专利名称：单胞菌酸的酶法制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及将假单胞菌酸(pseudomonic acid)及其酯转化成相应的单胞菌酸(monic acid)的方法。
已经知道假单胞菌酸有抗细菌特性，所知的假单胞菌酸包括四氢吡喃基化合物假单胞菌酸A(Nature，1971，234-416，JCS Perkin，Trans.I，1977，294)、假单胞菌酸B(JCS Perkin，Trans I，1982，2827)、假单胞菌酸C(JCS Perkin，Trans I，1982，2827)和假单胞菌酸D(JCS Perkin，Trans I，1983，2655)。
特别地是，本发明提供了将假单胞菌酸A(麦吡罗素mupirocin)(I)转化成单胞菌酸A(II)或将假单胞菌酸C(III)或其甲酯转化成单胞菌酸C(IV)的方法，所说物质通式如下 单胞菌酸在生产生物活性的化合物尤其是在生产药物中用作起始物。Beecham Group plc GB 1587058描述了单胞菌酸的化学制备方法，用化学方法制备存在一个提取产物的问题。
现在需要一种替代化学水解假单胞菌酸成单胞菌酸的方法。虽然已知道有很多水解酶，但我们意外地发现至今所试用的60种或如此通用的动物、植物和微生物性水解酶(例如Sigma化学公司，Poole，Dorset)中没有看到有适用的活性。例如，枯草杆菌蛋白酶E.C.3.4.21.14被发现不能水解假单胞菌酸A类似物中的9-羟基壬酸酯(Sime et al.1987，Tetlett 28(43)，pp 5169-72)。
Freer等(同位素标记化合物的合成和应用，Proceeding 3rdInternational Symposium，Elsevier)用哺乳动物的酶(猪肝的酯酶)将麦吡罗素[2-14C]转变成单胞菌酸[2-14C]。我们也发现这并不能提供所需要的活性水平。
现在我们已找到在本发明所说方法中适用的酶，它们能从某些放线菌(Actinomycetes)，特别是从北里孢菌属(Kitasatosporia)、克勃特尔孢囊菌属(Kibdelosporangium SP.)的菌种和一些链霉菌属(Streptomyces SP.)的菌种中分离到。
因此，本发明提供了一种生产单胞菌酸的方法，它包含将相应的假单胞菌酸或其酯与来自合适微生物的水解酶相接触。
就假单胞菌酸的酯来说，我们包括的是那些由本发明的水解酶所裂解以产生相应的单胞菌酸的酯。合适的酯包括(C1-C6)酯，特别是甲酯。
本发明也提供筛选能将假单胞菌酸转化成单胞菌酸的微生物的方法，该方法包括将所说的微生物与假单胞菌酸一起培养并与假单胞菌酸标准相比较测定其抗细菌活性的丧失。
特别适用的微生物包括变青链霉菌(S.lividans)特别是变青链霉菌菌株NCIMB 11416、灰褐链霉菌(S.giseofuscsus)菌株ATCC23916和产二素链霉菌(S.ambofaciens)菌株ATCC 23873以及干裂克勃特尔孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)ATCC 39922。菌株北里孢菌(Kitasatosporia)NCIMB 40568是一种新的微生物并因此成为本发明的另一个方面。该菌株于1993年6月14日已在苏格兰Aberdeen国家工业和海洋细菌菌株保存中心保存，其登记号为NCIMB40568。
北里孢菌菌株NCIM4B 40568为灰色孢子并具有以下特征胞壁肽聚糖左旋二氨基庚二酸/内消旋氨基庚二酸(LL-A2pm/meso-A2pm)[Buchanan R.E.和Gibbons，N.E.伯杰的细菌鉴定手册]。
