专利名称：七叶树组织培养产生生育酚的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过组织培养产生生育酚的方法。
自从Routin和Nickell(1956)提出第一个专利以来，应用细胞培养方法生产有用的次生物质已经取得了极大的进展。例如，日本的发酵法生产紫草素已达到了750升的水平，1984年以生物口红进入市场。到目前为止，从植物细胞中获得的有用化学物质已有几百种，包括药物、酶类、色素、香料、杀虫剂、维生素、香精、兴奋剂、食品添加剂等，每年都有许多从细胞培养得到新的有用物质的报道。人们通过改良培养基、添加前体、选择高产细胞株，适当控制培养条件或利用生物转化等不同手段获得许多比原植物高几倍甚至几十倍的有用成分，目前这一技术正在成为人们获得有用物质的一个富有活力的新领域。
越来越多的研究表明，生育酚对于维持人体正常生理活动具有至关重要的作用。人工合成的生育酚为消旋的(dl-型)，而天然产生的生育酚为d-型，据报道d-α-生育酚的生理活性是dl-α-生育酚的1.36倍，而且，近年来，国际社会中的许多组织极力反对使用人工合成的食品添加剂，人们趋于欢迎在食品中使用安全性高的天然添加剂。因此，天然生育酚制品的需求量越来越大。这样，寻求生育酚天然产生的新途径就变得非常迫切。
本发明的目的在于提供一种通过组织培养从七叶树中产生天然生育酚的方法。
本发明所提供的通过七叶树组织培养制备生育酚的方法，包括如下步骤a.将未成熟果实的子叶或果皮接种于含有1ppm萘乙酸、0.5ppm激动素、3%蔗糖和0.6%琼脂的MS培养基上，进行愈伤组织诱导;
b.将诱导所产生的愈伤组织转到含有1ppm萘乙酸、2ppm吲哚丁酸、0.5ppm激动素、500mg/l酪蛋白水解物、3%蔗糖和0.6%琼脂的MS培养基上进行愈伤组织繁殖，每3周继代1次;
c.将上述固体培养的愈伤组织取出后，立即放入-20℃冰柜中，冰冻后置冰冻干燥机上干燥;
d.取干燥后的愈伤组织，加10倍量的石油醚，于组织捣碎机内破碎，倒入三角瓶内，置暗处浸泡24小时，过滤，在氮气保护下，遮光，于70-80℃水浴锅上回收石油醚，蒸干后加少许正己烷溶解，待用;
e.用正己烷湿法装柱，将脱活中性氧化铝装入带筛板的层析柱中，加上上述正己烷溶解物后，先用70-90ml正己烷洗脱，再用7%的乙醚正己烷洗脱，并收集前70-100ml洗脱液，在氮气保护下，遮光蒸干。
本发明具有如下优点七叶树种子很容易失活，繁殖非常困难，七叶树已被国家列为珍稀濒危树种。而对其组织培养工作却没有人报道过，本发明所公开的方法为大规模繁殖该树种提供了光明的前景。生育酚对维持人体正常生理活动所起的作用已为人们所认识，但人工合成的生育酚是消旋的，天然产生的生育酚的生理活性是它的1.36倍，而且，由于人们担心人工合成的生育酚具有一定程度的毒副作用，因此更趋于接受天然产生的生育酚。本发明通过七叶树组织培养制备生育酚，为大规模工业化生产生育酚提供了一条有效的途径，同时，还证明了通过高大的木本科植物组织培养产生有用代谢物的可能性。
下面将结合实施例对本发明作更详细地说明将未成熟的七叶树果实用75%的酒精浸泡1-2分钟，用无菌水冲洗数次，再用0.1%的升汞浸泡5分钟，小心剥取果皮及子叶，切成0.5cm见方的小块，接种于诱导培养基上。诱导培养基是含有1ppm萘乙酸、0.5ppm激动素、3%蔗糖和0.6%琼脂的MS培养基。结果发现，果皮和子叶两者皆可诱导产生愈伤组织，诱导率都较高(80%以上)。组织块在接种后的5-7天开始膨大，10天以后有新鲜的愈伤组织形成。
而成熟种子经严格消毒后，接种于诱导培养基上，结果几乎100%遭到污染。
选择较为疏松、绿色、半透明状的愈伤组织进行愈伤组织繁殖，每3周继代一次。以MS为基本培养基，并加有3%的蔗糖，0.6%的琼脂和500mg/l酪蛋白水解物(CA)，其它激素的配比如表1所示。表中NAA代表萘乙酸，IBA代表吲哚丁酸，K代表激动素。
从表中可以看出，在6号培养基，即NAA1ppm，IBA2ppm，K0.5ppm的培养基上，愈伤组织的生长速度最快，因此，本发明中选用表1中6号培养基做为愈伤组织繁殖用培养基。生长率是培养后组织重量与初始接种量之比。
不同的PH对愈伤组织生长速度的影响如
