专利名称：能够产生抗猪呼吸和生殖系统疾病致病性病毒的免疫应答的疫苗的制作方法
此申请是现已放弃的1992年10月30日申请的系列申请NO.07/969，071的部分后续申请。
本发明涉及一种能够保护猪免受呼吸系统和生殖系统病毒致病的疫苗，一种防止猪患呼吸和生殖系统疾病的方法，一种生产疫苗的方法，和从一种引起猪呼吸和生殖系统疾病的病毒中获得的DNA。
近年来，北美和欧洲的猪群易于受到呼吸和生殖系统病毒新毒株的感染(见A.A.S.P.，1991年9月/10月，PP.7-11;TheVeterinaryRecord，1992年2月1日，PP.87-89;Ibid.，1991年11月30日，PP.495-496;Ibid.，1991年10月26日，p.370;Ibid.，1991年10月19日，PP.367-368;Ibid.，1991年8月3日，PP.102-103;Ibid.，1991年7月6日;Ibid.，1991年6月22日，p.578;Ibid.，1991年6月15日，p.574;Ibid.，1991年6月8日，p.536;Ibid.，1991年6月1日，p.511;Ibid.，1991年3月2日，p.213)。所鉴别出的第一个新毒株是一种与所谓的神秘猪病(MSD)或“兰耳朵综合征”相关的病毒，这种病目前称作猪不育和呼吸综合征(SIRS)或猪生殖和呼吸综合征(PRRS)。在欧洲，这种病也一直称作猪流行性流产和呼吸综合征(PEARS)、兰色流产病、兰耳朵病(英国)、abortusblau(荷兰)和SeuchenhafterSpatabortderSchweine(德国)，而且该相应的病毒命名为“Lelystad病毒”。在美国，此病也叫作Wabash综合征，神秘猪病(MPD)和猪疫。有时与PRRS相关的一种疾病是增生性间质性肺炎(PIP)。
在英国、德国、比利时和荷兰发现有“兰耳朵病”的暴发流行。在英国的流行曾导致猪展的取消。PRRS的症状包括食欲不佳(厌食)，低烧(发热)，四肢紫绀(耳朵显著呈兰色)，死产，流产，受影响的同窝仔高死率，小猪先天虚弱和Prematureforrowing。由受影响种猪生育的小猪大多数在48小时内死亡。PRRS临床症状包括轻度感冒样症状，呼吸急促(“声重”)，和一种弥散性间质性肺炎。PRRS病毒从与感染动物接触后有大约2周的潜伏期。这种病毒似乎是一种包裹的RNA动脉病毒(arterivirus)(Ibid.，1992年2月1日)。这种病毒曾在猪肺泡巨噬细胞和CL2621细胞中(Benfieldetal，J.Vet.DiagnInvest.，4127-133，1992;Collinsetal，SwineInfertilityandRespiratorySyndrome/MysterySwineDisease.Proc.，MinnesotaSwineConferenceforVeterinarians，PP.200-205，1991)，和在MARC-145细胞(Joo，PRRSDiagnosis，Proc.，AllenD.LemanSwineConference，VeterinaryContinuingEducationandExtension，UniversityofMinnesota(1993)，2053-55)中成功地生长。Wensvoort等人(MysterySwineDiseaseintheNetherlandsTheIsolationofLelystadVirus.Vet.Quart.13121-130，1991)曾报道了成功地培养了一种能引起SIRS的病毒。
PRRS在美国的出现曾对猪牧业带来了不利的影响。在加拿大，PRRS的特征是牝猪的厌食和发热持续2周，后期流产，死产率增加，小猪先天虚弱和快速腹式呼吸及腹泻之后继发新生期死亡。已公开了一些关于引起PRRS的病毒的分离，PRRS感染的诊断方法和抗PRRS病毒疫苗制备方面的工作(见加拿大专利公开NO.2，076，744;PCT国际专利公开NO.WO93/03760;PCT国际专利公开NO.WO.93/06211;和PCT国际专利公开NO.WO93/07898)。
在寻找PRRS致病因素过程中发现的第二个毒株可以引起一种现在称作增生性和坏死性肺炎(PNP)的疾病。PNP的症状和引起该症状的病毒病因学似乎与PRRS及其相应病毒相似，但存在可鉴别的差异。例如，引起PNP的病毒已确信是一种非经典成非典型的猪感冒A病毒(aSIV)。
PNP的主要临床症状是发热、呼吸困难和腹式呼吸。此病影响到不同年龄的猪，但大多数症状出现在4到16周龄之间的猪上。受影响猪的肺弥漫性变红，呈“肉样”稠度(Collins，A.A.S.P.，1991年9月/10月，PP.7-11)。相对而言，受PRRS影响的猪没有表现出明显的发热，而呼吸症状主要出现在有肺损伤的新生猪中(小于3周龄)，其特征是一种弥散性间质性肺炎。
脑心肌炎病毒(EMCV)是引起严重间质性肺炎并发严重间质性、坏死性和钙化性心肌炎的另一种病毒。实验发现EMCV在受影响牝猪中引起生殖系统疾病(Kim等人，J.Vet.Diagn.Invest.，1101-104(1989);Links等人，Aust.Vet.J.，63∶150-152(1986);Love等人，Aust.Vet.J.，63∶128-129(1986))。
近来，在美国中西部地区发现致病性更强形式的PRRS在3-8周龄猪中的发病率有所增加。典型的是，健康的3-5周龄猪在5-7天之后衰弱和发展为疾病。通过常规的病毒鉴别方法对受感染猪组织的检查已表明猪流感病毒(SIV)、假性狂犬病病毒(PRV)、和猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)与这种新型的PRRS无关。
本发明主要是涉及一种疫苗，该疫苗能保护猪免受能引起这种新的、更强致病性PRRS的致病因素影响，还涉及这种疫苗的生产和给药方法，以及编码能引起这种新型PRRS的感染因子部分基因组的DNA。不过，应当确信在本发明的研制过程中所得到的知识将有益于产生防止猪患任何和/或所有猪呼吸和生殖系统疾病的疫苗和方法。例如，本发明人已经鉴别出与以往公开的PRRS病毒病理学不同的至少一种PRRS病毒的病理学特征(见下表1)。因此，本发明不一定必须局限于与引起这种新型PRRS的感染因子相关的疫苗和方法，本发明已将该感染因子命名为PRRS病毒(PRRSV)“Iowa株”。
然后，在现有技术中涉及到抗这些猪病毒的有效疫苗的制备曾表现出了悲观和怀疑态度(TheVeterinaryRecord，1991年10月26日)。现有技术中有人相信人流感疫苗可以产生抗PRRS和PNP作用的保护作用(例如，见Ibid.，1991年7月6日)。尽管如此，一般行政管理部门不主张在食用动物中使用人疫苗，因此，这种方法在实际应用过程中是不可行的(Ibid)。
这些猪生殖和呼吸系统疾病以及如同发生过的它们的一些新变型已经并且将继续对猪饲养业产生不利的影响。令人惊奇的是在美国和世界各地动物疫苗的市场要比人疫苗的市场大。因此，除了通过防止畜牧业动物患病而带来的巨大公共卫生效益之外，研制新的兽医用疫苗还存在一种经济上的动力。
因此，本发明的一个目的是提供一种新的疫苗，该疫苗能保护猪免受可引起猪呼吸和生殖系统疾病的病毒感染。
本发明的另一个目的还提供了一种能防止猪受PRRSVIowa株感染的疫苗。
本发明的另一个目的是提供了一种疫苗，该疫苗可以产生抗一种能引起猪呼吸和生殖疾病的病毒、尤其是抗PRRSVIowa株的有效免疫应答。
本发明的另一个目的是提供一种防止猪受能引起猪呼吸和生殖系统疾病的病毒感染、尤其是防止猪受PRRSVIowa株感染的新方法。
本发明的另一个目的是提供一种能在猪中产生抗猪呼吸和生殖系统疾病致病性病毒、尤其是抗PRRSVIowa株的有效免疫应答的新方法。
本发明的另一个目的是提供一种抗体，该抗体可与能引起猪呼吸和生殖系统疾病的病毒发生免疫结合，尤其是抗PRRSVIowa株。
本发明的另一个目的是提供一种抗体，该抗体可以与能防止猪受猪呼吸和生殖系统疾病的病毒感染的一种疫苗进行免疫结合。
本发明的另一个目的是提供一种抗体，该抗体可以与一种能防止猪受PRRSVIowa株感染的疫苗发生免疫结合。
本发明的另一个目的是提供一种对患有猪呼吸和生殖系统疾病、尤其是患有因PRRSVIowa株引起疾病的猪的治疗方法。
本发明的另一个目的是提供一种对接触过猪呼吸和生殖系统疾病致病性病毒、尤其是PRRSVIowa株的猪的治疗方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于检测可引起猪呼吸和生殖系统疾病(尤其是因PRRSVIowa株引起的疾病)的病毒的诊断药盒。
本发明的另一个目的是提供一种从引起猪呼吸和生殖系统疾病的病毒或感染因子的，特别是从PRRSV的Iowa株的基因组中分离出来的多聚核苷酸。
本发明的另一个目的是提供一种多聚核苷酸，该多聚核苷酸可以编码引起猪呼吸和生殖系统疾病的一种病毒或感染因子、尤其是PRRSV的Iowa株的一种或多种蛋白质。
本发明的另一个目的是提供一种多聚核苷酸，该多聚核苷酸可以编码来源于猪呼吸和生殖系统疾病致病性病毒或感染因子、尤其是PRRSV的Iowa株的一种或多种抗原肽。
本发明的另一个目的是提供一种使用合适细胞系培养猪生殖和呼吸系统病毒或感染因子的一种新方法。
本发明的另一个目的是提供一种使用合适细胞系培养PRRSV的Iowa株的新方法。
本发明的这些和其他目的将通过下面优选实施方案的描述而变得显而易见，这些实施方案描述了一种能保护猪免受猪呼吸和生殖系统疾病致病性病毒或感染因子感染的疫苗，一种能够对引起这种猪病的病毒或感染因子产生有效免疫应答的组合物，一种保护猪免受引起这种猪病的病毒或感染因子感染的方法，和编码引起一种呼吸和生殖系统疾病的病毒或感染因子的一部分基因组的DNA。
图1是生产一种改进的活疫苗的流程图;
图2是一种生产灭活疫苗的方法流程图;
图3是一种概括性的生产一种亚单位疫苗的方法流程图;
图4是一种概括制备基因工程疫苗的过程流程图;
图5和6展示了用从PRRSVIowa株感染的猪中分离的感染因子样本感染10天后的普通猪肺的组织切片;
图7展示了感染9天后限菌猪肺的组织切片，所说的感染是用从PRRSVIowa株感染的猪中分离的感染因子样本进行感染。
图8展示了用从PRRSV的Iowa株感染的猪中分离的感染因子样本感染35天后限菌猪的心脏损伤情况;
图9展示了表现有广泛合体细胞的支气管肺泡洗出培养物，它是从感染后9天的限菌猪制备的，所说的感染是用从Iowa株PRRSV(ISU-12;见下面的实验Ⅰ，(Ⅱ)(C)部分)感染的猪中分离的感染因子的肺过滤样本进行感染;
图10是一种包裹病毒颗粒的电子显微照片，大约70nm的直径大小，表面小刺较短，此颗粒发现于用Iowa株PRRSV感染因子感染的猪肺泡巨噬细胞培养物中;
图11是一种多形的、包裹病毒颗粒的电子显微照片，大约80×320nm大小，并有抗体包裹，此颗粒是从用Iowa株PRRSV感染的猪肺泡巨噬细胞培养物中发现的。
图12(A)-(C)是展示猪肺泡巨噬细胞(SAM)培养物的一系列照片未感染的(A)，用ISU-12感染的那些培养物中的CPE(B)和用ISU-12感染的那些培养物中的IFA(C)(见下面的实验Ⅱ);
图13(A)-(D)是展示PSP-36细胞培养物的一系列照片未感染的(A)，用ISU-12感染后四天的那些培养物中的CPE(B)，用ISU-12感染后5天的那些培养物中的CPE(C)，和用ISU-984，(分离的代表Iowa株PRRSV的第二种病毒)感染5天后的那些培养物中的CPE(D);
图14(A)-(D)是展示ISU-12感染的PSP-36细胞中IFA的一系列照片未感染的(A)，用ISU-12感染2.5天后并用恢复期血清染色(B)，用ISU-12感染2.5天后并用抗PRRSV多克隆抗体染色(C)和用ISU-12感染感染并用抗PRRSV单克隆抗体染色(D);
图15是通放射免疫沉淀(RIP)测定的PSP-36细胞中繁殖的ISU-12的一种蛋白测定情况∶泳道1和2是假感染的PSP-36细胞，用抗PRRSV多克隆血清(1)和恢复血清(2)免疫沉淀;泳道3和4是病毒感染的PSP-36细胞，用抗PRRSV多克隆血清(3)和恢复血清(4)免疫沉淀;
图16是表示构建可引起PRRS的感染株之cDNAλ文库的一般方法流程图;
图17是表示通过特异杂交鉴别Iowa株PRRSV相关感染因子之可靠性cDNA克隆的一般方法流程图;
图18(A)-(C)是表示ISU-12核苷酸序列的开放读框架(ORF′S)，(A);亚基因组mRNA′S，其中方框中的L表示引导序列和(A)n表示基因组3′-末端的多聚(A)尾(B);和用于获得ISU-123′-末端核苷酸序列的λcDNA克隆，其中以实心标棒表示已测序的区和以虚影标棒表示测序的区(C);
图19代表Iowa株PRRSV相关感染因子基因组的1938-bp3′-末端序列;
图20表示由图19的DNA序列编码的推断氨基酸序列;其下面给出的是核苷酸序列;
图21是Iowa株PRRSV(ISU-12)相关感染因子与Lelystad病毒两者之间有关其开放阅读框架-5(ORF-5)部分的核苷酸序列比较;
图22是ISU-12病毒的ORF-6与Lelystad病毒的ORF-6的核苷酸序列比较;
图23是ISU-12病毒的ORF-7与Lelystad病毒的ORF-7之间的核苷酸序列比较;
图24是ISU-12病毒的与Lelystad病毒之间的3′-非翻译核苷酸序列比较;
图25表示未感的Trichoplusian卵细胞匀浆(HI-FIVETM，Invitrogen，San Diego，California);
图26表示用一种含有ISU-12ORF-6基因的具有细胞致病效应的重组杆状病毒感染的HI-FIVE细胞;
