专利名称：培养海洋微藻及用其生产二十二碳六烯酸的方法
技术领域：
本发明涉及生产多不饱和脂肪酸，二十二碳六烯酸(下文称之为“DHA”)的方法，该物质具有显著的生理功能，如降低胆固醇作用，抗凝血功效以及抑制癌功效，和其在改善记忆力及认知能力，防止老年性痴呆症及治疗阿尔兹默疾病等方面的与脑代谢相关的功效，并且它是幼鱼生长所必需的一种脂肪酸。特别是，涉及生产DHA的方法，包括连续有效地大量培养海洋微藻(显微镜下可见形式的海洋藻)并稳定地从上述培养的海洋微藻细胞中低成本生产DHA。
更具体地说，本发明涉及生产海洋微藻的方法，包括在通气和搅拌条件下，通过连续培养所述海洋微藻，来生产海洋微藻藻细胞，并涉及生产DHA的方法，包括在通气和搅拌条件下，连续培养海洋微藻，并从得到的藻细胞中提取DHA。
尽管已经知道鱼油中含有具有多种生理活性功能的DHA，但由于很难从鱼油中将其分离提取，所以其实际应用受到阻碍。近几年来，努力完成了阐述DHA生理活性功能及其实际应用方面的研究，在金枪鱼眼眶内脂肪等各种鱼油中存在高浓度DHA的发现及有效的脂肪酸纯化技术的发展促进了上述研究。
有关DHA的纯化及用途，已经公开了大量的报告，如用于防止并治疗血栓形成的试剂(JP-A-57-183716，本文所用的术语“JP-A”是指未审查的公开的日本专利申请)，一种分离并纯化多不饱和脂肪酸或其酯的方法(JP-A-61-37752)，一种含有多不饱和脂肪酸的抑制癌的组合物(JP-A-63-258816)，一种分离和纯化多不饱和脂肪酸烷基酯的方法(JP-A-63-8356)，一种含有二十二碳六烯单甘油酯作为活性组分的抑制癌的试剂(JP-A-1-203322)，一种含DHA和其酯作为活性成分的脑功能增强剂(JP-A-1-153629)和一种改善脑功能的组合物，一种提高认知能力的试剂，一种提高记忆力的药剂，一种防止痴呆症的试剂，一种治疗痴呆症的试剂或一种具有改善脑功能的生理功能食品(JP-A-2-49723)。
在大多数情况下，从如金枪鱼、沙丁鱼，狐坚等的鱼油中提取DHA或含DHA的油，但缺点是，由于鱼类的迁栖行动，所述油类不能作为稳定的供应源，由于不容易除去鱼油组合物和鱼油特有的恶臭味，所以很难从其它不饱和脂肪酸中分离DHA。至于从鱼油以外的其它物质中生产DHA或含DHA的油，已经设想了几种方法，如一种方法是用被孢霉属的菌株，通过微生物转化生产多不饱和脂肪酸(JP-A-63-185389)，一种方法是用能生产花生四烯酸的微生物生产富集多不饱和脂肪酸的油(JP-A-1-304892)，一种方法是从海洋微生物中生产含多不饱和脂肪酸的脂(JP-A-2-142486)，一种方法是用刺孢囊霉属的菌株生产多不饱和脂肪酸(JP-A-2-23878)，一种方法是从横断刺孢囊霉ATCC 16960和18036的培养混合物中得到多不饱和脂肪酸(EP-A-355972)。还有一些其它的已知方法，其中所用的微生物有细菌(DeLong，E.F.&.Yayanos，A.A.Appl.Environ.Micrbiol，vol，51(4)，P.730，1986)，真菌破囊壶菌(Thraustochytrium)(Haskins，R.H.等人;Can.J.Microbiol.vol.10，p.187，1964)，一种虫霉属真菌(Tyrrell;Can.J.Microbiol.vol.13，p.755，1967)，一种Japonochytrium sp.ATCC 28207真菌(JP-A-1-199588)及包括腰鞭毛亚纲和定鞭藻纲的藻类(Joseph，J.D.Lipids，vol.10.p.395，1975;Nichols，P.D.等人，Phyto chemistry，vol.23，p.1043，1984)。然而这些方法是以自然繁殖或简单的稳定培养为基础，没有积极的藻细胞增殖。另外，由于DHA产率低，从工业应用性的观点看，这些方法不如鱼油生产法。
