专利名称：新型作物增产菌的筛选和生产方法
技术领域：
本发明属于作物增产菌的筛选和生产方法，特别是芽孢杆菌的选育及发酵工艺。
现有的防病增产措施远不能适应人类社会及人类文明高速发展进步对作物高产的要求，因为增施化肥以及单纯依靠抗病品种和化学农药几大防病增产措施，带来了环境污染、品种抗性丧失及高投入、高能耗的弊病。为克服上述弊病，国内、外科学工作者，在利用各种各样微生物资源方面给予高度关注。较早的研究有菌肥、拮抗菌的利用，促生菌的利用，但这些研究仍属于土壤微生物的范畴，没有报道说明它与植物体有着紧密的有机联系。
本发明的发明人，根据多年的研究，并综合前人有关研究，提出了“植物体自然生态系”理论，这个理论对植物体进行了新的认识、分析和理论总结，指出植物体并非个体，而是与其体内、体表生活的无数微生物共同组成的共生复合体，是一个自然生态系。其体内体表生活的微生物由于长期进化的结果与植物体形成了相互依存、相互制约的关系，其中有些微生物对作物的生长发育、增产、改进品质有促进作用，将它们筛选出来再用到植物体上。由于它们为作物体表体内菌，因此能与植物体共存亡，只要植物能长就能发挥作用，这就是“作物增产菌”。
作物增产菌的筛选理论是植物体(如一棵水稻，一株大豆)不是一个个体，其体表、体内生活着大量的微生物，有特定的微生物群落。发明人曾经从作物根、茎、叶、花、种子、果实、块根等器官的不同组织部位，分离筛选出作物增产菌(蜡质芽孢杆菌Ba-cillus cereus)(申请号为88106560.9)，这种增产菌优于其他菌剂，它有广泛的适用性，可用于多种作物，可改善作物品质，增强抗逆能力，作物增产幅度平均达10%。
发明人在进一步研究过程中发现，不同类别的作物体内筛选得到的益菌菌株对不同类别的作物增产性有选择性;同种作物体内得到的益菌菌株其增产程度有显著差异，而高效能菌株的获得与分离筛选的取材部位和方式直接相关。
本发明目的是提供新型作物增产菌的选育和生产方法，这种增产菌可使作物的增产幅度进一步提高，抗病害性能好，这些菌种经固体发酵所得成品的含菌量达100亿/克，可降低产品成本。
为达到上述目的，本发明采用以下方法该方法中包括菌种的选育和固体发酵工艺，菌种选育有二种(以代号90-B028，90-B048表示)。
(1)从双子叶植物大豆的主根主茎中分离筛选出地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)(保存于CGMCC)保藏号(No.0154)，在温室内作生物测定(将菌液拌双子叶植物的种子)，并作拮抗性能测定，筛选出的高效能菌株经固体发酵工艺制得成品(代号90-B028)。
(2)从单子叶植物(旱稻)的根系伸长区分离筛选出蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)(保存于CGMCC)，保藏号(No.0155)，在温室内作生物测定(将菌液拌单子叶植物的种子)，并作拮抗性能测定，筛选出的高效能菌株经固体发酵工艺制得成品(代号90-B048)。
90-B028分离方法将采集的不同地区的大豆根际土样，在温室中将土样加入0.1%的蛋白胨水加富后置入花盆，保湿、保温18小时后，播种催芽(表面消毒的种子数粒)，待真叶出现后采样分离，一直采样到盛花期末。选大豆的主根和主茎，剪取5～10cm段，用自来水流水冲洗24小时，沾取70%酒精，立即在酒精灯上烧去酒精进行表面消毒，用镊子撕去皮层，再用解剖刀将粘在木质部的皮刮干净，使其完全显露木质部，再削成长度0.5～1.0cm的薄片(不要沾上髓)约2～3克，装入10ml无菌水的试管中，65～75℃恒温水浴10分钟，再倒入300ml无菌水中，用组织捣碎机捣碎约15分钟。吸10ml清液，用90ml水稀释，将稀释液用磁力搅拌器混合约5分钟，再用三角玻棒沾稀释液在牛肉蛋白胨平板上涂匀，置30℃恒温培养24～36小时进行菌落检查，将不同菌落进行平板划线，反复三次划线，纯化后转斜面，同时进行涂片，经芽孢染色镜检是否芽孢杆菌，为芽孢杆菌的进行编号待测。
