专利名称：人源化白细胞介素-2免疫毒素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用基因工程技术制备的新型蛋白质分子，具体地说涉及白细胞介素-2(IL-2)和血管生成素(angiogenin，Ang)的融合蛋白(缩写IL-2-Ang)，此种蛋白可做为免疫抑制剂应用于一些疾病的治疗。
IL-2是由T细胞分泌的一种细胞因子，绝大多数静止的T细胞并不表达IL-2受体，必须被特异活化后才表达，而在一些肿瘤特别是白血病、淋巴瘤、自身免疫疾病、移植排斥反应的病人体内有IL-2受体的异常高表达，这些表达IL-2受体的细胞恰好可以成为IL-2融合蛋白治疗的一个靶子，使IL-2毒素可以准确地杀伤这类细胞。
血管生成素(Ang)是存在于人体内的正常成份，在细胞外无毒性作用，因为它具有较强的促进新生血管生成作用而得名，这种因子还有RNA酶的活性，在细胞内可裂解40S亚基中的18S RNA而抑制蛋白质的合成，对细胞产生毒性作用(Rybak SM et al，PNAS 1992；893165)。
目前，已有多种免疫毒素被研制出来，特别是白细胞介素2(IL-2)免疫毒素，包括IL-2与绿脓杆菌外毒素的融合蛋白，IL-2与白喉毒素的融合蛋白等，后者在美国已进入临床I/II期试验，并收到较好疗效，是一种应用前景良好的新一代免疫抑制剂(Terry B et al，Immunol Rev 1992；129131)。但是目前研制的IL-2免疫毒素其毒素均是来自细菌或植物，对人体来说是异种蛋白，容易引起中和抗体的产生，使疗效下降，并可能导致严重副作用，迄今尚无有关人源性的IL-2免疫毒素的报道。
由于目前IL-2免疫毒素的毒素均是来自细菌或植物，对人体来说具有较强的抗原性，在临床试验中大多数病人都产生了可检测到的中和抗体，这就使治疗时间受到限制，也影响毒素作用的发挥，还有可能导致一些严重副作用。
本发明的目的是提供一种完全人源化的IL-2免疫毒素。
本发明的另一目的是提供一种采用生物技术来制备IL-2-Ang融合蛋白的方法。
本发明的又一目的是采用IL-2-Ang融合蛋白治疗移植排斥反应，某些T细胞淋巴瘤及自身免疫性疾病。
本发明的目的是通过下述方法实现的本发明利用基因融合，基因表达及基因工程产品纯化的程序，在大肠杆菌中生产IL-2-Ang融合蛋白。我们分别合成IL-2和Ang的上下游引物，其中IL-2的下游引物去除IL-2终止密码，经PCR扩增目的基因，分别进行克隆化，再经PCR扩增导入IL-3的N端14个氨基酸编码序列及内切酶消化获得IL-2和Ang的DNA片段，纯化后经基因融合，重组到大肠杆菌表达载体pKpL-3a(周保宏等，中华微生物学和免疫学杂志，1992，12(3)174)，转化大肠杆菌，诱导表达，分离包涵体、变性、复性及纯化获得重组IL-2-Ang融合蛋白，其两者之间含有人IL-3N端14个氨基酸编码序列做为接头。
本发明最大的优点在于IL-2与Ang均是人源的，对人体抗原性比较弱，可长期反复给病人使用。同时Ang是存在于人体内的正常成份，在细胞外无毒性作用，只有进入细胞内方能产生毒性作用，不会对无关细胞产生毒性作用，这就减少了IL-2免疫毒素的体内非特异毒性作用。
下面结合附图作详细说明
图1为IL-2-Ang融合蛋白DNA碱基序列(bp)。其中包括IL-2序列(DNA序列1--402bp)，IL-3N-端亲水性中间接头序列(DNA序列403-444bp)，Ang序列(DNA序列445-813)编码。
图2为氨基酸序列图。
图3为融合蛋白表达载体示意图，其中a示PL启动子，b示IL-2基因，c示中间接头，d示Ang基因，e示pKpL载体DNA。