一般知道，在微生物培养方法中，间歇培养和补料间歇培养因二级代谢产物和抑制微生物生长的废物的积累而不能有效地保持高生产率水平，而从生产效率的观点看，由于连续培养能以高水平保持和控制培养基中微生物相的繁殖活性，所以这种培养更有利。可以从有关各种微生物蛋白(单细胞蛋白，SCP)生产方法等的大量报告中，发现连续培养的上述优点。然而，对于海洋微藻来说，在几乎全部情形下，是通过无剪切力的稳定培养来生产，甚至未浓度发展振荡培养方法，这是因为藻细胞对搅拌剪切力的敏感性。基于上述原因，一般认为连续培养不适用于海洋微藻。
关于海洋微藻的振荡培养，到本申请日之前，仅有一篇报告涉及在Crypthecodinium cohnii中DHA形成的环境条件(D.H.Beach等人;Biochimica et Biop hysica Acta，vol，316，pp 56-65，1975)和一本书(David J.Kyle等人;Industrial Application of Single Cell Oils，chapter 16，pp. 287-300，Americal Oil chemist'sSociety，1992)，但用这些技术的DHA的生产量对于工业生产来讲太低了。最近，申请了一个关于用Crypthecodinium cohnii MK-8840(ATCC-40750)生产DHA及含它的配合物的发明(WO91/11918)，公开了振荡培养海洋微藻的方法。该发明是一种方法，其中限制了对于藻细胞生长所必需的营养以便通过牺牲细胞生长来增加藻细胞中含DHA的成分。但是，由于该方法以耗尽营养成分作为必需的条件，因此，不能将其用以进一步提高藻细胞中含DHA脂为目的的连续培养系统，因此，从工业生产上看，它有一定的不足。结果是，必需要为这些现有技术生产方法的实现，和用这些方法的DHA实际的工业化生产解决大量的技术问题，因此，认为很难有经济效益。
另外，已经有报告说，通过现有技术的连续培养系统，可以改善藻细胞的生产量，但会降低所需产品的含量，并且当使用具有较小特定生长率的微生物时，与间歇培养系统相比，通过连续培养系统产生的二级代谢物造成经济上的损失(P.F.Stanbury and A.Whitaker，Principles of Fermentation Technology;a Japanese version translated by B.Ishizaki and published by Gakkai Shuppan Center，p.238，1988)。
已经知道海洋微藻，Crypthecodinium cohnii，一般通过无性或有性繁殖来进行自身繁殖。
在无性繁殖的情况下，每个滋养体变成一个球细胞，其细胞质重复1到3次的细胞分裂，释放2到8个游动细胞。然后，通过这些游动细胞的细胞分裂使藻细胞的单个数目成倍增加。
在有性繁殖的情况下，另一方面，两个游动细胞作为配子相互结合形成有4个鞭毛的接合子。然后，这些鞭毛消失形成球形接合子，经过减数分裂，每个所得的细胞变成一个滋养体完成其繁殖。
观察这种海洋微藻Crypthecodinium cohnii的无性生活史，本发明人已经分离出一个菌株，它能够仅通过无性繁殖，在一个延长时期具稳定完成其繁殖并发现了该菌株可以稳定繁殖的培养条件。以上述结论为基础，完成了本发明。