90-B048的分离方法将不同地区采集的旱稻土样，放入温室中花盆内，播种浸种的旱稻种子，待出现第四片真叶时进行分离，选水稻苗的新根，用自来水冲洗12小时以上，再用7%漂白粉表面消毒5分钟，剪取根伸长区部位1～2厘米，共5克左右，加入10ml水，用65～75℃恒温水浴15分钟，用镊子将根段夹出，在无菌研钵中研碎，加水100ml左右，再用磁力搅拌器搅拌5分钟，再梯度稀释到10-3，用1ml吸管吸1ml稀释液，加入5个牛肉蛋白胨平板上，用三角棒涂布均匀，置28～30℃恒温培养18-36小时，进行菌落检查，将不同菌落进行平板划线，纯化后转斜面，并进行芽孢染色镜检，是芽孢杆菌的进行编号测定。
生物测定将分离物用牛肉蛋白胨液体培养基进行摇床培养30小时左右，计测含菌量，将菌种数目用原培养液调节到108cfu/ml，作为拌种用菌液，将成活种子加入菌液拌种，使每粒种子接菌106cfu(大豆分离物拌种大豆种子，水稻分离物拌种水稻种子)。将直径20cm，高20cm塑料盆装满菜田土，每四个花盆“田”字形排列为一个处理，每7个菌处理和一个原增产菌和一个培养液处理作为对照，共9个处理为一区组，随机区组排列，重复5次，大豆每盆播15粒种子，水稻每盆播20粒种子，盖土1cm，浇水，除虫，除草管理约20～30天，以出现四片真叶为标志，连根挖出并冲去根上的土壤，甩干后称单盆鲜重，记录株数和每盆重，用互变量分析法比较各处理间的差异显著性，以显著增加鲜重的进行第二次生物测定。第二次生物测定同前一次，花盆排列改用拉丁方排列，经显著性测定后进行第三次测定，仍用拉丁方方式进行，经三次生物测定均高于营养液对照组和优于作物增产菌(申请号88106560.9)。
平板拮抗测定选用四种植物病原菌，分别为立枯丝核菌(Phizoctonia solani)，尖孢镰刀菌(Fusarium Oxysporum f.sp Vasinfectum)，长蠕孢菌(Hclminthosporium sotivum)长喙壳菌(Ceratocystis fimbriala)，将上述病原菌接种在马铃薯、蔗糖、洋菜平板上，两点放置，相距约4cm，每个病原作三次重复，置25°～28℃恒温箱培养30小时(长喙壳菌在48小时后)，再将待测细菌用接种环在两个菌落间划一直线，再置入28～30℃温箱培养24～48小时后，记录抑菌情况，出现抑菌带的再继续观察到48小时，对可以抑制三种以上病原菌的进行下一步测定。
菌种培养、换代、保藏划线接种于牛肉蛋白胨培养基(5克蛋白胨、3克牛肉汁、15～20克琼脂，配1000ml水)斜面，4℃(短期)或-10℃(长期)冰箱或冷库保存，定期转管传代(划线法)。
90-B028增产菌的生物学特性地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)，菌体直杆状，成链，光镜测量长2.5～3.5μm，宽0.8～1.2μm，革兰氏阳性，原生质内无不着色小球，运动;牛肉蛋白胨平板培养，菌落圆形，直径0.1～0.3cm，边缘整齐，中央凹，边缘隆起，菌落无光泽，不透明，波折。芽孢椭圆或柱状，中生或次端生，孢囊不膨大。最高生长温度45℃，最低15℃，适宜温度为30～32℃，接触酶阳性、VP阳性，VP液生长后，PH6.3厌气生长，PH5.7生长，7%NaCl中生长，碳水化合物不产气，还原NO+3或NO+2，利用柠檬酸盐，水解淀粉，适宜碳源为苹果酸、麦芽糖，适宜氮源为蛋白胨，天冬酰胺、谷氨酸。
