专利名称：作用于人体癌的新型抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种作用于人体癌细胞的新型抗体。尤其是，本发明涉及到鼠单克隆抗体和嵌合单克隆抗体，他们作用于与各种人体癌症包括结肠癌、乳腺癌、子宫癌和肺癌相关联的一种细胞膜抗原。鼠单克隆抗体对癌组织有很强的专一性，而对正常人体组织或其他类型的肿瘤如淋巴瘤或肉瘤则根本不表现反应性。本发明抗体具有独特的优点。首先，它能进入到所结合的癌细胞内部。因此，本发明的BR96抗体能够用于临床治疗，例如，可以作为需要进入癌细胞内部的抗体-药物或抗体毒素结合物的抗体成分。第二，该抗体可以传递抗体依赖性细胞毒素“ADCC”和依靠补体传递的细胞毒素“CDC”。第三，足够浓度的该抗体可用于诊断方法中，如通过体外或体内方法检测癌症。
抗人体肿瘤分化抗原的单克隆抗体可以为各种抗肿瘤药物如放射性同位素，化疗药物和毒素击中目标提供保障。〔Baldwin and Byers，(eds.)见“单克隆抗体在肿瘤诊断和治疗中的应用”，London，Academic press(1985)〕。另外，一些单克隆抗体的优点是可以在人体效应器细胞或血清存在下借助ADCC或CDC杀死肿瘤细胞〔Hellstrom et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83∶7059-7063(1986)〕，另有一些单克隆抗体具有直接的抗癌活性而不依赖于任何宿主成分〔Derbin et al.，Oncogene 2∶387-394(1988)〕。
已知许多单克隆抗体能与癌相关性抗原发生反应〔见，如Papsidero，“运用单克隆抗体对癌症进行免疫学检测的新进展”，Semin.Surg.Oncol.，1(4)∶171-81(1985);Schlom et al.，“单克隆抗体在人体癌症治疗中的潜在性临床应用”，Important Adv.Oncol.，170-92(1985);Allum et al.，“单克隆抗体在恶性肿瘤诊断和治疗中的应用”，Surg.Ann.，18∶41-64(1986);and Houghton et al.，“单克隆抗体在癌症治疗中的潜在性应用”。Semin.Oncol.，13(2)∶165-79(1986)〕。
这些已知的单克隆抗体可以与各种不同的癌症相关性抗原包括糖蛋白、糖脂和粘蛋白结合〔见，如，Fink et al.，“用单克隆抗体作为识别和鉴定人肿瘤抗原的诊断性试剂”。Prog.Clin.Pathol.9∶121-33(1984)〕。例如，对可以和特定类型癌症的糖蛋白抗原结合的单克隆抗体的描述见美国专利4，737，579(抗非小细胞性肺癌的单克隆抗体)，美国专利4，753，894(抗人体乳腺癌的单克隆抗体)，美国专利4，579，827(抗人体胃肠癌的单克隆抗体)，和美国专利4，713，352(抗人体肾癌的单克隆抗体)。单克隆抗体B72.3是一种研究最多的抗体，它可以识别一种分子量大于1.000kd的肿癌相关性粘蛋白抗原，这种抗原有选择地在许多不同类型癌症上表现出来。所以，B72.3表现出可以和84%的乳腺癌，94%的结肠癌，100%的子宫癌和96%的非小细胞肺癌发生反应。〔见Johnston，“通过对单克隆抗体B72.3的研究说明单克隆抗体在临床细胞学中的运用”，Acta Cytol.，1(5)∶537-56(1987)和美国专利4，612，282，issued to Schlom et al.〕。另一获得专利的单克隆抗体，KC-4，〔见美国专利4，708，930〕，可以识别一种大约400-500kd的蛋白质抗原，这种抗原存在于许多种癌如结肠癌，前列腺癌、肺癌和乳腺癌。看来B72.3和KC-4抗体都不能进入他们所作用的癌细胞内。
已经公开了与肿瘤细胞相关性糖脂抗原发生反应的单克隆抗体。例如，Young et al.，“对糖脂神经节-N-三糖基脂酰基鞘氨醇(Asialo GM2)的两个独特空间部位具特异性的单克隆抗体的制备”，J.Exp.Med.150∶1008-1019(1979)公开了专门作用于Asialo GM2的两种单克隆抗体的制备方法。Asialo GM2是一种细胞表面糖神经鞘脂抗原，这种抗原用来作为一种由kirsten鼠肉瘤病毒转化的BALB/C V3T3细胞的标记。也见，Kniep et al.，“神经节三糖基脂酰基鞘氨醇(Asialo GM2)，一种作为来自何杰金病人(Patients with Hodgkin′s Disease)的细胞系的糖神经鞘脂标记物”，J.Immunol.，131(3)∶1591-94(1983)和美国专利4，507，391(抗人体黑素瘤的单克隆抗体)。
其他一些与癌细胞上糖脂抗原发生反应的单克隆抗体包括由Rosen等人描述的单克隆抗体，“运用一组鼠单克隆抗体对人体小细胞肺癌分化抗原的分析”，Cancer Research，44∶2052-61(1984)(抗人体小细胞肺癌的单克隆抗体)，以及Varki et al描述的，“由单克隆抗体限定的人体肺腺癌相关抗原”，Cancer Research，44∶681-87(1984);(抗人体肺、胃、结肠腺癌和黑素瘤的单克隆抗体)，和美国专利4，579，827(抗人体结肠腺癌的单克隆抗体)。并见Hellstrom et al.，“L6，一种与大多数的人体癌发生反应的IgG 2a抗体的抗癌作用”，Proe.Natl.Acad.Sci.U8A，83∶7059-63(1986)该文指出，L6单克隆抗体可以识别一种存在于人体非小细胞肺癌、乳腺癌和结肠癌表面的糖类抗原。
对来自许多类型癌症的大多数细胞具有高度特异性反应能力的其他一些单克隆抗体是非常需要的。这是因为很多癌细胞具有抗原异源性，这样在诊断或治疗过程中常需要使用许多抗同一肿瘤块的不同单克隆抗体。而且还需要，尤其是在治疗学上，一种所谓的“进入性”抗体，例如，很容易被所结合的癌细胞吸收的抗体。这种类型的抗体可以应用于使用抗体-药物或抗体-毒素结合物的治疗方法中，该方法中将一种治疗用抗癌药剂结合到一种抗体上以传递到癌组织，即此抗体结合到与它具有反应性的肿瘤相关性抗原上，并将抗癌药物释放到癌细胞内部〔见，如Embleton et al.，“抗癌药物的抗体传递”，见“用于癌症诊断和治疗的单克隆抗体”，pp.317-44(Academic Press，1985)〕。不能够进入所结合的癌细胞内部的抗肿瘤相关性抗原的抗体在制备带有抗癌药物或毒素的结合物时一般是没有用处的，因为这种结合物不能够到达他们在细胞内的作用位点。因此需要通过其他的方法在治疗中运用这些抗体。
可以和淋巴细胞抗原发生反应的几种进入性抗体是已知的。相对而言，用于处理固体肿瘤的这样的抗体是不多见的。进入性抗癌抗体的几个例子之一是Domingo et al公开的一种抗体，“转铁蛋白受体作为抗体药物结合物的靶子”，Methods Enzymol.，112∶238-47(1985)。这种抗体可以和存在于癌细胞上的人体转铁旦白-受体糖旦白发生反应。但是，由于很多正常组织上也存在有转铁蛋白-受体，并且经常有较高含量，因此在抗体-药物或抗体-毒素结合物中使用抗转铁蛋白受体的抗体，可以对正常细胞带来明显的毒副作用。因此，使用这种抗体有选择性地杀死或抑制癌细胞是有问题的。另一个进入性抗体是BR64(公开于互补在审美国专利申请No.289，635，申请日1988年12月22日和No.443，696申请日1989年11月29日，本文以此作为参考)。
运用细胞融合技术生产单克隆抗体〔kohler and Milstein，Nature(London)256∶495(1975)〕已经能制备出许多和抗原，包括已往未知抗原，发生反应的鼠单克隆抗体。但是，鼠单克隆抗体被人体免疫系统识别为外来物质，而对其进行中和以致于不可能运用于人体治疗。因此，近来的研究集中于通过将DNA引入到哺乳动物细胞中，并使免疫球旦白基因表达来生产所谓的“嵌合”抗体〔Oi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U8A 80∶825(1983);Potter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81∶7161;Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81∶6581(1984);Sahagan et al.，J.Immunol.137∶1066(1986);Sun et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.84∶214(1987)〕。
嵌合抗体是含有人类和非人类成分的免疫球蛋白分子。尤其是，该嵌合抗体的抗原结合区(可变区)来自非人类(如鼠)而该嵌合抗体具有的能赋予免疫球蛋白生物学效应功能的不变区来自人类。这种嵌合抗体应当具有非人类抗体分子的抗原结合特异性和人类抗体分子所赋予的效应功能。
一般地说，生产嵌合抗体的操作步骤如下a)识别和克隆编码该抗体分子抗原结合部分的恰当的基因片段这种基因片段(被称为VDJ，可变区，转换区和重链连结区，或者称为VJ，可变区，轻链连接区或简称为V或可变区)既可以是CDNA也可以是基因组形式;
b)克隆编码不变区或所需部分的基因片段;
c)将可变区和不变区连接在一起成为可编码完整嵌合抗体的一种可转录和可翻译形式。
d)将这种结构连接到一个含有选择性标记和基因控制区如启动子、强化因子、和多(A)附加信号的载体中;
e)在细菌中扩增这种结构;
f)将这种DNA掺入到真核细胞(转染)，常是哺乳动物淋巴细胞中去。
g)选择表达出选择性标记的细胞;
h)筛选表达预期嵌合抗体的细胞;和k)测试该抗体的特定的结合特异性和效应器功能。
通过这种生产嵌合蛋白质的方法，已经制造了与几种独特抗原特异性的特性〔例如，抗-TNPBoulianne et al.，Nature，312∶643(1984);和抗癌抗原Sahagam et al.，J.Immunol.137∶1066(1986)〕。同样，已通过将新顺序连接到那些编码抗原连接区的顺序上，获得了几个不同的效应功能物。这些物质包括酶〔Neuberger et al.，Nature 312∶604(1984)〕，来自另一种的免疫球蛋白不变区和另一免疫球蛋白链的不变区〔Sharon et al.，Nature 309∶364(1984);Tan et al.，J.Immunol.135∶3565-3567(1985)〕。
哺乳动物细胞内同源重组的发现能够将新顺序靶击到特定的染色体位点上。当培养的哺乳动物细胞将外源性DNA整合到染色体DNA上，含有与质粒顺序同源的顺序的位点处，则可以发生同源重组〔Folger et al.，Mol.cell.Biol.2∶1372-1387(1982);Folger et al.，Symp.Quant.Biol.49∶123-138(1984);Kucher-lapati et al.，proc.Natl.Acad.sci.USA.81∶3153-3157(1984);Lin et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 82∶1391-1395(1985);de Saint Vincent et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 80∶2002-2006(1983);Shaul et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82∶3781-3784(1985)〕这种细胞内同源重组的可能性可以使内源性基因发生原位变异。已经发现通过将含有与靶位点同源的DNA片段和带有所需变异的新顺序片段的质粒DNA引入细胞内而对染色体顺序进行修改的条件〔Thomas etal.，Cell 44∶419-428(1986);Smitbies et al.，Nature 317∶230-234(1985);Smith et al.，Symp.Quant.Biol.49∶171-181(1984)〕。在哺乳动物细胞染色体DNA和外源性质粒DNA之间发生的同源重组可以引起质粒的整合或者由同源性质粒顺序替代某些染色体顺序。这样可以将一个所需的新顺序安置于内源性靶位点上。