图27表示用一种含有ISU-12ORF-7基因的具有细胞致病作用的重组杆状病毒感染的HI-FIVE细胞;
图28表示用一种含有ISU-12ORF-6基因的重组杆状病毒感染的HI-FIVE细胞，将其用抗ISU-12的猪抗血清染色，然后用荧光结合的抗猪IgG染色，其中昆虫细胞正产生一种由ISU-12ORF-6基因编码的重组蛋白;
图29表示用一种含有ISU-12ORF-7基因的重组杆状病毒感染的HI-FIVE细胞，将其用抗ISU-12的猪抗血清染色，然后用荧光结合的抗猪IgG染色，其中昆虫细胞正产生由ISU-12ORF-7基因编码的重组蛋白;
图30表示用ISU-12特异引物对ORF-5(泳道E)，ORF-6(泳道M)和ORF-7(泳道NP)进行PCR扩增的结果，其中泳道SM包括分子量标准，
图31表示在用BamHI和EcoRI限制酶切割质粒DNA之后，表达含有ISU-12基因组之ORF-5(泳道E)，ORF-6(泳道M)或ORF-7(泳道NP)的重组杆状病毒转移载体PVL1393的结果;泳道SM包括分子量标准;
图32表示ISU-12mRNA的Northern印迹分析;
图33A和33B表示从Iowa株PRRSV其他分离物(ISU-22，ISU-55，ISU-79，ISU-1894和ISU-3927)中获得的mRNA的Northern印迹;和
图34是3周龄、PRRSV-血清阴性、无特异性致病原(SPF)猪的平均肉眼肺损伤分级(按受影响肺的百分数表示)的条形图，此组猪以本发明一种实施例的疫苗进行鼻内(IN)或肌肉内(IM)给药，还给出了一组对照猪的条形图(NV/cHALL)。
本发明中，“猪呼吸和生殖系统疾病”是指上述的疾病PRRS、PNP和EMCV，由Iowa株PRRSV引起的疾病，和已经出现并且将继续出现的这些疾病的密切相关的变异疾病。
“防止猪患由猪呼吸和生殖系统致病病毒或感染因子所致疾病”的疫苗，如果在给不受影响的获得使用这种疫苗之后，则不会出现肺损伤或疾病症状，或者不如感染的不受保护猪的损伤或症状严重，而如果给变影响猪使用这种疫苗之后，肺损伤或疾病的症状会消失或不如感染的不受保护猪的肺损伤或症状严重。不受影响的猪是指从未接触过猪呼吸和生殖系统疾病感染因子、或即使接触过猪呼吸和生殖系统疾病感染因子但没有表现出疾病症状的猪。受影响的猪是指表现出疾病症状的猪。可以对猪呼吸和生殖系统疾病的症状进行定量或分级(如，体温/发热、肺损伤[肺感染组织的百分数])或半定量(如，呼吸窘迫的严重程度[下面详细解释])
“猪呼吸和生殖系统病毒或感染因子”可引起如上所述的猪呼吸和生殖系统疾病。
引起新的、毒力更强形PRRS的因子已命名为“Iowa”株PRRSV。由“Iowa”株PRSS病毒的某些分离物引起的疾病与其他猪呼吸和生殖系统疾病的症状相似但比其更严重。临床症状包括嗜眠、呼吸窘迫、“声重”(强迫呼气)、发烧、毛发粗糙、打喷嚏、咳嗽、眼睛浮肿、和偶发结膜炎。损伤可以包括肉眼和/或显微镜下肺损伤和心肌炎。感染因子可以是单一病毒，或与一种或多种其他的感染因子(如，其他病毒或(细菌)相结合。另外，还发现了毒力差和无毒力形的Iowa毒株，它可以引起一系列的上述症状或根本不引起症状，但是仍然可以根据本发明使用它提供一种保护以抵抗猪呼吸和生殖系统疾病。
在各种猪病中的组织损伤是不同的。下面的表Ⅰ对与猪病毒引起的一些疾病相关损伤的生理学观察和病理学进行了比较
表Ⅰ
猪病毒性肺炎比较病理学
损伤PRRS(p)PRRS(o)SIVPNPPRCVPPMVIowa
II型++++++++++++++++
Inter增厚++++++++++++
肺泡渗出物+++++++++++++++
气管坏死--++++++++++++-
合胞体-+++/-+++++++
脑炎++++---+++
心肌炎+/-++----+++
其中“PRRS(p)”代表PRRS病毒的公开病理学，“PRRS(o)”代表本发明人观察到的PRRS病毒的病理学，“SIV”代表猪流感A病毒，“PRCV”代表猪呼吸冠病毒(coronavirus)，“PPMV”代表猪副粘液病毒，“Iowa”是指由本发明人所发现的PRRSV新毒株，“Ⅱ型”是指Ⅱ型肺细胞(它在感染猪中繁殖)，“Inter.”是指间质性，“气管环死”是指末端气管坏死，符号(-)以及(+)至(++++)是指如下的相对严重程度分级
(-)阴性(未发现)
(+)轻度(刚超过观察界限之上)
(++)中度
(+++)严重
(++++)最严重
本发明人已在美国的中西部鉴别出与PRRS相关的PRRSVIowa株。尚未清楚与自然界存在的Iowa株PRRSV相关的疾病是由于一种特异病毒引起，还是由于一种病毒与一种(或多种)其他感染因子结合所致。不过，斑块纯化的Iowa株PRRSV样本似乎是一种单一的特异性病毒。因此，“该Iowa株PRRSV”是指一种特异性的斑块纯化病毒或一种从感染动物中获得的或含有一种病毒与一种(或多种)其他感染因子结合物的组织匀浆，而且用Iowa株PRRSV感染的猪表现出如上所述由Iowa株PRRSV所致的一种或多种疾病症状特征。
最近的资料表明PRRSV的Iowa株与引起常见PRRS的感染因子有所不同。例如，在表现有PRRSV的Iowa株所致疾病症状的感染猪中观察到的损伤比在用常见的以往所述PRRS病毒单独感染的猪中观察到的损伤更严重，而且患有因PRRSV的Iowa株所致疾病的猪其流感病毒也是血清阴性，包括与PNP相关的病毒也是血清阴性。
关于图1-4，提供了制备本发明所包括的各种类型疫苗的方法流程图。所提供的图1-4的流程图是为了举例说明制备本发明疫苗的方法，并不是为了以任何方式限制本发明。
在图1-4中详述的每个方法的第一步是鉴别易于感染猪呼吸和生殖系统病毒或感染因子的细胞学。(为了简化有关疫苗制备的讨论，该术语“病毒”含义是指与猪呼吸和生殖系统疾病相关的病毒和/或其他感染因子)。然后制备敏感宿主细胞的主细胞原液(MCS)。将敏感宿主细胞继续由MCS传代。从MCS′和MCS+n之间的传代细胞制备工作细胞原液(MCS)。
在MCS和MCS+n之间，优选在WCS的敏感宿主细胞学上繁殖一种主要种病毒。从表现出与有意义病毒所致之相应疾病症状的感染猪采取的合适、优选匀浆的组织样本中通过本领域已知的方法分离粗制病毒。用粗制病毒感染合适的宿主细胞、优选WCS样本，然后培养。进一步通过本领域已知的方法从感染的、培养的宿主细胞分离和斑块纯化疫苗病毒。优选的是对用于制备疫苗的病毒进行二次斑块纯化。
然后通过本领域已知的方法从斑块纯化的病毒制备主要种病毒(MSV)。然后将MSV(X)在WCS中通过MSV(X+1)，MSV(X+2)，MSV(X+3)，和MSV(X+4)病毒传代进行至少四次传代。MSV(X+4)被认为是工作种病毒。优选的是，用于本发明的猪研究和疫苗生产的病毒传代是MSV(X+5)，第五代传代的产物。
将工作种病毒与工作细胞原液一起通过已知的方以足够的量进行培养以制备原型疫苗，优选MSV((X+5)。该原型疫苗可以是适用于兽医学领域的任何类型。合适的类型包括修饰的活或减毒疫苗(图1)，灭活的或杀伤的疫苗(图2)，亚单位疫苗(图3)，基因工程疫苗(图4)，和在兽医疫苗领域中承认的其他类型疫苗。可以通过化学处理或加热等，以一种普通技术熟练人员已知的方式将杀伤的疫苗灭活。
在图1-4的每个图所述方法中，制备原型疫苗之后，通过本领域已知的方法建立猪激发模型和临床检测方法。例如，在进行实际疫苗接种/激发研究之前，必须以症状临床检测结果，体征等概念定义所要预防和/或治疗的疾病。如上所述，已经以疾病症状和体征的方式对与PRRSV的Iowa株相关的感染因子进行了定义。对与PRRSVIowa株相关的感染因子的分析临床分析描述见下面的实施例。
在对疾病进行充分定义和特征化之后，可以给猪施用一种原型疫苗，然后使该猪接触能致病的病毒或感染因子。在本领域中已知该方法称为“激发”该猪及其免疫系统。在观察到接触病毒或感染因子的激发猪的应答以及分析了该原型疫苗保护猪的能力之后，通过本领域已知的方法进行了效能研究。然后通过本领域已知的方法以分别的步骤建立效能检测方法，从而产生了准生产系列。
在如图1所述制备一种修饰活疫苗的过程中，一旦制备一种原型疫苗，首先应当建立最佳的细胞生长条件和病毒产生条件，然后通过本领域已知的方法制备一种预试验生产(productionoutline)。一旦完成预试验生产，进一步通过本领域已知的方法制备准生产系列。准生产系列是指一种有希望原型疫苗的大规模生产，它表明了可以生产具有统一标准之系列的能力。制备一种原型活疫苗的一种方法是将病毒感染的细胞(优选主要种病毒感染的细胞)进行一次或多次冻融循环以溶解细胞。可以将冷冻和融化的感染细胞培养物冻干(冷冻干燥)以增加其储存的保藏能力。将其再加水后，该物质可以用作活疫苗。
用于制备灭活疫苗的准许可系列的建立方法(图2)类似于用来制备修饰活疫苗所用的方法，只有一点基本的修改。使细胞生长条件和病毒产生条件最佳化后，还必须使病毒灭活方案最佳化，才可以制备合适的预试验生产。病毒灭活方案及其最佳化一般对于本领域的技术人员是已知的，并且可以依据所研究的特定病毒以已知或可预知的方式变化。
亚单位疫苗的制备(图3)不同于修饰活疫苗或灭活疫苗的制备。在制备原型疫苗之前，必须鉴别出疫苗病毒的保护性或抗原性成份。这种保护性或抗原性成份包括可以在猪中引起特别强的保护性或免疫应答的病毒衣壳蛋白的特定氨基酸片段或碎片(优选是至少5个氨基酸长，特别优选是至少10个氨基酸长);单个或多个病毒衣壳蛋白本身，其寡聚物，和构成病毒亚结构或此亚结构的可鉴别部分或单位的病毒衣壳蛋白的高级联合;存在于病毒表面之上或附近或存在于病毒亚结构如病毒粒子之中的寡聚糖苷、糖脂或糖蛋白;与病毒相连的脂蛋白或脂基，等。可以通过本领域已知的方法鉴别这些成份。一旦鉴别出，则通过本领域已知的方法进一步纯化和/或克隆病毒的保护性或抗原部分(“亚单位”)。
用于亚单位疫苗的准生产系列制备(图3)除某些修改之外类似于用于灭活疫苗(图2)的方法。例如，如果该亚单位是通过重组基因技术产生的，可以通过本领域中技术人员已知的方法(见，如，Maniatisetal，“MolecularCloning∶ALaboratoryManual，”ColdSpringHarborLaboratory(1989)，ColdSpringHarbor，Massachusetts一书的相关章节)最佳地表达克隆的亚单位。另一方面，如果所使用的亚单位代表病毒的完整结构特征，如完整衣壳蛋白，那么必须使从病毒中将其分离的方法最佳化。在另一种情况中，使灭活方案最佳化之后，可以在制备预试验生产之前使亚单位纯化方案最佳化。
基因工程疫苗(图4)是以用于制备其他疫苗的一般方法的修改方法开始的。在斑块纯化之后，可以通过本领域中已知的方法，优选通过使用PSP-36或巨噬细胞作为宿主的常规细胞培养方法从合适的组织匀浆中分离野生型病毒。
通过本领域中已知的方法，优选使用商业上可购买的RNA分离药盒(例如，从Stratagene，LaJolla，California购买的药盒)，通过胍异硫氰酸盐方法从生物学上纯化的病毒或感染因子中提取RNA，并且通过本领域中的已知方法，优选通过在CsCl梯度中超速离心进行纯化。可以通过寡聚(dT)-纤维素柱层析进一步纯化或浓缩RNA。
然后将病毒基因组通过本领域中已知的方法(见Maniatis等人，同上)克隆到一种合适的宿主中，并对病毒基因组进行分析以确定该基因组中产生病毒抗原部分的基本区域。之后的方法一般与用于修饰的活疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗的方法相同。
本发明疫苗可以保护猪以抵抗可引起猪呼吸和生殖系统疾病的病毒或感染因子。优选的是，本发明疫苗保护猪以抵抗与PRRSVIowa株相关感染因子。尽管如此，本发明的疫苗还可以期望保护猪抵抗因接触PRRSVIowa相关感染因子的密切相关变异体而带来的感染。
相当少的病毒可适用于产生活病毒疫苗。活病毒疫苗的优点是可以在疫苗的受体中激活所有可能的免疫应答，包括系统的、局部的、体液的和细胞介导的免疫应答。活病毒疫苗的缺点是有活的外来因子污染的可能，如SV40病毒和牛病毒性腹泻病毒，牛胎血清的一种常见污染物。这种危险，加上病毒可能会在田间转为毒性或涉及到胎儿、幼小动物和其他种时没有被减毒的危险性，远远超过了活疫苗的优点之所在。
可以通过用灭活剂如福尔马林或疏水溶剂、酸等处理病毒，通过用紫外线或X-线照射、通过加热等制备灭活的病毒疫苗。灭活是以本领域中可理解的方式进行的。如果一种病毒不能感染易受感染的细胞，该病毒则认为是灭活的。例如，在化学灭活方法中，用足够量或浓度的灭活剂以足够高的(或低的，因灭活剂而定)的温度或PH对含有病毒的合适病毒样本或血清样本处理足够长的时间以灭活该病毒。在足以灭活该病毒的温度下和足够长时间下加热灭活该病毒。照射灭活是使用一定波长的光或其他能量以足以灭活病毒的时间进行。用于人体的灭活疫苗的例子包括流感疫苗、脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗和乙型肝炎疫苗。用于猪的灭活疫苗的成功和有效举例是猪细小病毒疫苗。
通过上述图3中讨论的方法从半纯化的病毒亚单位制备亚单位病毒疫苗。例如，已经制备出从流感病毒中分离的血凝素和从流感病毒分离的神经氨酸酶表面抗原，并表现出比完整病毒小的毒性。或者，也可以从高度纯化的病毒亚单位制备亚单位疫苗。用于人的疫苗例子是人乙型肝炎病毒的22-nm表面抗原。人疱疹复合病毒亚单位和用于人的亚单位和用于人的亚单位疫苗的许多其他例子是已知的。
在自然界中可以发现减毒病毒疫苗，而且该疫苗可以有自然发生的基因缺失，或者，也可以通过几种已知方法，如在细胞培养物成组织培养物中进行连续传代，制备该疫苗。也可以通过基因缺失或基因突变使病毒减毒。
