专利名称：在成熟果实中使用蕃茄e8衍生的启动子表达异源基因如5-腺苷甲硫氨酸水解酶的制作方法
技术领域：
本发明领域本发明描述了使用E8启动子以及本文描述的变异体作为有用的可调节启动子以表达包括AdoMetase基因在内的异源基因。参考文献Ausubel，F.M.，et al.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，MediaPA.
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Studier，F.W.，et al.，J.Virol 19136(1976).本发明背景乙烯是一种植物激素，是植物的代谢、作用以与其他微量植物激素相互作用的强有力调节剂。在正常生理状态下乙烯是气体。即使浓度很低，乙烯对植物也有很大的激素作用。
不管是由植物自身产生的，还是使用外源的，乙烯的作用是很多的，显著的并且具有很大的商业价值。其各种生理作用中包括有叶脱离；花渐衰；花萎蔫；叶黄化；叶偏上；以及刺激水果和蔬菜成熟。乙烯可加速植物中选择的细胞群和完整器官如果实，叶或花的衰老。衰老是正常的，受遗传控制的退化过程，通常会导致植物死亡。
正常情况下由植物组织产生的乙烯量很低。然而大量乙烯是在成熟和衰老过程中产生的。大量乙烯也可随着由化学药品、极限温度、水压、紫外光、昆虫损害、病害或机械损伤引起的外伤而产生。在这些外伤状态下由植物产生的乙烯被称为“愈伤乙烯”或“压力乙烯”。在水果和蔬菜中，割伤或擦伤对乙烯产生的刺激作用很大，并对贮藏效果影响很大。由乙烯诱导的叶褐变是造成包括莴苣和烟草在内的许多植物损失的共同根源。在一些组织中，仅仅暴露于少量乙烯即可引起相邻植物或植物组织(如新近产生的组织)突然大量产生乙烯。这种自身催化作用可能非常显著，并导致在运输和贮藏过程中果实质量的丢失。
特别针对收获后贮藏寿命的新技术已经存在了数十年，但因高花费、副作用以及不能完全阻止乙烯产生等问题而妨碍了其应用。这一类技术包括有受控制的大气(CA)贮藏、化学处理、包装和照射。
CA设备减慢乙烯的生物合成是通过(i)低温；(ii)将氧气水平降低至3％以下，和(iii)将贮藏区域的二氧化碳水平提高至3％-5％的范围。有时加上昂贵的涤气管，它可减少已经呼出至大气中的乙烯。缺点是CA设备的建造昂贵，使用花费高，并且不能完全消除乙烯的产生和副作用。另外，CA贮藏技术只能控制外部的乙烯，而不能控制残留在植物组织内部的乙烯。CA贮藏也可引起不必要的副作用高CO2水平、低O2水平或低温可引起创伤。
另一种处理方法是通过化学处理限制植物组织中乙烯的生物合成。抗生素根瘤菌毒素(rhizobitoxine)的类似物Aminoethoxyinylglyeine(AVG)即是这样一种抑制剂。然而AVG因其高毒性不能用作食品中的化学添加剂。硫代硫酸银(STS)也可有效地减慢果实成熟和花渐衰，但它也有毒并不能用于食品。而且，STS只对某些花起作用，并经常会导致黑斑形成。
最近报道了产生乙烯生物合成受损之转基因植物的分子遗传学方法。Hamilton等人通过在转基团植物中表达反义基因以抑制乙烯合成，鉴定出蕃茄EFE(pTOM13)的cDNA克隆。Oeller等人证明表达乙烯、1-氨基环丙烷-1-羧酸盐合酶的生物合成途径中限速酶的反义RNA可抑制番茄植物的果实成熟。Klee等人从土壤细菌中克隆出编码ACC脱氨酶的基因并将它导入蕃茄植物。转基因植物中乙烯合成的降低不会引起任何明显的植物表型异常。然而，这些植物的果实却显示出显著的成熟延迟，并且成熟果实的坚硬时间至少比非转基因对照果实长6周。本发明概要本发明描述了转基因植物，尤其是带果实的转基因植物的开发。这些植物含有编码所需基因产物，如S-腺苷甲硫氨酸水解酶(AdoMetase)的DNA序列。AdoMetase能将S-腺苷甲硫氨酸水解成高丝氨酸和5′-甲硫腺苷。在本发明的转基因植物中，所需基因产物的表达处于衍生于E8的启动子的转录控制之下。编码所需基因产物的DNA序列不是与E8启动子正常相邻的DNA序列(同源序列)，更确切地说，此序列是与E8启动子异源的。
E8基因启动子包含调节区，它位于蕃茄E8基因编码序列的S′端。可用标准杂交或DNA扩增法鉴定与E8启动子同源的启动子。
图13显示E8启动子部分的有代表性核苷酸序列。本发明已限定了两个E8启动子区域，即包括图13中所示全部区域的SE8启动子和包括碱基1189至2214所示区域的下方E8启动子。这些启动子中的任何一个都可用于产生本发明的转基因植物。
可从包括下述的大量噬菌体中得到AdoMetase酶编码序列大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体T3、大肠杆菌噬菌体BA14、克雷伯氏杆菌(Klebsiella)噬菌体K11以及沙雷氏菌(Seratti)噬菌体IV。典型的AdoMetase酶编码序列衍生于大肠杆菌噬菌体T3，其有代表性的编码序列示于图11。
本发明的一个实施方案是转基因的蕃茄植物，它含有异源的DNA序列，其表达处于E8启动子的控制之下。本发明还包括转基因蕃茄果实细胞。本发明包括含有编码和表达AdoMetase之DNA序列的转基因番茄植物细胞和蕃茄果实细胞，其中AdoMetase的表达处于E8启动子的转录控制之下。