运用可以为少数细胞类型提供显性选择如NEO和HPRT的基因进行同源重组方法已经被人们进行评述〔Song et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 84∶6820-6824(1987);Rubinitz and Subramani，Mol.cell.Biol.6∶1608-1614(1986);和Liskay，Cell 35∶157-164(1983)〕。近来，对运用同源重组进行基因修饰来改变抗体分子和制备嵌合抗体分子的方法进行了描述〔Fell et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86∶8507-8511(1989);和美国互补在审专利申请No.243，873申请日1988年9月14日和No.468，035申请日1990年1月22日，二者和本申请属于同一受让人。本文对以上全部内容进行了参考〕。
将抗癌单克隆抗体用于临床的最直接方式是运用在体外和动物模型内表现有抗癌活性的单克隆抗体，以未修饰形式给药。大多数抗癌抗原的单克隆抗体本身并不表现有任何抗癌活性，但是已知某些单克隆抗体可以传递补体依赖性细胞毒素(CDC)，也就是说，在人血清作为补体来源存在的情况下可杀死人体癌细胞〔见，如Hellstrom et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA82∶1499-1502(1985)〕，或者传递和效应器细胞如人类NK细胞或巨噬细胞结合的抗体依赖性细胞毒素(ADCC)，通过将单克隆抗体与用51Cr标记的癌靶细胞培养4hr后，测定溶解细胞来检测ADCC和CDC活性。
将靶细胞用51Cr标记，然后暴露于效应器细胞(这种细胞是用淋巴细胞分离培养基纯化得到的人类淋巴细胞形式)和抗体的结合物4小时，加入抗体的浓度在0.1μg/ml和10μg/ml之间变化。通过测定靶细胞中51Cr的释放来衡量癌细胞的溶解情况(细胞毒性)。以单独培养的靶细胞或者分别和淋巴细胞或单克隆抗一起培养的靶细胞作为对照，测定所释放的51Cr的总量，并且将与单克隆抗体和效应器细胞共培养的靶细胞的死亡率与单独培养的靶细胞的死亡率相比较来计算抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。测定补体依赖性细胞毒性(CDC)的方法，除了加入人血清做为补体来源(稀释到1∶3～1∶6)替代效应器细胞外，与测定抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法相同。
具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的单克隆抗体，由于他们经常具有体内抗癌活性，被认为是具有医疗用途的。另一方面，在体外不显示抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性活性(CDC)的抗体，一般在体内也是无效的，除非是用作抗癌药物的载体。单克隆抗体能够激活宿主的补体则说明在治疗学上是有益的，这不仅是因为可杀死癌细胞，而且是因为肿癌的血液供应会增加，从而促进药物的摄入〔见Hellstrom et al.，肿瘤治疗的免疫学方法单克隆抗体，肿瘤疫苗和抗个体基因型，见共价修饰抗原和抗体在诊断和治疗中的应用，Quash and Rodwell，eds.Marcel Dekker，pp.15-18(1989)〕。在鼠单克隆抗体中，IgG 2a和IgG 3同型模式是最常与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)相关联的。具抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的抗体，仅高度选择性地杀死它们所结合的癌细胞，且如果不是选择性地进入肺、肝或其它器官将不可能产生毒性作用。这样将使这种抗体比放射性标记抗体或某些类型的免疫结合物具有优越性。
很少有抗体能自己单独，也就是说，在ADCC和CDC作用机制中不存在效应器细胞或补体的情况下，去杀死癌细胞。BR96就是这样一种抗体，因为它在抗体浓度大约10μg/ml或更高的情况下本身单独能杀死癌细胞。这些抗体由于能干扰肿瘤细胞生长的关键机制而具有特殊的意义。
因此，很明显，对许多类型的癌症具有高度选择性、自身具有抗癌活性、而且能够容易地被癌细胞摄入细胞内的抗体，在癌症治疗中可能会有较大的有益性。
本发明提供对一定类型的人类癌症具有高度选择性的进入性抗体。具体地说，本发明的新型抗体，称为BR96抗体，是一种结合到存在于人类癌细胞的一种细胞膜抗原上的鼠单克隆抗体和嵌合抗体。这种抗体与癌细胞具有高度反应性，如来自乳腺癌、肺癌、结肠癌和卵巢癌的癌细胞，而对正常人体细胞或其他类型的肿瘤如淋巴瘤或肉瘤不表现或表现出有限的反应性。另外，本发明的抗体可以进入它们所结合的癌细胞内部，并且能够自己单独，也就是不以结合物形式和不存在效应器细胞或补体的情况下杀死癌细胞。因此，BR96抗体在治疗应用中具有特殊的用途。例如，可以和癌细胞反应，并且在结合物中作为各种具有抗癌作用的药物的一种靶选择性载体，这些抗癌药物包括化疗药物，毒素、免疫应答修饰应子，酶和放射性同位素。因此，这些抗体可以用作各种免疫结合物的成份之一，这些免疫结合物包括那些需要内在化并且将其标记后可将放射性同位素传递到癌组织的抗体-药物和抗体-毒素结合物。BR96抗体甚至在未修饰的形式下也具有治疗学意义。因而，这些抗体可以用于检测癌症的体外和体内诊断方法。
图1描述的是，用一种如下面实施例3所述的不同浓度的BR96-RA免疫毒素对3396乳腺癌细胞进行处理后，对脑苷与该癌细胞DNA结合的抑制百分率。BR6-RA是一种内在性抗体，由于它不与3396细胞结合，可以作为负相关对照。
图2描述的是，用一种如下面实施例3所述不同浓度的BR96-RA免疫毒素对2707肺癌细胞处理后，对脑苷与该细胞DNA结合抑制的百分率。BR6-RA是一种也可以和2707癌细胞结合的内在性抗体。
图3描述的是，用一种如下面实施例3所述不同浓度的BR96RA免疫毒素对HCT结肠癌细胞处理后，对脑苷与该细胞DNA结合的抑制百分率。BR96不与HCT116细胞结合。
图4描述的是，用一种如下面实施例3所述变化浓度的BR96-RA免疫毒素对C结肠癌细胞处理后，对脑苷掺入该癌细胞DNA抑制百分率。BR6-RA不和C细胞结合;L6-RA可以与C细胞结合，但不能进入该细胞。
图5描述的是，用一种如下面实施例3所述不同浓度的BR96-RA免疫毒素对3347结肠癌细胞处理后，对脑苷掺入此癌细胞DNA的抑制百分率。BR96不与这些细胞结合，但BR6与它们结合。
图6描述的是，对碘化丙胺鎓(propidium iodide)染色的3396乳腺癌细胞，2987肺癌细胞和3619结肠癌细胞的细胞毒素进行FACS分析的结果，如下面实施例4所述。
图7是指如下面实施例4所述的BR96对各种细胞系细胞增殖的影响。
图8显示通过如下面实施例4所述的染色方法，测定得到的BR96对各种细胞系细胞生长的影响。
图9描述的是如下面实施例5所述的测定BR96抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性的测定结果。
图10描述的是如下面实施例6所述的测定补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的结果。
图11是一个如下面实施例7所述的BR96抗糖脂反应活性的测定结果直条图表。
图12是一个如下面实施例7所述的BR96抗新糖蛋白反应活性测定结果的直条图表。
图13是一个表示如下面实施例8中所述的用羊抗K轻链检测试剂进行ELISA分析得到的BR96F(ab′)2片段的结合活性与完整单克隆抗体结合活性比较的图表。
图14是一个表示如下面实施例8所述的用过氧化物酶结合蛋白A检测试剂进行ELISA检测得到的BR96F(ab′)2片段的结合活性与完整BR96单克隆抗体结合活性比较的图表。
图15是一个如下面实施例9中所述的电击穿方法中运用的载体Phgamma1HC-D的示意图。
图16是一个如下面实施例9中所述的电击穿方法中运用的载体pSV2gpt/ck的示意图。
图17是一个描述如下面实施例9中所述的比较本发明鼠BR96单克隆抗体与本发明嵌合BR96抗体二者结合能力而进行竞争性结合试验的测定结果示意图。
图18描述的是如下面实施例10中所述的本发明抗体作用于3396乳腺癌细胞的细胞毒性的FACS分析结果。
图19描述的是如下面实施例10中所述的本发明抗体作用于2987人类肺腺癌细胞的细胞毒性的FACS分析结果。
图20描述的是如下面实施例10中所述的本发明抗体作用于MCF-7细胞的细胞毒性的FACS分析结果。
图21描述的是，用如下面实施例10中所述的不间浓度鼠BR96-RA免疫毒素和嵌合(chi)BR96-RA对3396乳腺癌细胞处理后，对胸苷掺入此癌细胞DNA的抑制百分率。
图22描述的是，用如下面实施例10所述的不同浓度鼠BR96-RA免疫毒素和Chi BR96-RA对3630乳腺癌细胞处理后，对胸苷掺入此癌细胞DNA的抑制百分率。
图23描述的是一个如下面实施例11中所述的未修饰的BR96对癌细胞系H2987的抗癌作用示意图。
图24是一个说明如下面实施例11中所述的用BR96对动物进行治疗后癌症消失情况的直条图。
图25描述的是如下面实施例11中所述的将BR96抗体植入H2707细胞内后以肿块体积计算其剂量效应作用。
图26描述的是如下面实施例11中所述的用F(ab′)2片段和嵌合BR96植入2707细胞后以肿块体积测定其治疗效果。
描27描述的是如下面实施例11中所述的用各种剂量的BR96抗体治疗后肿瘤的消失情况，作为与F(ab′)2片段和嵌合BR96作用结果的比较。
为了更全面地理解本发明描述的内容，进行如下的详细描述。
本发明涉及到对癌细胞具有高度特异性的新型抗体。尤其是，与一定类型的癌症如乳腺癌、肺癌、子宫癌和结肠癌发生反应的抗体，而这些抗体与正常人体组织或其他类型的肿瘤如肉瘤或淋巴瘤不表现出或表现出有限的反应性。
BR96抗体可以用来分离它们所结合的抗原并识别其特征。因此，BR96抗体可以用来作为一个探针以确定所识别出的抗原决定簇，并对其进行定性，而且进一步定义与它们发生反应的细胞膜抗原〔见，如，Nudelman et al.，”用单克隆抗体确定人类黑素瘤相关神经节苷脂抗原的特征，4.2”，J.Biol.Chem.257(1)12752-56(1982)and Hakomori，“肿瘤相关糖类抗原”，Ann.Rev.Immunol.2∶103-26(1984)〕。
根据单克隆抗体BR96进行初步的抗原决定簇筛选的结果表明，BR96抗体结合的肿瘤细胞上的抗原是Lewis Y抗原的一种墨角藻糖化(fucosylated)的变体。对LewisY(LeY)抗原的描述见Abe et al.，J.Biol.Chem.258∶8934(1983);Lloyd et al.Immunogenetics 17∶537(1983);Brown et al.，Bio.Sic.Rep.3∶163(1983);Hellstrom et al.，Cancer Res.46∶3917(1986)，对岩藻糖化的(fucosylated)Lewis Y抗原的描述见Abe et al.，Cancer Res.46∶2639-2644(1986)可以通过运用由Kohler和Milstein首次提出的建立完善的杂交瘤方法来生产本发明的单克隆抗体〔见，Kohler和Milstein，“Continuous Cultures of Fused Cells SeCreting Antibody of Pre-Defined Specificity”，Nature，256∶495-97(1975)。并且Brown et al.，“Structural Characterization of Human Melanoma-Associated Antigen p97With Monoclonal Antibodies”，J.Immunol.，127(2)∶539-46(1981)〕;Brown et al.，“Protein Antigens of Normal And Malignant Human Cells Identified By Immunoprecipitation With Monoclonal Antibodies”，J.Biol.Chem.，255∶4980-83(1980);Yeh et al.“Cell Surface Antigens of Human Melanoma Identified By Monoclonal Antibody”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76(6)∶297-31(1979);and Yeh et al.，“A Cell-Surface Antigen Which is Present In the Ganglioside Fraction And Shared By Human Melanomas”，Int.J.Cancer，29∶269-75(1982)〕。