按照本发明培养微生物的培养基适当地含有可以同化的碳源与氮源以及无机盐。合适的氮源包括玉米浆、酵母提取物、大豆粉、肉膏、棉籽粉、面粉、麦芽、酒糟干燥可溶物、氨基酸、蛋白水解物以及铵和硝态氮。合适的碳源包括葡萄糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、甘油和糖浆例如福氏糖浆。
合适的培养基还要包括碱金属离子(例如钠)、卤素离子(例如氯化物)和碱土金属离子(例如钙和镁)以及痕量元素例如铁和钴。
适宜地，细胞通过离心或过滤进行收集。
本发明的生物转化/方法能用整个细胞、渗透过的细胞的无细胞提取物或从微生物中分离的酶或其中的任一固定化形式去实现。
在用整个细胞实现生物转化时，微生物的形式可以是正生长着的培养物、休眠的培养物、洗过的菌丝体、固定化细胞或原生质体。
当用无细胞提取物时，生产这些无细胞提取物可适当地用切碎和/或化学或酶溶解或其他破坏细胞的方法，最好用超声波处理，任选一种处理以后除去细胞碎片，而把酶活性留在溶液中。
按照下述实施例合适地进行酶的制备。酶可通过用常规方式特别是在好气条件下，在合适的液体或半固体培养基中培养微生物进行制备。
培养条件中温度范围为5-50℃，pH范围为3-9，优选的为6-8，最优选的是7.2。
可以纯化形式、部分纯化形式，作为不纯状态得到的、破碎细胞的滤液、粗制细胞匀浆液来分离和应用所说的酶。合适的是，例如最低要求地纯化酶，以除去那些可能会催化破坏起始物或所述酶的其它酶。
本发明另一方面是提供了一种能够将假单胞菌酸水解成单胞菌酸的酶，该酶的获得是通过按照下列实施例5和/或7(和实施例6)所述处理链霉菌/北里孢菌/克勃特尔孢囊菌的菌丝体，离心和破碎细胞(超声波处理)，接着进行分部分离和色谱法。
最合适的酶是固定化酶，例如用Powell(1990)在MicrobialEnzymes and Biotechnology，p369-394(由Fogarty和Kelly编著)中所讨论的方法把酶固定在不溶的载体材料上，这就提供了增加产量和生产率的优点。
起始材料假单胞菌酸可以用英国专利1395907中所叙述的方法制备。
用整个细胞进行生物转化时，保温培养基包括休眠细胞培养基在一升pH 6.5的去离子水或pH调节过的水系统中含有KH2PO42克、K2HPO41.5克、KCl 0.2克、MgCl2·6H2O 0.2克、Na2SO4·10H2O 0.22克和葡萄糖1.0克。
当用无细胞提取物进行生物转化时，保温培养基含有适用的缓冲液。
除底物外，酶反应混合物可以含有一个或多个其它辅助因子，例如金属离子或稳定剂，如硫醇。
本发明的方法可在水性介质中合适地进行，反应混合物pH要合适地维持在4-9的范围，较好的维持pH6-8，最好的维持在大约pH7.2例如7.4pH。用缓冲液或优选加酸或碱滴定，以适当地控制pH。反应的温度通常应在5-50℃，优选在22-45℃，最优选在32-37℃的范围。
可以选择地是，反应也能在有机溶剂中或存在有机溶剂例如丙酮、甲基异丁基酮(MIBK)时进行。
反应时间取决于反应物的浓度及辅助因子、温度和pH等因素。
反应完成后，产物可用下文实施例所示的常规方法分离出来。最初的纯化可以方便地涉及色谱法步骤。
用下述实施例说明本发明。
实施例1.筛选和测定方法1.1.初筛生物转化的发生伴随有抗细菌活性的丧失，因此这点可以用作测定的基础以鉴定能将假单胞菌酸转化成单胞菌酸的微生物。取G1培养基(实施例2)3×1ml体积分布到24孔微滴定板中并接种(例如用琼脂平板上生长的放线菌菌丝体)，在28℃振动培养四天。没有接种的对照板也同时培养(只含有G1培养基)。把假单胞菌酸0.05mg/ml加到微滴定板上并将此板再培养24小时。然后取50微升培养物(两份)加到含有适宜对假单胞菌酸敏感的菌株例如金黄色葡萄球菌(例如V573)或大肠杆菌(例如ESS菌株)的生物测定平板上。经在37℃培养过夜后测定其抑制圈。