本发明还包括调节植物细胞中基因产物表达的方法，在此方法中所提供的载体含有第一DNA序列，该序列含有对植物细胞中遗传选择有用的基因，其中该序列侧翼接有允许序列在植物宿主细胞中得以有效表达的调节元件。载体还包含编码所需基因产物的第二DNA序列，其中所说第二DNA序列的表达处于E8启动子的转录控制之下，并且所说DNA序列没有与E8启动子正常邻接。在一个实施方案中，第二DNA序列编码S-腺苷甲硫氨酸水解酶，该酶将S-腺苷甲硫氨酸水解为高丝氨酸和5′-甲硫腺苷。
上述载体被用来转化植物宿主细胞。培养这些细胞以产生转基因植物。当载体被用来产生带果实转基因植物时，果实细胞即可表达所需的基因产物，例如AdoMetase酶。可从与上述者相同的来源中得到AdoMetase酶编码序列。
可借助包括土壤杆菌介导的转化、电穿孔、显微注射和微弹轰击等多种转化方法将载体导入宿主植物细胞中。对植物细胞遗传选择有用的典型基因是提供卡那霉素抗性的基因。
本发明包括适用于植物转化方法的上述载体。
所选择的基因，如AdoMetase基因的表达可以由包括E8启动子或其衍生物在内的组织或阶段特异性启动子来调节。
本发明还包括使用如本文所述的E8启动子变异体赋予处于它们的控制下之任何基因的组织和/或阶段特异性表达。附图的简述图1图解显示在正常和压力状态下，由甲硫氨酸合成乙烯的代谢反应。
图2图解显示用于描述AdoMetase编码基因之遗传工程构建的步骤。
图3显示蕃茄E8启动子的元件以及用于扩增和分离启动子序列的引物。
图4显示从pGA-ESKN构建pGA-SESKN所涉及的步骤，并显示出E8基因的与AdoMetase(SAMase)编码序列相邻的元件，此编码序列之后紧跟着nosT转录终止序列。
图5A图解显示pGA-ESKN载体的结构。图5B图解显示pGA-SESKN载体的结构。
图6显示放射自显影图的照片，它证明了衍生于两种不同转基因植物的果实中的AdoMetase mRNA水平。
图7定量显示图6所示的结果，这些结果表明在成熟的蕃茄中，不同E8启动子对AdoMetase mRNA水平的影响。
图8是代表在不同阶段的成熟蕃茄中AdoMetase活性相对水平的图解说明。
图9给出有关4株不同转基因植物的果实进入发亮(breaker)阶段后的十天的时期内，乙烯产生的数据(图9A、ES19-2图9B、LS4-2图9C、ES35-1；和图9D，ES22A-1)。
图10显示得自SESKN转基因植物的蕃茄收获后的货架寿命。
图11显示衍生于噬菌体T3的AdoMetase基因的SAM-K修饰的序列。
图12A概述载体pESKN构建所涉及的步骤。图12B概述对载体pGA-ESKN的pESKN修饰所涉及的步骤。
图13显示蕃茄E8基因上游-2216碱基对区域的序列。本发明的详细描述本申请描述了使用如本文所述的E8启动子变异体赋予在它们的控制下之任何基因以组织和/或阶段特异性表达。I.在植物中S-腺苷甲硫氨酸水解酶的用途已证明在植物组织中氨基酸甲硫氨酸是乙烯的前体(见Imaseki的综述)。但是甲硫氨酸并不是直接的前体，它首先必须转变成锍化合物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，接着，在转变成乙烯前还需转变成氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)。在正常和压力状态下从甲硫氨酸合成乙烯的代谢反应示于图1中并简述如下甲硫氨酸→SAM→ACC→乙烯ACC合酶催化SAM降解为ACC和5′-甲硫腺苷(MTA)。在乙烯形成中，此步酶解反应似乎是限速步骤。例如，天然植物激素吲哚乙酸(IAA或植物生长素)通过诱导ACC合成酶的合成来刺激乙烯生成。相反地，从甲硫氨酸合成SAM和从ACC中生成乙烯并不需要植物生长素诱导。
另外，创伤和果实成熟可诱导ACC合成酶的形成，因而诱导SAM转变成ACC。ACC合成酶反应的另一产物MTA必须再循环回到甲硫氨酸以提供充足的甲硫氨酸供给以不断产生乙烯。已经阐明这种从MTA到甲硫氨酸的再循环途径存在于植物组织中(Adams，et al.；Kushad，et al.，)。从MTA是ACC合成酶强有力的抑制剂这一发现的角度看，MTA的降解还具有另外的意义。因此，在正常植物组织中MTA降解和再循环的重要性是双重的1)防止MTA直接抑制乙烯的合成，和2)提供充足的甲硫氨酸以不断合成乙烯。此代谢途径的概要示于图1a中。
在植物组织中，MTA降解的第一步是由特异性的MTA核苷酶将此核苷水解为5-硫核糖(MTR)。MTR不仅为甲硫氨酸的形成提供其甲硫基部分，也为此氨基酸的合成贡献出其核糖中的四个碳。因此，通过再循环得以保存甲硫基基团。需指出的是，此途径只能为乙烯的生物合成维持甲硫氨酸供给，而不能导致甲硫氨酸合成的净增加。