尽管DHA有各种生理活性，如抑制癌的功效，但由于其原材料依赖于鱼油，所以其供应和质量还不稳定。另外，为了除去鱼油特殊的臭味，现有技术的方法需要许多纯化步骤和费用。更严重的是，甚至通过这些纯化步骤也不能足以除去鱼油的特殊臭味，因此，显示了该产品的不方便利用性。由于这些技术问题尚未得到解决，所以最终产品很昂贵。
从上文看，提供一种生产方法就成为本发明的一个目的，其中，通过连续培养，可以用工业化方法生产并稳定地供应质量稳定的、代替鱼类的海洋微藻，由此，改善藻细胞中二十二碳六烯酸(DHA)的含量，且藻细胞的生产率比现有技术的方法高出很多，从藻细胞中稳定生产的DHA费用低。
为了克服现有技术中存在的上述问题，本发明人进行了深入的研究并用连续培养代替现有技术的间歇培养成功地生产出高密度的海洋微藻藻细胞，并发现，用该方法可以明显改善藻细胞中的DHA含量。以这些结果为基础，已经完成了本发明的DHA生产方法，其中，回收经连续培养系统生产的藻细胞并直接从细胞或经干燥后，提取并纯化DHA。
特别是，根据本发明，提供一种培养海洋微藻的方法，包括在通气和搅拌条件下，在培养基中连续培养海洋微藻，由此生产海洋微藻藻细胞。
优选地是，海洋微藻是Crypthecodinium cohnii，更优选地是对表面活性剂有抗性的，并且可以承受振荡培养和连续培养。优选地是，用多元醇、丙酮酸、三油酸甘油酯和/或氨基酸补充培养基。优选地是，在连续培养中使用Crypthecodinium cohnii的无性繁殖期。
本发明的另一目的是提供一种生产DHA的方法，包括从经上述海洋微藻生产方法生产的藻细胞中提取DHA。
本发明的另一目的是提供一种Crypthecodinium cohnii菌株，该菌株能够在通气和搅拌条件下承受连续培养并能生产DHA。
本发明的另一目的是提供一种Crypthecodinium cohnii菌株，该菌株对表面活性剂有抗性并能承受振荡培养和连续培养并能生产DHA。
通过进一步的描述，本发明的其它目的和优点是显而易见的。
在成功地发现并培育了能承受其连续培养的Crypthecodinium cohnii菌株的基础上，完成了本发明。通过从海洋微藻中经重复单细胞分离具有连续培养抗性的藻菌株，以及这些分离物随后的培养适应性，得到了该菌株，所述的藻菌株能够在振荡培养和连续培养条件下生长，曾认为所述的海洋微藻仅适合稳定培养。在上述特有的技术成功的基础上，获得了本发明的功效，所述的技术成功完全不同于现有技术，在重复它们的液体振荡培养后，现有技术会引起藻细胞繁殖能力的降低。
本发明中所用的微生物是能生产DHA的海洋微藻，如Crypthecodinium cohnii等。这些是已知的藻类，并且可以从包括ATCC(美国典型培养物收集中心)的保藏培养机构获得。上述微藻的说明性实例包括Crypthecodinium cohnii ATCC 30021，30543，30556，30571，30572，30575，50051，50053，50055，50056，50058，50060等保藏培养菌株，最佳的是Crypthecodinium cohnii ATCC 30021。
将这些藻菌株经过重复的单细胞分离和培养适应培育出一个能够承受连续培养条件的菌株，并在本发明的方法中使用如此培育的菌株的藻细胞。
为了培育上述菌株，将培养的藻细胞悬浮在1.0%到3.5%的生理盐水中达到102到103个细胞/ml的浓度，分散在含2%到4%重的葡萄糖和0.2%到0.5%重的酵母提取物的琼脂培养基上，然后温育3到4天。