这些方法包括将一种免疫原(例如，带有抗原的细胞或细胞提取物或纯化抗原)注射到一种动物(如鼠)体内，以在该动物体内激发预期的免疫应答(即抗体)。在足够时间之后，从动物体的脾脏、淋巴结或外周血中得到产生抗体的淋巴细胞。优选的是，该淋巴细胞来自脾脏。然后将脾脏淋巴细胞与一种骨髓瘤细胞系，一般在融合剂如聚乙烯乙二醇(PEG)存在下进行融合。根据常规方法，任何一种骨髓瘤细胞系都可以用作一种融合成分;例如，P3-NS1/1Ag4-1，P3-X63-Ag8.653或Sp2/0 Ag14骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞系是可以从美国Mary Land，Rochville，的美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)处得到的。
将得到的细胞，包括所需要的杂交瘤，在一种选择性培养基中，如HAT培养基，进行生长，其中没有融合的亲代骨髓瘤或淋巴细胞最后会死亡。只有杂交瘤细胞可以活下来，并且能在限制性条件下生长以获得离体的细胞系。从杂交瘤的上清液中筛选所需特异性的抗体，例如运用曾在免疫接种中使用的抗原通过免疫测定方法进行筛选。然后在限制性稀释条件下将阳性细胞系进行亚克隆，且能分离所产生的单克隆抗体。可运用现有技术中已知方法在体外或体内(在腹水液中)繁殖，根据上述方法制得杂交瘤〔见，总的说，Fink et al.，同上文，第123页，表6-11〕。普遍使用的纯化单克隆抗体的方法包括硫酸铵沉淀法，离子交换色谱分析法和亲合层析〔见，如，Zola et al.，“单克隆杂交瘤抗体的生产和定性方法”，见单克隆杂交瘤抗体方法和应用，Hurell(ed.)，pp51-52(CRC Press 1982)〕。
根据本发明的一个优选实施例，通过下述的杂交瘤技术，运用一个乳腺癌细胞系3396作为免疫原来制备本发明的一种单克隆抗体，称之为BR96。按下述方法制备的能产生BR96抗体的BR96杂交瘤，于1989年2月22日在ATCC保藏，并且给出下面的保藏号BR96 ATCC 入藏号NoHB10036BR96抗体属于IgG3亚纲。这种抗体对于不同器官类型的癌细胞具有高度的特异性，例如乳腺癌、肺癌、结肠癌和卵巢癌，以及从各种乳腺癌、肺癌和结肠癌建立的培养细胞系。再者，BR96抗体与其他类型的癌细胞不进行结合，如T细胞淋巴瘤细胞系，CEM和MoLT-4，B细胞淋巴瘤细胞系，P3HR-1或黑色素瘤细胞系。BR96抗体能够进入到抗原阳性的癌细胞内，对该抗原阳性癌细胞具有毒性，BR96抗体可以传递抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)活性，而且令人惊奇地是，单独本身，即在未修饰形式下，就具有细胞毒性。BR96抗体似乎能识别LeY抗原。
根据另一个实施例，通过对纯化BR96的胃蛋白酶消化制备BR96单克隆抗体的F(ab′)2片段〔Nisonoff et al.，“The Antibody Molecule”，Academic Press，New York(1975)〕，如下面所述。F(ab′)2片段与癌(3396)和MCF7细胞的结合能力可以与完整的BR96单克隆抗体的结合能力相比。
在另一个优选的实施例中，运用如Fell等人所描述的两步同源重组方法生产本发明的嵌合(鼠/人)抗体，见Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86∶8507-8511(1989)和美国互补在审专利申请No.243，873，申请日1988年9月14日，和申请No.468，035，1990年6月22日，与本申请属于同一受让人;本发明参考了所有这些公开文件的全部内容。这个两步方法包括使一个编码人IgGgammal重链的靶载体，对表达鼠BR96单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞系(杂交瘤ATCC No.HB10036)进行转染，以制备一种能表达含有人IgGgammal重链的BR96嵌合抗体的杂交瘤。然后用一种含有可编码人Kappa(K)轻链的DNA的靶载体转染这种杂交瘤，以制制备一种可表达含有人类IgGgammal重链和人K轻链的BR96嵌合抗体的鼠杂交瘤。用来转染杂交瘤的靶载体是用Xbal酶消化的PHgammal HC-DD4载体(Oncogen，Seattle，WA)和用HindⅢ消化的PSV2gptt/CK载体(Oncogen，Seattle，WA)。
由下述方法制备并可以产生嵌合人/鼠BR96抗体的嵌合BR96杂交瘤，本文定义为Chi BR96已经于1990年5月23日在ATCC保藏，并以下面的入藏号得到认可Chi BR96 ATCC NoHB10460一经识别出表达该嵌合抗体的杂交瘤，即对该杂交瘤进行培养，然后用现有技术中已知的分离单克隆抗体的方法从该细胞培养的上层液中分离所需的嵌合分子。
本文所用“术语
BR96抗体”包括完整的，未受损的多克隆和单克隆抗体物质，如由杂交瘤ATCC No.HB10036产生的鼠BR96单克隆抗体以及嵌合抗体分子如由杂交瘤ATCC No.10460产生的嵌合BR96抗体。上述的BR96抗体包括用现有技术中已建立的方法而得到的含有该抗体活性抗原结合区的任何片段，如Fab，F(ab′)2和FV片段〔见，例如，RouseauX et al.，“从不同鼠IgG亚纲的单克隆IgG中制备蛋白水解片段的最佳条件”，见Methods Enzymol.，121∶663-69(Academic Press 1986)〕。本发明的BR96抗体还包括融合蛋白质。
另外，本发明的BR96抗体对于来自主要器官如肾、脾、肝、皮肤、肺、乳腺、结肠、大脑、甲状腺、心脏、淋巴结或卵巢等正常人体组织不表现出任何免疫组织学方法可检测到的结合能力。该抗体与外周血液白细胞也不发生反应。BR96抗体对扁桃体和睾丸中的某些细胞表现出有限的结合力，而对胰腺中的腺泡细胞和胃与食管的上皮细胞可以进行结合。因此，该BR96抗体在相对于正常细胞来说对癌细胞具有高度特异性方面比大多数已知抗癌抗体具有优选性〔见，如Hellstrom et al.，“癌症治疗的免疫学方法单克隆抗体，癌疫苗和抗个体基因型”，见共价修饰抗原和抗体在诊断和治疗中的应用，Quash/Rodwell(eds.)，第1-39页(Marcell Dekker，Inc.，1989)和Bagshawe，“Tumour Markers-Where Do We Go From Here”，Br.J.Cancer，48∶167-75(1983)〕。
另外，本发明包括那些能够与BR96抗体所结合的相同抗原决定簇进行结合，并且在该位置与BR96抗体进行竞争性结合的抗体，这样的抗体包括那些与BR96抗体具有相同抗原特异性但在种源，同型模式，结合亲和力或生物学功能(如细胞毒性)方面不同的抗体。例如，可以运用现有技术中已知的重组类别转换和融合技术来构造具有BR96抗体的抗原结合区的本发明抗体的类型、同模标本和其他变体〔见，例如，Thammana et al.，“杂交瘤内从IgM向IgG的免疫球蛋白重链类别转换”，Eur.J.Immunol.13∶614(1983);Spira et al.，“通过亚选择和ELISA测试来识别单克隆类型转换变体”，J.Immunol.Meth.74∶307-15(1984);Neuberger et al.，“具有新效应器功能的重组抗体”，Nature 312∶604-608(1984);和Oi et al.，“嵌合抗体”，Biotechniques，4(3)∶214-21(1986)〕。因此，与BR96抗体具有相同结合特异性的其他嵌合抗体或其他重组抗体(例如，抗体和第二种蛋白质如淋巴因子或肿瘤抑制生长因子结合的融合蛋白)都属于本发明的范围。
本发明BR96抗体的抗个体基因型抗体也属于本发明范围。可以使用BR96抗体和它的片段作为免疫原制备这些抗基因型抗体，该抗基因型抗体可以用于检测对肿瘤的体液免疫应答和临床治疗的诊断，例如作为一种疫苗在病人体内诱导抗癌免疫应答〔见，如Nepom et al.，“抗基因型抗体和特异性肿瘤免疫力的诱导”，见Cancer and Metastasis Reviews，6∶487-501(1987)〕。
本发明BR96抗体也可用于临床诊断，在体外或体内检测具有该抗体特异性结合的抗原的人体癌症。体外诊断方法包括癌细胞的免疫组织学检测(例如，对人体组织、细胞或癌切片标本的检查)或肿瘤相关抗原的血清学检测(如，血标本或其他体液的检查)。
免疫组织化学方法包括对一种带有本发明BR96抗体的生物标本如组织标本进行染色，然后检测标本上与抗原结合在一起的抗体的存在。该样本上有这种抗原抗体复合物的形成说明该组织中有癌细胞存在。标本中抗体的检查可以运用现有技术中已知的技术如免疫酶学方法，例如免疫过氧化物酶染色方法或抗生物素蛋白-生物素(ABC)方法或免疫荧光方法〔见，例如，Ciocca et al.，使用单克隆抗体的免疫组织化学方法”，Meth.Enzymol.，121∶562-79(1986);Hellstrom et al.，“抗人体肺癌的单克隆鼠抗体”，Cancer Research 46∶3917-23(1986);和Kimball(ed.)，Introduction to Immunology(2nd Ed.)第113-117页(Macmillan Pub.Co.1986)〕。例如如下面实施例2所述，利用免疫过氧化物酶染色方法，以说明BR96抗体抗肺癌、乳腺癌、结肠癌、和卵巢癌的抗癌活性以及该抗体与正常人体组织样本的低反应性。
血清学诊断方法包括检查并测定被分泌到或“流到”认为是患有癌症的病人血清或其他生物体液中的肿瘤相关抗原的量。运用现有技术中已知的方法可以在体液中检查出这种抗原，例如，运用放射免疫测定法(RIA)或酶连接免疫吸附剂测定法(ELISA)，其中与“流出”抗原发生反应的抗体用来检查体液样本中抗原的存在〔见，如Uotila et al.，“Two-Site SandwichELISA With Monoclonal Antibodies To Human AFP”，J.Immunol.Methods，42∶11(1981)和Allum et al.，同上文，第48-51页〕。因此这些运用本发明公开的BR96抗体的检测方法，可以用来在生物液体中检测可以和BR96抗体发生反应的糖脂抗原和检查病人体内的癌症。因此，从上面可以明显看出，本发明的BR96抗体可以用于大多数涉及到抗原抗体反应的测定方法。这些测定方法包括，但不局限于此，液相和固相的常规放射免疫测定法(RIA)和酶连接免疫吸附剂测定法(ELISA)，免疫荧光测定方法和其他的免疫细胞化学测定方法〔见，如Sikora et al.，(eds)，Monoclonal Antibodies)第32-52页(Blackwell Scientific Publications 1984)〕。
本发明还包括能完成上述测定方法的诊断药盒。在一个实施例中，该诊断药盒包括本发明的BR96单克隆抗体，及其片段、融合蛋白或嵌合抗体，以及一种含有一个可与BR96抗体特异性结合的配对成分和一种能够产生可检测信号的标记物的结合物。该诊断用药盒还包括一些辅助试剂例如缓冲试剂和蛋白质稳定试剂(如，多糖)。如果需要的话，该药盒还可以包括有信号产生系统的其他成分，包括减少背景干扰的试剂、执行试验的控制试剂、设备和容器。在另一个实施例中，该诊断药盒包括一种由本发明BR96抗体和能够产生可检测信号的标记物组成的结合物，也可以有如上所述的辅助试剂。
本发明的BR96抗体也可以用于体内临床诊断来检测人体癌症。这种方法之一是通过肿瘤成像技术来检测体内肿瘤。根据这种方法，用一种合适的能够产生可检测信号的成像试剂标记该BR96抗体。可以运用的成像试剂例如包括，但不局于此，放射性标记物如131I、111In、123I、9gmTc，32P，125I，3H和14C荧光标记物如荧光素和碱性蕊香红，以及化学发光剂如虫荧光素。可以运用现有技术中已知的方法使用这些试剂对该抗体进行标记。例如，见Wensel and Meares，“Radioimmunomaging And Radioimmunotherapy”，Esevier，New York(1983)描述的有关抗体的放射性标记方法，〔并见，Colcher et al.，“Use of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenograft In Athymic Mice”，Meth.Enzymol.121∶802-16(1986)〕。