90-B048增产菌的生物学特性蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，菌体直杆状，宽1.0μm，长3～5μm，革兰氏阳性，染色细胞具有不着色的小球，运动，牛肉蛋白胨平板，菌落近圆形，直径0.4～0.8cm，边缘不整齐，菌落无光泽，蜡质，最高温度47℃，最低温度15℃，最适温度28～32℃，接触酶阳性，VP阳性，VP液培养后PH为4.5～6.0，厌氧生长，PH5.7生长，碳水化合物，产气阳性，还原NO+3或NO+2，利用柠檬酸盐，水解淀粉，适宜碳源为葡萄糖，麦芽糖，适宜氮源为蛋白胨，无机氮源为NH+4。
固体发酵工艺(1)菌种将冰箱保存的斜面菌种转移到新鲜斜面进行活化，再转入扁瓶中划线、培养，无杂菌污染时，加入蛋白胨水刮下菌膜，准备接种到种子罐。
(2)种子罐发酵采用高压蒸汽灭菌，压力为0.1～0.14MPa，温度为120℃～126℃灭菌30分钟，冷却到45℃以下时，注射接种扁瓶菌种，在30～32℃温度和1∶0.8～1.0的通气量培养到对数期放入贮液罐。
种子罐培养基配方豆饼粉0.5%～0.6%;鱼粉0.4～0.6%;蚕蛹粉0.4～0.6%;葡萄糖0.2～0.4%;花生油或糖油0.25%，其他为水调节PH7.5，消毒灭菌保证PH6.8～7.2之间。
(3)固体培养基配料将干燥的草碳粉碎，用风选机筛至160～200目/吋以草碳为基数，再加入0.1%～0.2%的蛋白胨，0.1%～0.2%的鱼粉，加水量为30%～34%。以水量为基数，水内加入H3BO3200～286PPM、MnCl2·H2O 100PPM、ZnSO4220PPM、CuSO480～120PPM、H2MoO420～40PPM、FeSO4112～150PPM、KI 10～28PPM、MgSO4200～350PPM，配成营养液喷雾加入草碳中，并用搅拌机混合均匀。
(4)装袋灭菌将混合均匀的培养料500克装一聚丙烯塑料袋，装灭菌车121°～126℃(0.11MPa～0.14MPa)高压蒸汽灭菌1～2小时，冷却到45℃以下接菌。
(5)接菌将灭菌的培养料用传送带送入接菌室，用接在菌液贮槽的接菌器，每袋接菌27～33ml，保证每克固体培养基接菌1～1.2×108cfu/克，抖动混合均匀后，折口置30°～32℃培养室固体发酵，约培养24～36小时，保证菌剂含芽孢数超过100×108cfu/克时，进行包装，得到产品。
产品质量检验(1)含菌量检验将培养24小时后的菌剂以代为单位抽样，随机抽样率为0.5～1.0%，用稀释法和血球记数板计测含菌数目，用生物统计法估计产品最低含菌不少于100×10cfu/克，平均数为140×108cfu/克时，为合格。
(3)理化指标检验用烘干法测定含水量不大于38%。
用灼烧法测定灰分(不燃物)不大于55%。
用烘干样品过分样筛使低于160目细度的不超过1%。
包装破损率不超过0.1%。
封包不合格率为0。
附
图1为增产菌固体发酵工艺流程框图。
图中， ()/() 箭头表示主流程，→箭头表示付流程，
双线框表示无菌条件。
下面叙述本发明的发酵工艺的最佳实施例(1)生产工艺以草碳为基础原料，风选过筛，加水，加营养液，搅拌，装袋，灭菌。将菌种活化，扁瓶菌种，种子罐发酵。固体接菌，混合，培养室培养，质检，封口，封包。