图1所示。从图中可以看出，同其它许多植物一样，七叶树愈伤组织在PH5.8时生长最为理想。
实验中还发现，当培养温度高于32℃或低于22℃时，愈伤组织的生长都受到抑制，组织块变得坚硬，呈非透明状。同愈伤组织在26℃±1条件下培养时相比，相同时间内生长的组织量，前者仅为后者的一半。因此，愈伤组织的培养最好在25-28℃条件下进行。在相同培养条件下，光照(光照强度为1300Lux)和黑暗中愈伤组织的生长率，经测定分别为7.8和5.1。这表明，光照对愈伤组织的生长有促进作用。
愈伤组织的生长速度与时间的关系如图2所示。图中显示了接种量分别为2克以及3克/50ml培养基时愈伤组织的生长情况。可以看出，两者的愈伤组织都在第10天左右生长速度开始变快。同时还可以看出，接种量不同，生长所持续的时间也不同，初始接种量为2克的持续到第28天，而接种量为3克的持续到第20天左右，以后生长缓慢。
为了制备生育酚，将上述在固体培养基上繁殖的愈伤组织取出后，立即放入-20℃冰柜中，冰冻后，置冰干燥机上，冰冻干燥，然后，放置在-20℃冰柜中备用。
准确称量一定量的样品，加10倍量的石油醚，于组织捣碎机内破碎，用石油醚洗涤玻璃器皿，洗液倒入三角瓶中，密封，暗中浸泡24小时，过滤，每次用10ml左右的石油醚，洗滤渣三次，合并滤液，在氮气的保护下，遮光，于70-80℃水浴锅上回收石油醚。蒸干后，加少量正己烷溶解，待用。
根据材料的量不同，称取8-15克脱活中性氧化铝，于直径为1cm，长30cm带筛板的层析柱中，用正己烷湿法装柱，加入上述正己烷溶解物后，先用70-90ml正己烷洗脱，再用7%的乙醚正己烷溶液洗脱，并收集前70-100ml洗脱液，在氮气保护下，遮光，蒸干。这样，就制备出了生育酚，经鉴定确认为γ-生育酚。
实验中所用正己烷(A.R)由北京化工厂生产，乙醚(A.R)由天津化学试剂二厂生产，石油醚(30-60℃，A.R)由北京五二九五二化工厂生产。
用上述方法制备的生育酚可用于各种目的。
表1 不同的激素浓度对愈伤组织生长的影响激素浓度(ppm)编号 生长率(鲜重)NAA IBA K1 1 0.5 0.3 4.022 2 0.5 0.3 4.423 1 1 0.3 3.804 1 1.5 0.3 4.645 2 2 0.5 4.456 1 2 0.5 5.677 3 1 0.5 4.23注初始接种量为2.2g，培养16天后取样测定。
权利要求
1.一种通过七叶树组织培养制备生育酚的方法，包括a.将未成熟果实的子叶或果皮接种于含有1ppm萘乙酸、0.5ppm激动素、3%蔗糖和0.6%琼脂的MS培养基上，进行愈伤组织诱导；b.将诱导所产生的愈伤组织转到含有1ppm萘乙酸、2ppm吲哚丁酸、0.5ppm激动素、500mg/l酪蛋白水解物、3%蔗糖和0.6%琼脂的MS培养基上进行愈伤组织繁殖，每3周继代1次；c.将上述固体培养的愈伤组织取出后，立即放入-20℃冰柜中，冰冻后置冰冻干燥机上干燥；d.取干燥后的愈伤组织，加10倍量的石油醚，于组织捣碎机内破碎，倒入三角瓶内，置暗处浸泡24小时，过滤，在氮气保护下，遮光，于70-80℃水浴锅上回收石油醚，蒸干后加少许正己烷溶解，待用；e.用正己烷湿法装柱，将脱活中性氧化铝装入带筛板的层析柱中，加上上述正己烷溶解物后，先用70-90ml正己烷洗脱，再用7%的乙醚正己烷洗脱，并收集前70-100ml洗脱液，在氮气保护下，遮光蒸干。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于上述愈伤组织诱导和繁殖是在光照强度为1300勒克斯，温度为25-28℃的条件下完成的。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于接种用的果皮及子叶是被切成0.5×0.5cm的小块。
全文摘要
本发明提供了一种七叶树组织培养及制备生育酚的方法，在含有萘乙酸、激动素的MS培养基上进行愈伤组织诱导，在含有萘乙酸、吲哚丁酸和激动素的MS培养基上进行愈伤组织繁殖，通过层析柱从愈伤组织的石油醚浸出物中制备出生育酚。
文档编号C12P17/06GK1049520SQ9010801
公开日1991年2月27日 申请日期1990年10月8日 优先权日1990年10月8日
发明者胡昌序, 巩志忠 申请人:中国科学院植物研究所