通过本领域中已知的技术产生基因工程疫苗。这些技术包括使用重组DNA的技术和使用活病毒的技术。例如，可以识别出特定的病毒基因，该基因编码能在猪中诱导较强免疫或预防性应答的蛋白。可以将这种识别的基因克隆到蛋白表达载体如杆状病毒载体中，并用于感染合适的宿主细胞(见，如，O′Reillyetal，“BaculovirusExpressionVectorsALabManual，”FreemanScCo.(1992))。培养宿主细胞，从而表达所需的疫苗蛋白，可以将其纯化到一种所需的水平，然后用于预防猪患呼吸和生殖系统疾病。
基因工程蛋白可以在昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。可以将通过常规方法纯化和/或分离的基因工程蛋白直接接种到动物中，以使其预防猪呼吸和生殖系统疾病。将从猪生殖和呼吸系统疾病感染因子或病毒中获得的包裹蛋白用于疫苗中以诱导中和性抗体。将从猪生殖和呼吸系统疾病感染因子或病毒获得的核蛋白用于疫苗中以诱导细胞免疫。
优选的是，本发明用一种含有从PRRSV之Iowa株获得的多核酸的转移载体转化一种昆虫细胞系(HI-FIVE)。优选的是，本发明的转移载体包含有线性化的杆状病毒DNA和含有从PRRSV之Iowa株获得的多核酸的质粒。可以用线性化杆状病毒DNA和质粒共转染该宿主细胞系，以便制备重组杆状病毒，特别优选的是，本发明的多核酸可编码PRRSV之Iowa株的一种或多种蛋白。
或者，也可以将从猪呼吸和生殖系统疾病感染因子或病毒获得的编码一种和/或多种包裹蛋白和/或核蛋白的RNA或DNA插入到活载体中，如痘病毒或腺病毒中，并用其作为疫苗。
因此，本发明进一步涉及从引起呼吸和生殖系统疾病的病毒之部分基因组中分离的多核酸，优选的是从PRRSV之Iowa株的部分基因组分离的多核酸。该术语“多核酸”是指来源于感染因子的RNA或DNA，以及与该RNA或DNA对应或互补的RNA和cDNA。该多核酸可以用作产生本发明疫苗的一种工具，用作筛选或鉴别感染动物的工具，和用作识别相关病毒和感染因子的工具。
在本发明的一个实施例中，该多核酸编码可引起呼吸和生殖系统疾病的病毒的一种或多种蛋白，优选是编码病毒膜(包裹)蛋白和衣壳蛋白(核蛋白)之一或二者。特别优选的是，本发明的多核酸是来源于基因组3′-端的一个2kb片段，并且它编码一种或多种由PRRSVIowa株之基因组的ORF-5和ORF-6编码的包裹蛋白和/或由该基因组的ORF-7编码的核蛋白。最优选的是，该多核酸是从与PRRSV之Iowa株相关的感染因子基因组分离的;例如，从下面的实验Ⅰ-Ⅲ中所述的因子(ISU-12)分离，并且它选自于由ORF5(SEQIDNO13)，ORF6(SEQIDNO15)，ORF7(SEQIDNO18)和ISU-12基因组的1938-bp3′-末端序列(SEQIDNO8)组成的组。
在本申请文件中，由来源于病毒或感染因子的RNA和/或DNA编码的蛋白或肽，如果其多核酸与编码免疫原蛋白或肽的多核酸具有90%或更大的同源性，则认为是“免疫学上等同的”。在本申请中的“同源性”是指两种或多种病毒或感染因子之间相同核苷酸或氨基酸序列的百分率。因此，本发明的另一方面还包括一种与从呼吸和生殖系统疾病致病性病毒基因组获得的多核苷酸、优选与从PRRSVIowa株相关感染因子的基因组获得的多核酸具有至少90%同源性的分离的多核酸。
可以通过本文所述方法或本领域中普通技术人员已知的方法，用该病毒基因组的相当短片段的多核酸(大约20bp或更长)来筛选或鉴别感染的动物、和/或识别相关的病毒。因此，本发明的另一方面还包括一种基本上由从呼吸和生殖系统疾病致病性病毒部分基因组获得的分离片段组成的分离的(而且如果需要，是纯化的)多核酸，优选从PRRSV之Iowa株相关感染因子的部分基因组获得的多核酸，它至少有20个核苷酸长，优选是20至100个核苷酸长。特别优选的是，该分离的多核酸片段是从ISU-12基因组的1938-bp3′-末端序列(SEQIDNO8)获得的，而最优选的是，它选自于由SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5，SEQIDNO6和SEQIDNO7组成的组。
可以通过用一种或多种合适的限制酶消化对应于(互补于)病毒多核酸的cDNA而获得本发明的分离的多核酸片段，或者使用商业上可获得的自动多核苷酸合成仪来合成该多核酸。
在本发明的另一个实施方案中，该多核酸编码一种或多种来源于呼吸和生殖系统疾病性病毒的抗原肽，优选编码一种或多种来源于PRRSV之Iowa株相关感染因子的抗原肽。如上所述，本发明的多核酸编码来源于呼吸和生殖系统疾病致病性病毒的一种蛋白的抗原部分，优选编码来源于PRRSV之Iowa株相关感染因子的蛋白抗原部分，该蛋白抗原部分至少有5个氨基酸长度，特别优选至少10个氨基酸长度。测定该蛋白的抗原部分的方法对于本领域中的那些普通技术人员是已知的。
本发明还涉及由PRRSV之Iowa株的一种或多种ORF编码的蛋白，优选的是，该蛋白是由选自于下面一组的多核酸序列编码的，所说的一组序列是SEQIDNo8，SEQIDNo13，SEQIDNo15，SEQIDNo18和SEQIDNo19(还参见SEQIDNo9-12);本发明的蛋白和抗原肽可用于血清学检验以筛选接触过PRRSV、尤其是接触过PRRSV之Iowa株的猪。
本发明还进一步涉及引起猪生殖和呼吸系统疾病的病毒或感染因子的生物学纯样本，所说的生殖和呼吸系统疾病其特征是昏睡、呼吸窘迫、被迫呼气、发热、毛发粗糙、打喷嚏、咳嗽、眼睛水肿和偶发结膜炎。本发明的病毒或感染因子的生物学纯样本的进一步特征是它可以引起具有下列组织学损伤的猪生殖和呼吸系统疾病肉眼和/或显微镜下肺损伤、Ⅱ型肺细胞、心肌炎、脑炎、肺泡渗出物形成和合胞体形成。术语“生物学纯的”是指其中所有子代样本都来源于一个单一父代的病毒或感染因子样本。通常“生物学纯”样本是在细胞培养中通过三次斑块纯化而获得的。特别是本发明的生物学纯病毒或感染因子是猪生殖和呼吸系统综合征的Iowa病毒株，其样本已根据布达佩斯条约在美国典型培养物保藏中心(12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852，U.S.A.)以入藏号VR2385，VR2386，-，-，-和-保藏。
对PRRSV的Iowa株也可以通过对其mRNA的Norther印迹分析进行特征化。例如，PRRSV的Iowa株可以含有7或9个mRNA，也可以在其中有缺失。特别是，正如下面实验中所述的，PRRSV的Iowa株的mRNA可以含有多达4个缺失。
本发明还涉及一种预防猪患病毒感染的组合物，它包括一定量的本发明疫苗，所说的一定量是指能有效地激发对引起猪生殖和呼吸系统疾病的病毒的免疫应答，组合物还包括一种生理学上可接受的载体。
有效量的本发明疫苗是指能够激发对该疫苗的足够免疫应答的量，以保护曾接触过引起猪生殖和呼吸系统疾病或相关疾病的病毒的猪。优选的是，对猪的保护程度应当是所要预防的疾病的一种至所有异常生理症状或效应(如肺损伤)需得到显著的减少。
该组合物可以是单剂量给药或重复剂量给药。剂量单位可以含有，如，1-1，000微克的基于病毒的抗原(疫苗)，但不应含有足以能引起付作用或感染生理症状量的基于病毒的抗原。确定有效抗原成份合适剂量的方法在本领域中是已知的。
含有本发明疫苗的组合物可以与佐剂联合给药。佐剂是指一种在与本发明疫苗结合使用时可以增加对本发明疫苗免疫应答的物质。佐剂可以与疫苗在相同时间和相同部位给药，或者在不同时间给药，例如，作为一种加强剂给药。较好的是佐剂也可以以疫苗给药的方式、位点或部位不同的方式、位点或部位对动物给药。佐剂包括氢氧化铝、硫酸铝钾、从大肠杆菌分离的热不稳定性或热稳定性肠毒素、霍乱毒素或其B亚单位、白喉毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、佛氏不完全佐剂、佛氏完全佐剂等等。对于毒素类佐剂、如白喉毒素、破伤风毒素和百日咳毒素，可以在使用之前进行灭活，例如用甲醛处理灭活。
本发明还涉及保护猪免受猪呼吸和生殖系统疾病致病病毒感染的方法，包括给需要预防这种病毒感染的猪使用有效量的疫苗以激发抵抗这种病毒的免疫应答。所说的“保护猪免受感染”以抵抗猪呼吸和生殖系统病毒或感染因子，其含义是指将本疫苗给猪施用后，该猪与对照(未感染的)猪比较表现出减少的(不太严重的)或没有与相应疾病相关的临床症状(如发热)。可以对临床症状进行定量(如，发烧、抗体量、和/或肺损伤)，或半定量(如，呼吸窘迫的严重程度)。
在本发明中，已建立了用于测定受影响猪中呼吸窘迫的系统。本发明的临床呼吸评分系统按如下等级评价受影响猪的呼吸窘迫
0＝无疾病;正常呼吸
1＝当猪紧张应激时(被迫的大量和/或加速呼吸)轻度呼吸困难和呼吸急促
2＝当猪在休息状态时轻度呼吸困难和呼吸急促
3＝当猪在应激状态时中度呼吸困难和呼吸急促
4＝当猪在休息状态时中度呼吸困难和呼吸急促
5＝当猪在紧张应激时严重呼吸困难和呼吸急促
6＝当猪在休息状态下严重呼吸困难和呼吸急促
在这种临床呼吸评分系统中，“0”分是正常，并表示该猪没有受到猪呼吸和生殖系统疾病的影响。“3”分表示中度的呼吸疾病，而“6”分表示非常严重的呼吸疾病。如果以疫苗或组合物给药激发的一组猪表现出其平均临床呼吸得分低于没有给以疫苗或组合物激发的一组相同的猪，那么则认为一定量的本疫苗或组合物是有效的。(当一头猪接触一定浓度的足以在未接种疫苗动物中引起疾病的感染因子时，被认为是“被激发的”)。
优选的，本发明疫苗组合物是在尚未接触能引起生殖或呼吸系统疾病的病毒时直接给猪施用。本疫苗可以口服或非肠道给药。非肠道途径给药的例子包括真皮内、肌肉内、静脉内、腹膜内、皮下和鼻内途径给药。
如果以溶液形式给药，本疫苗可以制备成水溶液、糖浆、酏剂或酊剂的形式。这种制剂在本领域中是已知的，可以通过将抗原和其他合适的添加剂溶解在合适的溶剂系统中而制备。这种溶剂包括水、盐、水、乙醇、乙二醇、甘油、A1液等。本领域已知的添加剂包括人工色素、调味剂、甜味剂和抗微生物防腐剂，如硫汞撒(乙基汞硫代水杨酸钠)。例如，可以加入部分水解的明胶、山梨醇或细胞培养基来使该溶液稳定，并且可以通过本领域已知的方法，使用本领域中已知的试剂如磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钾和/或磷酸二氢钾来缓冲该溶液。
液体制剂还可以包括悬浮液和乳浊液。对于悬浮液的制备，例如，使用一种胶体磨;对于乳浊液的制备，例如使用一种匀化器，在本领域中是已知的。
设计用于注射入体液系统内的非肠道剂型需要合适的等渗性和缓冲到猪体液体相应水平的PH。非肠道剂型在使用前也必须灭菌。
如需要可用氯化钠和其他盐调节等渗性。可以使用其他溶剂，如乙醇或丙二醇来增加组合物成份的溶解度和溶液的稳定性。在本制剂中可以使用的另一些添加剂包括葡萄糖、常用抗氧剂和常用螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)。
本发明还涉及生产本疫苗的方法，包括下列步骤
(A)收集可引起猪呼吸和生殖系统疾病的病毒或感染因子，和
(B)以选自下列一组中的一种方式处理该病毒或感染因子(ⅰ)斑块纯化该病毒或感染因子，(ⅱ)在足以灭活该病毒或感染因子的温度和时间条件下加热该病毒或感染因子，(ⅲ)将病毒或感染因子与一足够灭活该病毒或感染因子量的化学灭活剂接触或混和，(ⅳ)将该病毒或感染因子分解成相应的亚单作并分离出至少一种亚单位，和(ⅴ)合成或分离编码该病毒或感染因子表面蛋白的多核酸，用该多核酸感染合适的宿主细胞，培养该宿主细胞，并从培养物中分离该表面蛋白。
优选的是，通过下列步骤从培养基中收集该病毒或感染因子(ⅰ)沉淀感染的宿主细胞，(ⅱ)溶解沉淀的细胞，和(ⅲ)在进行下一处理步骤之前离心该病毒或感染因子。特别优选的是，在收集之前先将用该病毒或感染因子感染的宿主细胞在合适的培养基中进行培养。
优选的是，在培养感染的宿主细胞之后，向培养基中加入足够沉淀感染细胞量的常用聚(乙二醇)(PEG)溶液来沉淀感染的宿主细胞。可以通过离心进一步纯化沉淀的感染细胞。然后通过本领域中普通技术人员已知的方法溶解该沉淀的细胞。优选的是，通过反复冷冻和融化(特别优选的是进行三次冷冻和融化循环)来溶解该细胞。溶解的沉淀细胞释放出病毒，然后进行收集，优选是通过离心收集。可以通过在CsCl梯度中离心来分离和纯化该病毒，然后从CsCl梯度中回收含有合适病毒的带。
或者，也可以将感染的细胞培养物冷冻和融化以溶解细胞。可以用冷冻和融化的细胞培养物直接用作活疫苗。不过优选的是，将冷冻和融化的细胞培养物进行冻干(用于保存)，然后使用时加水制成疫苗。
该培养基可以含有足以允许该病毒感染细胞生长之浓度的，本领域中认可的缓冲盐水、基本营养源和合适的碳源和氮源。合适的培养基包括Dulbecco′s最低基础培养基(DMEM)、Eagle′s最低基础培养基(MEM)Han′s培养基、199培养基、胎牛血清和其他支持病毒感染细胞生长的等同培养基。该培养基可以补充胎牛血清(达10%)和/或L-谷氨酰胺(达2mM)，或其他合适的添加成份，如常规的生长补充成份和/或抗生素。优选的培养基是DMEM。
优选的是，可以从在合适细胞系中培养的病毒或感染因子制备本发明疫苗。该细胞系优选是PSP-36或能被病毒感染并能培养的等同细胞系，等同于PSP-36的一种代表性细胞系是细胞系PSP-36-SAH，它已经根据布达佩斯条约在美国典型培养物保藏中心(12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852，U.S.A.)于1992年10月28日保藏，保藏号为CRL1117.1。另一种等同细胞系是MA-104，可从WhittakerBioproducts，Inc.(Walkersville)，Maryland)购买到。初步结果表明与PRRSV的Iowa株相关的感染因子可以在猪陀螺状细胞中培养。斑块纯化之后，与PRRSV之Iowa株相关的感染因子引起损伤，其特征列于上表Ⅰ的“Iowa”条下，如图5-8所示。