1.2.第二次筛选用增加的底物浓度进行接种以发现在较高底物浓度下能够进行所需转化的培养物。取含有100ml G1培养基(实施例2)的三角瓶(500ml)，每瓶用在含0.02％吐温80的水中的培养物/菌丝体的接种物1.5ml进行接种。三角瓶在28℃进行摇动(240rpm)培养4天，然后把瓶中液体离心并再悬浮于休眠细胞培养基(实施例2)中。为补偿可变的生长密度又把培养物悬浮在2X和6X肉汤密度之间(生长后得到的起始细胞密度相当于1X肉汤细胞密度)。把0.05MNaH2PO4pH7.0中的假单胞菌酸(10mg/ml)经过滤除菌后加到每个三角瓶中，使其终浓度为0.5mg/ml。在28℃振摇培养24小时后，把三角瓶中的液体离心，测量上清液体积并用高压液相色谱法对一个等分试样进行分析(实施例2)。
特别好的结果得自二种培养物；北里孢菌NCIMB 40568(87％转化成单胞菌酸，肉汤细胞密度为2)和干裂克勃特尔孢囊菌ATCC39922(76.9％转化率，肉汤细胞密度为2)。用变青链霉菌NCIMB11461也得到了可比的结果。用小量的阳性培养物在2和5.5mg/ml底物浓度下还进行了进一步培养。
1.3.提取和分析通过加入NaCl以饱和已冷却(0-5℃)的上清液并用5MHCl调pH到3.0进行提取。以乙酸乙酯为提取溶剂(3×1/3体积)，然后用MgSO4干燥，并在旋转蒸发以前过滤。保留小体积(0.5ml)在冷却状态过夜使产生结晶，然后使结晶干燥。用高压液相色谱法进行纯度测定(实施例2)，并用氢谱核磁共振(1HNMR)确定其结构是单胞菌酸。
为进行氢谱核磁共振(250兆赫兹)分析，样品放在氘化的二甲基亚砜中并与单胞菌酸标准相比较。实施例2.用北里孢菌的整个细胞反应用含有0.02％吐温80的1.5ml水中悬浮的北里孢菌NCIMB 40568的菌丝悬浮液接种到含100ml G1培养基的500毫升锥形三角瓶中。G1培养基在1升去离子水中含有糊精30克，福氏糖浆20克、细菌学用的蛋白胨7克、调pH到6.8。接种后的三角瓶在28℃振摇培养4天，以后把肉汤离心并把沉淀重悬于250ml三角瓶中的25ml静止细胞培养基(KH2PO40.5克，K2HPO41.5克、KCl 0.2克、MgCl2·6H2O 0.2克、Na2SO4·10H2O 0.22克和葡萄糖1.0克，去离子水1升并把pH调到6.5)。把溶在0.05M NaH2PO4(pH7.0)中的假单胞菌酸(10mg/ml)加到悬浮液中使其最终浓度为500μg/ml。
在28℃振摇24小时后，离心三角瓶中的液体并用高压液相色谱法(高压液相色谱法分析C18柱4.6×250mm，30％MeOH/0.05M NaH2PO4pH4.8，230nm，1.5ml/min，单胞菌酸Rf＝4.9分)对一个等分试样进行分析。分析结果确定87％的底物转化成单胞菌酸。用氢谱核磁共振分析仪(250兆赫兹)进行分析，确定该结构是单胞菌酸。实施例3.用北里孢菌的无细胞提取物反应把北里孢菌NCIMB 40568接种到含有如上述实施例2所述的G1培养基的三角瓶中，并把三角瓶在28℃振摇48小时。从这种子瓶中取2ml肉汤为一份接种到另6个三角瓶中，每个三角瓶含有100mlG1培养基。把三角瓶在28℃振摇72小时后，离心肉汤，弃去上清液，并把细胞再悬浮于60毫升pH7.4的0.2M Tris/HCl缓冲液中。细胞以10ml为一批用超声波处理(MSE Soniprep，20秒中5个循环间隔40秒)进行破碎，并把该破碎细胞的悬液离心，留取上清液。把250μl假单胞菌酸溶液(在pH7.4 0.3M Tris/HCl缓冲液中浓度8mg/ml)加到250μl破碎细胞的上清液中。反应物在37℃振动培养24小时。然后加入甲醇(500μl)并把混合物在冰中冷却10分钟。用离心除去所沉淀的蛋白质，并如实施例2所述测定上清液的单胞菌酸。鉴定了单胞菌酸，底物转化率为92％。实施例4.用变青链霉菌的无细胞提取物反应如实施例3所述培养变青链霉菌NCIMB 11416，用种子三角瓶对每个含100ml G1培养基的5个生产三角瓶进行接种。