本文和1990年12月12日提交的共同拥有的PCT国际申请PCT/US90/07175中报道了减少植物中乙烯生物合成的方法，该方法使用编码S-腺苷甲硫氨酸水解酶的基因。此酶由大肠杆菌噬菌体T3编码，可将腺苷甲硫氨酸(AdoMet)水解为高丝氨酸和MTA。此酶的推荐名称是AdoMet水解酶(AdoMetase)，或它的另一个名称为S-腺苷甲硫氨酸裂解酶(SAMase)(Studier，et al.，)。此反应的两种产物(即高丝氨酸和MTA)都再循环生成甲硫氨酸；MTA如前所示(图1)，高丝氨酸则通过已知存在于植物组织中的代谢途径。
AdoMetase基因已经被鉴定、分离、克隆和测序(Hughes，etal.，1987a；Hughes，et al.，1987b)。此基因含有两个指定17105和13978道尔顿的多肽框内阅读序列。两种多肽在相同的赭石型密码子处终止。这可导致使从较长的多肽羧基末端开始的14kd多肽与17kd多肽有82％的同一性。两种多肽都存在于部分纯化的细胞中，并来自表达克隆化基因的大肠杆菌(Hughes，et al.，1987b；Studier，et al.，1976)。编码AdoMetase或SAMase基因的其他噬菌体是大肠杆菌噬菌体BA14、克雷伯氏杆菌噬菌体K11和沙雷氏菌噬菌体IV(Mertens，et al.，Horsten，et al.，)。
在植物细胞中，AdoMetase表达对植物甲硫氨酸再循环途径的影响示于图1b。使用表达AdoMetase基因的转基因植物并监测乙烯产生所进行的支持本发明的试验证明，AdoMetase对该途径的作用是使产生乙烯的支路“短路”减少这种转基因植物中的乙烯产生，包括其叶组织和果实中的乙烯产生。II. AdoMetase编码基因不同的噬菌体可望含有在其DNA序列中变异的AdoMetase基因。从噬菌体编码序列中分离AdoMetase编码序列可按如前所述从噬菌体T3中分离AdoMetase的方法完成。另外，也可产生AdoMetase编码序列的简并杂交探针并根据同源序列的存在用来筛选从携带所选择之噬菌体基因组片段的质粒。可通过标准生化试验来评价AdoMetase酶解活性(例见实施例5)。
此外，可通过遗传学技术来修饰AdoMetase的氨基酸序列以产生生物活性有所改变的酶(详见下文)。生物活性的增加可允许使用较少量的酶以控制植物中乙烯的生物合成。
在将AdoMetase基因置于土壤杆菌表达载体中之前，对其进行一系列重组DNA操作。首先，将M13HB1的MaeIII-BamHI片段(Hughes，et al.，1987a)亚克隆到pUC19质粒载体中以产生pUC19-SAM(实施例1)。为了提高植物AdoMetase基因的翻译效率，对ATG起始密码子周围的核酸序列进行位点特异性诱变。合成39个碱基对的双链寡核苷酸并在基因的5′末端替换BamHI-XmnI片段(图2)。此替换的净结果是将天然T3序列中的CACCAAATGA改变成最适的真核生物翻译起始序列GCCACCATGG(Kozak，et al.，；Lutcke，et al.，)。
此变化也在SAMase起始密码子处导入了一个NcoI位点(CCATGG)，以有利于与不同的启动子融合。对AdoMetase编码序列的唯一变化是将氨基酸位置2处的氨基酸由异亮氨酸变成缬氨酸这是高度保守的氨基酸改变。AdoMetase改变形式被称作SAM-K(图11)。
构建带有SAM-K的重组牛痘载体(vvSAM-K)。在非洲绿猴细胞或T3感染的细菌细胞中表达该载体，就基因与在相同细胞中表达的天然T3基因进行比较。AdoMetase的比活性在vvSAM-K感染的细胞中比在T3感染的细菌细胞中更高，这说明SAM-K编码AdoMetase的全功能译本。
支持本发明所进行的实验已证明了AdoMetase在转基因蕃茄和烟草植物中的组成性表达。在这些植物中，正如叶圆盘检测法所测定的，这些植物合成乙烯的能力有显著的降低。III. 启动子调节的SAMase基因表达在本发明的方法中使用了可调节的启动子。可调节启动子的一个范例是蕃茄E8基因启动子。已阐明E8基因的表达可以(i)在成熟开始时，和(ii)用乙烯处理蕃茄而被诱导(Deikman，et al.，1988；Lincoln，et al.，；Giovannoni，et al.，)。已发表了E8启动子的序列(Deikman，et al.，1988；Deikman，et al.，1992)，—2216碱基对区域的DNA序列示于图13中。
使用图13所示序列制备引物，用于聚合酶链反应(PCR)以从蕃茄基因组DNA中扩增1124碱基对启动子(实施例1)。在引物的每一末端设计了唯一的限制性位点，并用来将启动子以合适方向置于pUC19中SAM-K基因5′端(图3)。启动子片段的3′末端设置有NcoI位点(CCATGG)，以使E8基因产物的ATG起始密码子在NcoI位点中用作ATG。这使得完整的E8启动子可精确地直接置于SAM-K氨基酸编码序列的前面而不带有插入序列(实施例1，图12A)。
构建两种AdoMetase表达载体(实施例1)，即pGA-ESKN载体(图12A、12B和图5A)和pGA-SESKN载体(图4和图5B)。pGA-ESKN载体含有相邻于AdoMetase编码序列的E8启动子部分(图4，下方E8启动子)。已分离出含有可与-1124 E8区域杂交的蕃茄基因组序列的λEMRL-3克隆，并用作-1124 E8(较下方的E8)启动子上游区域的来源。限制性酶切谱分析和亚克隆可以鉴定出大约为1200bp的HindIII-XbaI片段为原-1124bp E8启动子的直接上游区域(图4)。将此区域加到pGA-ESKN构建体上可产生pGA-SESKN，其含有与AdoMetase基因融合的大约为-2254bp的E8启动子(图4，SE8)。