因此，本发明还涉及一种培养病毒或感染因子的方法，优选的是在选自由PSP-36和能被病毒感染并能培养的等同细胞系组成的组中的一种细胞系中培养。根据本发明培养病毒成感染因子的方法包括感染细胞系PSP-36或一种能被引起猪呼吸和生殖系统疾病的病毒或感染因子所感染并能培养的等同细胞系，然后在合适的培养基中培养感染的细胞系。
优选的是，该病毒或感染因子是PRRSV的Iowa株，或其引起选自PRRS、PNP和相关疾病一组中的疾病。特别优选的是，本疫苗是从PRRSV的Iowa株制备，并在PSP-36细胞中培养的。
该细胞系MA-104是从猴肾细胞获得的，并且是上皮样细胞。MA-104细胞在含有Dulbecco′s最低基础培养基和10%FBS(胎牛血清)的培养盘中形成一个融合单层。当单层形成时，用从一种感染猪的合适组织(如肺和/或心脏)获得的10%匀浆组织样本接种该细胞。优选的是含有合适的抗生素，以允许病毒和宿主细胞的生长而抑制除宿主细胞外的其他细胞(如细菌或酵母)的生长和/或存活。
PSP-366和MA-104两种细胞都可以使PRRS病毒的某些分离物生长至高滴度(超过107TCID50/ml)。PSP-36和MA-104细胞也能使与PRRSV的Iowa株相关的感染因子生长。MA-104细胞还可以使轮状病毒(rotaviruses)、脊髓灰质炎病毒、和其它病毒生长。
CL2621细胞据信是一种非猪来源的上皮细胞，并且是专买的(Boehringer-Mannheim)。与PSP-36和MA-104不同的是某些引起PRRS的病毒样本尚未在CL2621细胞中成功地培养(Bauristaetal，AmericanAssociationofSwinePractitionersNewsletter，432，1992)。
CL2621的基本特征是它是非猪来源的，并且是上皮样的细胞，在MEM培养基中生长。不过，Benfield等人(J.Vet.Diagn.Invest.，1992;4127-133)曾报道了可用CL2621细胞繁殖PRRS病毒，而用MA-104细胞控制脊髓灰质炎病毒的繁殖，因此推论出CL2621与MA-104不相同，并且推论相同的细胞也许不能繁殖两种病毒。
与PRRSV的Iowa株相关的感染因子一般不能在除PSP-36、PSP-36-SAH和MA-104以外的其他细胞系中生长。尽管如此，如上所述，曾报道某些引起PRRS的病毒在CL2621和初级猪肺泡巨噬细胞中生长，而PRRS病毒的某些株不在PSP-36、MA-104或CL2621细胞中生长。
可以用本发明疫苗制备一种可以为接触过病毒或感染因子的患者(本申请中是猪)提供免疫抵抗力的抗体。本发明所包括的抗体在免疫学上可与下面两种的任何一种结合(1)一种保护猪以抵抗可引起呼吸和生殖系统疾病的病毒或感染因子的疫苗或(2)猪呼吸和生殖系统病毒或感染因子本身。还可以用本发明抗体作为一种诊断试剂以确定猪是否曾接触过呼吸和生殖系统病毒或感染因子，而且可用于制备本发明疫苗。可以通过已知方法用该抗体制备免疫亲合柱，并且可以用这种免疫亲合柱分离病毒或感染因子，或其蛋白。
为了激发抗这种疫苗或病毒的抗体，应当用用于制备该疫苗的蛋白免疫合适的宿主动物如小鼠、兔子或用于这种接种的其他动物。然后用一种上述类型的疫苗免疫(注射)该宿主动物，可以选择性地使用一种免疫增强剂(佐剂)，如上所述的那些。优选以特定的间隔时间进一步免疫该宿主动物1至5次，时间间隔优选是每1至4周，最优选是每2周。然后处死该宿主动物，收集其血液。通过已知方法从收集的全血中分离血清。该血清含有抗该疫苗的抗体。还可以通过已知的方法纯化抗体以提供免疫球蛋G(IgG)抗体。
本发明还包括抗本发明疫苗和/或病毒的单克隆抗体。可以通过Kohler等人(Nature，Vol.256(1975)，495-497页)的方法制备单克隆抗体。基本的方法是，将从免疫宿主动物(上述)脾脏完整细胞制剂中获得的免疫细胞通过常规方法与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。培养杂交瘤，并用携带有感染因子(病毒或疫苗)的液体或接种物筛选所产生的培养液。将杂交瘤引入到宿主动物的腹膜内产生该杂交瘤的腹膜生长物。收集宿主动物的腹水溶液可以提供一种由杂交瘤产生的抗该感染因子的单克隆抗体样本。也可以将从杂交瘤细胞培养物获得的上清液用作该单克隆抗体的来源，并通过本领域中普通技术人员已知的方法分离。优选的是，本发明的抗体是IgG或IgM型的免疫球蛋白。
本发明还涉及一种患有呼吸和生殖系统疾病的猪的治疗方法，包括给需要治疗的猪使用有效量的在生理可接受载体中的抗体，该抗体可与引起猪呼吸和生殖系统疾病的病毒免疫结合，或与能保护猪抵抗猪呼吸和生殖系统病毒感染的疫苗免疫结合。
本发明方法还涉及一种用于检测可引起猪呼吸系统疾病、猪生殖系统疾病或猪生殖和呼吸系统疾病的病毒的诊断药盒，它包括上述的本发明抗体和一种指示与所说抗体发生阳性免疫反应的诊断试剂。
本发明的诊断药盒优选是基于对已知免疫荧光检测(IFA)、免疫过氧化物酶检测(IPA)和酶联免疫吸附检测(ELISA)方法的修改。
在IFA中，用丙酮和甲醇溶液固定感染的细胞，将感染猪的恢复期血清抗体与感染细胞一起孵育，优选在37℃下保温约30分钟。出现的阳性免疫反应是该抗体可结合病毒感染的细胞，但不能被进一步的洗涤步骤(通常用PBS缓冲液洗3次)洗掉。然后加入用荧光试剂(FITC)标记的第二种抗体(一种抗-抗体)并孵育，优选是30分钟。阳性免疫反应可引起第二种抗体与第一种抗体的结合，洗涤后被保留下来，并产生荧光信号，对该信号可以进行检测和半定量。阴性免疫反应可产生很小或不产生抗体与感染细胞的结合。因此，荧光标记的第二抗体不能够结合，荧光标记被洗掉，与合适的阳性对照相比较检测出很小或没有荧光。
IPA和ELISA药盒与IFA药盒相似类，不同的是用一种特异性酶替代荧光试剂来标记第二抗体。因此，当加入一种结合到第二抗体上的酶的合适底物时，可产生一种着色产物，这种产物可以通过例如比色法进行检测和定量。
在进行下面实施例的描述过程中本发明的其他特征将更为显而易见，这些实施例只是为了说明本发明，而不是倾向于限制本发明。
实验1
在实施例1中，对5-8周龄猪的地方性肺炎进行了研究。在猪中观察到的PRRSV之Iowa株的显微镜损伤与病毒病因学是一致的。(因此，在下文中，为了使讨论更简便，该术语“病毒”和“病毒的”是指本发明上述含义中的病毒或感染因子，或其特征)。使用从感染猪中分离的并通过0.22μm滤器过滤的肺匀浆将该疾病实验性地转移到普通和限菌猪上。没有表现出常见的猪病毒性呼吸病理改变。在细胞培养物中通过电子显微镜观察到两种类型的病毒颗粒。一种类型大约直径是70nm，并且被包裹，具有短的表面小刺。另一种类型是被包裹的、细长的和多形的，大小为80×320nm，并且有抗体包裹。
(Ⅰ)机料和方法
(A)从感染有自然发生肺炎的猪获得的材料
从SorthwesternIowa的一个有900头包括从种猪产仔到肉食猪的猪群中选三头感染的6周龄猪取其组织进行研究。对该猪群的早期观察发终断级5到7天之后，50-70%的类似感染猪变得食欲不佳，毛发粗糙，昏睡，咳嗽，发热和“声重”。大约10-25%的感染猪有结膜炎。大部分感染猪在7-10天内恢复，但是，10-15%由于二次细菌感染导致严重的发育不全，而不适合于作为肉食出售。在此猪群中疾病开始暴发时就出现猪生殖系统疾病，包括死产率增加，干瘪胎儿，和不育症，但随着时间的推迟会慢慢消失。在哺乳期发生的呼吸系统疾病会一直持续下去。
在从4头不同的6周龄猪获得的福尔马林固定组织中观察到以增生性细支气管炎和肺泡炎为特征的肺损伤。试图分离SIV、假性狂犬病病毒(PRV)和脑心肌炎(EMCV)没有成功。对于冷冻肺切片，免疫荧光检查猪流感病毒(SIV)、假性狂犬病病毒(PRV)和猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)是阴性。从鼻腔中分离出了D型出血败血性巴斯德菌(Pasteurollamultocida)，而从肺中分离出了猪副流感嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)。
从该猪群中进一步获得已断奶10天的5头急性发作的5-6周龄猪。所有的猪体温至少40.5℃。对这些猪进行尸检，收集从具有大多数表现为典型疾毒性肺炎肉眼损伤的猪中获得的肺组织样本，并制备该样本以用于立即接种到没有常见特异性病原体(SPF)的猪中。对从全部5头急性发作的5-6周龄猪中获得的肺、肝、肾、脾、脑、和心脏组织样本进行普通细菌和病毒病原体的培养。收集相同组织的切片，在10%中性缓冲的碎尔马林中固定以进行组织病理学检查。
(B)在普通猪中的实验性传染
(1)实验猪
从没有支原体、PRV、猪呼吸冠状病毒(PRCV)、和可传染性胃肠炎病毒(TGEV)的猪群中获得十六头5周龄的猪。将8头猪置于两个分离的4×5米的房间里，该房间有混凝土地板和自动通风设施。给猪喂18%蛋白玉米大豆定量餐和随意的水。
(2)实验设计
在对患有自然发生的肺炎的猪进行尸检后后马上在Dulbecco′s修饰的Eagle′s最低基础培养基中制备10%肺匀浆，以1000xg离心10分钟澄清，然后再以10，000xg离心10分钟。使澄清的上清液通过0.22μm滤器过滤。用5ml过滤的肺匀浆通过鼻内接种8头猪。用从正常未感染的限菌猪中按上述制备的5ml过滤肺匀浆鼻内接种8头对照猪。
每天监测临床症状和温度并记录。分别在接种后(DPI)5、7、10和15天时使每组中的一头猪进行安死术，并尸检。在尸检时收集组织以用于需氧和厌氧细菌分离法，支原体分离，检测有关猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)、SIV、PRV、副流感病毒3型(PI-3)和牛呼吸合胞体病毒(BRSV)的抗原，以及用于病毒分离。在10%中性缓冲的福尔马林中固定组织以用于组织病理学检查。在使之死亡的时候用福尔马林浸泡以固定肺。
(C)在限菌猪中的实验性传染
(1)实验猪
将8头初乳即断奶的、剖腹产的(CDCD)杂交种1天龄限菌猪随机分入两个隔室(每个隔室4只猪)。以一种铁强化的、无菌、罐装液体牛奶代用品(SPF-LAC，Pet-AgInc，Elgin，Illinois)饲养这些猪。
(2)实验设计
用过滤的(0.22μm)肺匀浆鼻内(3ml)和口服(1ml)接种3天龄的四只主要猪。该过滤物是从感染后(DPI)7天收集的实验感染的普通猪肺制备的。用从正常限菌猪中制备的肺匀浆接种四头对照猪。
分别在感染后(DPI)5、9、28和35天杀死每组中的一头猪。收集肺、肝、肾、脑、脾、胸腺、鼻甲、心脏和小肠组织，并用10%中性缓冲的福尔马林固定以用于组织病理学检查。收集肺、脑、脾和心脏用于病毒分离。收集肺、肝、和脾用于细菌分离。将肺组织立即收集到Friis培养基中用于支原体分离或在-70℃冷冻。
(D)微生物检测
(1)病毒分离
将以1000xg澄清的组织悬浮液(10%W/V)接种到细胞单层上并观察细胞病作用。使用初级胎猪肾培养物、初级猪肺泡巨噬细胞培养物和建立的细胞系PK15、牛鼻甲、幼仓鼠肾(BHK)、Vero和猪试验物(ST)试图分离病毒。从感染的和对照的限菌猪中制备直接支气管肺泡洗出培养物。通过间接免疫荧光使用抗猪细小病毒(PPV)、SIV、牛病毒性腹泻病毒、血细胞凝集脑脊髓炎病毒(HEV)、TGEV和EMCV的参考限菌超免疫或恢复期猪血清以试图检测病毒，通过尿囊内接种10天龄胚胎鸡卵使过滤物盲目地传代三次，每次传代之后测定尿囊液的血细胞凝集活性。
(2)支原体分离
将肺悬浮液接种到支原体肉汤培养基Friis(Friis(1975)，ActaVet.Scand.，27，337)、BHI-TS、D-TS(Rossetal(1971)，JournalofBacteriology，103，707)和BHL(Yamamoto等人(1982)，Proc.Int.PigVet.SocietyCongress，P.94)中。当出现明显生长或在第3、7、14和21天时对培养物进行传代培养，并通过外免疫荧光进行鉴别。(DelGiudiceetal(1967)，JournalofBacteriology，93，1205)。
(3)细菌分离
将鼻甲试抹样本接种到两个血液琼脂平板上以及接种到 MacConkey，Tergitol-7和PMD(以用于分离P.multocida)琼脂上。在CO2和H2的厌氧环境下于37℃下保温一个血液琼脂干板。用一种表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)滋养菌落在第二种平板上交叉找线，并与其他平板在37℃通气下保温。
肺组织是完全以鼻甲试抹物形式平板培养的。在2个血液琼脂平板(需氧和厌氧)和一个Tergitol-7平板上培养肝和脾组织。所有细菌分离物通过标准方法进行鉴别。
(Biberstein(1990)，InDiagnosticProceduresinVeterinaryBacteriologyandMycology，ed.Carteretal，5thed.，pp.129-142，AcademicPressInc.，SanDiego，Cal.;andCarter(1990)InDiagnosticProceduresinVeterinaryBacteriologyandMycology，ed.CarterG.R.andColeJ.R.，5thed.，pp.129-142，AcademicPressInc.，SanDiego，Cal.).