如实施例3所述首先把从肉汤中得到的细胞重新悬浮在38ml 0.2M Tris/HCl(pH7.4)缓冲液中进行细胞破碎。把250μl假单胞菌酸(2mg/ml，在0.2M Tris/HCl pH7.4的缓冲液中)加入250μl细胞上清液中。反应物在2 ℃振动培养24小时。如实施例2所述终止反应，并用高压液相色谱法测定单胞菌酸。59％的底物转化，鉴定为单胞菌酸产品。实施例5.用从北里孢菌NCIMB 40568菌株得到的半纯化酶制品水解如实施例3所述培养北里孢菌NCIMB 40568，如上所述，在超声波处理破碎细胞之前将从500毫升生长培养基中所得的菌丝块重新悬浮于50ml 0.2M Tris/HCl(pH 7.4)缓冲液中。回收的上清液用5mM二硫苏糖醇和1％w/v硫酸链霉素处理，然后在0℃保存30分钟。离心后移出41ml上清液，并在上清液中在0℃于5分钟内加完硫酸铵(9.16克)，边加工边轻轻搅拌。再搅拌15分钟后把样品离心，并保留上清液。在该上清液(43ml)中以同样的方式再加入硫酸铵(5.3克)。
从所得悬液中取9ml离心，保留的沉淀片状物在含有0.1M NaCl、10％w/v甘油和1mM二硫苏糖醇的2.5ml混合液中再溶解。通过凝胶过滤脱盐把所得制品在-20℃贮存。
聚1ml这种蛋白制品样本冻融并用0.2M氯化钠溶液(1.0ml)稀释，并加入0.01氢氧化钠溶液调节所得溶液的pH到7.01。把假单胞菌酸溶液(2mg溶于pH7.4去离子水0.78ml中)在30℃加到这个搅拌的溶液中，并随着0.01M氢氧化钠溶液的加入所得混合液的pH维持在7.4。
5小时以后对碱加入的监测说明了82％假单胞菌酸转化成单胞菌酸而这阶段高压液相色谱法说明转化率为88％。10小时以后加入到反应液中的碱达一个克分子当量而pH稳定说明反应已终止。在反应未进行的高压液相色谱法检测说明96％假单胞菌酸转化成单胞菌酸。实施例6用从变青链霉菌NCIMB 11416得到的固定化制品将假单胞菌酸转化成单胞菌酸把于-70℃贮存于20％蔗糖中的变青链霉菌NCIMB 11461的孢子接种到五个一升三角瓶，每个三角瓶装400ml培养基。所说培养基含有25克酵母膏、2克NaH2PO4·2H2O、1克MgSO4·7H2O、0.01克MnSO4·4H2O、0.01克FeSO4·7H2O、0.08克CaCl2·2H2O和15克甘油(pH6.8)。这些三角瓶在往复摇床上于30℃振摇培养24小时后，先把它们合并再将其接种到容量1000升标准构型附盘状涡轮式搅拌发酵罐中的800升DFO3A培养基(每升含有27.5克酵母膏，33克甘油，2.2克NaH2PO4·2H2O，5克MgSO4·7H2O，0.01克MnSO4·4H2O和1克消泡剂TDB1(Henkel)开始运行条件是搅拌250rpm，30℃，排出压力15psi，气体流量为40m3/小时，pH用氨水控制在6.8。在运行中通过增加搅拌速度到300rpm，空气流量到80m3/小时和排出压力增加到20psi，溶解的氧量水平保持在饱和值5％以上。38小时以后罐温冷却到大约5℃同时降低空气流量和搅拌速度。
肉汤通过流过除污(desuldging)离心机(Westphalia型SAMR5036流速10-20/分)体积减少到约120升。取40升这种浓缩菌丝块通过匀浆器(APV Manton-Gaulin LAB60型，1升/分10,000psi)在温度保持30℃以下进行匀浆。通过加入40升0.1MNaH2PO4(pH7.0)溶液并再通过除污离心机部分澄清匀浆物。用DDS M38超过滤仪把上清液(80升)减少到约25升体积。取90克聚乙烯亚胺放到1升水中在加入变链霉菌提取物之前先用2MH3PO4把pH调到7.8，然后用这种溶液与8升上清液配成含聚乙烯亚胺0.5％。在室温中搅拌15分钟后，混合液4600rpm离心(Mistral6000离心机，1升的离心瓶)20分钟，弃去沉淀块。用硫酸铵加到上清液中使其达到65％的饱和度。15分钟后用离心(条件与上述相同)回收沉淀并重新悬浮在3升0.1M的磷酸缓冲液(0.039MNaH2PO4，0.061M Na2HPO4，pH7.0)中。