接着，将在琼脂培养基上形成的每个菌落转移到300ml容积的锥形瓶中，该锥形瓶中含有已经用表面活性剂补充到0.01到1.0g/升终浓度的100ml液体培养基(Ⅱ)，该培养基含有实施例中所示的组合物。将接种的菌落在150到250rpm的振荡器上，于24到32℃培养2到8天。将所得的培养混合物离心，回收藻细胞，用有机溶剂从回收的细胞中提取DHA以测量每个藻菌株的DHA生产率。
然后，将振荡培养得到的藻细胞悬浮在2%的生理盐水中，并将上述的稳定培养/振动荡培养过程复10到15次。在每个复步骤中，筛选有高生长率、高表面活性剂抗性和高DHA生产率以及能承受振荡培养条件的藻菌株。然后，用含有补充有上述表面活性剂的液体培养基(Ⅱ)的约5升容积的小发酵罐，在28到32℃，培养基PH7.0，搅拌速度200到350rpm，通气率0.2到1.5vvm条件下，将每个筛选的藻菌株经5到10次的重复连续培养。用这种方法，完成具有高生长率、高表面活性剂抗性和高DHA生产率以及能承受振荡培养和连续培养条件的藻菌株的培育。
将通过把约2%重的琼脂加到含2%到4%重葡萄糖及0.2%到0.5%重酵母提取物的生理盐水中而制备的琼脂培养基用于单细胞分离，并将在下列连续培养操作中所用的液体培养基用于培养适应。
在有关培养适应的振荡培养及连续培养中，将表面活性剂或消泡剂加到液体培养基中以达到0.01到1.0g/升的终浓度。
然后，用这样得到的连续培养抗性藻菌株进行连续培养。下面描述连续培养的条件。
可以将任何培养基组合物用于本发明的藻菌株培养，如果它们可以在培养基中适当的进行自身繁殖。
培养基可含有适当的碳源、氮源、无机盐等。可以被本发明的藻类同化的碳源的实例包括有机化合物，如甘油等，碳水化合物如葡萄糖、果糖、半乳糖等以及有机酸如柠檬酸、乙酸等。
另外，将多元醇、丙酮酸、三油酸甘油酯和/或氨基酸加到液体培养基中可以提高DHA的产量。认为在脲循环中可获得的氨基酸如精氨酸和谷氨酸有利于DHA的产率。将多元醇、丙酮酸、三油酸甘油酯和/或氨基酸加到液体培养基中的优选量是0.25-10mM。
培养基中用于连续培养的碳源浓度一般优选在0.1%到6.0%重量范围内，最好为0.2%到3.0%重。对于在藻细胞分离回收后，降低需处理的培养基中残余葡萄糖的数量，从而节约葡萄糖的费用，并将DHA产率保持在稳定的水平，上述浓度范围是优选的。
氮源的说明性实例包括通常所用的无机氮化合物，如硫酸铵、硝酸铵等，和有机氮源，如胨、酵母提取物、酪蛋白水解物、谷氨酸、玉米浆等。在培养基中，用于连续培养的氮源浓度可以优选占培养基中所含碳源的1/10到1/5。
关于无机盐，天然海水是最好的，但也可使用各种类型的已知的人造海水，以及各种钠盐、磷酸盐、镁盐、钾盐、硼酸盐、碳酸盐等。
也可以用痕量的重金属盐如铁盐、锰盐、钴盐、锌盐、氯化物、溴化物等。本发明方法所用的无机盐中，也包括这些重金属盐。
说到培养方法，用其无性繁殖，完成Crypthecodinium cohnii的连续培养。用这种方法，藻细胞中DHA的含量明显提高。
无性繁殖的条件是保持生长条件而不是减少生长所需的营养，由于在营养耗尽的条件下可以观察到新鲜水甲藻的有性繁殖[Phycologia，14(1)，1-8(1975)]。
由于DHA累积于本发明所用的Crypthecodinium cohnii菌株的藻细胞内，所以通过提高藻细胞的生产率可以增加DHA的生产量。
另外，按下文实施例中所说明的，本发明中所用的海洋微藻Crypthecodinium cohnii，甚至经连续培养，也不降低作为其代谢物的DHA的含量。