这两种载体被转移到蕃茄植物中(实施例2)以产生表达AdoMetase的转基因植物。除了以土壤杆菌为基础的以外，许多方法都可用于引起植物宿主的转化，如电穿孔法，显微注射和微弹轰击法。这些方法是本技术领域中熟知的(Klein，et al.，；Miki，et al.，；Bellini，et al.，)。另外，这些方法提供了将所选择的DNA导入植物基因组的手段这种DNA可以包括含有与AdoMetase编码序列功能上相邻之E8基因启动子的DNA盒。
使用敏感性RNAase保护检测法(RPA)，根据其合成AdoMetasemRNA的能力检测几株转基因植物(实施例3)。图6和7显示在果实成熟的不同阶段，使用来自两株转基因植物(ESKN和SESKN)的果实进行RPA的结果。包括未成熟和成熟的叶、花和茎在内的这些植物中的其它组织不含有AdoMetase RNA。尽管在ESKN转基因植物中AdoMetase的表达可调节至成熟的绿色果实之后，但仍反复观察到(如图6和7所示)在完全成熟的果实中AdoNetase的表达已被关闭。另一方面，SESKN转基因果实在成熟的果实中仍保持AdoMetase mRNA的表达。
为了确定AdoNetase酶活性的存在是否与AdoMetase mRNA的水平相关，使用得自不同成熟阶段的ESKN转基因植物的四个果实的抽提物进行AdoMetase检测(实施例5)。图8显示得自单独的pGA-ESKN转基因植物的成熟的绿色、发亮(breaker)、橙色和成熟果实的AdoMetase活性水平。这些数据证明AdoMetase活性大致遵循成熟果实中与AdoMetase mRNA水平相同的表达模式。
以上所示的数据提示在AdoMetase表达构建体中包含天然E8启动子的上游区域可加强成熟的转基因蕃茄中AdoMetase基因的长期表达。图6显示pGA-SESKN系22A-1和pGA-ESKN系18的RPA结果。ESKN系18在所有ESKN转基因系中具有一个最高水平的AdoMetase表达。图7显示AdoMetase mRNA的定量检测结果。结果表明，-2254bp的E8启动子表达在果实发育的整个成熟期内一直维持。这种表达模式与也示于图6中的-1124bp E8启动子(ESKN)mRNA水平形成鲜明对比。
图9显示对从发亮期挑选的果实进行乙烯散发测定和每天分析的结果。如根据橙色果实发育所需时间证实的，SESKN系22A和35-1的果实产生蕃茄红素的速率降低。另外，从这些蕃茄中产生的乙烯总量减少约80％。在所分析的25个SESKN转基因植物中，AdoMetase的表达和乙烯生物合成的降低密切相关。
当贮藏于室温(22℃)下时，根据货架寿命特性评价合成较少量乙烯的SESKN蕃茄(实施例5)。将来自SESKN系22A-1和35-1每一种的三个果实与未经转化的正常蕃茄相比。根据蕃茄皮上肉眼可观察到的收缩和皱纹来确定衰老程度。没有检测硬度，但需说明在转基因系植物中硬度更大。这些衰老评价的结果示于图10中。即使在发亮期后55天，22A-1蕃茄仍可保持发硬，显得更象是遭到脱水，而不是正常蕃茄软化诱发的衰老。
这些结果证明，在转基因植物中可为AdoMetase酶提供组织特异性地调节能力。另外，用两种不同的E8启动子(较低处的E8和SE8)所得到的结果揭示，可使用这些启动子类似的组织特异性表达任何所需要的基因产物。组织或阶段特异性启动子是可调节与特定植物组织，或植物或植物组织的发育阶段直接相邻(下游)基因之转录的DNA区域。可使用这些启动子表达的其他一些有用的基因产物包括编码(i)气味或颜色修饰蛋白，及(ii)酶的基因产物，如由taumatin基因编码(其修饰蕃茄红素合成)的酶。另外，表达限制到特定组织的某些基因是有用的，如果实---例如，如果它被构成性表达任何基因，则可能对植物有害。这样的基因包括编码耗尽必需代谢物的降解酶基因。从上述结果中可以看出，E8启动子区域的衍生物可用作其表达处于它们的控制下之基因的组织和阶段特异性表达的开关。
本方法适用于所有高等植物。除E8启动子外的可调节的启动子也可用于本发明的实践中，它包括但不局限于蕃茄的E4基因启动子和蕃茄的乙烯生成酶(EFE)启动子。另外，可使用E8启动子的两个区域(下行E8和上行E8，图4)作为杂交探针，探针另一些植物种基因组有代表性的DNA文库。然后试验与E8启动子同源的序列，分析其在它们被分离出的植物品种中的组织特异性表达，可使用本文所述的方法在异源植物系统中试验这种启动子以及E8启动子自身的可调节表达。可使用如GUS(β-葡糖苷酸酶)等报道基因试验从这些启动子开始的组织特异性的可调节表达。可使用荧光、分光光度或组织化学检测法很容易地检测GUS蛋白质的表达(Jefferson，1987)。
用标准重组操作如引物特异性扩增(Mullis；Mullis，et al.，)或寡核苷酸杂交法(Ausubel，et al.，；Sambrook，et al.，)，可从不同的蕃茄栽培品种中分离出E8启动子的变异体。