酶溶液用0.5升0.1 M磷酸缓冲液(pH7.0)稀释，加入200克(NH4)2SO4使导电性增加到40mS。加入400克交换树脂A568树脂(Rohm和Haas，Chauny，法国)(31毫克蛋白/克树酯)，搅拌此混合物过夜，用1M NaOH控制pH在7.0，以使水解酶吸附。用过滤法回收酶-树脂，并在滤器上用200ml蒸馏水清洗，后把它加到3.5升含0.2％戊二醛的0.1M磷酸盐液(pH7.0)中。把混合物搅拌1小时后用过滤法回收酶-树脂并把它加到3.5升0.1升磷酸缓冲液(pH7.0)中。把混合物再搅拌1小时后，用过滤法回收酶-树脂并在4℃用湿法贮存。
取250克酶-树脂加到1升0.25％假单胞菌酸液中，并使该混合物在32℃搅拌同时加1M NaOH维持pH在7.4。24小时后用过滤法回收酶-树脂。采用高压液相色谱法分析滤液的单胞菌酸(高压液相色谱法分析10μC18柱(3.9×300mm，Bondapak)，30％甲醇，0.05M NaH2PO4，pH3.8，1.5ml/min，Rf＝4.5分)和假单胞菌酸(高压液相色谱法分析10μC18柱(3.9×300mm，Bondapak)，67％甲醇，0.06M醋酸铵，pH6.3，1.5ml/min，Rf＝5.5min)。分析结果显示溶液中没有假单胞菌酸，单胞菌酸的克分子产率是63％。酶-树脂可重复使用3次以上，虽然认为，假单胞菌酸消失的时间随着每次重复反应而增加，到第四次酶重复反应，假单胞菌酸消失的时间增加到96小时。单胞菌酸四次酶作用的平均产率是80％。
将首次酶作用的单胞菌酸溶液在2℃冷却并用300克氯化钠饱和。取5MHCl以滴加方式调节pH到3.0。加入乙酸乙酯(350ml)在分层以前剧烈搅拌混合物5小时。水相层用350ml乙酸乙酯提取二次以上。合并乙酸乙酯提取物，在MgSO4上干燥，用旋转蒸发仪浓缩到150ml(保持温度在30℃以下)，在冰浴中搅拌直至沉淀产物，然后在2℃存于过夜。
把产物进行过滤，用乙酸乙酯清洗，在真空中干燥并用高压液相色谱法和氢谱核磁共振进行分析。分析结果确定产物是单胞菌酸。回收到0.6克单胞菌酸(55％提取率)。实施例7变青链霉素NCIMB 11416的水解酶的纯化把8升超滤浓缩液(实施例6)用脱氧核糖核酸酶(Sigma DN-25，320mg)处理，在4℃维持1小时后离心(6,000xg，30分钟，4℃)。在搅拌时逐加固体硫酸铵(Sigma III级)到分开的上清液中使其达到30％的硫酸铵饱和度。把悬液静止15分钟然后离心(6,000xg，30min，4℃)。用真空过滤(Whatman GF/D滤纸)除去沉淀。把硫酸铵加到滤液中使其达到80％的硫酸铵饱和度。过15分钟后，把悬液离心(17,700xg，25min，5℃)，倾去上清液保留沉淀。
通过加入在50mM磷酸氢二钠pH7.0缓冲液中的1M硫酸铵液使体积达到2.5升后使沉淀大量地被溶解，然后加蒸馏水到最终体积5.0升。这样就得到相当于50mM磷酸氢二钠pH7.0缓冲液中1M硫酸铵达到的导电度。把这种制品上样至疏水性相互作用的树脂柱(丁基琼脂糖6XL，亲和色谱法Ltd)，柱大小为8.0cm×9.0cm，上柱前，柱先用上述缓冲液平衡，在室温中过柱。
柱用同样缓冲液冲洗后，用逐步减低50mM磷酸缓冲液中硫酸铵的浓度梯度直到0.1M硫酸铵浓度进行洗脱。用50ml试样加到450μl假单胞菌酸A(2mg/ml，在0.2M Tris/HCl缓冲液中，pH7.4)对柱的分级部份进行酯酶活性测定。反应物在37℃温育1小时后加入甲醇(500μl)。混合物在冰上冷却10分钟然后通过离心除去沉淀的蛋白质。如实施例2所述测定上清液中的单胞菌酸。用Bradford方法(Anal.Biochem，1974，72，248-254)确定蛋白质浓度。