为了将藻细胞密度提高到开始连续培养所必需的特定水平(如15g/升)，需进行预培养。可以在15到32℃，最好28到32℃，中性培养基PH范围内完成预培养和连续培养。可以根据培养基中剩余的碳源和分泌的物质量确定培养的完成。
通过将培养基糖(葡萄糖)浓度控制在使藻菌株得到适当的特定生长速率的某一水平，优选的是6.0%重或更低的水平，最好是0.2%到3.0%重，完成连续培养。
酵母提取物作为氮源，其用量为葡萄糖浓度的1/5到1/10，并根据将在下文实施例中描述的培养基(Ⅰ)的组合物，使用矿物质。
可以用选自脂肪酸酯、有机硅等的表面活性剂或消泡剂完成连续培养，最好用配有喷雾器和搅拌器的罐发酵器。
表面活性剂或消泡剂的说明性实例包括甘油单脂肪酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯，和硅基消泡剂，如甘油单油酸酯，甘油单硬脂酸酯、甘油单棕榈酸酯、甘油单亚油酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、SiliconKM-75等。
优选的，在培养基中所用的表面活性剂或消泡剂的量为0.01到1.0g/升，以防止泡沫而不损害藻细胞的DHA生产量。
按照本发明的连续培养，将罐发酵器或大的罐作为培养容器，当藻细胞密度达到预先确定的水平时，将新鲜的培养基连续加到容器中，同时以与培养基添加速率相同的速率回收培养的培养基。通过离心、过滤或类似的方法从回收的培养培养基中收集由此繁殖的藻细胞。
有关供应培养基的稀释速率，可以以0.25hr-1或更低，但最好是0.1到0.2hr-1的液体体积速率有效地进行连续培养，以得到最大的生产量。如果速率大于0.25hr-1，会冲掉培养基并破坏连续培养的稳定操作，因为它高于Crypthecodiniumcohnii无性繁殖的特定生长速度。
尽管在连续培养操作期间，可以将稀释速率保持在一个稳定的水平，但最好逐渐增加稀释速率，如以10小时的间隔。
优选的是，以26到30℃，0.2到1.0vvm的通气速度，若使用高速搅拌机时，以高速搅拌机顶端外周速度为50到250cm/秒，进行连续培养。
通过添加新鲜的培养基并将上述培养条件保持在一个恒定的水平，从而有效进行连续培养。
对于连续添加的培养基，可以用实施例中所示的用葡萄糖和酵母提取物补充的培养基(Ⅲ)。
通过使用一般的离心、过滤等方法，例如在10℃，以8000xg离心10分钟，可以完成从流出的培养基中回收藻细胞。将由此回收的藻细胞用于DHA的提取，如此或经冻干或加热及通气方法干燥后进行提取。
优选的是在有脂肪酸氧化抑制剂，如α一生育酚存在或在惰性气体如氮气中，进行从藻细胞中提取和纯化DHA。实施例中所示的提取方法中，使用有机溶剂系统如甲醇/氯仿，Folch、Lees和Stanley的纯化方法也有用。可以通过各种类型的柱层析或再结晶，将由此部分纯化的产物进一步纯化。
实施例用下面的实施例进一步说明本发明。但应理解，这些实施例仅起说明的目的，而不作为限制本发明的界限。
下面是在有创新力及比较的实施例中所用的培养基组合物和海水。
培养基(Ⅰ)(Aquamarine，由YaesuYakuhin制造)MgSO4.6H2O 11.11g KBr 0.10gCacl2.2H2O 1.54g H3BO30.03gSrcl3.6H2O 0.04g NaF 0.003gKcl 0.69g Nacl 24.53gNaHCO30.20g Na2SO44.09g
蒸馏水1.0升。