本发明的详细实施步骤如下一.IL-2功能区基因克隆为获得最佳碱基排列，避免可能干扰转译起始的mRNA二级结构，增加表达的IL-2均一性和稳定性，在构建IL-2cDNA质粒表达克隆pKpL-h IL-2时已除去其起始密码子ATG，现以人工合成的SD序列为上游引物，(5′-TCGACCTAAGGAGGTTTAAC-3′)，IL-2基因功能区3′端为下游引物(5′-GTTAGTGTTGAGATGATGCTTT-3′)，下游引物去除终止密码TAG，以pKpL-h IL-2cDNA克隆为模板，经PCR扩增IL-2基因片段，获得的0.4Kb产物用Promega Magic试剂纯化，经SalI酶切后再纯化，与SmaI接头连接，再经SmaI酶切，将经上述处理的PCR产物与经SalI和SmaI双酶切后的pKpL表达载体重组，转化pop2136受体菌，挑选克隆，经诱导表达和质粒酶切鉴定获得阳性克隆pKpL-mh IL-2。
二.含中间接头的Ang基因克隆根据已公布的人Ang序列设计引物，以肝细胞文库为模板经PCR扩增Ang的cDNA片段，将其插入本室构建的人IL-3表达克隆pMT-h IL-3质粒(马大龙等，高技术通讯，1991，1126)获得Ang的表达克隆pMT-hAng，再以pMT-hAng质粒DNA为模板，用IL-3的上游序列引物(5′GCTCCCATGACCCAGACA-3′)，和Ang下游序列引物(5′-TTTAAGCTTACGGACGGGGAAAATGG-3′)，经PCR扩增，即可获得5′端带有人IL-3N-端14氨基酸(见图3c)和人Ang编码序列(见图3d)的基因片段。
三.IL-2-Ang表达质粒的构建将Ang的PCR产物以HindIII酶切后与去终止密码的IL-2表达克隆(见图3b)连接，即构成重组的IL-2-Ang表达克隆pKpL-IL2-Ang(IL-2-Ang核苷酸序列见图1，完整质粒图谱见图3)。在pL启动子(见图3a)作用下，表达IL-2-Ang融合蛋白(氨基酸序列见图2)。
四.大肠杆菌高效表达融合蛋白将pKpL-IL2-Ang克隆转化pop2136受体菌，以2％接种量接种于LA液体培养基，30℃水浴振荡约8小时，加等量新鲜LA液体培养基42℃诱导3小时，收获菌体裂解，SDS-PAGE电泳，用薄层扫描仪测得表达蛋白占菌体蛋白25％，蛋白带的分子量为28KD，与理论估计值相符。
五.纯化将上述收获菌体置冰浴超声破碎，离心10000rpm10分钟，4℃，包涵体用洗液洗涤二次，再用0.15MPBS pH7.4洗二次，8M尿素37℃变性3小时，室温过夜复性，透析后过DEAE离子交换柱，可获得纯化度大于90％的产品。
六.活性测定经3H胸腺嘧啶掺入β液闪仪测定，0.2ug的IL-2-Ang融合蛋白即可明显抑制体外的混合淋巴细胞反应，体内活性检测15ug/天/只注射小鼠，5天后取脾脏检测发现可明显抑制对ConA活化脾细胞的增殖反应。
权利要求
1.一种新型的融合蛋白，命名为IL-2-Ang，其特征在于N端为人IL-2，C端为血管生成素(Ang)，两者间含有一段由亲水性氨基酸组成的多肽，起接头的作用，可防止IL-2和Ang的分子间干扰。
2.如权利要求1.所述之融合蛋白，其特征在于其制备IL-2-Ang的方法，该方法是利用基因融合，基因表达及基因工程产品纯化的程序，在大肠杆菌中生产IL-2-Ang融合蛋白。
3.如权利要求1，2.所述之融合蛋白，IL-2-Ang的用途可作为免疫抑制剂用于移植排斥，自身免疫病，某些T细胞淋巴瘤等疾病的治疗。
全文摘要
本发明公开了一种新型的人源化白细胞介素-2免疫毒素(缩写IL2-Ang)，其特点是在人白细胞介素-2(IL-2)的羧基端融合人血管生成素(Angiogenin，Ang)，两者之间带有一段由亲水氨基酸组成的接头。通过基因工程技术在大肠杆菌表达和纯化，获得IL-2-Ang，并证明其具有免疫抑制活性，它的优点在于毒素成分源于人体蛋白，不易引起机体的免疫应答，在治疗自身免疫病，变态反应，移植排斥和T淋巴细胞肿瘤中有良好的应用前景。
文档编号C12N15/26GK1114685SQ94117768
公开日1996年1月10日 申请日期1994年11月9日 优先权日1994年11月9日
发明者马大龙, 王露 申请人:北京医科大学