把大量收集得到的活性级分1500ml用超滤器(Amico YM30)浓缩到800ml。把该浓缩液对5升50mM磷酸氢二钠组成的内含0.5M氯化钠和10％v/v甘油pH7.0的缓冲液在4℃透析(Spectro-pore4)过夜。将该透析液上样至金属离子螯合的亲和树脂柱(螯合的快流速琼脂糖，填充有铜离子，Pharmacia)柱大小为19.0cm×2.6cm，上柱前用后缓冲液平衡柱。柱上装载物用缓冲液冲洗，然后用含有硫酸铵浓度从0-1M增高的缓冲液进行线性梯度洗脱。柱的级分如前述同样条件进行酯酶活性测定。收集有活性的洗脱级分(110ml)并经超滤器(YM30)浓缩成15ml。在超滤中，另一缓冲液(25mM Bis Tris丙烷pH7.0在10％v/v甘油中)引用作交换的缓冲液。
把浓缩液上样至阴离子交换柱(Resource Q，1ml Pharmacia)，上柱前用上述缓冲液平衡。冲洗后用含氯化钠浓度从0-1M增加的相同缓冲液进行线性梯度洗脱。酶活性测定结果显示，在洗脱液中含有三个活性级分。
通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Phast凝胶，Pharmacia，10-15％梯度)，用考马斯兰染色进行活性级分分析，结果显示在中间级分有其峰浓度的均质蛋白且与最高酶活性相互关连。这些数据也为反相高压液相色谱法(洗脱液＝在0.08％三氟乙酸中甲醇浓度梯度为0-80％λ＝215nm)分析所认可。
活性级分的蛋白测定表明总蛋白量有0.5mg(标准为牛血清蛋白)。实施例8确定变青链霉菌NCIMB 11416水解酶的分子量最后离子交换纯化中活性最高级分(实施例7)在反相高压液相色谱法上(RP-HPLC)产生一个峰。取这个峰物质在FinniganLasermatt仪上用激光一解吸质谱仪(LD-MS)进行分析，总分子量(用LD-MS)为54048(±200)道尔顿。
权利要求
1.生产单胞菌酸(Monic acids)的方法，它包括使相应的假单胞菌酸(pseudomonic acid)或其酯与来自合适微生物的水解酶相接触。
2.如权利要求1所要求的方法，其中假单胞菌酸是假单胞菌酸A(I) 或假单胞菌酸C(III)或其甲酯
3.如权利要求1或2中所要求的方法，其中微生物属于链霉菌属(Streptomyces)、北里孢菌属(Kitasatosporia)或克勃特尔孢囊菌属(Kibdelosporangium)的菌种。
4.如权利要求3中所要求的方法，其中使用微生物的无细胞提取物。
5.如任一在前权利要求中所要求的方法，其中的酶是被固定化的。
6.北里孢菌NCIMB 40568菌株(Kitasatosporia SP.NCIMB40568)。
7.一种能够将假单胞菌酸水解成单胞菌酸的酶，通过用实施例5、6或7的方法处理如权利要求6中所限定的微生物或变青链霉菌(S.lividans)NCIMB 11416的菌丝体，通过离心、破碎细胞和分级分离及色谱法可以得到。
8.如权利要求7中所要求的酶，其分子量接近54,000道尔顿。
9.筛选能将假单胞菌酸转化成单胞菌酸的微生物的方法，包括把所说的微生物与假单胞菌酸一起培养和与标准假单胞菌酸相比较测定假单胞菌酸抗菌活性的丧失。
全文摘要
生产单胞菌酸(Monic acids)的方法，包含将相应的假单胞菌酸(pseudomonic acid)或其酯与来自适宜微生物特别是链霉菌属(Streptomyces SP.)菌种的水解酶相接触。
文档编号C12P17/06GK1126493SQ94192658
公开日1996年7月10日 申请日期1994年6月21日 优先权日1993年7月3日
发明者E·F·海斯, J·T·赛米, S·R·沃朗尼基, D·A·伊安多尔 申请人:史密丝克莱恩比彻姆有限公司