PH7.0(用1N Hcl调整)培养基(Ⅱ)用2%(V/V)葡萄糖和0.2%(V/V)酵母提取物补充的改良培养基(Ⅰ)培养基(Ⅲ)用24%(V/V)葡萄糖和2.4%(V/V)酵母提取物补充的改良培养基(Ⅰ)培养基(Ⅳ)用0.5g/l的表面活性剂补充的改良培养基(Ⅱ)日本Kawasaki-cho、Chuoh-Ku、Chiba-shi海边的海水有创新力的实施例1将Crypthecodinium cohnii ATCC 30021的细胞悬浮在2%的生理盐水中，达到102到103个细胞/ml的密度，分散在含2%(重)葡萄糖和0.2%(重)酵母提取物的琼脂培养基上，然后在28℃温育4天。
接着，将在琼脂培养基上由此形成的每个菌落转移到含100ml培养基(Ⅳ)的300ml容积锥形瓶中，所述的培养基(Ⅳ)是由用表面活性剂补充的液体培养基(Ⅱ)，达到0.5g/升的终浓度而制备的。将由此接种的菌落在180rpm的摇床上于28℃培养5天。使所得的培养混合物经离心回收藻细胞，用有机溶剂从回收的藻细胞中提取DHA以测量每个藻菌株的DHA生产量。用这种方法，筛选具有高DHA生产量的藻菌株。
然后，将由此筛选的藻菌株的细胞悬浮于2%生理盐水中，并将上文的稳定培养/振荡培养过程重复12次。在每个重复步骤，筛选表现高生长率、高表面活性剂抗性和高DHA生产量以及能承受振荡培养条件的藻菌株。然后，用含下列液体培养基(Ⅳ)的5升容积的小罐发酵器，在28℃，培养基PH7.0，300rpm的搅拌速度，0.3vvm的通气率，将上述筛选的每个藻菌株经过7次重复的连续培养。用这种方法，完成培育，得到具有高生长率，高表面活性剂抗性和高DHA生产量并能承受振荡和连续培养条件的藻菌株。将上述得到的连续培养抗性菌株在上述所述菌株能够重复其无性繁殖的条件下，用于下列培养步骤。
为了用于下列的培养实验，通过用2%(V/V)葡萄糖和0.2%(V/V)酵母提取物补充培养基(Ⅰ)的组合物，并将所得的混合物在120℃于高压灭菌锅中灭菌15分钟，从而制备培养基(Ⅱ)。
将一满环的Crypthecodinium cohnii ATCC30021的细胞接种到起始PH为5.5到7.5的100ml培养基(Ⅱ)中以在28℃完成为期7天的稳定培养。(下文将由此得到的藻细胞称为“稳定培养藻细胞”。)将10ml由此得到的培养培养基接种到5个烧瓶(300ml容积)中的每个含100ml培养基(Ⅱ)(PH6.8)的瓶中，并在180rpm的旋转摇床上于28℃培养5天。(下文将由此得到的藻细胞称为“振荡培养藻细胞”。)将5个烧瓶中所得的培养液(500ml)混合起来，并将其作为种培养物接种到含7升培养基(Ⅱ)(PH7.0)的10升容积的罐发酵器以在28℃、300rpm的搅拌速度和0.3vvm的通气率完成罐发酵。在这种情况下，将0.75g的脂肪酸酯基表面活性剂，甘油单油酸酯用作消泡剂。
在罐发酵开始后，收集样品，在105℃干燥5小时以测量藻细胞密度。当藻细胞的密度达到5g/升时，在与上述罐发酵相同的培养条件下，通过以0.1hr-1的稀释速率连续补充培养基(Ⅲ)，从而开始连续培养。连续补料开始后，通过从0.1hr-1的起始速率到0.12，到0.14然后到0.16hr-1逐步增加稀释速率，完成为期3天的连续培养，细微调整稀释速率是为了将培养基葡萄糖浓度保持在0.5%到3.0%(重)的范围内。连续培养开始后，在培养培养基中未发现一个有复鞭毛的藻细胞。(下文将由此得到的藻细胞称为“连续培养藻细胞”。)将从罐发酵器中流出的培养培养基于10℃以8000xg离心15分钟，以回收随后经冻干的藻细胞。
将部分培养培养基在105℃干燥5小时以找出一个产率为15.0g/升的干燥藻细胞和一个生产量为1.8g/hr/l的干燥藻细胞。