另一个其启动子可用于AdoMetase表达的基因是蕃茄的多聚半乳糖醛酸酶基因启动子。
以下实施例举例说明，但无意限制本发明。
材料和方法从Peto Seed，Inc.，(Saticoy，CA)得到蕃茄种子(Lycopersicon esculentum Mill.var.cerasiforme(Dunal)Alef.cv.Large Red Cherry)并使之在标准温室条件下生长。将收获的果实储存于室温(22℃)下。
实施例1AdoMetase基因的克隆A.AdoMetase基因的分离从纯化的T3 DNA(Hughes，et al.，1987a)中鉴定AluI-HaeIII限制性片段上的AdoMetase基因。按ATCC No.11303-B3(American Type Culture Collection，12301 Parklawn Dr.，Rockyille MD 20852)得到噬菌体T3。首先将DNA片段克隆到噬菌体M13 MP8载体(Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.，Piscataway，NJ)中。将MaeIII至BamHI片段亚克隆到pUC19质粒载体(Pharmacia)中以产生pUC19-AdoMetase(pUC19-SAMase；图2)。1990年12月12日提交的共同所有的PCT国际申请，PCT/US90/07175(该文献列为本文参考文献)中描述了制得pUC19-AdoMetase载体的方法。将此载体转化到大肠杆菌中并用作进一步的构建实验和DNA序列测定的DNA来源。
B.修饰克隆的AdoMetase基因的氨基末端序列使用合成的双链寡核苷酸改变SAMase ATG起始密码子周围的核苷酸序列，对克隆的AdoMetase基因作进一步基因工程修饰，使之含有共有的真核细胞转译起始位点(Kozak；Lutcke，et al.，)。
用XmaI和BamHI消化质粒pUC19-AdoMetase并在琼脂糖凝胶电泳后经电洗脱纯化1.9kb和1.3kb片段。将具有图3中所示序列的合成的双链寡核苷酸接头连接到1.9kb片段上。并且用XmaI消化该连接的DNA以除去多余的接头。
然后在低熔点琼脂糖上电泳以重新纯化接头连接的1.9kb片段，并连接到1.3kb片段上以形成质粒pUC19-SAM-K。对改变的基因区域进行DNA序列分析。图11中给出了基因序列。该基因被称为SAM-K并用于构建下述植物表达载体。也可以通过电穿孔、显微注射或微弹轰击法使用该质粒DNA直接转化植物宿主。
C.使用蕃茄E8启动子构建载体使用两种不同形式的E8启动子构建含SAM-K的载体。使用聚合酶链反应(PCR)(Mullis；Mullis，et al.；Perkin-ElmerCetus，Norwalk CT)从蕃茄(Lycopersicon esculentum var.cerasiform)DNA中分离第一种启动子(-1124bp)。PCR反应中使用的引物是基于Deikman等人(1988)所述的序列。寡核苷酸引物的序列示于图3中。设计寡核苷酸，以分别在扩增之E8启动子片段的5′和3′端掺入限制性核酸内切酶位点(XbaI和NcoI)。这些限制性核酸内切酶切割位点有利于亚克隆到pUC19-SAM-K载体中(参见图2)NcoI位点存在于合成寡核苷酸中的ATG起始密码子区域附近。
图12A概要描述了从载体pNCN(Pharmacia Inc.，Piscataway，NJ)和pUC-SAM-K(如上文所述)开始的载体pESKN的产生。E8启动子的序列(下行E8启动子)与图13中作为碱基1189到2214示出的序列相似。
图12B概述了产生用于本发明之土壤杆菌载体的一种方法。但可以将存在于例如pESKN中的E8/AdoMetase盒掺入许多适用于植物转化的载体中。
从pGA482(An，et al.，1985)，即含有与胭脂氨酸(nopaline)合成基因启动子(An，et al.，1988)融合的新霉素磷酸转移酶II基因的pBIN19衍生物(Clontech laboratories)制备土壤杆菌双载体。图5A中显示了所得到的命名为pGA-ESKN的载体。
从含有完整E8基因的入EMBL-3克隆中分离第二种E8启动子(-2254bp)。在噬菌斑提升滤膜杂交(plaque-lift filterhybridizations)中使用PCR衍生的E8启动子片段(如上所述)作为杂交探针，从得自Clontech Laboratories(Palo Alto，CA)的蕃茄(Lycopersicon esculentum var.VFN8)基因组文库中选择E8基因克隆。根据阳性杂交信号鉴定携带E8基因的入克隆。用噬菌斑形成法纯化携带E8的噬菌体并分离入噬菌体DNA。