(2)原料及营养液草碳含水量低于8%时风选，细度200目/吋，加入水分30%，水内加入营养成份如下以草碳为基数加入蛋白胨0.1%、鱼粉0.2%。
以加水量为基数加入H3BO3286 PPM、MnCl2·H2O 100 PPM、ZnSO4220 PPM、CuSO4120 PPM、H2MoO420 PPM、FeSO4150 PPM、KI 10 PPM、MgSO4284 PPM、PH7。
(3)菌种用培养基斜面与扁瓶菌种用牛肉汁3g、蛋白胨5g、琼脂粉18克，水1000ml，PH＝7。
种子罐配方黄豆饼粉0.5%、鱼粉0.4%、蚕蛹粉0.5%、葡萄糖0.3%、糠油0.25%，其他为水，PH值7.5，消毒后，PH7.0左右。
(4)要求及最佳条件
固体接种量为30ml菌液，每克固体接菌1×108cfu/克以上，加入菌液后保证含水量在36%，不超过38%。要求接菌后要使菌种在草碳中分布均匀。
固体菌剂培养温度为30℃恒温培养24小时。
扁瓶菌种培养温度30℃，菌体粗壮整齐，培养时间约18小时。
种子罐培养温度为30℃，通气量为1∶1(V∶V)，罐压0.05MPa，接菌量为发酵液的1%。
种子质量检查，在接菌6小时后进入对数期在培养到8～10小时时菌体整齐粗壮，含菌量约3亿/ml，无杂菌污染，即可停止培养，进入贮液罐备用。
成品质量检验菌体数和芽孢数检查采用生物统计法计算最低含菌量，少于100×108cfu/克的不合格。同时进行生测法检验增产菌的效果，保证使用质量。
作物增产菌的应用方法一、拌种每亩用30～60克固体菌剂加水5倍均匀撤入种子中，翻动数次，使菌剂均匀沾附在种子表面，稍晾干后即可播种。
二、喷雾每亩取15～30克固体菌剂，用每亩喷雾所需的水量进行稀释，装喷雾器，然后将滤液均匀喷到植株上。
三、浸沾根苗每亩取30～60克固体菌剂，用每亩浸沾根菌所需的水量稀释，将根苗均匀地浸沾上菌液，稍凉即可扦插，栽植。
作物增产菌通过拌种、喷雾、浸沾根苗等方式，将菌株沾附在种子表面作大田试验，作物增产菌有二种，一种为地衣芽孢杆菌(90-B028)，一种为蜡状芽孢杆菌(90-B048)，也可以将90-B028和90-B048二种菌株等量混合接种到含有固体培养料的塑料袋内，发酵得到的菌种。结果见下表。
新型增产菌田间试验结果
注①菌剂用量为最低限，低于此用量增产不明显，增加用量可不成正比的增加产量。
②当亩用种量超过10公斤时加倍使用。
③本表数据仅小区对比试验。
新型作物增产菌的优点具有作物增产菌(申请号为88106560.9简称YIB)的作用特点，弥补YIB的不足。
1.从应用效果来看，新型增产菌对诸如油菜、棉花、大豆、西瓜等双子叶类作物平均增产幅度达15～25%，对水稻、玉米、小麦、高梁等单子叶类作物平均增产幅度达15～20%，对萝卜、甜菜、甘薯、马铃薯等块根、块茎或其他无性繁殖体增产幅度20～30%，明显优于作物增产菌YIB的增产效果，增产稳定性优于YIB。
2.新型增产菌的筛选同时注重了对水稻纹枯病、小麦赤霉病和油菜菌棱病三种病害的拮抗性能，两菌株混用对油菜菌棱病防效达73～78%，对水稻纹枯病防效达66.5～78%，防小麦赤霉病效果达70～76%，明显优于作物增产菌YIB的仅起占领作用的防病效果。
3.从筛选方法来看，新型增产菌是定向筛选植物体特定微生境中的菌株，既提高了菌株的效能，又提高了优良菌株的捕获机率。
4.新型增产菌的固体发酵，产品含菌量达100亿/克，为作物增产菌YIB的3倍左右，不仅降低了生产成本，而且应用时，用菌剂量仅需YIB的70%，便利了运输和应用。