(4)血清学
用血清中和试验测定抗PRV、TGEV和EMCV的血清抗体。用血液凝集抑制试验检测抗EMCV和HEV的血清抗体。用间接免疫荧光试验检测抗BRSV、PI-3、SIV和TGEV的血清抗体。测定限菌血清中的抗PRRSV抗体。通过使用细胞系CL2621的间接免疫荧光检测来测定PRRSV抗体。
(Ⅱ)结果
(A)自然发生肺炎
从急性发作的猪获得的肺没有完全损坏。肉眼观察，肺组织有中度小叶间水肿，并且多发性地形成涉及所有肺叶的肺不张融合线性区。颅侧和中肺叶有5-15%的颅前侧实变。
病理组织学检表明有中度、急性扩散性增生性细支气管炎和肺泡炎。发现有轻度的多发性淋巴浆细胞心肌炎。在其他器官中没有发现损伤。
试图从原始发作期以及后来从猪群中获得的急性发作的猪中分离腺病毒、PRV、SIV、HEV、猪呼吸冠状病毒(PRCV)、猪细小病毒(PPV)、EMCV和肠道病毒，结果病毒分离为阴性。对冷冻肺切片进行免疫荧光检查没有发现猪肺炎为支原体、SIV、猪呼吸合胞体病毒(BRSV)、副流感病毒-3(PI-3)、PRV或TGEV抗原。
上述(Ⅰ)(A)部分中的5头普通SPF猪之一来源的血清在1∶20稀释度时通过间接免疫荧光发现它可与PRRSV发生阳性免疫反应。从这种猪的鼻甲和肺中分别分离出了D型出血败血性巴斯德菌(Pasteurellamultocida)和猪副流感嗜血杆菌(HaemophilusParasuis)。选择用于匀浆和接种的急性受影响的猪肺中没有分离出需氧或厌氧细菌(见方法和材料，上述的(C)(2)部分)。
(B)普通猪研究
感染后7天(7DPI)，所有的主要猪发烧40-41.1℃，并且有中度呼吸窘迫。这些猪食欲不佳和嗜睡，感染后15天，这些猪恢复。
肺脏的肉眼观察变化其特征是没有完全衰弱、轻度小叶间水肿和表现有涉及20-40%肺的多发性肺不张灰褐色线性区。
对感染后7天的肺组织显微镜检查发现有斑块间质性肺炎，其特征是Ⅱ型肺细胞增生，在肺泡腔中有炎性细胞和坏死血细胞碎片混合聚集，并且在肺泡间隔有世噬细胞和淋巴细胞浸润。肺泡腔内含有蛋白性液体。有时，在肺泡腔和间隔中发现合胞体样细胞。
图5表示的是用苏木素-曙红染色的感染后10天普通猪的肺组织切片。在肺泡空间(箭头顶部)中有广泛性的Ⅱ型肺细胞增殖(箭头)和坏死细胞碎片。在第10天观察到的损伤状况和表现与第7天所观察的结果相似。
图6表示的是用苏木素-曙红染色的感染后10天普通猪的肺组织切片。在肺泡空间有合胞体样细胞(箭头)存在。与第7天相比在第10天观察到的Ⅱ型肺细胞增殖更明显，合胞体更多。
在感染后15天损伤及表现出中等严重，但猪的临床症状表现为正常。从肺中没有分离出细菌或支原体。试图分离EMCV、PRV、PRCV、腺病毒和SIV病毒，结果为阴性。对冷冻肺切片的免疫荧光检查没有发现BRSV、PI-3病毒、PRV、SIV、TGEV或猪肺炎支原体抗原。
在对照猪中没有发现肉眼或显微镜损伤。
(C)限菌猪研究
在感染后5天所有接种的主要猪表现了严重的呼吸窘迫和“声重”。体温是40.5℃或更高，并且这些猪食欲不佳和嗜睡。感染后8天这些猪临床症状改善，感染后15天表现为临床正常。没有猪死亡。用保持为临庆正常的正常肺匀浆过滤物接种对照猪。
感染5天后的肉眼观察损伤其特征是肺脏没有完全衰弱、轻度多发性红褐色肺不张和轻度小叶间水肿。显微镜下，有轻度扩散性间质性肺炎，伴有肺泡间隔的单核细胞浸润多病灶区和中度的Ⅱ型肺细胞增生。在肺泡腔中有炎性细胞、坏死细胞碎片和蛋白性液聚集。在其他器官中没有发现损伤。
感染后9天，肺脏没有衰退、有中度小叶间水肿和坚实的红褐色肺不张多发性1-3cm区。图7表示的是用苏木素-曙红染色的感染9天后限菌猪的肺组织切片。有中度的Ⅱ型肺细胞增生(箭头顶部)和合胞体样细胞形成(箭头)。显微镜下，该损伤类似于感染后5天观察到的结果，不同的是Ⅱ型肺细胞增殖更明显，在肺泡间隔和腔内有中等数量的合胞体样细胞。肾脏中肾小管扩张，有些含有淋巴浆细胞渗出物和细胞碎片。
感染后28天，有20%的涉及顶叶和中叶的颅前侧两边肺不张，而其他肺叶有局部的1-2cm肺不张区。显微镜下，肺损伤类似于感染后9天观察到的结果。另外，还有轻度的细支气管周围和小动脉周围淋巴浆细胞聚焦。轻度至中度的淋巴细胞和浆细胞浸润多发性地存在于脉络丛、脑脊膜、心肌和鼻甲中。
图8表示的是感染后35天，肺损伤严重程度减轻，但多发性淋巴浆细胞性心肌炎明显。试图分离PRV、SIV、腺病毒、EMCV、HEV、PPV、肠病毒和PRCV，没有成功。在猪肺泡巨噬细胞中观察到细胞病效应，其特征是细胞变圆、溶解和细胞死亡。在图9中表示的是表现有广泛合胞体的直接支气管肺泡洗出培养物，这些结果在从对照猪中制备的类似培养物中没有观察到。通过负染色免疫电子显微镜检查这些培养物发现有两种类型的病毒样颗粒。一种类型如图10所示是大约直径70nm，被包裹的，并有短的表面小刺。另一种类型，如图11所示，是包裹的，多形的，大约80×320nm，并有抗体包裹。从肺、肝、脾或脑组织中没有分离出细菌。
在感染后28天和35天收集的血清对SIV、EMCV、PRV、TGEV、BRSV、HEV或PI-3病毒没有抗体滴度这些血清对抗PRRS病毒的抗体呈阳性(1∶1280)。
在整个研究过程中对照猪保持正常，在任何组织中没有肉眼或显微镜下的损伤。从对照猪中没有分离出细菌或病毒。
(Ⅲ)讨论
从自然发生地区性肺炎的猪获得的肺脏过滤物在实验性接种到普通和限菌猪中时会引起肺和心脏损伤。在自然发生和实验性疾病中观察到的损伤在病毒病因学方面是一致的。
没有分离出普通的、以前鉴别出的猪病毒性呼吸系统致病原。观察到有细胞病效应，其特征是初级猪肺巨噬细胞培养的细胞溶解，与Yoon等人的PRRS病毒感染相一致(JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation，Vol.4(1992)，P.139)。不过，在本研究中观察到的直接支气管肺泡洗出培养物中的大量合胞体在以前有关PRRS的报告中没有发现。
对感染细胞培养物的电子显微镜观察发现有两种病毒样颗粒。一种70nm带有短表面小刺的包裹病毒样颗粒似乎与Benfield等人报告的PRRS病毒一致(JournalofVeterinaryDiagnosticInvestigation，Vol.4(1992)，P.117)，其他病毒样颗粒似乎不同。没有猪对SIV、PRV、TGEV(PRCV)或EMCV表现出抗体效价。但限菌猪对PRRS病毒的确表现出血清转化。
实验1中再产生的临床疾病其特征是在感染后5天内所有接种的限菌和普通猪中表现出中度至严重的呼吸窘迫。此实验中的疾病比以前实验(CollinsetalandYoonetal.，同上)中观察到的疾病更严重。
Morin等人(CanadianVeterinaryJournal，Vol，31(1990)，P.837)描述的有关最近识别出的A型SIV变异体(aSIV或其相关疾病，同上)的末梢气管上皮坏死和增生在实验1中没有发现。也没有观察到沿肺泡间隔有与aSIV(Morin等人，和Girard等人，同上)相关的纤维蛋白沉淀和透明膜。在实验1中感染后15天以上的活猪中所观察到的严重非化脓性心肌炎与aSIV(Morinetal，andGirardetal，同上)无关。该猪对SIV无血清转化，并且通过在胚胎鸡卵中传代也未检测出SIV。
在PRRS暴发流行和实验性接种中观察到的主要肺损伤是显著的间质性单核细胞浸润(Collins等人，Pol等人，同上)其他人尚未发现在实验1的感染猪中发现的Ⅱ型肺细胞增生、合胞体细胞形成和心肌炎。在用实验1的可过滤感染因子(我们将其命名为PRRSV的Iowa株)再产生的一致性损伤表明本研究中所述的疾病是一种特异性病毒因子或一种PRRS病毒与另一种感染因子联合引起的。
实验Ⅱ
(Ⅰ)材料和方法
(A)田间病例材料和历史
在从因持续性严重的护理期肺炎而经历过PRRS，并且在产下的最后42个同窝仔中只有20个猪存活的猪群中获得1头猪。将该猪杀死，收集肺组织样本并用标准的、无菌匀浆技术使其匀浆。在Eagle′s最低基础培养基(MEM)中制备肺匀浆液(10%W/V)，通过一种0.22mμ过滤器过滤，此匀浆液用作为接种物。
(B)细胞
从购自WhittakerBioproducts，Inc.(Walkersville，Maryland)的MA-104细胞制得一种传代细胞系，命名为PSP-36。将PSP-36细胞的样本分离繁殖，这种细胞系命名为PSP-36-SAH。将猪肺泡巨噬细胞和大约90个其他细胞系(下面的表Ⅱ中描述了它们的一些例子)用于病毒分离。
(C)病毒分离
将上述制备的肺匀浆液以2，000xg或3，000rpm4℃下离心15分钟澄清。上清液通过一个0.22mμ滤器过滤。将过滤物接种到上述的(B)部分中的每个细胞系中。然后将培养物保持于有0-4%胎牛血清(FBS)和抗生素的合适培养基中。每天监测细胞系的细胞病效应(CPE)。如果在8或9天内没观察到CPE，再将培养物盲目传代2-3次。如果发现可疑的CPE，使用抗ISU-12的恢复期猪抗血清以间接免疫荧光检测(IFA)检查该培养物。
(D)病毒效价
在含有2%FBS和1×抗生素的Dulbecco′s最低基础培养基(DMEM)中制备ISU-12分离物的一系列10倍稀释液。将每种稀释液(0.2ml)双份接种于PSP-36细胞和猪肺泡巨噬细胞培养物接种过的Lab-Tek室的每个孔中。感染后3天(DPI)，用冷的80%丙酮和20%甲醛溶液在4℃下固定该室15分钟。然后使用恢复期ISU-12抗血清和抗PRRS病毒血清在IFA中对该室染色。
(E)间接免疫荧光检测(IFA)
用ISU-12分离物感染PSP-36细胞和猪肺泡巨噬细胞培养物。在感染后20和48小时，用冷的80%丙酮和20%甲醇溶液在4℃固定该培养物15分钟。使用从SouthDakotaStateUniversity，Brookings，SouthDakota购买的ISU-12恢复期血清，抗-PRRSV血清和抗-PRRSV单克隆抗体进行IFA。使用未感染的PSP-36细胞和巨噬细胞培养物作为对照。
(F)放射免疫沉淀测定(RIP)
用35S-甲硫氨酸和35S-半胱氨酸标记ISU-12分离物和假感染的PSP-36细胞。用0.5ml 104TCID5的ISU-12病毒感染存在于25cm3烧瓶中的3天龄PSP-36细胞。在感染后24小时，用甲硫氨酸和半胱氨酸含量缺乏的DMEM替代该培养基，并将培养物在37℃保温1小时。然后用含100μci/ml35S-甲硫氨酸(35Met)和35S-半胱氨酸(35Cys)的新鲜甲硫氨酸和半胱氨酸含量不足的DMEM替代该培养基。加入35Met和35Cys之后5小时，用冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(PH7.2)洗涤细胞三次，然后从烧瓶中刮出细胞，以1，000xg离心410分钟沉淀。然后用溶解缓冲液使含有标记病毒蛋白的细胞沉淀物和假感染细胞沉淀物溶解，再按照Zhu等人(Am.J.Vet.Res.，51∶232-238(1990))的方法通过离心澄清细胞残渣。将该溶解物与已在4℃下预先吸收有冷的正常PSP-36细胞溶解物过夜的ISU-12恢复期血清和抗-PRRS病毒血清一起孵育。
在室温下加入琼脂糖-蛋白A珠(从SigmaChemicalCo.，StLouis，Missouri购得)2小时，收集免疫长期复合物。然后用溶解缓冲液洗涤琼脂糖-蛋白A珠的免疫复合物的混合物三次，再用蒸馏水洗涤三次。将混合物再悬浮于50ml样本缓冲液中，按照Zhu等人所述(同上)在SDS-PAGE凝胶上跑带。
(G)电子显微镜观察(EM)
在一种25cm2瓶中用ISU-12病毒感染PSP-36细胞。在感染后48小时，用3%戊二醛(PH7.2)在4℃下固定感染细胞2小时。然后从瓶中刮出细胞，并通过离心沉淀。处理细胞沉淀物并嵌入塑料中。将嵌入塑料的细胞沉淀物切成薄片，染色，然后在透射电子显微镜下按照Poul等人所述(Am.j.Vet.Res.，38∶311-315(1976))进行观察。
(Ⅱ)实验性复制猪生殖和呼吸系统疾病
(A)实验92.1SPF
将上述来源ISU-12的肺过滤物鼻内接种到6头5周龄的无特异性致病菌(SPF)的猪体内。在接种后(DPI)3、5、10、28和43天时杀死猪。
(B)实验92.3SPF
用感染有ISU-12肺过滤物的猪肺泡巨噬细胞物鼻内接种5周龄的6头SPF杂交猪体内。在接种后(DPI)10天和28天杀死ISU-12接种的猪。
(C)实验92.10SPF
用含有105TCID50/ml病毒的在PSP-36上繁殖的3ml ISU-12鼻内接种三头5周龄猪。两头猪作为未接种对照。在接种后5、10、28天各杀死一头实验组猪。并在接种后5天和10天各杀死一头对照猪。
(D)实验92.12.SPF
将22头5周龄的猪分成6组。在组Ⅰ中，用在PSP-36上繁殖的含有105TCID50/ml病毒的3ml斑块纯化的ISU-12(斑块No.1)鼻内接种6头猪(实验组)。在组Ⅱ中，用对照细胞培养基接种6头猪。在组Ⅲ(斑块No.2)和组Ⅳ(斑块No.3)的每组中，用斑块纯化的ISU-12接种2头猪。在组Ⅴ中，用没经斑块纯化的ISU-12接种3头猪。在组Ⅵ中，用ISU-12组织过滤物接种3头猪。
在接种后的5、10和25天各将组Ⅰ和组Ⅱ的每组杀死两头实验猪和对照猪。在接种后10天杀死分别用斑块No.2和No.3接种的两头猪。在接种后的5、10和25天各杀死组Ⅴ和Ⅵ中的一头猪。
(E)显微镜检查
在杀死时收集肺、脑、心脏和脾组织，用10%中性缓冲的福尔马林固定，嵌入石蜡中，用苏木素和曙红染色。
(Ⅲ)结果
(A)病毒培育
(1)在猪肺泡巨噬细胞培养物中培育ISU-12分离物。
在用ISU-12肺过滤物感染的猪肺泡巨噬细胞培养物中于感染后2-3天开始观察到细胞病效应(CPE)。CPE的特征是巨噬细胞聚集和细胞溶解。在ISU-12感染的培养物中大约90%的巨噬细胞培养物于4-5DPI表现出CPE。图12(A)表示在未感染的巨噬细胞培养物中没有观察到CPE。在巨噬细胞培养物中3次传代的ISU-12病毒效价是104-105TCID50/ml。
如图12(C)所示，使用从限菌猪中获得的ISU-12恢复期血清通过IFA在ISU-12感染的猪肺泡巨噬细胞培养物的细胞浆中检测出病毒抗原。在未接种的巨噬细胞培养物中未检测出免疫荧光。
(2)在传代细胞系中培育ISU-12分离物
在测试的大约90个细胞系中(见上述的“材料和方法”(B)部分)，在6个细胞系中表现出病毒复制，它们是PSP-36、PSP-36-SAH、MA-104、滑液细胞、肺泡巨噬细胞和猪鼻甲细胞。
图13(B)表示的是在2DPI开始的CPE，其特征是退化、细胞变圆和细胞聚集。在3-4DPI时，圆形细胞聚集数目增多，并且有些聚集块发生融合。许多园型细胞脱离细胞单层，导致进一步的单层分裂。5DPI后，CPE变得十分广泛，一般涉及到超过95%的单层。如图13(A)所示，在对照PSP-36细胞中没有观察到CPE。ISU-12分离物在PSP-36细胞上于第11次细胞培养传代时可生长至高效价，大约106-107TCID50/ml。
在用从实验性接种了ISU-12肺过滤物的限菌猪中获得的恢复期血清感染的细胞浆中检测出了病毒抗原(见图14(B))。在对照PSP-36细胞中未观察到荧光(图14(A))。
(Ⅲ)病毒特征
(A)ISU-12与PRRS病毒的抗原相关性
通过在IFA中的明亮细胞质荧光显色表明(见图14(C))，抗PRRS病毒分离物VR-2332的单克隆抗体(购自Dr.Benfield，SouthDakotaStateUniversity，Brookings，SouthDakota)和抗PRRSV血清(从USDANationalVeterinaryServicesLaboratory，Ames.Iowa)可与ISU-12感染的PSP36细胞发生反应，但不与未感染的PSP36细胞发生反应。
(B)病毒蛋白
用抗-ISU-12恢复期血清和抗-PRRS病毒血清分析病毒蛋白。两种血清识别至少4种蛋白，分子量分别是19、24、32和61kD(图15)。在图15中，用抗-ISU-12血清(泳道2和5)、抗PRRSV血清(泳道3和4)、抗-PRRSV单克隆抗体(泳道6)或兔抗-PRRSV血清(从Dr.Benfield，SouthDakotaStateUniversity，Brookings，SouthDakota获得)免疫沉淀假感染的(泳道2和3)或ISU-12感染的(泳道4-7)。泳道1和8有分子量标记。这些蛋白在假感染的PSP-36细胞中不明显。