使用λE8基因组克隆作为HindIII至XbaI片段的来源，所说的片段是E8启动子的大约-2254至-1124bp上游区域。将该片段在HindIII和XbaI位点插入pGA-ESKN中的约-1124bp E8启动子的5′端(图4)。所得质粒称为pGA-SESKN。图13显示来自一个栽培品种(Deikman，et al.，1988，1992)的-2216bp区域的核苷酸序列。HindIII至XbaI片段(用于构建约-2254启动子)含有连接到该-2216bp序列之末端的附加5′序列。
图4显示存在于pGA-SESKN中的E8启动子的两个部分的关系。
所有构建中均利用标准的重组DNA技术(Adams，et al.；Ausubel，et al.)。将得自pUC19SAM-K的BamHI至KpnI AdoMetase片段克隆到pGEM7Xf(+)(Promega，Inc.，Madison，WI)的相同位点中以构建另一个λ载体，即pGEM7Zf(+)SAM-K。
也可使用其他植物克隆载体，如pRI121(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)去实践本发明。可以改变AdoMetase基因序列的植物启动子上游区，使其在转基因植物中获得组织特异性表达、温度依赖性表达，或光依赖性表达。除上述E8启动子外，另一个有用的植物启动子是组成型花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子(Pharmacia)。
实施例2植物转化使用直接转化方法将pGA-ESKN和pGA-SESKN AdoMetase质粒分别导入土壤杆菌中。
使用根瘤土壤杆菌菌株C58的解除防御能力的衍生物，即根瘤土壤杆菌菌株EHA101(Hood，et al.)将编码序列导入植物中。该菌株包含有T-DNA-less Ti质粒。使用基本上如Nagel等人所述电穿孔法将pGA-ESKN和pGA-SESKN AooMetase质粒转换到EHA101中。简单地说，使根瘤土壤杆菌培养物在YEP培养基(每升含10g酵母浸膏，10g蛋白胨，和5g NaCl)中生长至对数中期(OD 6000.5至1.0)。在冰上冷却后，离心沉淀50ml细胞培养物，重新悬浮在冰冷的1ml 20mM CaCl2中并分成各1ml等份。
一般地，将1μg质粒DNA加到各等分样品中并在冰上保温30分钟。然后在液氮中冷冻等分样品并于37℃熔融5分钟。加入1mlYEP培养基并于28℃保温2小时。离心沉淀细胞，重新悬浮在50μlYEP中，并铺敷在含有20μg/ml卡那霉素的YEP琼脂平板上。2天内出现卡那霉素抗性转化的菌落。
从子叶的顶端和基部切下蕃茄子叶组织分离块。在蕃茄生长平皿(Fillatti，et al.)上将子叶分离块预调整2天。用含有pGA-ESKN或pGA-SESKN AdoMetase质粒的EHA101接种预调整的分离块，并最后在10ml EHA 101/[pGA-ESKN或pGA-SESKN)的过夜培养物中放5分钟。然后将分离块与EHA101菌株在Fillatti等人所述的蕃茄生长平皿上共培养2天。
使分离块生长于含有2Z培养基、MS盐、Nitsch和Nitsch维生素、3％蔗糖、2mg/1 seatin、500mg/1羧苄青霉素、100mg/1卡那霉素和0.7％琼脂的组织培养基(Fillatti，et al.)中。分离块在组织培养物中生长8至10周。在所有培养基中羧苄青霉素处理保持2至3个月。在将分离块和植物放入土壤罐中之前，一直将它们保持在作为反选择的羧苄青霉素中，以使之摆脱有生命力的根瘤土壤杆菌细胞植物。
实施例3检测SAMase mRNA的RNAase保护试验用得自转基因植物和野生型植物的各发育阶段的蕃茄果实作为mRNA来源。从蕃茄细胞中提取mRNA并使用“QUICK PREP RNA”试剂盒(Pharmacia，Inc.)纯化之。使用Ambion，Inc.(Hialeah，FL)的“PRAII”试验盒，按照生产商提供的使用说明书进行RNAase保护试验(RPA)。该方法先前已由Lee等人描述过。
使用包含在“RIBOPROBE IT T7 RNA聚合酶系统”(来自Promega，Inc.)中的噬菌体T7 RNA聚合酶，由pGEM7Zf(+)SAM-K产生32P-UTP标记的RNA探针。在制备性聚丙烯酰胺凝胶上纯化放射性标记的探针并使用最长达一周时间。
1μg分离的mRNA与大约10,000 CPM RNA探针杂交，并按“RPAII”药盒中说明书推荐的方法作进一步处理。简单地说，将1μg纯化的mRNA与10,000 CPM RNA探针混合，总反应体积为15μl。然后加入20μl允许互补序列杂交的杂交缓冲液(Ausubel，et al.；Maniatis，et al.；Sambrook，et al.)。Ambion的“PRAII”试剂盒中配备了杂交溶液。将溶液加热至90℃保持3-4分钟使所有RNA变性，并于45℃保温过夜以使互补序列杂交。将溶液冷却到37℃并加入RNase(装在Ambion试验盒中)以降解所有未杂交的探针。
在变性聚丙烯酰胺凝胶上分辨被保护的探针、干燥、并加胶片曝光最长达16小时。从凝胶上切下各带，将其溶解在液态氟光体中，并使用液体闪烁计数装置检测样品中存在的放射活性，从而完成对RPA信号的定量分析。使用从以有意义方向克隆到pGEM52(+)中的AdoMetase片段合成的不同量未经标记的RNA，制备标准曲线。RNAase保护试验中，检测的线性范围取决于输入32P标记的RNA探针的量，但一般范围是10pg至1ng mRNA。