对于已进行放射性标记的抗体，可将该抗体施用于病人，定位于带有和该抗体结合的抗原的肿瘤上，运用已知技术可以在体内检查出该抗体或使之成像，如运用一种gamma相机或放射线体层照像机进行放射原子核扫描〔见，如，Bradwell et al.，“抗体显像中的发展”见Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.，(eds)，第65-85页(Academic Press 1985)〕。将该抗体和医疗上可接受的载体一起施用于病人，这种载体如水、盐水、林格氏溶液(Ringer′s Solution)，Hank′s溶液、或非水溶性载体如不易挥发的油。该载体也可以含有增加该抗体等渗性和化学稳定性的物质如缓冲液或保存剂。该抗体组合物施用时，例如静脉内方式，剂量要足以提供足够的γ放射物，而使该癌症靶位点显影。在施用后到检查前之间要有足够的时间以便对靶肿瘤进行定位。对于肿瘤成像的综述，见Allum et al.，同上文，第51-55页。
该BR96抗体的特性a)对癌细胞具有非常高的特异性;b)能够内在化;c)当以合适的浓度使用时，自身单独可以对抗原阳性癌细胞具有毒性，也就是在未修饰的形式下显示毒性;和d)补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性活性，暗示可以应用于许多体内治疗方法中。首先，该BR96抗体单独使用可以在体内击中和杀死癌细胞。还可以将该抗体与合适的治疗药物联合使用来治疗人体癌症。例如，可以将该抗体结合规范或常规的治疗方法如化学疗法或放射疗法使用，或者将该抗体结合或连接到一种治疗药物，或毒素上，也可以连接到一种淋巴因子或一种癌抑制生长因子上，以便将治疗药物传递到癌症位置。这种治疗药物与抗体结合的方法是已知的〔见，如，Arnon et al.，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In Cancer Therapy”，见MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.，(eds)第243-56(Alan R.Liss Inc.1985);Hellstrom et al.，“Antibodies For Drug Delivery”，见Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)Robinson et al.，(eds)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987);“Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review”，见Monoclonal Antibodies84Biological And Clinical Applications，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985);和Thorpe et al.，“The Preparation And Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates”，Immunol.Rev.，62∶119-58(1982)〕。本发明的BR96抗体尤其适合于作为一种治疗结合物使用，因为它容易进入到所结合的癌细胞内部，并且将治疗药物传递到细胞内的反应位点处。
另外，还可以将BR96抗体与高能量的放射物结合在一起，如一种放射性同位素象131I;当这种抗体位于癌症位置处。即可以引起几个细胞直径大小的杀死量(见，如，Order，“Analysis，Results，And Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，见Antibodies for Cancer Detective And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，第303-16页(Academic Press(1985)〕。还有另一个实施例，可以将BR96抗体结合到第二种抗体上形成一种抗体异源结合物对癌细胞进行治疗，Segal在美国专利4，676，980中进行了描述。
而且本发明BR96抗体还具有其他的治疗应用，包括如通过重组DNA技术，将该抗体结合或连接到一种能够将前体药物转化成细胞毒性药物的酶上，并且使用这种抗体-酶结合物和前体药物结合在一起，在癌组织处将前体药物转化成细胞毒性药物〔见，如，Senter et al.，“Anti-Tumor Effeets ofAntibody-alkaline phosphatase”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85∶4842-46(1988);“Enhancement of the in Vitro and in Vivo Antitumor Activities of Phosphorylated Mitomycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates”，Cancer Research 49∶5789-5792(1989);and Senter，“Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme ConjugatesA New Approach to Cancer Therapy，FASEB J.4∶188-193(1990)〕。该BR96抗体的另一个治疗用途包括该抗体可以在补体存在下或作为一种抗体药物或抗体毒素结合物的一部分，从癌症病人骨髓中去除癌细胞。根据这种方法，可以用该抗体在体外(ex Vivo)对自体骨髓进行净化，然后再输回到病人体内〔见，如，Ramsay et al.，“Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies”，J.Clin.Immunol.，8(2)∶81-88(1988)〕。
再者，如前所述，还可以在治疗学上使用本发明的嵌合或其他重组BR96抗体。例如，可以运用一种至少含有BR96抗原结合区并连接至少一个第二种具有抗癌活性蛋白质的功能活性部分(如淋巴因子或oncostatin)的融合蛋白质，在体内治疗人体癌症。而且，可以运用现有技术中已知的重组技术来制造双重特异性抗体，其中该抗体的结合特异性之一是BR96的结合特异性〔见，如，美国专利4，474，893〕。
最后，可以在治疗学上将RR96抗体的抗基因型抗体用于活性肿瘤免疫接种和肿瘤治疗〔见，如.，Hellstrom et al.，“Immunologicai Approaches To Tumor TherapyMonoclonal Antibodies，Tumor Vaccines，And Anti-Idiotypes”，见Coralently Modified Autigeus And Antibodies In Diagnosis And Therapy，同上文第35-41页。
虽然本发明包括治疗人体癌症的药物组合物，结合物及其方法。例如，本发明包括用于治疗人体癌症的药物组合物，该组合物含有一种药物学有效量的BR96抗体和医药上可接受载体。该组合物含有的BR96抗体既可以是未修饰的形式结合到一种治疗剂上的(如，药物，毒素、酶或第二种抗体)抗体，也可以是重组形式的(如，嵌合或双特异性BR96)。本组合物还可以包括用于治疗癌症的其他抗体或结合物(例如，一种抗体合剂)。
本发明的抗体组合物可以通过常规给药方式给药，包括，但不局限于此，静脉内，腹膜内、口腔、淋巴内给药，或者直接向肿癌内给药。优选的是静脉内给药。
本发明的抗体组合物可以是各种不同的剂型，包括但不局限于此，溶液或悬浮液，片剂，丸剂、粉未剂、栓剂、聚合微胶囊剂或微型囊剂，脂质体和放射用或输液用溶液。优选剂型取决于给药方式和治疗应用。
优选的该抗体药物组合物还包括现有技术中已知的医药上可接受的常规载体和佐剂，如人血清蛋白，离子交换剂，氧化铝、卵磷脂、缓冲物如磷酸盐，甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白。
本发明组合物的有效的给药方式和剂型要取决于疾病的严重程度和病程，病人的健康状况和对于治疗的反应，以及主治医生的判断。因此，该组合物的剂量相对于个体病人来说，应当是很小的。不过，本发明抗体组合物的有效剂量可在大约1到大约2000mg/m2的范围内。
为了更全面地理解本发明，提供下列实施例。应当明白的是，这些实施例只是解释本发明，而不是以任何形式限制本发明的范围。
实施例1制备BR96单克隆抗体可以运用如前所述的杂交瘤融合技术制备本发明的BR96单克隆抗体，见M.Yeh et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1979)同前，and Yeh et al.，Int.J.Cancer(1982)，同前。简单地说，运用来自人体乳腺腺癌的移植培养细胞作为免疫原对一种三月龄的BAL B/C鼠进行免疫接种，该移植培养细胞被定义为3396或H3396(来自病人乳腺的腺癌，已经在Oncogen，Seattle，Washington建立培养物)。该鼠要接受五次注射在前四次注射中，每次它接受一次腹膜内注射和在鼠体的4个点上进行一次皮下注射。第5次注射时，该鼠只接受一次腹膜内注射。每次注射的细胞总数大约是107个细胞。在最后一次免疫接种三天后，取出脾脏，并将脾细胞悬浮于RPMI培养基中。然后在聚乙二醇(PEG)存在下将脾细胞和P3-X63-Ag 8.653鼠骨髓瘤细胞进行融合，并将该细胞悬浮液在含有选择性HAT培养基的微量滴定孔中生长，方法如Yeh et al.，所述，同前〔也见，Kohler和Milstein，Nature，256∶495-97(1975)和Eur.J.Immunol.6∶511-19(1976)〕。将该混合物接种以形成源于单一融合细胞或克隆系的低浓度培养物。
运用类似于Douillard et al.，在“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay For Screening Monoclonal Antibody Production Using Enzyme-Labeled Second Antibody”，Meth.Enzymol.，92∶168-74(1983)描述的ELISA方法，在这些杂交瘤培养物的上清液中筛选作用于乳腺癌细胞系3396和作用于从皮肤活组织检查得到的成纤维细胞系的直接结合活性。
根据这种方法，将抗原(可与所筛选抗体发生反应的抗原)固定于微量滴定平板上，然后和杂交瘤上层液进行培养。如果上层液含有所需抗体，该抗体将结合到该固定抗原上，并且通过加入一种抗免疫球蛋白抗体-酶结合物和一种该酶的底物以产生一种可测量的光密度变化来检测这种抗体。在本研究中，将乳腺癌细胞或对照成纤维细胞分散到一个有96孔的组织培养平板上(Costar Cambridge，MA)，并在一个湿的37℃培养器(含5% CO2)中培养过夜。然后用100μl新制备的1.0%戊二醛(加入后终浓度为0.5%)将该细胞固定，并在室温下保持15分钟，接着用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗三次。然后再将该细胞用含5%牛血清蛋白(BSA)的PBS阻遏30分钟，再用PBS冲洗三次。然后加入100μl/＃孔来自杂交瘤培养物的上层液，在室温下将这些井孔保温1小时，并用PBS将这些细胞冲洗三次。下一步，将羊抗鼠辣根过氧化酶(Zymed，CA)在0.1%BSA和PBS中稀释后，加入到浓度为100ul/孔将反应物在室温下培养1小时或在37℃下培养30分钟，然后将该细胞用PBS冲洗三次。接着加入100ul/孔的O-苯二胺(OPD)，并将该平板在室温下避光培养5-45分钟。通过根据10-20分钟内孔内颜色的变化来检查与该细胞结合的抗体。加入100ul/孔的H2SO4终止该反应，然后在一种Dynatech(ALexandria，VA)Microelisa自动阅读器上读出490nm处的光吸收率。