(C)病毒结构
在ISU-12感染的PSP-36细胞中观察到有55-85nm的典型病毒颗粒。这些病毒颗粒是包裹的，呈球形，并且存在于ISU-12感染的PSP-36细胞的细胞浆小囊中。
(Ⅳ)实验性再现疾病
(A)实验92.1SPF
将上述ISU-12来源的肺过滤物鼻内接种到六头5周龄的无特异性致病菌(SPF)的猪上。在接种后(DPF)的3、5、10、28和43天杀死这些猪。在3DPI时，ISU-12猪表现出严重的呼吸窘迫和发烧。这些症状持续0-14天。肉眼观察肺损伤其特征是60%的肺严重多发性灰褐色实变。还有中度的心肌肥大和腹水聚集。显微镜下变化的特征的是严重的增生性间质性肺炎，伴有Ⅱ型肺细胞增生、合体细胞形成、肺泡有渗出物和轻度的间质增厚，有单核细胞。有轻度的非化脓性心肌炎、严重的脑炎和中度的淋巴浆细胞性肾炎。通过NVSL证实在10和28天处死的ISU-12实验性猪对PRRS因子有血清转化。
(B)实验92.3SPF
所有的ISU-12接种的SPF猪在3天内都表现出严重的呼吸系统疾病，持续超过14天。内眼观察的损伤特征是肺部充血、水肿和明显的多发性弥散性肝样变。显微镜下观察，有严重的增生性间质性肺炎、中度肾炎、中度心肌炎和轻度脑炎。通过NVSL证实在接种后10和28天处死的ISU-12接种的猪对PRRS有血清转化。
(C)实验92.10SPF
在5-22DPI发现的接种猪的临床症状包括严重的嗜睡和发烧、中度厌食和中度至重度呼吸窘迫。在整个实验过程中这些猪有中度的流沚现象。在5DPI，显微镜下的损伤包括轻度增生性间质性肺炎和严重坏死化脓性扁桃腺炎。在10DPI观察到中度多发性PIP。伴有Ⅱ型增生、肺泡渗出、多核巨大细胞和合体细胞形成。在10DPI还发现有中度多发性脑炎，伴有血管周围套和神经胶质增生。在10DPI检查出轻度门静脉周围淋巴巨噬细胞性肝炎，轻度非化脓性心肌炎和鼻炎。在26DPI，有严重的间质性肺炎，特征是伴有单核细胞的明显多发性间质增厚、中度多发性Ⅱ型肺细胞增生、中等量的混合性肺泡渗出物，和松散的细支管周围淋巴细胞和巨噬细胞套。还发现有中度多发性心肌炎、轻度肝炎和轻度肾炎及扁桃腺炎。在10DPI时两头ISU-12接种的猪对PRRS有血清转化。
在实验过程中对照猪保持临床正常，既没表现出肉眼的损伤，也没有显微镜下损伤。而它们对PRRS保持血清学阴性。
(D)实验92.12SPF
如上述实验92.10SPF所述，生物学上未克隆的ISU-12对SPF猪有致病性，并且引起间质性肺炎、心肌炎和脑炎。用ISU-12的三个生物学克隆(斑块Nos.1、2和3)接种的猪会引起轻度间质性肺炎，但在这些猪中没有检查出有Ⅱ型肺细胞增生，肺泡渗出，心肌炎和/或脑炎的迹象。在10DPI时所有用ISU-12(包括克隆的或未克隆的)接种的猪对PRRS表现出血清转化。对照猪保持不发生病毒感染和疾病。
(Ⅴ)概述
用从自然患病猪(ISU-12来源的肺和心脏过滤物(0.22mμ)在5周龄SPF猪上实验性的再现了严重的肺炎。由PRRSV，(ISU-12)的Iowa株引起的肺炎其特征在于间质性肺炎，Ⅱ型肺细胞增生，和合体细胞形成。在受影响的猪中观察到心肌炎和脑炎。ISU-12可在猪肺泡巨噬细胞培养物和一种传代细胞系PSP-36中产生细胞病效应(CPE)。通过间接免疫荧光在ISU-12-感染的培养物中检测出了病毒抗原，但在未感染的细胞中未检出。使用多克隆和单克隆抗体通过间接免疫荧光证实ISU-12与PRRS病毒株VR-2332有抗原相关性。不过，在用非斑块纯化的ISU-12感染的猪的显微镜下损伤中观察到有所不同，从而表明在PSP-36中可能生长有另一种病毒或感染因子，而且说明其他病毒或感染因子可能是导致由PRRSV的Iowa株引起的疾病和损伤与在现有技术中报道的有关PRRS病毒引起的疾病不同而且更严重的原因之所在。所有用克隆或未克隆的ISU-12接种的猪在10DPI对PRRS表现出血清转化。对照猪保持没有病毒感染和疾病。
实验Ⅲ
与猪呼吸和生殖系统综合征Iowa株相关的感染因子
3′-末端区的分子克隆和核苷酸序列
(Ⅰ)材料和方法
(A)病毒繁殖和纯化
在下文中，为了使讨论更简便，该术语“病毒”和“病毒性”是指本申请上述有关含义的病毒或感染因子，或该病毒或感染因子的特性。
用传代的细胞系PSP-36分离和繁殖与PRRSV的Iowa株相关的ISU-12分离物。在PSP-36细胞上将ISU-12病毒斑块纯化3次。然后用斑块纯化的病毒感染PSP-36细胞。当超过70%的感染细胞表现出细胞病改变时，将该培养物冷冻和融化三次。以5，000xg在4℃下低速离心来澄清培养基。然后用7%PEG-8000和2.3%NaCl在4℃下过夜并搅拌来沉淀病毒，通过离心将沉淀物制成沉淀小丸。然后再将病毒小丸悬浮于2ml的tris-EDTA缓冲液中，铺到CsCl梯度(1.1245-1.2858g/ml)顶层。以28，000rpm在20℃超速离心大约8小时，可观察到密度为1.15-1.18g/ml的一条清楚带，并收集之。通过IFA测定此带的感染活性效价，发现此效价是106TCID50/ml。通过负染色电子显微镜(EM)还观察到典型的病毒颗粒。
(B)分离病毒RNA
使用一种商业上购买的RNA分离药盒(从Stratagene获得)以CsCl梯度从含有病毒的带中分离总RNA。然后根据柱子生厂厂家(Invitrogen)所述的方法通过寡聚(dT)-纤维素柱层析富集多聚(A)RNA。
(C)构建ISU-12cDNAλ文库
图16表示的是用于构建cDNAλ文库的一般概要方法。使用具有-XhoⅠ限制位点的寡聚(dT)引物通过反转录来完成由mRNA合成第一股cDNA。核苷酸混合物含有普通的dATP、dGTP、dTTP和类似物5-甲基dCTP，它可以保护cDNA免受下一克隆步骤中所用的限制酶的影响。
用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ完成第二股cDNA合成。用T4DNA聚合酶使cDNA末端变钝(平整末端)，用T4DNA连结酶将其连结到EcoRⅠ转接体上，然后再用T4多核苷酸激酶激化(即磷酸化)。用XhoⅠ消化cDNA，并在琼脂糖凝胶上对消化的cDNA大小进行选择。选择大于1kb大小的消化的cDNA，并通过商业上可买到的DNA纯化药盒(GENECLEAN，可从BIO101，Inc.，LaJolla，California购得)进行纯化。
将纯化的cDNA连接到λ噬菌体载体臂上，用XhoⅠ和EcoRⅠ粘性末端加工处理。将连结的载体装配到含有λ提取物的感染性λ噬菌体中。用大肠杆菌细胞的SURE株(从Stratagene获得)进行转染，然后扩增该λ文库并在XL-1蓝色细胞系中滴定。
(D)通过鉴别性杂交筛选λ文库
图17表示的是通过鉴别性杂交来识别PIP病毒ISU-12株之确认可靠性克隆的一般概要步骤，并在下文中进行了描述。将λ文库置于XL-1蓝色细胞上，将斑块移到尼龙膜上，共两份，并通过惯用方法用0.5NNaOH变性。按照柱子生产厂家(Invitrogen)所述通过寡聚(dT)纤维素柱层析分离由病毒感染的PSP-36细胞和非感染的PSP-36细胞得到的信使RNA。
根据生产厂家(Amersham)所述在32.P-dCTP存在下使用随机引物由分离自病毒感染的PSP-36细胞和正常PSP-36细胞的mRNA合成互补DNA探针。然后通过Sephadex G-50柱层析分别纯化两种探针(第一个是从病毒感染的PSP-36细胞合成，另一个是来自正常的、未感染的PSP-36细胞)。用该探针在42℃、50%甲酰胺中分别与双份的尼龙膜杂交。分离能与从病毒感染细胞制备的探针杂交但不与从正常细胞制备的探针杂交的斑块。借助于G408辅助噬菌体通过体外切割获得含有病毒cDNA插入物的噬菌体质粒。然后在XL-1蓝色细胞上扩增获得的噬菌体质粒(Phagemids)。通过Qiagen柱层析分离含有病毒cDNA插入物的质粒，并进一步测序。
(E)核苷酸测序和序列分析
通过Qiagen柱层析纯化含有病毒性cDNA插入物的质粒，并用普通的和反向引物，以及各种内部寡聚核苷酸引物通过Sanger′s双脱氧方法测序。序列是从至少三个分离克隆中获得的。如果获得的是模糊的序列数据则应对另外的克隆或区域进行测序。使用两个计算机软件程序GENWORKS(Intelligenetics，Inc.，MontainView，California)和MACVECTOR(InternationalBiotechnologies，Inc.，NewHaven，Connecticut)分别对核苷酸序列数据组合和分析。
(F)寡聚核苷酸引物
使用一种自动DNA合成仪(AppliedBiosystems)以单股DNA的形式合成寡聚核苷酸，并通过HPLC纯化。合成寡聚核苷酸PP284(5′-CGGCCGTGTGGTTCTCGCCAAT-3′;SEQIDNO1)和PP285(5′-CCCCATTTCCCTCTAGCGACTG-3′;SEQIDNO2)用于PCR扩增。用这两个引物从病毒基因组的最3′末端产生一个DNA探针以用于Northern印迹分析(见下面的讨论)。合成寡聚核苷酸PP286(5′-GCCGCGGAACCATCAAGCAC-3′;SEQIDNO3)和PP287(5′-CAACTTGACGCTATGTGAGC-3′;SEQIDNO4)用于PCR扩增。用由这两个引物产物的DNA探针进一步筛选λ文库。用寡聚核苷酸PP288(5′-GCGGTCTGGATTGACGACAG-3′;SEQIDNO5)，PP289(5′-GACTGCTAGGGCTTCTGCAC-3′;SEQIDNO6)，PP386(5′-GCCATTCAGCTCACATAGCG-3′;SEQIDNO7)，PP286和PP287作为测序引物以获得内部序列。
(G)Northern印迹分析
用引物PP284和PP285通过PCR对来自ISU-12 cDNA克隆的最3′末端的一个特异性DNA片段进行扩增。用商业上可买到的DNA纯化药盒(GENECLEAN，从Bio 101获得)从琼脂糖凝胶上切下DNA片段，并用32P-dCTP通过随机引物续展(用一种从Amersham可得到的药盒)进行标记。根据厂家(Stratagene)所述的方法使用一种商业上可购得的用于分离总RNA的药盒，在感染后36小时从ISU-12感染的PSP-36细胞中分离总RNA。用6M乙二醛和DMSO使ISU-12亚基因组mRNA种变性，并在1%琼脂糖凝胶上分离。(在下面的实验Ⅷ中描述了改用1.5%琼脂糖凝胶的类似方法的结果，并示于图32中)。用一种POSIBLOTTM压力点样器(Stratagene)将分离的亚基因组mRNA转移到尼龙膜上。在一种带有滚瓶的杂交罐中于42℃和50%甲酰胺条件下进行杂交。
结果
(A)IUS-123′末端基因组的克隆、识别和测序
从来源于ISU-12-感染的PSP-36细胞的部分纯化病毒构建一种寡聚(dT)-引导的cDNAλ文库。在用基于Lelystad病毒序列的探针筛选cDNAλ文库时遇到了麻烦。制备了三套引物。第一套(PP105和PP106;SEQIDNOS21-22)与位于病毒粒子基因区中的Lelystad基因组序列的位点14577至14596和14977至14995相对应。第二套(PP106和PP107，SEQIDNOS22-23)与ORF′S6和7旁侧的Lelystad基因组序列的位点14977至14995和14054至14072相对应。第三套(PM541和PM542;SEQIDNOS24-25)与位于ORF-16区中的Lelystad基因组序列的位点11718至11737和11394至11413相对应。
PPl055′-CTCGTCAAGTATGGCCGGT-3′(SEQIDNO21)
PPl065′-GCCATTCGCCTGACTGTCA-3′(SEQIDNO22)
PPl075′-TTGACGAGGACTTCGGCTG-3′(SEQIDNO23)
PM5415′-GCTCTACCTGCAATTCTGTG-3′(SEQIDNO24)
PM5425′-GTGTATAGGACCGGCAACCG-3′(SEQIDNO25)
试图用这三套引物从ISU-12感染因子中通过PCR产生探针全部未获成功。不过，在用鉴别性杂交技术几次尝试之后，用从ISU-12-感染的PSP-36细胞和正常PSP-36细胞制备的探针分离出了可靠性的代表ISU-12-特异性cDNA的斑块。涉及鉴别性杂交的方法步骤描述并列于图17中。
开始识别出三个阳性斑块(λ-4，λ-75和λ-91)。借助于G408辅助噬菌体通过体外切割获得存在于λ噬菌体中的含病毒性cDNA插入物的噬菌体质粒。通过限制性酶消化和末端序列测定来分析阳性克隆的插入物。通过与来源于PRRSVIowa株感染的PSP-36细胞的RNA杂交，但不与来自正常PSP-36细胞的RNA杂交这一现象进一步证实了cDNA克隆的特异性。然后用引物PP286，PP287通过PCP从克隆λ-75的5′-末端产生的DNA探针。用此探针进一步识别出阳性斑块(λ-229，λ-268，λ-275，λ-281，λ-323，和λ-345)。所有用于获得3′-末端核苷酸序列的λcDNA克隆示于图18中。至少测定三个分离的克隆以减少任何错误。如果出现任何模糊的序列数据，则用另外的克隆和内部引物(PP288，PP289，PP286，PP287和PP386)来确定序列。该1938-bp3′-末端序列(SEQIDNO8)示于图19中，而推断出的氨基酸序列(SEQIDNO9-12)示于图20中。
(B)一套嵌套亚基因组mRNA
在1%乙二醛/DMSO琼脂糖凝胶上分离来源于病毒感染PSP-36细胞的总RNA，并在尼龙膜上点样。用在病毒基因组最3′-末端区旁侧的一套引物(PP284和PP285)通过PCR产生一种cDNA探针。该探针含有一个3′-非翻译序列和大部分的ORF-7序列。Northerm印迹杂交结果表明从PRRSVIowa株感染的PSP-36细胞获得的mRNA种类类型非常类似于Lelystad病毒(LV)、马动脉炎病毒(EAV)、乳酸脱氢酶-升高病毒(LDV)和冠状病毒的类型，其相同点在于病毒的复制需要有亚基因组mRNA′S的形成。
该结果还表明ISU-12-特异性亚基因组mRNA代表了一套3′-嵌套mRNA，因为Northern印迹探针只代表最3′末端序列。ISU-12病毒基因组RNA(14kb)和6个亚基因组mRNA(RNA2(3.0kb)，RNA3(2.5kb)，RNA4(2.2kb)，RNA5(1.8kb)，RNA6(1.3kb)和RNA7(0.98kb))的大小类似于LV的那些相应RNA大小(图18)，只是在基因组和亚基因组RNA种类方面有所不同。在亚基因组mRNA的相对量方面也表现出不同，RNA7是最主要的亚基因组mRNA。
(C)对由亚基因组RNA编码的开放阅读框架进行分析
在SEQIDNO8中发现有三个大的ORFORF-5(nt239-901;SEQIDNO13)，ORF6(nt889-1403;SEQIDNO15)和ORF7(nt1403-1771;SEQIDNO18)。位于所得序列5′末端的ORF4在SEQIDNO8的1938-bp3′-末端序列中是不完整的。ORF5、6和7各具有一种编码大于100个氨基酸的能力。ORF5和ORF6互相重叠10bp，而ORF6和ORF7互相重叠5bp。还发现了完全位于ORF7中的两个较小ORF，分别只编码37个氨基酸和43个氨基酸。另两个短ORF与ORF5完全重叠。这两个ORF的编码能力分别只是29个氨基酸和44个氨基酸。通过Northern印迹分析表明没有特异性的亚基因组mRNA与这些较小的ORF相关。ORF6和ORF7具信是分别编码病毒膜蛋白和衣壳蛋白。
(D)用于引导接头的一致序列
序列分析表明一种短的序列基本结构，AACC，可以作为在亚基因组mRNA中翻译时加入引导序列的位点(连接点)。分别发现ORF6的连接点位于ATG起始密码子的上游21bP处，而ORF7的连接点位于ATG起始密码子的上游13bP处。在ORF5中没有识别出AACC一致序列，不过在LV的ORF5中发现了此序列。在LDV和EAV中发现了类似的连接序列。
(E)3′-未翻译序列和多聚(A)尾
与LV中的114nt，LDV中的80nt和EAV中的59nt相比，在ISU-12病毒基因组中识别出了接在ORF7的终止密码子之后的150核苷酸长(150nt)的非翻译序列。该多聚(A)尾的长度是至少13个核苷酸。在PIP病毒ISU-12、LV和LDV的多聚(A)尾临近区中有一个相同序列，CCGG/AAATT-多聚(A)。