按一般使用的Bligh-Dyer提取法[Shin Seikagaku Jikken Koza(A New Course of Biochemical Experiments)，vol，4Lipid-Ⅱ，P.9，1991，Tokyo Kagaku Dojin]从上述冻干藻细胞中提到并纯化DHA，其中，用5体积甲醇/氯仿(1/2)与藻细胞混合，并用搅切器处理。
将由此部分纯化的产品经甲基酯化作用(上一段落所描述的出版物，P.54)以便用DHA原样品通过气相层析分析确定其数量。
同样，用常规方法，通过液体层析(柱，ODS;流动相，甲醇∶水＝95∶5;流速，1.0ml/min;检测，RI)完成DHA分离以得到纯度为99.2%的DHA，且发现其生产量为0.12g/l/hr。
经气相层析确定的藻细胞中的脂肪酸组成如下。
藻细胞脂肪酸培养 稳定培养 振荡培养 连续C12:0 33.4% 5.7% 3.0%C14:0 40.2% 27.5% 16.2%C16:0 10.9% 22.7% 23.7%C18:0 0.9% 1.6% 1.8%C18:1 3.3% 8.0% 9.1%C22:6(DHA) 11.3% 34.5% 45.2%总量 100.0% 100.0% 100.0%有创新的实施例2在与有创新的实施例1中的描述相同的条件下，培养海洋微藻Crypthecodinium cohnii的每个下述ATCC菌株。按照藻细胞产率和每小时DHA的产率在表1列出了结果(ATCC 30021，连续培养3天;其它菌株，连续培养1天)。
表1 Crypthecodinium cohnii连续培养的结果
比较实施例1(补料间歇培养)用Crypthecodinium cohniiATCC 30021作为试验菌株，在与有创新的实施例1中的描述相同的条件，完成稳定培养和振荡培养，将由此得到的500ml培养培养基作为菌种，接种到含7升培养基(Ⅱ)的10升容积的罐发酵器中。
首先，在28℃，培养基PH6.8，搅拌速度300rpm及0.3vvm的通气速率，用上述接种的罐发酵器进行间歇培养直到藻细胞密度(干细胞)达到5g/l。然后，通过在间歇培养开始后的60，80，100小时，无菌添加作为碳源的葡萄糖、作为氮源的酵母提取物和矿物质，由此补充占总量10%(重)的碳源、相当量的氮源10%(重)和培养基(Ⅰ)的各矿物质浓度，从而完成补料间歇培养。在补料间歇培养过程中，将培养基温度保持在恒定的28℃，但在间歇培养开始后60小时，将搅拌速度逐步从300rpm提高到315rpm，80小时后，达到330rpm，100小时后，到350rpm。以同样的方式，60小时后，将通气速率逐步从0.3vvm提高0.35vvm，80小时后达到0.4vvm，100小时后，达到0.5vvm。作为消泡剂，需要时，加入2.25g(总量)脱水山梨醇脂肪酸酯。培养120小时后，得到每升26.3g的干燥藻细胞。在最终得到的培养培养基中，发现藻细胞各有一个复鞭毛。
按与有创新实施例1中的描述相同的方法，完成从所得的干燥藻细胞中提取并纯化DHA以得到每升1.15g的DHA。干燥藻细胞和DHA的生产量分别为0.21g/hr/l和9.58mg/hr/l。
比较实施例2按与有创新的实施例1中的描述相同的方法，间歇培养比较实施例1中得到的藻菌种，并且，当藻细胞密度达到干细胞为15g/l时以0.35hr-1的稀释速率开始连续培养基补料。然而，具有稳定细胞密度的连续培养仅持续12小时，因为藻细胞的生长率与培养基的补料速率不相匹配。
比较实施例3用下列Crypthecodinium cohnii的各ATCC菌株重复比较实施例1的补料间歇培养，结果列于表2。
表2Crypthecodinium cohnii补料间歇培养的结果<