应当注意的是，这种测定方法可以通过使用完整的细胞或纯化的可溶性抗原或细胞提取物作为固定抗原来进行。当用可溶性抗原或细胞提取物作为抗原时，开始将该抗原在PBS中以50μl/孔进行平板培养，并在开始测定之前，在室温下将该平板培养过夜。当使用完整细胞作为抗原时，可以使用新鲜的或固定后的细胞。另一种情况中，开始时在培养基中以100μl/孔的104个细胞进行平板培养，并在一个37℃的恒温箱(含5% CO2)中培养过夜。
如下面实施例2所述，选择可以产生与乳腺癌细胞系结合但不能与人成纤维细胞结合的抗体的杂交瘤，并在一种FACS细胞分类器中根据外周血白细胞(PBLS)进行检测。将对于PBLS显示阴性的杂交瘤进行克隆，在体外扩增，然后进一步检测其抗体特异性。将这些能产生与人乳腺癌发生反应的抗体杂交瘤进行再克隆、扩增，并注射到用异十八烷抗原免疫的3月龄BALB/C鼠中，生长成腹水癌。
根据这种方法，获得杂交瘤细胞系BR96，进行克隆，并注射到鼠体内，形成一种腹水癌。如上所述，该BR96杂交瘤已经在AATCC保藏。通过运用固定的重组蛋白A(Repligen，Cambridge，MA)进行亲和色谱分析，从腹水中纯化单克隆BR96抗体。用一种等体积的结合缓冲液(1M磷酸钾，PH8)稀释澄清的腹水，并将其置于一个预先用结合缓冲液平衡过的蛋白A柱子上，该柱子用结合缓冲液充分洗涤，用50mM磷酸，PH3洗脱该抗体。用1M Tris液，PH9中和纯化的抗体部分，以磷酸盐缓冲的盐水进行透析。将纯化的BR96最后无菌过滤，并冷藏或冰冻储存。
实施例2BR96单克隆抗体的特性同型测定为了测定由BR96杂交瘤产生的免疫球旦白的类别，利用以下技术a)Ouchterlony免疫扩散法将杂交瘤细胞上层液试样置于一个25%琼脂板的中心孔中。将单特异性兔抗鼠Ig同型抗体(Southern Biotechnology，Birmingham，AL)置于外侧的孔中，并将此板在室温下培养24-48小时。然后读出沉淀线。
b)ELISA同型法(Isotyping)在Dynatech Immulon 96孔平板中覆盖存在于PBS中的浓度为1ug/ml的羊抗鼠Ig抗体，每孔中加入50ul，加盖后在4℃放置过夜。用PBS/Tween 20，0.05%冲洗此板，加入100ul/孔的培养基在室温下阻滞一小时。冲洗此板后，加入BR96杂交瘤的上层液，并在室温下培养1小时。在用含有2%牛血清白蛋白(BSA)的PBS冲洗后，将此板与连结有过氧化物酶的单一特异性兔抗鼠Ig同型抗体(Zymed，South San Francisco，CA)一起在37℃培养30分钟，再次冲洗此板，然后与在0.1M PH4.5的柠檬酸缓冲液中的1mg/ml OPD和0.03%H2O2一起培养。在一个Dynatech ELISA平板读数器上测定630nm处的光密度。
根据这些方法，测出BR96单克隆抗体是属于IgG3同型抗体。
BR96单克隆抗体的特性BR96抗体表现出与许多类型的癌症具有高度的反应活性，而与正常细胞的反应活性只是有限的。这种特性可通过对冷冻组织切片的免疫细胞学研究和对完整的培养细胞的结合情况的研究实验证明。
免疫组织学利用L.A.Sternberger在《免疫化学》第104-69页(John Wiley和Sons，New York，1979)中描述的过氧化物酶一抗过氧化物酶(PAP)技术以及H.J.Garrigues等人修改的方法”在初级人体黑素瘤组织切片中的与人体黑瘤有关的抗原，P97的测定”，Int.J.Cancer，29∶511-15(1982)，进行免疫组织学研究。从外科手术得到这些试验的靶组织，使用预先在液氮中冷却的异戊烷将该组织在切除后4小时内冷却。将组织在液氮中或-70℃贮存到使用。制备冷冻切片、空气干燥、用丙酮处理并再次干燥〔见Garrigueset al.，同前〕。用苏木精对用于组织学评估的切片染色。为了减少非特异性背景，将切片用在PBS中稀释到1/5的正常人血清进行预培养〔见Garrigues et al.，同前〕。在10%正常人血清和3%兔血清溶液中稀释鼠抗体，兔抗鼠IgG和鼠PAP。兔抗鼠IgG(Sternberger-Meyer免疫化学公司，Jarettsville，MD)稀释至1/50使用。含有2mg/ml特异性纯化的PAP的鼠PAP复合物(Sternberger-Meyer免疫化学公司)稀释至1/80使用。
染色方法包括，用特异性抗体(如BR96)或对照抗体对一系列切片处理2.5小时，在室温下将切片与稀释至1/50的兔抗鼠IgG一起培养30分钟，然后将这些切片在室温下置于稀释至1/80的鼠PAP复合物中30分钟。在每一次用抗体处理后，将载片在PBS中洗涤两次。
通过加入溶于0.05M Tris，pH7.6缓冲液中的新鲜制备的0.5%3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(Sigma化学公司，St.Louis，Mo)和0.01%H2O2进行8分钟免疫组织化学反应〔见Hellstrom et al.，J.Immunol.127∶157-60(1981)〕。进一步将其置于溶于蒸馏水中的1% OSO4溶液中20分钟，以加强染色。用水轻洗切片，在乙醇中脱水，在二甲苯中显色，并置于载片上。用类似方法，用苏木精对切片染色。
对载片编号后分别进行评估，并由一个独立的调查者检查已编号的样品。使用差异干扰反差镜片(Zeiss-Nomarski)对典型的载片拍照。将抗体的染色程度评为0(无反应活性)，+(极弱的阳性细胞)，++(至少1/3的阳性细胞)，+++(多数细胞为阳性)，++++(几乎所有细胞为强阳性)。由于在+和0染色程度的差别比+和++染色程度的差别更不易清楚地区分，所以++或更大的染色等级被认为是“阳性的”。在肿瘤样品中，对肿瘤和基质细胞都要观测。所记录的染色情况是肿瘤细胞的，因为基质细胞完全不被染色或者远比肿瘤细胞的染色弱。
下面表1表明了用BR96单克隆抗体对各种肿瘤和正常组织样本的免疫组织学染色情况。此表清楚地表明，BR96抗体与许多种类的人体癌样品反应，不与肉瘤样品反应，并且对黑素瘤只有很小的反应活性。此外，它对进行试验的任何大量正常人体组织仅显示出有限的反应活性。检测到的与用于试验的正常细胞具有有限反应活性表现在该抗体与扁桃体和睾丸中的小亚群细胞，胰腺中的腺泡细胞、以及胃和食管的上皮细胞结合的反应活性。
表1用BR96单克隆抗体对人体肿瘤和正常组织标本的免疫过氧化物酶染色组织类型 阳性数/试验次数肿瘤肺癌(非小细胞) 14/17乳腺癌 17/19结肠癌 15/18卵巢癌 4/4子宫内膜癌 2/2黑素瘤 2/5
肉瘤 0/5胃癌 2/2胰腺癌 2/2食管癌 2/2颈癌 2/2正常组织肺 0/7脾 0/5乳房 0/2结肠 0/7肾 0/7肝 0/5脑 0/2心 0/3皮肤 0/2甲状腺 0/2肾上腺 0/1卵巢 0/2淋巴结 0/2淋巴细胞团 0/4胰腺 2/2(只有腺泡细胞呈阳性)子宫 0/7视网膜 0/1
睾丸 2/2(只有小亚群细胞是阳性)扁桃体 2/2(只有小亚群细胞是阳性)胃 2/2(上皮细胞是阳性)食管 2/2(上皮细胞是阳性)对BR96抗体与各种培养细胞系的结合也进行了测定。利用Brown等人描述的方法用125I-标记的抗体进行直接结合的测试方法〔“Quantitative Analysis of Melanoma-Associated Antigen P97In Nomal And Neoplastic Tissues”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78∶539-43(1981)〕，或通过使用Coulter-Epics C荧光活化细胞分类器(FACS)Ⅱ进行直接免疫荧光法〔Hellstrom et al.，Cancer Res.46∶3917-3923(1986)〕来识别结合在完整的培养细胞的细胞表面上的抗体。
对于使用FACS细胞分类器进行的结合分析，将2×105-1×106培养细胞等分在含15%胎牛血清(FBS)的IMDM培养基(Gibco，NY)中，使总体积达到500μl/管。在Serofuge上将细胞离心1.5分钟并除去上清液。向每管中加入100μl浓度为10μl/ml的BR96单克隆抗体，将内容物混合并在冰上保持30分钟。通过在Serofuge上离心1.5分钟，用500μl 15%FBS/IMDM将反应混合物洗涤三次(在第三次洗涤后将试管吸干)。然后向每支试管中加入5μl在15%FBS/IMDM中以1∶25稀释度稀释的最优化的FITC-结合的山羊抗鼠IgG抗体(Tago，Burlingame，CA)，将反应混合物混合并培养30分钟。重复洗涤步骤，在将试管吸干后，将每团细胞重新悬浮于200-500μl PBS中。将每份样品在Coulter Epic SC FACS上进行免疫荧光分析并测定平均荧光密度(MFI)。由MFI值决定线性荧光当量(LFE)。将每个测试样品的LFE值被阳性对照的LFE值除，得到用特异性抗体染色细胞测得的亮度和用对照抗体染色细胞测得的亮度的比值。结合情况数据表示在下面的表2中。
表2BR96与各类悬浮细胞结合情况的FACS分析细胞系 比率(10μg/ml)乳腺癌3396 54乳腺癌MCF-7 38乳腺癌3630 22乳腺癌3680 22肺癌2987 15肺癌2707 30肺癌2964 2肺癌3655-3 18结肠癌RCA 34结肠癌3619 22结肠癌3347 5结肠癌HCT116 1结肠癌CB5 27
结肠癌C 30结肠癌3600 16卵巢癌3633-3 11黑素瘤2669 1黑素瘤3606 1黑素瘤3620 1T细胞淋巴系CEM 1T细胞淋巴系MoLT-4 1B细胞淋色系P3HR1 1外周血液白细胞 1表2表明，BR96单克隆抗体与乳腺癌、肺癌和结肠癌细胞系反应，但是不与黑瘤系或者T或B淋巴系反应，也不与正常的外周血液白细胞反应。使用放射物标记抗体的Scatchard分析表明，BR96与3396细胞系结合的近似缔合常数(Ka)为3.6×106抗原位点/细胞这些数据表明，单克隆抗体BR96可以识别在大多数人体癌症上丰富存在(高达106分子/细胞)的细胞表面抗原。
实施例3BR96单克隆抗体进入癌细胞内部进行测量BR96单克隆抗体进入抗原阳性癌细胞内的试验。通过一种方法，将BR96与蓖麻蛋白A链毒素结合，以产生一种免疫毒素BR96-RA，然后测定进入癌细胞的这种免疫毒素。通过测定蓖麻蛋白A链杀死肿瘤细胞的程度而估测，癌细胞对结合物的摄取情况。
该抗体和毒素的结合通过下面实验进行用二硫苏糖醇(5mM)对脱糖基化(Deglycosylated)蓖麻蛋白A链(Inland Labs，Austin，TX)〔也见，Blakey et al.，Cancer Res.47∶947-952(1987)〕进行处理。然后用PBS PH7.2作为洗脱液在G-25 Sephadex上进行凝胶过滤，过滤后物质以2∶1摩尔比加至溶于PBS的抗体中，此抗体预先按照Lambert等人的方法〔J.Biol.Chem.，260∶12035-12041(1985)〕用N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸(SPDP)(Pierce，Rockford，IL)进行修饰。在室温下进行12-24小时的反应，然后用1倍体积的水将此溶液稀释。使用兰色琼脂糖凝胶CL-6B(pharmacia，Uppsala，Sweden)过滤去除未结合的抗体〔参见Knowles et al.，Anal.Biochem.，160∶440-443(1987)〕。
用高盐(10×PBS)对将结合物和过量蓖麻蛋白A链洗脱，并用PBS作洗脱液将其在Sephacryl-300(pharmacia)上进一步纯化。所得到的结合物不含未结合的单克隆抗体或蓖麻蛋白A链，而主要是以1∶1结合的加合物。
然后利用胸苷摄取抑制分析法测量BR96-RA被各种癌细胞系内在化情况。按照这种分析法，抑制3H-胸苷进入癌细胞DNA的抑制率(如对细胞增殖的抑制)即是BR96-RA对细胞的细胞毒性作用的测量值，也是免疫毒素进入细胞的一个测量值。
为进行此分析，将癌细胞以1×104个细胞/孔的浓度置于一个96孔的微滴板中，每孔中有100μl含15%胎牛血清(FCS)的IMDM培养基，将此板在37℃保温12-18小时，使细胞粘连。然后去除培养基。将此平板置于冰上。然后将100μlBR96-RA免疫毒素以1og 10连续稀释的方式，从起始浓度为10μg/ml开始稀释到终浓度为0.01μg/ml，加入。将反应混合物在冰上保持4小时。冲洗此板，加入200μl/ml培养基，并在37℃进一步培养18小时。在此时刻以1μCi/孔的量将50μl3H-胸苷加入，并将此板在37℃含5%CO2培养器中培养6小时。将此测定板在-70℃冷冻至少一小时，并在凝胶干燥剂上解冻15分钟。使用一个PHD细胞收集器，由塑料闪光小瓶中的玻璃纤维过滤器(Filter Strips，No.240-1，Cambridge Technology)收集细胞。然后向闪光小瓶中加入3ml闪烁计数液体，并在一个Beckman LS3891beta闪烁计数器上对位于这些小瓶内细胞计数，每个样品测量1分钟。