5.固体发酵采用200目草碳省去YIB喷雾时过滤的手续，使用方便。
6.与YIB液体工艺相比，本产品可延长贮存期3倍。
7.与YIB可湿粉剂比，固体产品保留了发酵过程中的代谢产物，故应用后，直观效果明显，易于被农民接受。
权利要求
1.一种新型作物增产菌的筛选和生产方法，其特征在于它包括分离筛选和固体发酵工艺(1)分离筛选方法选大豆主根、主茎(从真叶出现至盛花期末)，剪取5～10cm段，经自来水冲洗，消毒，去皮，再将剩下的木质部削成长度0.5～1.0cm的薄片，约2～3克，装入无菌水试管中，65～70℃恒温水浴10分钟，再倒入300ml无菌水中，用组织捣碎机捣碎约15分钟，吸10ml清液，用90ml水稀释，接种，培养分离筛选出地衣芽孢杆菌菌株(Bacillus Licheni-formis)(保存于CGMCC，保藏号NO.0154)，将菌株在温室内作生物测定，测定三次，测定时菌种的数目用牛肉蛋白胨液体培养液调至108cfu/ml，菌液拌双子叶植物，播种于花盆中，随机区组排列，以出现四片真叶为标志，记录株数和每盆重，性能优越菌种作拮抗性能测定，筛选出的菌种进行固体发酵。(2)固体发酵工艺a.菌种活化，再转入扁瓶或摇瓶中扩大培养，无杂菌污染时，加入蛋白胨水刮下菌膜，准备接种到种子罐。b.种子罐发酵采用高压蒸汽灭菌，压力为0.1～0.14MPa，温度为120℃～126℃，灭菌30分钟，冷却到45℃以下时，注射接种扁瓶菌种，在30～32℃温度和1∶0.8～1.0的通气量培养到对数期放入贮液槽。种子罐培养基配方豆饼粉0.5%～0.6%；鱼粉0.4～0.6%；蚕蛹粉0.4～0.6%；葡萄糖0.2～0.4%；花生油或糠油0.25%，其余为水，调节PH为7.5，消毒灭菌，保证PH在6.8～7.2之间。c.固体培养基配料将干燥的草碳粉碎，用风选机筛至160～200目/吋，以草碳为基数，再加入0.1～0.2%的蛋白胨，0.1%～0.2%的鱼粉，加水量为30～40%，以水量为基数，水内加入H3BO3200～286PPm，MnCl2·H2O100PPm，ZnSO4220PPm，CuSO480～120PPm，H2MoO420～40PPm，FeSO4112～150PPm，KI10～28PPm，MgSO4200～350PPm，将配成营养液喷雾加入草碳中，并用搅拌机混合均匀。d.装袋灭菌将混合均匀的培养料500克装一聚丙烯塑料袋，装灭菌车121℃～126℃(0.1MPa～0.14MPa)高压蒸汽灭菌1～2小时，冷却到45℃以下接菌。e.接菌将灭菌的培养料用传送带送入接菌室，用接在菌液贮槽的接菌器，每袋接菌27～33ml，保证每克固体培养基接菌1～1.2×108cfu/克，抖动混合均匀后，折口置30°～32℃培养室固体发酵，约培养24～36小时，保证菌剂含芽孢数超过100×108cfu/克时，进行包装，得到产品。
2.按权利要求1所述的筛选和生产方法，其特征在于所述的营养液中，以水为基数，水中添加的组份含量是H3BO3286PPm，MnCl2·H2O100PPm，ZnSO4220PPm，CuSO4120PPm，H2MoO420PPm，FeSO4150PPm，KI10PPm，MgSO4284PPm。
3.按权利要求1所述的筛选和生产方法，其特征在于所述的种子罐培养基配方为黄豆饼粉0.5%，鱼粉0.4%，蚕蛹粉0.5%，葡萄糖0.3%，糠油0.25%，其他为水。