(F)ISU-12和LV基因组在ORF5、6和7以及在非翻译序列方面的序列比较
图21表示的是ISU-12和Lelystad病毒的基因组的ORF-5区的比较。图22、23和24分别表示了相应的ORF-6区、ORF-7区和非翻译序列的比较。
比较的结果列于下表Ⅲ。与上述一样，如果一病毒与免疫原性病毒有90%或更大的同源性则认为是在免疫学上等同的。LV和ISU-12的ORF5、ORF6、ORF7和非翻译序列之间的核苷酸序列同源性分别是60%、68%、60%和58%。因此，LV和ISU-12不是免疫原性等同的。
LV中的ORF5和6的大小分别比ISU-12中的ORF5和6小61nt和3nt。相对而言，LV中的ORF7大小比ISU-12中的ORF7大小要大15nt。而且，3′-末端非翻译序列在长度上也不同(在ISU-12中是150nt，而在LV中只有114nt)。象LV一样，除了ORF5之外，在PRRS病毒Iowa株分离物ISU-12的基因组中也识别出了该连接序列，AACC。ISU-12中ORF6的连接序列是在ATG起始密码子的上游21nt处，而LV中ORF6的连接序列是在ATG上游28nt处。
实验Ⅳ
Iowa株感染因子基因在昆虫细胞中的表达
(A)生产重组杆状病毒
使用基于ISU-12基因组核苷酸序列的引物通过PCR分别扩增ORF-5、ORF-6和ORF-7。用下列引物扩增ORF-5
5′-GGGGATCCGGTATTTGGCAATGTGTC-3′(SEQIDNO26)
3′-GGGAATTCGCCAAGAGCACCTTTTGTGG-5′(SEQIDNO27)
用下列引物扩增ORF-6
5′-GGGGATCCAGAGTTTCAGCGG-3′(SEQIDNO28)
3′-GGGAATTCGTGCACAGCTGATTGAC-5′(SEQIDNO29)
用下列引物扩增ORF-7
5′-GGGGATCCTTGTTAAATATGCC-3′(SEQIDNO30)
3′-GGGAATTCACCACGCATTC-5′(SEQIDNO31)
将扩增的DNA片段克隆到杆状病毒转移载体pVL1393(从Invitrogen获得)中。将1μg的线性化杆状病毒AcMNPVDNA(从Pharmingen，SanDiego.California购得)和2μgPCR扩增克隆的含cDNA载体构件与50μl的Lipofectin(Gibco)混合，并在22℃保温15分钟，以制备转染混合物。
在接种HI-FIVE细胞之后1小时，用新鲜的Excell400昆虫细胞培养基(从JRScientificCo.购得)替代该培养基，并一滴滴地加入转染混合物。将所得到的混合物在28℃保温6小时。之后，移去转染培养基，加入新鲜的Excell400昆虫细胞培养基。然后将所得到的混合物在28℃下保温。
转染5天后，收集培养基并澄清之。将10倍稀释的上清液接种到HI-FIVE细胞上，并在室温下保温60分钟。在弃去接种物之后，在细胞上铺一层1.25%的琼脂糖。在28℃下保温4天。之后，选择清楚的斑块，并用无菌巴斯德吸管吸出。每一斑块与1ml的Grace′s昆虫培养基在-5ml的带盖塞的试管中混合，并置于冰箱中过夜以使病毒从琼脂糖中释放出。以2000xg离心该试管30分钟以去除琼脂糖，把上清液转移到新的无菌试管中。重复斑块纯化步骤三次以避免可能的野生型病毒污染。将纯的重组克隆存放于-80℃下以用于进一步的研究。
(B)重组Iowa株感染因子蛋白的表达
用间接免疫荧光检测和放射免疫沉淀试验评价表达。
间接免疫荧光检测用野生型杆状病毒或重组杆状病毒对在24孔细胞培养簇平板中的Hi-five昆虫细胞(如图25中所示)进行感染或者对其进行假感染。72小时之后，固定细胞，并用合适稀释的猪抗-ISU-12多克隆抗体染色，接着用荧光素异硫氰酸盐-标记的(FITC-标记的)抗猪IgG染色。如图26-29中所示，在用重组病毒感染的细胞中检测出了免疫荧光，而在假感染细胞或用野生型杆状病毒接种的细胞中没有荧光。例如，图26表示了用含有ISU-12ORF-6基因的重组杆状病毒(Baculo.PRRSV.6)感染的HI-FIVE细胞，它表现出了细胞病效应。图27表示的是用另一种含有ISU-12ORF-7基因的重组杆状病毒(Baculo.PRRSV.7)感染的HI-FIVE细胞，它也表现出了细胞病效应。用含有ORF-5的重组杆状病毒(Baculo.PRRSV.5，数据未显示出)获得了类似结果。图28和29表示的是分别用含ISU-12ORF-6基因和ISU-12ORF-7基因的重组杆状病毒感染的HI-FIVE细胞，用猪抗ISU-12抗血清进行了染色，接着用荧光素结合的抗猪IgG染色，其中昆虫细胞正在产生重组Iowa株感染因子蛋白。用含ORF-5的重组杆状病毒获得了类似的结果。
放射免疫沉淀用每种重组病毒(Baculo.PRRSV.5，Baculo.PRRSV.6和Baculo.PRRSV.7)进行放射免疫沉淀以进一步确定重组蛋白的抗原活性和可靠性。对HI-FIVE昆虫细胞进行假感染，或者用每种重组杆状病毒感染。感染两天之后，加入不含甲硫氨酸的培养基。每种混合物保温2小时，然后加入用35S-甲硫氨酸(Amersham)标记的蛋白，该混合物在28℃下再保温4小时。通过三次冷冻和融化循环制备放射标记的细胞溶解物，用预免疫或免疫抗-ISU-12抗血清与细胞溶解物一起孵育。用蛋白A琼脂糖沉淀免疫复合物并在煮沸之后于SDS-PAGE上分析。在80℃下将凝胶进行X-线拍片，并冲洗。用ORF-6(图30)和ORF-7(图31)产物检测出了预期大小的带。
实验Ⅴ
对下表4中所述的PRRSV的其他样本进行三次斑块纯化。通过将一种澄清的组织匀浆在PSP-36-SAH细胞上培养并选择单个斑块(假定一个斑块是由单个病毒产生的)进行斑块纯化。然后培养选择的斑块，再次选择单个斑块，然后培养第三次。用从SouthDakotaStateUniversity，Brookings，SouthDakota购买的抗-PRRSV单克隆抗体进行IFA。
在下面的表5中列出了鉴别出的选择用于进一步研究的某些分离样本，并以其致病性和mRNA的数目描述了其特征。
表4
PRRXV3X斑块纯化的分离物
PRRSV冷冻日期PRRS单克隆滴度
分离物 制备原液 IFA结果 TCID50/ml
ISU-22 9/15/92 + 105.57±0.15
ISU-28 9/15/92 + 105.14±0.28
ISU-12 9/17/92 + 104.33±0.21
ISU-3927 9/21/92 + 103.56±0.17
ISU-984 9/21/92 + 103.89±0.24
ISU-7229 9/22/92 + 103.45±0.20
ISU-92-11581 9/22/92 + 102.39±0.17
ISU-695 10/01/92 + 104.49±0.20
ISU-79 10/01/92 + 105.69±0.25
ISU-412 10/01/92 + 105.31±0.50
ISU-55 10/01/92 + 105.54±0.10
ISU-33 10/05/92 + 105.36±0.21
ISU-1894 10/27/92 + 105.18±0.33
ISU-04 10/27/92 + 105.78±0.24
ISU-51 2/07/93 + 104.59±0.15
ISU-30262 4/01/93 + 105.99±0.24
注所有病毒分离物是斑块纯化的和在PSP-36-SAH细胞上繁殖的
表5
＊＝某些表现出缺失的mRNA
每种未进行斑块纯化的ISU-12、斑块纯化的ISU-12、ISU-22、ISU-51、ISU-55和ISU-3027的样品已根据布达佩斯条约的条款在美国典型培养物保藏中心(12301ParklawnDrive，Rockville，Naryland20852，U.S.A.)进行了保藏，保藏号分别是VR2385，VR2386，-，-，-和。
ISU-3927的mRNA在7个mRNA中有四个表现出缺失。ISU-3927的mRNA4、5、6和7与ISU-12的那些mRNA4、5、6和7相比迁移更快，因此，它们比ISU-12的那些mRNA要小。这些特性可能与ISU-3927的较低毒力有关。
在5周龄的CDCD猪中比较6种分离物的致病性。用105TCID50病毒接种15只猪。在10 DPI时处死10只猪，再在28 DPI时处死5只猪。病毒分离物ISU-12，ISU-22和ISU-28是致病性最强的，而ISU-51和ISU-55致病性低。在以前的研究中，ISU-3927对5周龄的猪只有轻度的致病性。
由ISU-22和未斑块纯化的(也即;未斑块纯化的分离的感染因子)ISU-12引起的损伤比由斑块纯化病毒引起的损伤持续时间更长。斑块纯化的分离物可引起轻度的心肌炎和脑炎。未斑块纯化的分离物比相应斑块纯化的分离物引起更严重的疾病。
CDCD小猪可以作为评价候选疫苗致病性和功效的理想模型。分离物ISU-12、ISU-22和ISU-984可产生类似的损伤，并且根据对肉眼和显微镜下损伤的检查，可用其来评价疫苗的功效。ISU-3927的毒力较小，但足够用于评价抗PRRSV致病株的疫苗。
用斑块纯化ISU-12感染的猪在28天的一段时间内其体重增加比对照猪(用未感染的PSP-36细胞激发的)平均少9.9磅。初步结果表明在2-10DPI表现出淋巴细胞减少和中性白细胞增多。
只有那些用未斑块纯化的ISU-12感染的猪表现出明显的脑炎。在用生物学克隆的(斑块纯化的)Iowa株分离物激发的任何猪中没有观察到鼻炎。相对而言，当用组织过滤物(未斑块纯化的分离物)作为接种物时鼻炎是严重的。
对用ISU-12未斑块纯化的、ISU-12斑块纯化的、ISU-22、ISU-984、ISU-3927和未感染的PSP-36细胞感染的CDCD猪的病理学和组织学概括于下表6-12中。在这些表中，肉眼肺损伤分级代表了肺实变的百分数(也即，患肺炎疾病表现出损伤的肺组织的百分数)。分级是以0-100%实变的水平为基础的。“ND”是指肉眼肺损伤分级未确定。
在上表6中，“unpl.”是指未斑块纯化的，而“uninoc.”是指未接种的。
上表6中的结果表明ISU-12和ISU-22产生的损伤比其他的分离物产生的损伤持续时间更长。由ISU-12、ISU-22和ISU-984产生的损伤其严重程度相似。由ISU-3927产生的损伤其严重程度更轻，而比由其他分离物产生的损伤消失得更早。所有肉眼损伤在36DPI时消失。
下面表7-12中所列的病理学结果是以上表1中所列严重程度的相同分级为基础的。在下面的表7-12中，“Int，thick”是指间质增厚，“alv.exud.”是指肺泡渗出，而“encephal.”是指脑炎。
在7DPI时，由ISU-12、ISU-22和ISU-984引起的肺损伤是严重的，并且互相类似。在7DPI时由ISU-3927引起的肺损伤只是轻度或中度严重。
在10DPI时，由ISU-12、ISU-22和ISU-984引起的肺损伤类似于在7DPI时的损伤，但其严重程度稍小。只有由未斑块纯化的ISU-12感染的猪表现出轻度的脑炎和心肌炎。在10DPI时，由ISU-3927引起的损伤几乎消失。
在21DPI时，由未斑块纯化的ISU-12引起的心肌炎是严重的，而由ISU-12、ISU-22和ISU-984引起的心肌炎中度的。只有由未斑块纯化的ISU-12感染的猪在21DPI时表现出中度的脑炎。
在28DPI时，在由未斑块纯化的ISU-12和ISU-22感染的猪中肺损伤仍然是中度。这些分离物还可以在28DPI时产生严重的心肌炎。不过，由ISU-12、ISU-984和ISU-3927引起的肺损伤在28DPI时几乎消失。
在36DPI时，所有损伤基本消失。在36DPI时每组中检查一只猪。
实验Ⅵ
进行体内交叉中和研究。首先用一种选自ISU-12、ISU-22、ISU-984和ISU-3927的分离物鼻内接种CDCD猪，四周以后，用ISU-12激发该猪。在用ISU-12激发后8DPI时检查肺损伤和其他疾病症状。对照猪只用ISU-12激发。结果列于下表13中。
下表13中所列的病理学结果是以上表1中所列严重程度的相同分级为根据的。在下表13中，“Int.thick.”是指间质增厚，“alv.exud.”是指肺泡渗出，和“encephal.”是指脑炎。
上表13中的数据表明ISU-12可以保护猪抵抗由ISU-12引起的疾病的大部分症状。ISU-984可提供保护作用以抵抗由ISU-12(它是已知PRRSV病毒毒力最强的株之一)引起的某些PRRS的症状和临床指征。
但是，ISU-3927(PRRS病毒Iowa株的一种轻度致病性变异体)作为一种活疫苗可最大程度地保护所研究的分离物以抵抗用ISU-12的进一步激发。因此，ISU-3927在商业上有希望用作活疫苗。
实验Ⅶ
用下面表14中所列的PRRSV Iowa株的分离物接种有10只CDCD猪的组，或者用未感染的PSP-36细胞接种以作为对照。在用105TCID50的下表14中所列的每种病毒分离物鼻内激发时该猪大小为5周龄。在10DPI时处死该猪。
在下表14中提供了10DPI时平均肉眼肺损伤的评分，以表示分离物的致病性。并提供了标准偏差(SD)以表示平均肺损伤评分的统计学显著性。
另外，根据上述的临床呼吸评分系统(见下表16中的“临床评分均数”)检查每组猪的呼吸窘迫情况。“肉眼评分”是指上述的肉眼肺损伤评分。“Enceph.”，“myocard.”和“rhinitis”是指每组中分别表现出脑炎。心肌炎和鼻炎的猪的数目。“显微评分”是指一种根据下述用于评价和比较肺组织间质性肺炎的显微镜下损伤的分级所得评分
0＝无疾病;正常肺组织
1＝轻度多发性显微镜下损伤
2＝轻度弥散性显微镜下损伤
3＝中度多发性显微镜下损伤
4＝中度弥散性显微镜下损伤
5＝严重多发性显微镜下损伤
6＝严重弥散性显微镜下损伤
在不表现出肉眼损伤的组织中可以观察到显微镜下损伤。因此，除了肉眼肺损伤、呼吸窘迫、发热等之外，“显微评分”还为评价和比较这些分离物的致病性提供了另外的均数。
实验Ⅷ
从用ISU-12、ISU-22、ISU-55、ISU-79、ISU-1894和ISU-3927中的每一种感染的PSP-36细胞中分离mRNA，并在一种1.5%琼脂凝胶上进一步分离，以更好地分离亚基因组mRNA。发现了两组迁移方式。
组Ⅰ包括分离物ISU-12、ISU-1894、ISU-3927和可能是，ISU-51。图32表示了ISU-12的Northern印迹分析，而图33表示的是ISU-1894、ISU-3927和ISU-51的Northern印迹分析。象Lelystad病毒一样，在这些分离物的每种中发现了7个亚基因组mRNA(在图32和33中标记的1-7)。该亚基因组mRNA(SgRNA)的大小类似于Lelystad病毒的亚基因组mRNA。
组Ⅱ包括分离物ISU-22，ISU-55和ISU-79。这些分离物的每一种有9个SgRNA，而不是7个。组Ⅱ中的SgRNA1、2、3、6和7与组Ⅰ中的那些相同，但在组Ⅰ的SgRNA3和6之间发现有两个另外的SgRNA，在图33中以箭头表示。
初步结果表明在PSP-36细胞中可能除ISU-12之外组Ⅱ的病毒比组Ⅰ的分离物会更好地复制。不过，在某些情况下，与组Ⅱ的分离物相比，甚至ISU-12也会复制得很差。
实验Ⅷ
在3周龄、PRRSV-血清学阴性的SPP猪中进行了猪生殖和呼吸系统综合病毒(PRRSV)改性的活疫苗功效研究。该疫苗每2ml剂量中含有105.8TCID50的斑块纯化的PRRSV ISU-12(Iowa株)。有9只猪通过鼻内途径(IN)给一单剂量疫苗，7只猪通过肌肉内途径(IM)给一单剂量，而9只猪作为未接种疫苗的激发对照(NV/CHALL)。在接种后35天激发疫苗和对照，然后在激发后10天对肉眼肺损伤评分(受影响肺的百分数)。
在图34中以每个直方图上的数字表示每组猪的平均肉眼肺损伤评分。通过肺损伤评分的减少评价疫苗的功效。两个接种组表现出比非接种对照组有显著低的(P＜0.01)肉眼肺损伤评分。在接种组之间未发现评分的显著差异性。证明ISU-12 PRRSV疫苗在三周龄猪中以105.8TCID50剂量是有效的。
其他观察
ISU-12病毒由于它对氯仿处理敏感，因此是一种包裹病毒。ISU-12的复制对5-溴脱氧尿核苷处理有抗性。因此，ISU-12不是一种DNA病毒。ISU-12缺乏血细胞凝集活性。
显然，根据上述教导对本发明的许多修改和变化是可能的。因此应当明白，在下面的权利要求范围内，本发明可以按除本文所具体描述之外的方式来实施。
序列表
(1)一般信息
(ⅰ)申请人
PAUL，PREMS.