对测试的每个细胞系绘制出与相应于免疫毒素的浓度的胸苷结合的百分抑制率图。表示在图1-5中。在每一次测试中，都进行对照试验。分析结果以未处理对照细胞结合的3H-胸苷的百分数表示。
图1描绘了由BR96-RA内在化引起的对胸苷与3396乳腺癌细胞系的细胞结合的百分抑制率。使用2707肺癌细胞系(图2)和C结肠癌细胞系(见图4)得到了相似的结果。BR96-RA没有进入HCT116细胞系，这是一种不与BR96结合的人的结肠癌细胞系(见图3)。图5表明BR96-RA未进入3347，(一种不与BR96结合的结肠癌细胞系);另一方面，与3347细胞结合的BR6-RA未进入此种细胞。因此，这次研究不仅证明BR96抗体的内在化，还证明BR96抗体选择性地进入抗原阳性癌细胞。
实施例4未修饰的BR96单克隆抗体的细胞毒性进行三种类型的实验，以探究在FACS分析试验中观察到的意想不到的结果，即单克隆抗体BR96自身单独(如未修饰状态)具有的细胞毒性。为避免血清中补体的影响，将使用的所有血清加热灭活(56℃，30分钟);此外，对生长于无血清基质中的细胞进行一些FACS分析实验(如下文中所述)，并在无血清存在条件下对细胞进行试验。
首先，用单克隆抗体BR96对来源于各种抗原阳性癌细胞系(3396，2987，3619)的活的悬浮细胞进行处理。用含有浓度为60，30，15，7.5和3.8ug/ml的100ulBR96或对照单克隆抗体的培养基(IMDM，15%FBS)与细胞(5×105)在冰上共培养30分钟。用培养基洗涤细胞两次后，将细胞悬浮于500ul培养基中，并加入染料propidiumiodide对其进行染色，此染料可染死细胞〔Krishan，Cell Biol，66∶188(1975);以及Yeh，J.Immunol.Methods，43∶269(1981)〕。从浓度为1mg/ml染料贮存溶液(在70%乙醇中)中取5ul加入到细胞样品中，在冰上培养15分钟，洗涤一次，最终悬浮于500ul培养基中。利用通过用红色荧光识别死细胞的Coulter Epics C FACS对细胞进行计数，对两个参数分析，即水平方向表示呈现的光散射的值，垂直方向表示的红色荧光对数值。利用Coulter Epics c Quadstat程序计算与细胞成活力相对应的细胞数目。对能够结合BR96的肿瘤细胞和不能结合BR96的肿瘤细胞同时进行同样的研究。结果在图6中。图6表明，使用BR96与源于三种抗原阳性癌细胞一起培养时能很快地杀死细胞。未处理的或抗原阴性细胞不能被BR96杀死。
第二，利用一个96孔的微滴板，预先在有150μl含FBS的IMDM培养基中吸附66小时，在每个孔中将肿瘤细胞(3396，3630，2987，3619和HCT 116)暴露于BR96，37℃ 18小时，每个孔中加入3×103个细胞。以1uci/井孔的量加入50ul3H-胸苷，平板在37℃继续培养6小时。然后将其在-70℃冷冻至少1小时，并在凝胶干燥剂中解冻15分钟，在玻璃纤维过滤器上收集细胞。然后按照前面实施例中所述方法进行3H-胸苷分析，所不同的是将细胞和抗体在37℃培养。图7显示实验结果。BR96抑制3〔H〕胸苷结合进抗原阳性细胞系，这种影响是与剂量相关的。抗原阴性细胞系HCT116不受BR96的浓度影响。
第三，使用Linsley等人所述的修改方法，〔Linsley et al.，“生长调节因子On costatin M细胞受体的识别与特性”，J.Biol.Chem.264∶4282-4289(1989)〕，进行生长抑制分析。在96孔微滴板上，将来源于四种不同细胞系(HCT 116，2987，3396和3630)的细胞接种于含15%胎牛血清(FBS)的0.1ml IMDM中，并在37℃放置3小时。不同浓度的完整BR96单克隆抗体被加至0.1ml体积，然后在37℃连续培养72小时。随后去除培养基，并用结晶紫(0.1%于20%甲醇中)将这些细胞染色30分钟，并用PBS洗涤三次。通过加入0.1ml溶于50%乙醇中的0.1M PH4.2的柠檬酸钠溶液，将结合染料洗脱。样品一式三份在ELISA读数器上分析，测量BR96存在下的吸收率，以及未处理样品的吸收率。这些方法所得结果表示细胞生长的百分抑制率。结果显示于图8。这些分析结果与前面所述的胸苷结合试验的结果(图7)一致。
实施例5BR96抗体的ADCC活性按照Hellstrom等人描述的方法〔Proc.Natl.Acad.Sci。(USA)82∶1499-1502(1985)〕测定BR96单克隆抗体的ADCC活性。简单地说，使用一种如Cerrotini等人描述的测量51Cr释放的短周期51Cr-释放试验〔Adv.Immunol.18∶67-132，(1974)〕，作为肿瘤细胞溶解(细胞毒性)的证据。将健康人的外周血淋巴细胞在Ficoll-Hypaque〔Hellstrom et al.，Int.J.Cancer 27∶281-285(1981)〕上进行分离，以提供相当于对SK-MEL-28细胞具有5%天然致死细胞活性的效应器细胞;通过用100μCi(1Ci＝37Gbq)51Cr在37℃将细胞培养2小时，对细胞(106)进行标记，然后将其洗涤三次并再悬浮于培养基中。将标记的细胞接种于V底微滴板(Dynatech Laboratories，Alexandria，VA)中(每个孔中加入20μl 2×104个细胞)加入纯化抗体BR96(10μg/ml，1μg/ml和0.1μg/ml)，然后在每个孔中加入100μl的2×105个淋巴细胞。将此混合物培养2-4小时，然后将此板以400×g的速度离心。除去上清液，取100μl样品用r计数器测量放射活性。每组进行两次同样的实验;两个相同实验间的差异小于10%。进行几个“交叉回交”实验，其中对肺(或结肠)癌和黑瘤靶进行使用单克隆抗体BR96和使用抗黑瘤单克隆抗体MG-22的平行实验〔Hellstrom et al.，Proc.Natl.Sci.USA，82∶1499-1502(1985)〕，抗黑瘤单克隆抗体MG-22不与多数癌细胞结合。对照实验包括单独培养靶细胞或者分别与淋巴细胞或单克隆抗体一同培养。
从不与抗体或淋巴细胞接触的靶细胞释放至基质中的每分钟计数(cpm)值定义为自发释放，总的释放就是在分析结果时从渗透性溶解的靶细胞中释放的计数值。按下式计算百分细胞毒性;
(试验平均释放-自发释放)/(总释放-自发释放) ×100使用Hellstrom等人描述的方法〔Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，UCLA Symposia On Molecular and Cellular Biology，New Series，eds.Reisfeld & Sell，Liss，New York，Vol27，pp 149-164(1985)〕，通过测定效应细胞对用Leu-11b表面标记的抗血清和豚鼠补体进行培养的灵敏度，来确定效应细胞的特性，本文引用此文作为参考。进行上述工作以测定Leu-11b标记的表达，Leu-11b标记具有天然杀死(NK)细胞的特性，并且可以通过在单克隆抗体BR96存在下，由传递抗人体黑瘤细胞的ADCC的淋巴细胞表达。单独的效应器细胞产生的细胞毒性(“天然杀死作用”)从图9的数据中减去。
对10μg/ml抗体浓度的结果表示在图9中，此结果表明如果BR96具有足够的浓度以及如果靶细胞具有足够浓度的抗原决定簇，BR96可传递ADCC活性。当抗体浓度低于抗体本身表现出细胞毒性的浓度时(通常是约20μg/ml)可以观察到ADCC活性。用单独抗体BR96作为对照(它在试验浓度下产生0%的杀死率)进行51Cr分析。只有使用BR96抗体与细胞系结合时才发现有ADCC活性。因为当单克隆抗体浓度降至0.1μg/ml时，通过ADCC可以杀死那些与BR96结合的源于五种不同癌细胞系的细胞，而不与BR96结合的，源于第6种细胞系2964的细胞不能被杀死。为获得ADCC所需的抗体结合被以下事实进一步证实，即能结合不同抗体L6的两种癌(3619和2987细胞系)都能被L6通过ADCC杀灭，而其它的则不能被杀灭。在此分析条件下，BR96本身只造成释放1%的标记物，甚至于当试验浓度为10μg/ml时。
实施例6BR96传递补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力在人血清作为补体源(补体依赖性细胞毒性)(CDC)存在的条件下，按照与实施例5所述ADCC试验相似的方法(参考文献同前)进行试验，以测定单克隆抗体BR96杀死肿瘤细胞的能力，与实施例5不同的是在每个微试验孔中加入100μl稀释至1∶3～1∶6的正常人血清作为补体源;以取代效应细胞悬浮液。
如图10所示，在0.1～5.0μg/ml的抗体浓度下，可以观察到BR96结合的细胞有CDC，而对于BR96抗原阴性细胞系HCT116和3347则没有CDC。但是，当使用与3347细胞结合的L6单克隆抗体时，能够将3347细胞杀死。以在没有补体存在的条件下进行的BR96试验，作为对照实验。由51Cr释放分析来检测BR96本身单独具有杀死作用。这些数据表明在人血清存在下，在BR96本身单独存在时不具细胞毒性的浓度时，BR96具有细胞毒素作用。(对照抗体不具有CDC)。
实施例7BR96对糖脂和糖蛋白的反应活性测定利用ELISA分析，测定BR96抗体与各种结构已知的碳水化合物的固定糖脂抗原和合成糖蛋白(所谓“新糖蛋白”)的反应活性，这种测试方法使用过量纯化的糖脂和糖蛋白以及抗体(Dr.John Magnani，Biocard，Gaithersburg，MD;Lloyd等人，Immunogenetics 17∶537-541(1983)〕。在微井孔中，将100ng/孔的糖脂从甲醇中干燥。通过培养在磷酸盐缓冲盐水(PBS)PH7.4中稀释至200ng/孔的糖蛋白，将合成糖蛋白覆盖于孔的表面。对溶于0.01M PH7.4Tris-HCl中浓度为10μg/ml的纯化BR96进行分析，此Tris-HCl中存在含1%牛血清蛋白的1%BSA，在相同缓冲液中稀释至1∶100的腹水抗体进行分析。在这些高浓度下大多数结合作用可以被迅速检测到。测得吸收值应是相同孔的平均值。此分析结果概括在图11和12中，图11和12表示BR96与LeY抗原的反应。
这些结果表明，BR96能够与Lewis Y(Fucα1-2Galβ1-4(Fucα2-3)Glc Mac)抗原的一个变种形式结合，并且岩藻糖α1-3与Glc NAc结合后形成能被BR96识别的LeY相关性抗原决定基的一部分。BR96具有高度肿瘤特异性和内在化能力(前面没有描述单克隆抗体与LeY抗原的反应)表明此抗体能识别复合抗原决定簇-包括LeY抗原的一部分。
实施例8BR96F(ab′)2片段的制备与特性通过蛋白A亲合色谱分析，从鼠腹水液体中纯化鼠BR96(IgG3)。简单地说，将脱脂化腹水通过一个含有固定蛋白A基质(Repligen Corp Cambridge，MA)的柱子，柱子预先用1M pH8.0的磷酸钾平衡。在腹水通过后，用平衡缓冲液冲洗柱子，直至用分光光度法不能再检测到旦白质。然后用0.1M pH3.0的柠檬酸缓冲液将被结合的BR96从柱子上洗脱。洗脱后，立即用1.0M，pH9.0的Tris缓冲液中和洗出物，甚至pH为约7.0。然后将单克隆抗体在PBS中透析，并在贮存或使用前将其浓缩。
然后根据Lamoy的方法〔“Preparation of F(ab′)2Fragments from Mouse IgG of Various Subclasses”，Meth.Enzymol.121∶652-663(1986)〕，通过用胃蛋白酶消化纯化的BR96单克隆抗体，产生F(ab′)2片段。将反应混和物通过一个蛋白A亲合色谱柱，剩余的完整抗体和Fc片段被吸附。将生成的F(ab′)2片段制剂在PBS中充分透析，并无菌过滤。
通过凝胶渗透HPLC，SDS-PAGE和对人体乳腺癌细胞系3396(Oncogen，Seattle，WA)进行ELISA分析确定BR96F(ab′)2片段制剂的特性。使用凝胶渗透HPLC对由F(ab′)2制剂组成的蛋白质分子大小进行测定。不同制剂的可重复色谱结果表明75-80%的蛋白质是F(ab′)2。在较高分子量物质如完整BR96或蛋白质聚集体相对应的位置未检测出蛋白质。剩余的20～25%蛋白质在与灭活胃蛋白酶和与较小的非蛋白A结合消化产物相应的位置被洗脱下来。