4.一种新型作物增产菌的筛选和生产方法，其特征在于它包括分离筛选、固体发酵工艺两部分(1)分离筛选方法选水稻苗的新根(从出现第四片真叶开始)，经自来水冲洗、消毒，剪取根伸长区部位1～2厘米，约5克，加入10ml水，用65～75℃恒温水浴15分钟，用镊子将根段夹出，在无菌研钵中研碎，加水100ml左右，再用磁力搅拌5分钟，再梯度稀释到10-3，吸取1ml稀释液，接种培养分离筛选出蜡状芽孢杆菌菌株(Bucillus cereus)，(保存于CGMCC，保藏号No.0155)，菌株在温室内作生物测定，测定三次，测定时，菌种的数目用牛肉蛋白胨液体培养液调至108cfu/ml，菌种拌单子叶植物，播种于花盆中，随机区组排列以出现四片真叶为标誌，记录株数和每盆重，性能优越菌种作拮抗性能测定筛选出的菌种进行固体发酵。(2)固体发酵工艺a.菌种活化，再转入扁瓶或摇瓶中扩大培养，无杂菌污染时，加入蛋白胨水刮下菌膜，准备接种到种子罐。b.种子罐发酵采用高压蒸汽灭菌，压力为0.1～0.14MPa，温度为120℃～126℃，灭菌30分钟，冷却到45℃以下时，注射接种扁瓶菌种，在30～32℃温度和1∶0.8～1.0的通气量培养到对数期放入贮液槽。种子罐培养基配方豆饼粉0.5%～0.6%，鱼粉0.4～0.6%，蚕蛹粉0.4～0.6%，葡萄糖0.2～0.4%，花生油或糠油0.25%，其余为水，调节PH为7.5，消毒灭菌保证PH在6.8～7.2之间。c.固体培养基配料将干燥的草碳粉碎，用风选机筛至160～200目/吋，以草碳为基数，再加入0.1～0.2%的蛋白胨，0.1%～0.2%的鱼粉，加水量为30%～40%。以水量为基数，水内加入H3BO3200～286PPm，MnCl2·H2O100PPm，ZnSO4220PPm，CuSO480～120PPm，H2MoO420～40PPm，FeSO4112～150PPm，KI10～28PPm，MgSO4200～350PPm，将配成营养液喷雾加入草碳中，并用搅拌机混合均匀。d.装袋灭菌将混合均匀的培养料500克装一聚丙烯塑料袋，装灭菌车121℃～126℃(0.1MPa～0.14MPa)高压蒸汽灭菌1～2小时，冷却到45℃以下接菌。e.接菌将灭菌的培养料用传送带送入接菌室，用接在菌液贮槽的接菌器，每袋接菌27～33ml，保证每克固体培养基接菌1～1.2×108cfu/克，抖动混合均匀后，折口置30°～32℃培养室固体发酵，约培养24～36小时，保证菌剂含芽孢数超过100×108cfu/克时，进行包装，得到产品。
5.按权利要求4所述的筛选和生产方法，其特征在于所述营养液中，以水为基数，水中添加组份的含量是H3PO3286PPm，MnCl2·H2O100PPm，ZnSO4220PPm，CuSO4120PPm，H2MoO420PPm，FeSO4150PPm，KI10PPm，MgSO4284PPm。
6.按权利要求4所述的筛选和生产方法，其特征在于所述种子罐培养基配方为黄豆饼粉0.5%，鱼粉0.4%，蚕蛹粉0.5%，葡萄糖0.3%，糠油0.25%，其他为水。
全文摘要
新型作物增产菌的选育和生产方法，它包括菌种选育和固体发酵工艺。菌种选育工艺中，采取从双子叶植物大豆的主根、主茎中分离筛选菌株以及从单子叶植物水稻根系中分离筛选菌株，这二种菌株分别经固体发酵工艺制得新型作物增产菌。经实验，它们可使双子叶类作物增产15～25％，单子叶作物增产15～20％，对块根、块茎或其他无性繁殖体增产20～30％，并可改善作物品质，提高抗病害能力，其固体发酵产品的含菌量达120亿/克，成本低，便于包装运输。
文档编号C12N1/20GK1056896SQ9010359
公开日1991年12月11日 申请日期1990年5月22日 优先权日1990年5月22日
发明者陈延熙 申请人:陈延熙