>
有创新的实施例3用Crypthecodinium cohnii ATCC 30021，在与有创新的实施例2中描述的相同的条件下，除另外还用0.267mM的精氨酸补充培养基外，完成连续培养。结果，得到0.16g/l的DHA生产量。
有创新的实施例4在与有创新的实施例3中所描述的相同的培养条件下，除另外还用4.56g/l的甘油补充培养基外，完成连续培养。结果，得到0.12g/l的DHA生产量。
有创新的实施例5在与有创新的实施例3中所描述的相同的培养条件下，除还用5.0g/l的丙酮酸补充培养基外，完成连续培养。结果，得到0.14g/l的DHA生产量。
因此，按上文所述，按照本发明的生产方法，通过从经连续液体培养方法生产的海洋微藻细胞中提取DHA，可以以低成本稳定地提供没有鱼腥味的DHA，所述的连续液体培养方法可以有效地生产具有工业上稳定的高DHA含量的高密度藻细胞，而现有技术中DHA生产是依赖于从鱼油如，金枪鱼、沙丁鱼等中提取，由于是天然产品，其生产量和质量不稳定很大程度上取决于捕鱼季节和区域。
权利要求
1.一种培养海洋微藻的方法，包括在通气和搅拌条件下，在液体培养基中连续培养海洋微藻，由此生产所述的海洋微藻藻细胞。
2.根据权利要求1的海洋微藻生产方法，其中所述的海洋微藻是Crypthecodinium cohnii。
3.根据权利要求2的海洋微藻生产方法，其中所述的Crypthecodinium cohnii是表面活性剂抗性的，并能承受振荡培养和连续培养条件。
4.根据权利要求1到3的任一海洋微藻生产方法，其中所述的液体培养基用多元醇、丙酮酸、三油酸甘油酯和/或氨基酸补充的。
5.根据权利要求2到4的任一海洋微藻生产方法，其中使用Crypthecodinium cohnii的无性繁殖阶段。
6.一种生产二十二碳六烯酸的方法，包括在通气和搅拌条件下，在液体培养基中连续培养海洋微藻，并从所述海洋微藻所得的藻细胞中提取二十二碳六烯酸。
7.根据权利要求6的二十二碳六烯酸的生产方法，其中所述的海洋微藻是Crypthecodinium cohnii。
8.根据权利要求7的二十二碳六烯酸的生产方法，其中所述的Crypthecodinium cohnii是表面活性剂抗性的并能承受振荡培养和连续培养条件。
9.根据权利要求6到8的任一二十二碳六烯酸的生产方法，其中所述的液体培养基用多元醇、丙酮酸、三油酸甘油酯和/或氨基酸补充。
10.根据权利要求7到9的任一二十二碳六烯酸的生产方法，其中使用Crypthecodinium cohnii的无性繁殖阶段。
11.一种能承受通气和搅拌连续培养条件并能生产二十二碳六烯酸的Crypthecodinium cohnii菌株。
12.一种对表面活性剂有抗性并能承受振荡培养和连续培养条件且能生产二十二碳六烯酸的Crypthecodinium cohnii菌株。
全文摘要
本发明提供一种稳定且低成本生产无鱼腥味的二十二碳六烯酸的生产方法，其中从经连续液体培养生产的海洋微藻的细胞中提取二十二碳六烯酸，所述的连续液体培养方法可以有效地以工业上稳定的高浓度生产二十二碳六烯酸。特别是，提供培养海洋微藻的方法，包括在通气和搅拌条件下，在液体培养基中连续培养海洋微藻，由此生产海洋微藻的藻细胞，以及生产二十二碳六烯酸的方法，包括从经海洋微藻生产方法生产的藻细胞中提取二十二碳六烯酸。
文档编号C12P7/64GK1101034SQ9410662
公开日1995年4月5日 申请日期1994年4月26日 优先权日1993年4月26日
发明者武内大造, 上原健一, 饭时男 申请人:川崎制铁株式会社