实施例4乙烯检测密封装有个别果实的玻璃罐并取出2ml等分样品进行气体层析分析，于0.5至1.0小时内进行对蕃茄乙烯发散的检测。使用配有火焰电离检测器和6ft Porapak N柱的Hewlett Packard 5890型(PaloAlto，CA)气相层析系统检测乙烯(Adams，et al.)。该系统与HP Vectra计算机及最新版本的“CHEMSTATION(Hewlett Packard)联合使用可以检测2ml样品中低达0.2nl乙烯的乙烯浓度(0.1ppm)。检测液面上空间中的乙烯后，将数值转化成每小时每克组织所产生的乙烯n1数。
实施例5转基因蕃茄的特性鉴定A.成熟转基因果实中启动子对SAMase mRNA水平的影响在成熟的三个阶段，即发亮(Br)、桔黄(Or)和成熟(Ri)阶段从两株转基因植物-ESKN#18和SESKN#22A上选择转基因果实。转基因植物ESKN#18含有与Sam-K AdoMetase基因相邻的下方E8启动子(图4)。转基因植物SESKN#22A含有与Sam-K AdoMetase基因相邻的完整SE8启动子(图4)。按实施例3中所述方法测定成熟转基因果实中的AdoMetase mRNA水平。
在聚丙烯酰胺凝胶上分辨RNA保护试验的产物，并对X射线胶片曝光。图6中给出RNA保护试验的有代表性的放射自显影图谱。从该图中可以看出，在处于果实成熟的发亮阶段的两株转基因植物中存在AdoMetase mRNA。但在果实成熟的桔黄和成熟阶段，相对于SESKN转基因植物，ESKN转基因植物中AdoMetase mRNA水平则有所下降。
按实施例3中所述，以液体闪烁计数法定量分析AdoMetase mRNA的水平，并确定相对于标准曲线的mRNA浓度。图7所示为此分析的结果。结果与图6中所示结果相符。在处于果实成熟的发亮阶段的两株转基因植物中均存在AdoMetase mRNA，其中ESKN#18中的浓度较低。相对于发亮阶段的水平和SESKN转基因植物果实中的水平，ESKN转基因植物在果实成熟的桔黄和成熟阶段的AdoMetase mRNA水平较低，在SESKN转基因植物中，AdoMetase mRNA水平保持相对恒定。
B.成熟转基因蕃茄中SAMase活性的相对水平为了确定AdoMetase酶活性的存在是否与AdoMetase mRNA的水平有关，使用单一pGA-ESKN转基因植物的四个不同成熟阶段果实的提取物进行基于14C-SAM的AdoMetase分析。
冷冻待检测AdoMetase酶活性的植物组织，并在液氮中研成粉末。然后将研碎的组织悬浮在1.5体积的200mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM DTT和10mM EDTA中。强烈涡旋悬浮液后于4℃以40,000xg离心20分钟。然后向50μl提取物中加入5μl浓度为20μCi/ml且比活性为58.0mCi/mmol的14C-SAM(DuPont-New EnglandNuclear，NEC-363)。反应于37℃下保温1小时后取40μl反应混合物点于纤维素薄层层析(TLC)板(J.T.Baker，Inc.，Phillipsbury，N.J.，Baker-Flex Cellulose F)上，并在丁醇∶丙酮∶乙酸∶水(70∶70∶20∶40)中层析分离3小时。使用放射自显影方法鉴定MTA和MTR斑点，切下相应斑点后使用液体闪烁计数器计数。
图8显示成熟的绿色、发亮、桔黄和红熟(ripe)果实中的AdoMetase活性水平。AdoMetase活性水平定义为SAM(S-腺苷甲硫氨酸)转化成MTA(5′-甲硫腺苷)和MTR(5′-甲硫核糖)的百分转化率。ESKN转基因植物从发亮期至红熟期果实中AdoMetase活性水平逐渐降低与图7中所示的AdoMetase mRNA水平变化相符。
在该检测法中，处于任何成熟阶段的未被转化的蕃茄果实的提取物都不能将SAM降解为MTA或MTR。
C.成熟转基因果实中的乙烯产生按实施例4中所述方法测定由携带处于SE8启动子(图4)调控下之AdoMetase基因的转基因蕃茄产生的乙烯。试验由4个转基因品系产生的温室栽培的蕃茄。分析结果示于图9A至9D中。图9中的4个曲线图各自代表得自一个pGA-SESKN转基因品系(ES19-2、LS4-2、ES35-1和ES22A-1)的果实与得自未被转化对照植物的果实的比较实验的结果。四个曲线图中的对照值(空心方框)均相同，并且代表得自两株不同植物的6个果实的平均值。各转基因品系的数值(黑心符号)是三个果实的乙烯测定值的平均数值。误差短线代表数据的一个标准偏差。
数据代表果实成熟的发亮阶段后10天的时间期间(发亮阶段后)。这些数据证明，在10天期间里转基因蕃茄果实相对于正常果实降低了乙烯产生量。
D. SESKN蕃茄的收获后货架寿命估计合成较少乙烯的SFSKN转基因植物的蕃茄果实在于22℃下储存时其货架寿命性质。将分别得自SESKN品系35-1、22A-1和LS4-2的各三个果实与得自两株未被转化的正常植物(M16和M15)的蕃茄果实相比较。每天肉眼检查果实蕃茄皮上出现的收缩和皱纹以确定衰老速度。图10中给出了这些衰老估测的结果。
