gln式(I)其中X是除蛋氨酸和天冬氨酸之外的氨基酸残基。这一方法包括合成一含有至少6个不带电的极性氨基酸残基，且末端为蛋氨酸的单链DNA、它的互补单链DNA、一编码(1)式氨基酸序列的单链DNA、它的互补单链DNA；用所得的四条单链DNA合成双链DNA，以编码不带电的极性氨基酸残基的DNA片断及其互补片段作为前导序列；在每一所得双链DNA片段的末端加上特异性限制酶的识别位点；用所述限制酶裂解一具有其它蛋白遗传信息的质粒；将上述双链DNA片段接于裂解质粒的每一切点上，以重建一含重组DNA的质粒；用重组质粒转化一微生物；培养所得转化菌株，生产作为嵌合蛋白一部分的、具有(1)式所示氨基酸序列的多肽；将微生物破碎，用溴化氰和肽链内切酶处理嵌合蛋白，以分离式(1)所示多肽；分步纯化多肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中不带电的极性氨基酸残基系选自由天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、和丝氨酸组成的一组氨基酸。
3.如权利要求1所述的方法，其中含合成的13-取代胃动素样基因插入子的所述重组质粒被两种限制酶处理，得一质粒片段，此片段是在13-取代胃动样基团的上游处、及质粒上的另一位点处被切下的;另一相同的重组质粒用一与在内部切第一个质粒相同的限制酶处理，并用另一酶处理，该酶使13-取代胃动素样基因的下游与前述上游有相同的切点，得到第二个质粒片段，用DNA连接酶将第二个质粒片断连于第一个质粒片段上，重建一质粒，它含有2个串联排列的13-取代胃动素基因，根据需要重复裂解、连接操作，以插入所需数目的胃动素样基因。
4.制备胃动素样多肽的重组DNA，它必须具有由至少6个不带电的极性氨基酸残基组成的前导多肽序列、至少一个相应于13取代胃动素的多肽，其中13位上的氨基酸残基不能是蛋氨酸和天冬氨酸，后一多肽经蛋氨酸与所述前导肽的下游相连。
5.一制备胃动素样多肽的表达载体，其中重组DNA插于其中，此DNA必须包含由至少6个不带电的极性氨基酸残基组成的前导多肽序列、至少一个相应于13取代胃动素的多肽，其中13位上的氨基酸残基不能是蛋氨酸和天冬氨酸，后一多肽经蛋氨酸与所述前导肽的下游相连。
全文摘要
胃动素样多肽、有关的重组DNA及插入了重组DNA的质粒的制备方法。
文档编号C12N15/16GK1040822SQ8910650
公开日1990年3月28日 申请日期1989年8月23日 优先权日1988年8月24日
发明者黑野昌庸, 三谷隆彦, 高桥治雄, 田中健一, 藤村克也, 泽井喜一 申请人:株式会社三和化学研究所