HALBUR，PATRICKG.
MENG，XIANG-JIN
LUM，MELISSAA.
LYOO，YOUNGS.
(ⅱ)发明名称
能够产生抗猪呼吸和生殖系统疾病性病毒的免疫应答的疫苗，保护猪免受呼吸和生殖系病毒致病的方法
(ⅲ)序列数目28
(ⅳ)联系地址
(A)地址OBLON，SPIVAK，McCLELLAND，MAIER＆NEUSTADT，P.C.
(B)街道1755S.JeffersonDavisHighway，Suite400
(C)城市Arlington
(D)州Virginia
(E)国家U.S.A.
(F)邮编22202
(ⅴ)计算机阅读形式
(A)媒介类型软盘
(B)计算机IBMPC兼容
(C)阅读系统PC-DOS/MS-DOS
(D)软件PatentInRelease＃1.0，Version＃1.25
(ⅵ)目前的申请数据
(A)申请号US
(B)申清日
(C)分类
(ⅶ)优选申请数据
(A)申请号US07/969，071
(B)申请日1992年10月30日
(ⅷ)代理机构/代理人信息
(A)名称Lovalleye，Jean-PaulM.P.
(B)登记号31，451
(C)档案号4625-016-55XCIP
(ⅸ)电讯资料
(A)电话(703)413-3000
(B)传真(703)413-2220
(C)电报248855OPATUR
(2)SEQIDNO1的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度22碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑类型未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO1
CGGCCGTGTGGTTCTCGCCAAT22
(2)SEQIDNO2的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度22碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑类型未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO2
CCCCATTTCCCTCTAGCGACTG22
(2)SEQIDNO3的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度20碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑类型未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合症病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO3
GCCGCGGAACCATCAAGCAC20
(2)SEQIDNO4的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度20碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑类型未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO4
CAACTTGACGCTATGTGAGC20
(2)SEQIDNO5的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度20碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑类型未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO5
GCGGTCTGGATTGACGACAG20
(2)SEQIDNO6的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度20碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑类型未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO6
GACTGCTAGGGCTTCTGCAC20
(2)SEQIDNO7的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度20碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑类型未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO7
GCCATTCAGCTCACATAGCG20
(2)SEQIDNO8的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度1938碱基对
(B)类型核酸
(C)链数双链
(D)拓扑类型未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离物ISU-12
(ⅸ)特征
(A)名称/键CDS
(B)位置1..255
(ⅸ)特征
(A)名称/键CDS
(B)位置239..901
(ⅸ)特征
(A)名称/键CDS
(B)位置1403..1771
(ⅸ)特征
(A)名称/键CDS
(B)位置889..1410
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO8
(2)SEQIDNO9的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度85氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO9
(2)SEQIDNO10的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度221氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO10
(2)SEQIDNO11的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度174氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO11
(2)SEQIDNO12的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度123氨基酸
(B)类型氨基酸
(C)拓扑线性
(ⅱ)分子类型蛋白质
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO12
(2)SEQIDNO13的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度667碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO13
(2)SEQIDNO14的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度605碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Lelystad
(C)个体分离物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO14
(2)SEQIDNO15的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度526碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO15
(2)SEQIDNO16的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度522碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Lelystad
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO16
(2)SEQIDNO17的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度372碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Lelystad
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO17
(2)SEQIDNO21的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度387碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑类型未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)未源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒体Iowa
(C)个体分离物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO18
(2)SEQIDNO19的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度164碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑类型未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离物ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO19
(2)SEQIDNO20的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度127碱基对
(B)类型核酸
(C)链数未知
(D)拓扑类型未知
(ⅱ)分子类型cDNA
(ⅵ)来源
(A)生物猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Lelystad
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO20
(2)SEQIDNO21的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度19碱基对
(B)类型核酸
(C)链数单链
(D)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)来源
(A)生物体猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Lelystad
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO21
CTCGTCAAGTATGGCCGGT19
(2)SEQIDNO22的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度19碱基对
(B)类型核酸
(C)链数单链
(D)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)来源
(A)生物体猪生殖和呼吸系综合征病毒
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO22
GCCATTCGCCTGACTGTCA19
(2)SEQIDNO23的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度19碱基对
(B)类型核酸
(C)链数单链
(D)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)来源
(A)生物体猪生殖和呼吸系综合征病毒
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO23
TTGACGAGGACTTCGGCTG19
(2)SEQIDNO24的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度20碱基对
(B)类型核酸
(C)链数单链
(D)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)来源
(A)生物体猪生殖和呼吸系综合征病毒
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO24
GCTCTACCTGCAATTCTGTG20
(2)SEQIDNO25的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度20碱基对
(B)类型核酸
(C)链数单链
(D)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)来源
(A)生物体猪生殖和呼吸系综合征病毒
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO25
GTGTATAGGACCGGCAACAG20
(2)SEQIDNO26的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度26碱基对
(B)类型核酸
(C)链数单链
(D)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型其他核酸
(A)生物体猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离ISU-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO26
GGGGATCCGGTATTTGGCAATGTGTC26
(2)SEQIDNO27的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度28碱基对
(B)类型核酸
(C)链数单链
(D)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)来源
(A)生物体猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离IUS-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO27
GGTGTTTTCCACGAGAACCGCTTAAGGG28
(2)SEQIDNO28的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度21碱基对
(B)类型核酸
(C)链数单链
(D)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)来源
(A)生物体猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离IUS-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO28
GGGGATCCAGACGTTTCAGCGG21
(2)SEQIDNO29的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度25碱基对
(B)类型核酸
(C)链数单链
(D)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)来源
(A)生物体猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离IUS-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO29
CAGTTAGTCGACACGGTCTTAAGGG25
(2)SEQIDNO28的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度22碱基对
(B)类型核酸
(C)链数单链
(D)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)来源
(A)生物体猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离IUS-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO30
GGGGATCCTTGTTAAATATGCC22
(2)SEQIDNO31的资料
(ⅰ)序列特征
(A)长度19碱基对
(B)类型核酸
(C)链数单链
(D)拓扑类型线性
(ⅱ)分子类型其他核酸
(A)描述DNA(合成的)
(ⅵ)来源
(A)生物体猪生殖和呼吸系综合征病毒
(B)毒株Iowa
(C)个体分离IUS-12
(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO31
CTTACGCACCACTTAAGGG19
权利要求
1、一种疫苗，它能在接触过能引起猪生殖和呼吸系统疾病的病毒的猪中激发有效的免疫应答。
2、根据权利要求1的疫苗，其中所说的病毒导致一种具有下列症状和临床指征特征的疾病Ⅱ型肺细胞形成，心肌炎，脑炎，肺泡渗出物形成和合体细胞形成。
3、根据权利要求2的疫苗，其中所说的病毒导致的疾病还具有下述的症状和临床指征特征嗜睡，呼吸窘迫，被迫呼气，发烧，毛发粗糙，打喷嚏，咳嗽，和轻度的间质增厚。
4、根据权利要求3的疫苗，其中所说的疾病是由猪生殖和呼吸系统综合征病毒的Iowa株引起的。
5、根据权利要求1的疫苗，其中所说的疫苗是从在选自PSP-36，PSP-36-SAH和MA-104的细胞系中培养的病毒制备的。
6、一种生物学纯的病毒样本或感染因子样本，它导致一种具有下述症状和临床指征特征的猪生殖和呼吸系统疾病Ⅱ型肺细胞形成，心肌炎，脑炎，肺泡渗出物形成和合体细胞形成。
7、根据权利要求6的生物学纯病毒或感染因子，其特征在于还具有下述的症状和临床指征嗜睡，呼吸窘迫，被迫呼气，发烧，毛发粗糙，打喷嚏，咳嗽和轻度的间质增厚。
8、根据权利要求7的生物学纯病毒，其中所说的生物学纯样本是与猪生殖和呼吸综合征病毒的Iowa毒株有关的感染因子，已于1992年10月28日寄存于美国典型培养物保藏中心，保藏号是VR2385和VR2386，还于1993年9月29日在该中心进行了保藏，保藏号为-，-，-和-。
9、一种预防猪受病毒感染的组合物，包括一定量的生理上可接受的载体中的权利要求1的疫苗，所说的一定量能有效地激发对猪生殖和呼吸系统疾病致病性病毒的免疫应答。
10、一种保护猪而抵抗一种猪生殖和呼吸系统疾病致疾性病毒感染的方法，包括给需要保护而抵抗所说病毒感染的猪使用一有效量的权利要求1疫苗。
11、根据权利要求10的方法，其中所说的疫苗是口服或非肠道给药。
12、根据权利要求11的方法，其中所说的疫苗是肌肉内、皮内、静脉内、腹膜内、皮下或鼻内给药。
13、根据权利要求10的方法，其中所说的疫苗是给需要保护而抵抗所说病毒感染的母猪使用所说的疫苗。
14、一种制备权利要求1疫苗的方法，包括下列步骤
(A)收集足够大量的能导致猪生殖和呼吸系统疾病的病毒或感染因子样本，和
(B)以选自下面一组中的一种方式处理所说病毒或感染因子(ⅰ)斑块纯化病毒或感染因子，(ⅱ)在足够灭活所说病毒或感染因子的温度和时间下加热所说病毒或感染因子，(ⅲ)将所说病毒或感染因子与足以灭活所说病毒或感染因子量的灭活化学药品接触或与之混合，(ⅳ)将所说病毒或感染因子分解成其相应的亚单位，并分离出至少一种所说的亚单位，和(ⅴ)合成或分离一种编码所说病毒或感染因子表面蛋白的多聚核酸，用所说的多聚核酸感染一种合适的宿主细胞，用所说的宿主细胞，和从所说的培养物中分离表面蛋白。
15、根据权利要求14的方法，其中所说的病毒或感染因子是从下列一组的一种来源中收集的，这组来源包括培养基，用所说病毒或感染因子感染的细胞，和用所说病毒或感染因子感染的细胞与培养基一起。
16、一种如权利要求15的方法，在所说的收集步骤之前，还包括在一种合适的培养基中培养所说病毒或感染因子的步骤。
17、一种能与权利要求1的疫苗免疫结合的抗体。
18、一种患有呼吸和生殖系统疾病的猪的治疗方法，包括给需要这种治疗的猪使用一有效量的在生理上可接受的载体中的权利要求17的抗体。
19、一种用于检测可导致猪呼吸系统疾病，猪生殖系统疾病或猪生殖和呼吸系统疾病病毒的诊断药盒，包括权利要求17的抗体和一种能指示与所说抗体发生阳性免疫反应的诊断试剂。
20、一种分离的多核苷酸，它与从能导致猪呼吸和生殖系统疾病的病毒或感染因子的部分基因组中获得的多核苷酸有至少90%的同源性。
21、根据权利要求20分离的多核苷酸，其中所说的病毒或感染因子与猪生殖和呼吸系统综合征的Iowa株有关。
22、根据权利要求21的分离的多核苷酸，基本上由选自下列一组中的一种序列构成SIQIDNO∶8，SEQIDNO∶10，SEQIDNO∶12，SEQIDNO∶15和SEQIDNO∶16。
23、一种由权利要求22的分离多核苷酸编码的蛋白。
24、一种分离的多聚核酸，基本上由从猪呼吸和生殖系统致病性病毒或感染因子的基因组获得的一种多核苷片段构成，它的长度是20至100核苷酸。
25、根据权利要求24的分离的多聚核苷酸，其中所说的病毒或感染因子是猪生殖和呼吸系统综合病毒的Iowa株。
26、一种权利要求24的分离的多聚核苷酸片段，基本上由选自下列一组中的一种序列构成，这一组包括SEQIDNO∶1，SEQIDNO∶2，SEQIDNO∶3，SEQIDNO∶4，SEQIDNO∶5，SEQIDNO∶6和SEQIDNO∶7。
27、一种培养病毒的方法，包括用所说病毒和培养物感染选自由PSP-36，PSP-36-SAH，MA-104和能被所说病毒和培养物感染的等同细胞系组成的一组中的一种细胞系，和
在一种合适的培养基中培养所说的感染细胞系，
其中所说病毒导致一种猪呼吸和生殖系统疾病。
28、根据权利要求27的方法，其中所说的合适细胞系选自由PSP-36，PSP-36-SAH，MA-104组成的一组。
29、根据权利要求27的方法，其中所说的病毒是猪呼吸和生殖综合症病毒的Iowa株，或它引起一种选自下列一组的疾病猪呼吸和生殖系统综合症，增生和坏死性肺炎，和非典型性猪流感。
30、根据权利要求29的方法，其中所说的病毒是猪呼吸和生殖系统综合征病毒的Iowa株。
全文摘要
本发明涉及一种能够保护猪免受呼吸系统和生殖系统病毒致病的疫苗，一种防止猪患呼吸和生殖系统疾病的方法，一种生产疫苗的方法，和从一种引起猪呼吸和生殖系统疾病的病毒中获得的DNA。
文档编号C12P21/02GK1096223SQ9312070
公开日1994年12月14日 申请日期1993年10月30日 优先权日1992年10月30日
发明者Ｐ·Ｓ·保尔, Ｐ·Ｇ·哈博, Ｘ·Ｊ·门格, Ｍ·Ａ·鲁牧, Ｙ·Ｓ·理奥 申请人:衣阿华州立大学研究基金会公司, 索维动物保健公司