利用非还原和还原SDS-PAGE测定F(ab′)2制剂中蛋白质的变性分子大小与结构排列。可以典型地观察到在F(ab′)2(约100kdal)位置有一条单一的主带，以及肉眼不可见的污染的完整单克隆抗体带(160kdal)。与灭活胃蛋白酶和小的消化产物相对应的较低分子量带(即小于100kdal)是最小的。在还原条件下得到预期的结果，即只出现双线的主谱带，它位于与轻链或重链剩余片段部分相应的约25kdal处。没有观测到完整的重链。
在用提供抗原的3396细胞进行的ELISA分析中，BR96F(ab′)2片段的功能(结合)活性可与完整BR96相比。如图13所示，用一种HRP-结合山羊抗鼠K轻链试剂测定3396细胞与BR96完整抗体或F(ab′)2片段结合情况。在一个完全相同的平板上，利用与完整抗体结合但不与F(ab′)2片段结合的HRP-结合蛋白A区别完整BR96的结合和F(ab′)2片段的结合(图14)这些结果表明BR96F(ab′)2(Lot RO201-1663-03，lot2)含有微量的完整BR96抗体。可以测定污染的完整抗体浓度是F(ab′)2存在量的8个三倍稀释量，或是约0.01%。另一种F(ab′)2制剂(lotR9011-1481-48，lot1)表明没有可检出量的污染的完整BR96，这说明任何BR96的作用可以解释为是由于Fab区的结合而不是Fc区的结合。
概括地说，通过HPLC和SDS-PAGE分析表明BR96F(ab′)2制剂完全没有污染的完整BR96 IgG。只有在一例中，利用非常灵敏的ELISA方法测定时，发现有可检测水平的污染的完整BR96抗体，此浓度与F(ab′)2片段的存在量相比较只有约0.01%重量。
实施例9嵌合BR96抗体(Chi BR96)的制备与特性按照Fell等人所述的方法〔Proc.Natl.Acad.SCi.USA 86∶8507-8511(1989)〕以及Fell和Folger-Bruce的互补在审专利申请美国申请号243，873，申请日1988、9、14以及申请号No.468，035，申请号1990年1月22日中的方法，两申请与本发明属于相同受让人。使用两步同源重组方法生产本发明的鼠/人嵌合BR96抗体(“ChiBR96”)，所有这些文献公开的内容在此全部引入作为参考。
人重链DNA转染将按照上述方法得到的鼠杂交瘤细胞系BR96(ATCC保藏号为HB10036)，通过在250V，960uFd电容量装置进行电击穿(Gene Pulser.Biorad Laboratories，Richmond，CA)方法，在等渗磷酸盐缓冲盐水(PBS)和30ug/ml hgammalHC-D载体的纯化6.2Kb Xbal限制片段中，由hgammal/HC-D〔保藏于农业研究培养物收集服务处(NRRL)，Peoria，Illinois，NRRL No.B18599)〔图15〕转染按上述方法得到的鼠杂交瘤细胞系BR96(ATCC No.HB10036)，细胞量为8×106个。48小时后，将细胞接种于96孔平板中(104个细胞/孔)。在含有10%(Vol/Vol)胎牛血清(FBS)和2.0mg/ml抗菌素氨基苷G418(GIBCo)的IMDM培养基(GIBCO，Grand Island，NY)中进行选择NeoR的试验。通过ELISA检测分泌的人IgG(Hu gammal)抗体。
在转染两周后，利用Sandwich ELISA分析对培养上清液进行选择。Fc特异性的山羊抗人IgG(CALTAG，San Fran cis co，CA)可用作俘获抗体，与辣根过氧化物酶HRPO结合的FC特异性的羊α人IgG(CALTAG)用作为检测所结合的人IgG抗体，从HuIgG阳性孔中取细胞，稀释后进行亚克隆，根据前面所述方法，用ELISA方法筛选稀释的克隆系检测人IgG gammal。仍用ELISA法对含有人IgGammal的克隆系筛选，以检测鼠IgG3重链。羊抗鼠IgG3(Southern Biotechnology Assoc.，Inc.，Birmingham，AL)作为俘获抗体，与HRPO结合的山羊抗鼠(Southern Biotechnology Assoc.，Inc.)用作为检测鼠IgG3的抗体。
选择一种人IgGgammal阳性鼠IgG3阴性(Hugammal+，MuG3-)细胞系，记作为ChiHBR96。这种重链嵌合杂交瘤细胞系，ChiHBR96对MCF-7细胞具有抗原特异性，且可通过测定人IgG在MCF7细胞上表达的定量ELISA方法测出CHi HBR96表达水平。此细胞系Chi HBR96可表达大约20ug/ml抗原特异性人IgG抗体。
轻链DNA转染按照上述方法，通过电击穿转染ChiHBR96杂交瘤(8×106个细胞)，此实验使用30ug/ml含有人轻链K免疫球蛋白顺序的人轻链重组载体pSV2gpt/Ck(NRRL No.B18507)(见图16所示)并用HINDⅢ线性化。48小时后将细胞接种于96孔平板中(104个细胞/孔)。在含有10%(Vol/Vol)FBS.15ug/ml次黄嘌呤、250ug/ml黄嘌呤和2.25ug/ml霉酚酸(MA)的IMDM培养基中对gpt进行选择。
通过ELISA测定分泌的人Kappa(HuK)抗体按照上述方法，在转染2周后，利用Sandwich ELISA分析筛选培养上清液。山羊α-人K(CALTAG)作俘获抗体，山羊抗人K HRPO(CALTAG)作为检测结合人K的抗体，含有人K抗体的孔中细胞稀释后亚克隆，用ELISA方法筛选亚克隆细胞系，以检测人K或鼠K链。山羊抗鼠K(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)被用作俘获抗体，与HRPO结合的山羊抗鼠K(Fisher Scientific)作为检测鼠K链存在的抗体。选择一种人K阳性，鼠K阴性细胞系(Huk+，Muk-)分析其对MCF-7细胞的抗原特异性，以及利用测定人IgG在MCF-7细胞上表达的定量ELISA方法测定该克隆的表达水平。选择对MCF-7细胞及HuIgG+，MuIgG3-Huk+，Muk-具有抗原特异性的细胞系并标记为嵌合BR96(Chi-BR96)。
这种重链与轻链抗原特异性嵌合BR96(Chi BR96)抗体的初始表达水平大约是25μg/ml。在软琼脂糖中用兔α HuIgG抗体覆盖经过4个连续克隆周期的细胞系以检测分泌的最高量嵌合抗体的细胞〔Coffino等，J.Cell.Physiol.79∶429-440(1972)〕，得到分泌约130μg/ml嵌合抗体的杂交瘤细胞系(ChiBR96)。杂交瘤ChiBR96于1990年5月23日保藏于ATCC，保藏号为ATCC No.HB10460。
Chi BR96的结合利用ELISA竞争结合试验〔Hellstrom等Cancer Res.50∶2449-2454(1990)〕测定本发明Chi BR96抗体和鼠BR96抗体与位于MCF-7细胞上的肿瘤相关性抗原的相对亲合力。简要地说，将与细胞系MCF-7粘连的抗原加至一个96孔微滴盘中(3×104个细胞/孔)，并使其生长约3-4天至融合。除去生长培养基，向每个井眼中加入100μl含0.5%戊二醛的PBS溶液(Sigma化学公司，St.Louis，Mo)将细胞固定30分钟。除去戊二醛，并用PBS轻洗此盘3次。每个井眼中加入200μl结合缓冲液(0.1%BSA的DMEM溶液)将此板阻滞1小时，或在-20℃无限期地贮存。除去结合缓冲液，并将样品和标准品加至各井眼中。将此板加盖，于4℃培养过夜。除去样品和标准品，并用PBS将此板洗涤三次。用含1%马血清的PBS溶液稀释的HRP-结合物加至各井孔中(100μl/井)并在37℃培养1小时。用含有3，3′，5，5′-四甲基-联苯胺(TMB)产色剂(Chromagen)(Genetic Systems，Seattle，WA)的柠檬酸缓冲液进行ELISA。用3N H2SO4阻止显色反应，并将此板在Titertek微板阅读器上在450nm处阅读。此分析表明0.3μg/ml生物素化的(biotinylated)ChiBR96抗体与未标记的ChiBR96或未标记鼠BR96单克隆抗体竞争抗原。用抗生物素蛋白HRPO检测结合的生物素化ChiBR96抗体，并用标准ELISA试剂显色。
如图17所示，两条结合曲线重合说明了两种抗体对肿瘤抗原有同样的特异性和相对亲合力。
实施例10ChiBR96抗体和BR96F(ab′)2片段的特性以及未修饰的ChiBR96和BR96F(ab′)2片段的细胞毒性。
用按照上面实施例8和9所述方法制备的ChiBR96和BR96F(ab′)2片段处理源于BR96抗原阳性癌细胞系3396.2987和MCF-7的活的悬浮细胞，以测定这些抗体的细胞毒性，与本发明BR96单克隆抗体进行比较。按照上面实施例4中所述的FACS方法，进行细胞毒性试验。试验结果表示在图18-20中以与1μg/ml抗体浓度相对应的死细胞百分数表示。
图18和20表明，嵌合BR96抗体和BR96IgG3的F(ab′)2片段与BR96单克隆抗体同样对3396和MCF-7细胞具有细胞毒性。图19表明对于2987细胞的细胞毒性作用远低于对于其它乳腺癌细胞的作用(图18和20)。这些结果表明较高的结合比率(表2)对于这些抗体杀死细胞是重要的，和/或不同的肿瘤细胞对这些抗体的杀死力有不同的敏感度。这些结果说明ChiBR96抗体和F(ab′)2片段本身，即以未修饰的形式，就具细胞毒素，也说明BR96抗体的细胞毒性不依赖于Fc区域。ChiBR96的内在化对ChiBR96抗体进入癌细胞进行测定，与BR96单克隆抗体的内在化进行比较。将这些抗体与蓖麻蛋白A链毒素结合，形成免疫毒素ChiBR96-RA(1-4条蓖麻旦白的A链/每个抗体分子)和BR96-RA(1-2条蓖麻旦白A链/每个抗体分子)，并按照上面实施例3所述方法，利用抑制胸苷摄取试验，测量这些抗体进入癌细胞系3396和3630。
每个测试细胞系的与免疫毒素的浓度相对应的胸苷结合百分抑制图表示在图21和22中。图21描绘了通过ChiBR96-RA和BR96-RA内在化而产生的对来源于3396乳腺癌细胞系的细胞与胸苷结合的百分抑制率。如图中所示，ChiBR96与BR96同样内在化，并且至少与BR96具有同样的杀死肿瘤细胞的能力。使用3630乳腺癌细胞系得到相似的结果(图22)。
Chi BR96抗体的ADCC活性使用下述细胞系乳腺癌细胞系3396、3630和3680(Oncogen，Seattle，WA)与MCF-7(ATCC.No.HTB22)，卵巢癌细胞系3633-3(Oncogen，Seattle，WA);和肺癌细胞系2987，3655-3以及2981(Oncogen，Seattle，WA)，按照上面例5所述方法对ChiBR96的ADCC活性进行测定。用各种抗体浓度的测定结果表示在表3中。
表3中所示用各种浓度抗体的测定结果，表明ChiBR96传递ADCC活性的程度与BR96相同。当抗体浓度低于ChiBR96抗体单独存在时具细胞毒性的浓度时，可以检出ADCC活性。单独使用抗体BR96作为对照，在试验浓度下，它产生0%的杀灭率。只有BR96抗体结合的细胞系具有ADCC活性。
ChiBR96传递补体依赖性细胞毒性能力使用乳腺癌细胞系3396，MCF-7，3630和3680;卵巢癌细胞系3633-3;和肺癌细胞系3655-3，2987与2981，按照实施例6所述方法，在作为补体源的血清(CDC)存在下对ChiBR96杀死肿瘤细胞的能力进行测定。结果表示在表4中。
如表4所示，在含有补体的人血清存在下ChiBR96具有相同于BR96的细胞毒性作用(CDC)。在任何浓度下，BR96和ChiBR96都不是细胞毒素。人血清也不是细胞毒素。
上述结果表明，本发明的完整BR96抗体和嵌合抗体进入了它们所结合的癌细胞中，在未修饰的形式下它们本身就是细胞毒素，并且它们对于表达高含量抗原决定簇的细胞具有ADCC与CDC活性。
实施例11体内测定BR96抗体利用异源移植了人体肿瘤的裸鼠进行一系列试验，测定本发明的未修饰BR96抗体治疗肿瘤的可能性。此外，测定可能对抗肿瘤剂BR96的效用产生影响的一些参数。这些参数包括在靶肿瘤细胞系中抗原表达水平，从肿瘤植入到开始治疗的时间以及剂量的影响。
在所有体内试验中，将人肺腺癌细胞系H2987或H2707肿瘤细胞系移植到所需数目的Balb/C nu/nu鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN)。将这些肿瘤细胞系的细胞在体外生长，收集、洗涤并再悬浮于PBS中，然后在每只鼠的后肋皮下(S.C)植入一千万个细胞。将这几组鼠随机分成相等的较小组，每组有8或10只鼠。