从图中给出的结果可以看出，条形图显示了果实达到各阶段的时间所有果实均在发亮阶段采摘。例如，品系35-1需18天成熟(红熟期)，但其后在第27天衰老。品系22A-1经过7天转成桔黄色，13天变红，然后在第52天衰老。既使在第55天发亮阶段后，22A-1蕃茄仍保持坚硬并且似乎经受可比软化诱发的正常蕃茄衰老更大的脱水损害。
没有检测得自上述5株植物的蕃茄硬度，但注意到得自转基因品系的果实的硬度要大得多。
虽然根据特定方法和实施方案描述了本发明，但可以在不背离本发明的前提下进行多方面的修饰和改动。
权利要求
1.带果实的转基因植物，其含有编码所需基因产物的DNA序列，其中所说DNA序列的表达处于E8启动子的转录控制之下，并且其中所说的DNA序列不是与E8启动子正常邻接的DNA序列。
2.根据权利要求1的转基因植物，其中所说的转基因植物是蕃茄植物。
3.根据权利要求1的转基因植物，其中E8启动子基本上由图13中给出的序列组成。
4.根据权利要求1的转基因植物，其中E8启动子基本上由图13中所示序列的碱基1189至2214组成。
5.根据权利要求1至4中任一项的转基因植物，其中所说的DNA序列表达将S—腺苷甲硫氨酸水解成高丝氨酸和5′—甲硫腺苷的S—腺苷甲硫氨酸水解酶。
6.根据权利要求5的转基因植物，其中所说的酶衍生于选自大肠杆菌噬菌体T3、大肠杆菌噬菌体BA14、克雷伯氏杆菌噬菌体K11和沙雷氏菌噬菌体IV的噬菌体。
7.转基因植物细胞，其包含编码所需基因产物的DNA序列，其中所说DNA序列的表达处于E8启动子的转录控制之下，且所说的DNA序列不是与E8启动子正常邻接的DNA序列。
8.根据权利要求7的转基因植物细胞，其中所说的细胞是果实细胞。
9.根据权利要求8的转基因植物细胞，其中所说的果实是蕃茄。
10.根据权利要求7的转基因细胞，其中E8启动子基本上由图13中所示的序列组成。
11.根据权利要求7的转基因细胞，其中E8启动子基本上由图13中所示序列的碱基1189至2214组成。
12.根据权利要求7至11之任何一项的转基因细胞，其中所说的DNA序列编码将S—腺苷甲硫氨酸水解成高丝氨酸和5′-甲硫腺苷的S-腺苷甲硫氨酸水解酶。
13.适用于转化植物宿主细胞的载体，其包含含有适用于在植物细胞中进行遗传选择之基因的第一DNA序列，其中所说的第一DNA序列侧翼接有允许该序列在植物细胞中有效表达的调节元件，以及编码所需基因产物的第二DNA序列，其中所说第二DNA序列的表达处于E8启动子的转录控制下，并且其中所说的DNA序列不是与E8启动子正常邻接的DNA序列。
14.根据权利要求13的载体，其中E8启动子基本上由图13中所示的序列组成。
15.根据权利要求13的载体，其中E8启动子基本上由图13中所示序列的碱基1189至2214组成。
16.根据权利要求13的载体，其中所说的适用于在植物细胞中进行遗传选择的基因赋予卡那霉素抗性。
17.根据权利要求13至16中任何一项的载体，其中所说的第二DNA序列编码将S-腺苷甲硫氨酸水解成高丝氨酸和5′-甲硫腺苷的S-腺苷甲硫氨酸水解酶。
18.根据权利要求17的载体，其中所说的第二DNA序列编码图11中所示的蛋白质序列。
19.根据权利要求17的载体，其中所说的酶衍生于选自大肠杆菌噬菌体T3、大肠杆菌噬菌体BA14、克雷伯氏杆菌噬菌体K11和沙雷氏菌噬菌体IV的噬菌体。
20.调节植物果实细胞中基因产物表达的方法，该方法包括提供根据权利要求13-19中任一项的载体，用所说的载体转化植物宿主细胞，并且培养转化的宿主细胞以产生带果实的转基因植物，其中植物果实细胞能够表达所说的所需基因产物。
21.根据权利要求20的方法，其中用选自土壤杆菌介导的转化、电穿孔、显微注射和微弹轰击的直接转化方法学完成对植物宿主的转化。
22.双链体DNA片段，其包含(i)编码所需基因产物的DNA序列，和(ii)接近所说DNA序列的，促进所说的DNA转录有效的启动子，其中所说的启动子是E8启动子，并且其中所说的DNA序列不是与E8启动子正常邻接的DNA序列。
23.根据权利要求22的DNA片段，其中E8启动子基本上由图13中所示的序列组成。
24.根据权利要求22的DNA片段，其中E8启动子基本上由图13中所示序列的碱基1189至2214组成。
25.根据权利要求22至24中任一项的DNA片段，其中所说的DNA序列编码将S-腺苷甲硫氨酸水解成高丝氨酸和5′-甲硫腺苷的S-腺苷甲硫氨酸水解酶。
全文摘要
利用蕃茄E8启动子的组织和阶段特异性，促进植物借助AdoMetase减少其组织中乙烯生物合成。显示AdoMetase的表达只限于成熟过程中的蕃茄果实。描述了E8启动子几个区域的功能特性。本文所述的E8启动子及其变异体提供了可表达其他基因及AdoMetase基因有用的可调节启动子。
文档编号C12N15/55GK1121356SQ94191731
公开日1996年4月24日 申请日期1994年4月8日 优先权日1993年4月9日
发明者R·K·贝斯韦克, A·J·费罗 申请人:艾皮托普有限公司