为了增加观测BR96的抗肿瘤作用的机会，仍然需要使抗体集中于发生任何效应的肿瘤植入位置，在肿瘤植入24小时后，在第2天开始治疗。虽然在一些例中治疗开始的时间不同，但是施用BR96和对照MAbs的剂量和时间安排是相同的。通过鼠的尾静脉静脉内(i.v.)注射溶于0.2ml PBS中的治疗剂量。通常的计划是，三天注射一次，共注射5次(Q3DX5)。但是在开始实验中在H2987肿瘤植入后第19和21天时额外注射两次。BR96抗体对2987和2707肿瘤的抗肿瘤作用通常从植入肿瘤细胞的第8天开始，对每只动物每周测量一次肿瘤体积。测量肿瘤长度与垂直宽度用下面通式计算肿瘤的体积肿瘤体积＝最长长度×(垂直宽度的平方/2)然后计算小组平均值并绘制与肿瘤植入的时间相对应的图。
在图23所描绘的开始实验中，用BR96治疗产生了极显著的对H2987细胞系的抗肿瘤作用。与这些细胞结合并进入这些细胞的BR64作为负对照，与PBS处理的对照相比，BR64显示的作用极小。
表5概括了在此第一个实验中，在治疗结束时对该肿瘤影响。
表5用未修饰的BR96在H2987植入后不同时间开始治疗的影响实验1第28天肿瘤的反应编组 MAb 完整的 部分的 稳定的 发展中的1 BR96 2 0 3 52 BR64 0 0 1 93 PBS 0 0 0 10只有用BR96抗体治疗才导致肿瘤完全消失。在这一组中两只动物没有肿瘤，另外三只鼠在用BR96抗体治疗后肿瘤停止生长。没有留下肿瘤迹象的2只鼠，在整个实验过程中都保持没有肿瘤。BR96抗体对已建立的肿瘤的抗肿瘤作用肿瘤治疗的最终目的之一是有效地治疗已确立的正在生长的肿瘤。为了检测BR96是否对所确立的肿瘤具有抗肿瘤作用，以H2987或H2707肺腺癌肿瘤细胞系作为异种移植物植入裸鼠中，在皮下注射一千万个细胞后的第8天，这两种肿瘤细胞系都产生了可触知的肿瘤，延迟开始治疗的时间以提供一种对已建立的肿瘤的抗肿瘤作用的测定方法。
因此，为进一步检验未修饰BR96的功效进行几次实验，在皮下植入肿瘤后的第5天或第8天中止治疗。由于延迟开始治疗时间，肿瘤细胞变成了确定的肿瘤。于是就产生了更难于治疗但是更实际地类似于临床疾病的一种动物模型。
治疗方案概括于表6中。如表中所述，用BR96抗体从不同的时间开始对三组鼠(每10只一组)进行治疗。对照组的鼠在第2天开始接受FA6或PBS治疗。FAb是一种鼠IgG3，它直接抗哺乳动物中不存在的一种细菌抗原，作为与未结合的阴性对照单克隆抗体相称的一个同型抗体。
对于H2987和H2707肿瘤细胞系进行的此实验结果表示于图24，其中绘制出了与肿瘤植入后开始治疗的时间相对应的没有肿瘤的动物数目。在治疗结束时，测定各组鼠肿瘤消失情况，根据没有可触知肿瘤存在来确定。由于治疗是在肿瘤植入后的不同时间开始的，因此确定肿瘤消失所用天数是可变的。较早开始治疗显然更有效，随着肿瘤植入时间增长后开始治疗则效率下降。由于延迟开始治疗使肿瘤长得更大更牢固，因此较晚开始治疗所造成的功效降低给治疗较大和已建立的肿瘤带来了更大的困难。
这些结果表明，BR96对两种不同肿瘤细胞系具有抗肿瘤作用。只是在用BR96抗体治疗的三组鼠中观察到抗肿瘤作用，而那些用对照FA6或PBS治疗的动物未显示出抗肿瘤作用。
很显然，对表达较高水平抗原的肿瘤细胞系H2707的治疗效果与对已确定的肿瘤的治疗效果相比有较大的差别。所观察到的H2707比H2987对用BR96治疗有更大的反应的实验结果与由肿瘤细胞表达的抗原量可以影响BR96治疗的推测是一致的。由上面的数据清楚地表明BR96对测试所用的肿瘤具有抗肿瘤作用。BR96抗体的剂量作用在另一次实验中，测定BR96对H2707肿瘤细胞系的剂量作用。在此实验中，BR96的量以半数对数值下降(从1mg/剂量下降到0.032mg/剂量)。与肿瘤植入后的时间相对应的各组鼠的平均肿瘤体积表示在图25中。对照治疗组的鼠只给最高剂量(1mg/剂量FA6)的单克隆抗体，FA6。这些对照动物未显示抗肿瘤作用，而当BR96抗体以所选择的剂量范围施用时，出现剂量依赖性反应。
F(ab′)2片段与嵌合BR96的抗肿瘤作用另外，测定F(ab′)2BR96片段的抗肿瘤作用，以检测体内抗肿瘤作用是否由FC部分造成的，或者是如体外分析表明的那样，F(ab′)2BR96片段实际上与肿瘤结合，随即进入细胞，足够将细胞杀死。用与完整BR96相同方案F(ab′)2片段的剂量是0.66mg/剂量，与1.0mg/剂量完整IgG3BR96相比，这个剂量与结合区片段的摩尔当量是一致的。对于使用抗体片段治疗的一组动物，与肿瘤植入后的时间相对应的平均肿瘤体积表示在图26中。很显然，抗体片段有一些抗肿瘤作用，尽管这种作用不象完整抗体一样强。在较旱时间点治疗过程中和治疗后即刻，这种效果最显著。
此试验也测定了嵌合BR96的抗肿瘤作用。选择0.32mg/剂量的中间剂量嵌合Mab。这一组鼠的平均肿瘤体积值也表示在图26中。用嵌合抗体BR96进行治疗比用相对应的剂量的鼠BR96IgG3治疗更有效。图27对此作了进一步证明，图27表明用嵌合BR96治疗的8只鼠中有6只在治疗结束时没有可触知的肿瘤。
对各个肿瘤的实验描绘在图27中，图27表明在用完整IgG3BR96抗体(剂量从1.0降到0.1mg/剂量)治疗后没有肿瘤的动物数证实了在治疗完成时有明显的剂量作用。意外的是，用0.032mg/剂量治疗与用0.32mg/剂量治疗产生了相似的抗肿瘤作用。这就使得接受治疗的肿瘤中被杀死细胞的量非常接近于肿瘤连续生长所需的最低量。
用F(ab′)2片段治疗的8只动物中有3只在治疗后没有可触知的肿瘤。因此对于在体内具有抗肿瘤作用的抗体Fc部分不是完全必需的，尽管它能够增加BR96的杀癌细胞性质，特别是在免疫活性动物中。
上面结果表明了未修饰的BR96抗体是体内抗肿瘤细胞系的有效抗肿瘤剂。此外，BR96抗体对阶段性或已确定生长的肿瘤有作用。这表明肿瘤细胞系上较高的抗原密度能够增强BR96杀死这些细胞的能力。这说明任何形式的单克隆抗体，即嵌合抗体、鼠完整IgG3或它的F(ab′)2片段都是有效的抗肿瘤剂。优选的是尽早治疗和较高剂量。
实施例12BR96抗体的定位与生物分配用如实施例11所述治疗实验中所用剂量的放射碘化BR96单克隆抗体给药，以测定生物分配特性。特别是，用完整的IgG3，BR96、嵌合的或F(ab′)2片段与适当的对照(分别是完整单克隆抗体FA6、嵌合96.5和96.5F(ab′)2定位于肿瘤和各种其它器官。
在进行定位实验之前，按照实施例11所述方法给动物注射肿瘤细胞，进行治疗研究。让肿瘤在动物体中生长约2周。在这期间，室温下根据制造商介绍方法，使用10μg碘原(Iodogen)用125I对100μg BR96抗体或片段进行放射标记10分钟。使用同样的方法用131I将对照抗体或片段进行标记。用适当的未标记抗体将这些放射碘化抗体稀释，以达到治疗实验中所用的剂量。将这些特异性和非特异性抗体混合后通过鼠的尾静脉进行静脉内注射。在选择的时间，从这一组中随机地抽鼠，使其麻醉，通过眶从放血并杀死。取出各种组织称重并在一个能区别出这两种放射性同位素碘的γ计数器上计数。由这些数据计算百分注射剂量和每克百分注射剂量。
定位实验中注射抗体24小时累积数据概括于表7中
只有肿瘤组织在特异性和非特异性抗体间表现出显著的差异。所有被测定的其它组织对特异性和非特异性抗体的摄取基本相等。一个可能的例外是对于非特异性抗体FA6在血液中的浓度较低。这说明促进了血液清除此抗体。但是肿瘤对特异性与非特异性抗体之间的差别大于血液中FA6与BR96含量的差别。
表7中的这些数据还表明，不管注射剂量是多少，在特定器官中存在的抗体剂量百分数是恒定的。因而表明当注射较高剂量的抗体时，在肿瘤部位存在较高定量的抗体。此外，这两种肿瘤细胞系在摄取特异性和非特异性抗体方面没有明显差别。
表7还表明，F(ab′)2比IgG 3或嵌合BR96能以更快的速度从动物体中消除。这就能够解释在治疗实验中这种片段比完整抗体的效能低。因此，这种片段的抗肿瘤作用是很快的且在被清除前的短时间内发生。
ChiBR96以相当于IgG3BR96的含量进行定位。与对照嵌合抗体相比较，ChiBR96仅在肿瘤中存在较高的量。这说明与鼠BR96 IgG3比较，ChiBR96效能的提高是由于人体不变区替换引起的。同样重要的是，人体不变区替换不会影响嵌合抗体定位于肿瘤的能力或对其生物分配产生不利影响。
概括起来说，IgG3和BR96的嵌合形式能够特异性地定位于肿瘤部位。此外，在采用相当剂量进行的预备试验中显示了它们的定位作用和治疗作用。通过治疗实验中F(ab′)2片段的抗肿瘤活性也间接证明了F(ab′)2片段的定位作用。这种活性还须在24小时前才发生。
显然，尽管在本发明中已给出了特别具体的实施例，但是在本发明范围内还可以进行变化和修改。因此，最好是用本文所附加的权利要求来限定本发明的范围，而不是通过实施例给出的特定的具体例子来限定。
权利要求
1.一种对人的癌细胞具有特异性免疫反应活性的抗体及其片段，所述抗体的特征在于能进入与之反应的癌细胞内部，传递ADCC或CDC活性，且在不存在宿主效应细胞或补体的情况下，杀死所述的人癌细胞。
2.如权利要求1所述的抗体，其中抗体是一种鼠单克隆抗体。
3.鼠单克隆抗体BR96，通过与保藏于ATCC中的HB10036具有相同特性的杂交瘤产生。
4.杂交瘤HB10036，保藏于ATCC。
5.一种重组蛋白质，它含有权利要求2所述的单克隆抗体的抗原结合区。
6.如权利要求5的重组蛋白质，其中蛋白质是一种人/鼠嵌合抗体。
7.嵌合抗体ChiBR96，通过与保藏于ATCC中的HB10460具相同性质的杂交瘤产生。
8.杂交瘤HB10460，保藏于ATCC。
9.如权利要求5的重组蛋白质，其中抗原结合区连接于具有抗肿瘤活性的第二种蛋白质的一个官能活性部分。
10.如权利要求9的重组蛋白质，其中第二种蛋白质是一种酶，淋巴激活素，制瘤素或毒素。
11.如权利要求5的重组蛋白质，其中抗原结合区与一个抗原反应，此抗原是一个Ley抗原的变种，它包括一个含有岩藻糖α1-3的抗原决定簇。
12.权利要求2所述抗体的Fab，F(ab′)2，或Fv片段。
13.对两种不同的抗原具有结合特异性的双重特异性抗体，所述抗原之一是与权利要求2的单克隆抗体结合的抗原。
14.如权利要求13的双重特异性抗体，其中抗原之一是一个Ley抗原的变种，它包括一个含有岩藻糖α1-3的抗原决定簇。
15.一种单克隆抗体，其抗原结合区竞争性抑制由杂交瘤HB10036产生的单克隆抗体BR96与其靶抗原的免疫特异性结合。
16.如权利要求15的抗体，其中所述抗原是一个Ley抗原的变种，它包括一个含有岩藻糖α1-3的抗原决定簇。
17.一种人/鼠重组抗体，其抗原结合区竞争性抑制由杂交瘤HB100036产生的单克隆抗体BR96与其靶抗原的免疫特异性结合。
18.如权利要求3或7的抗体，其中抗体与一个治疗剂结合形成一种抗体结合物。
19.如权利要求18的抗体，其中治疗剂是一种抗肿瘤药物，一种毒素，一种放射活性剂，第二种抗体或一种酶。
20.一种免疫结合物的组合方法，包括将如权利要求3或7所述抗体与一个可将前体药物转化为细胞毒素药物的酶和所述的前体药物相结合。
21.一种用于治疗人体癌症的药物组合物，含有药物有效量的如权利要求3或7的抗体。
22.一种用于治疗人体癌症的药物组合物，含有药用有效量的至少一种如权利要求18的抗体结合物。
23.一种用于治疗人体癌症的药物组合物，含有药物有效量的至少一种如权利要求9的重组蛋白。
24.一种体内治疗人体癌症的方法，包括给患者施用药物有效量的如权利要求3或7的组合物。
25.一种测定人体组织中存在癌的方法，包括将所述组织的样品与权利要求3或7的抗体接触，并检测所述抗体与所述组织的结合。
26.如权利要求25的方法，其中所述抗体用选自一种放射标记，一种酶，一种发色团和一种荧光素的标记物标记，以产生可检测的信号。
27.一种人体癌症成象的方法，包括给患者静脉注射有效剂量的如权利要求3或7的抗体以检测抗体，使所述抗体定位于癌细胞部位，并检测所述抗体。
28.如权利要求27的方法，其中所述抗体用一种标记物标记，以产生可检测信号，所述标记物选自于一种放射标记，一种酶、一种发色团和一种荧光素(fluorescer)。
29.一种与权利要求3所述抗体的基因型反应的单克隆抗基因型抗体。
30.一种诊断药盒，包括a)如权利要求3或7的抗体;以及b)一种具可测标记和一种如上面(a)所述抗体的特异性结合配体的结合物。
31.如权利要求30的诊断药盒，其中标记选自酶、放射标记、发色团和荧光素(fluorescers)。
全文摘要
本发明涉及与人体癌细胞具有反应活性的新型抗体。尤其是，本发明抗体包括一种鼠单克隆抗体，BR96；一种人/鼠嵌合抗体，ChiBR96；以及BR96的一个F(ab′)
文档编号C12N5/20GK1051389SQ9010725
公开日1991年5月15日 申请日期1990年6月30日 优先权日1989年6月30日
发明者英吉格德·赫尔斯特龙, 卡尔·埃里克·赫尔斯特龙, 乔治·J·施赖伯, 金·福格·布鲁斯 申请人:翁科根两合公司