具有前b细胞生长支持能力的膜蛋白多肽及其基因的制作方法

专利名称：具有前b细胞生长支持能力的膜蛋白多肽及其基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因及由该基因编码的新的膜蛋白，更详细地是有关编码新的具有前B细胞生长支持能力的膜蛋白多肽的基因、含有该基因的载体及由该载体转化的转化子以及利用该基因制造新的膜蛋白多肽的方法。
本发明还涉及识别具有前B细胞生长支持能力的新的膜蛋白多肽的单克隆抗体。
本发明的基因可编码增强慢性风湿性关节炎(RA)患者的滑膜细胞表面的前B细胞生长支持能力的新的膜蛋白。将本发明的基因插入适当的载体，通过转化常用的宿主细胞，可以大量制造具有前B细胞生长支持能力的均一的新的膜蛋白多肽。因此利用本发明可以鉴别慢性风湿性关节炎，还可以制备用于临床诊断的试剂。
慢性风湿性关节炎病人的滑膜或滑膜液中的炎症细胞来自于末梢血液，对于这些细胞向滑膜的迁移还没有完全阐明，但认为它与给予细胞的化学信号和细胞膜上的蛋白(粘附分子)之间的复杂相互作用有关。
关于膜蛋白在关节炎中的作用已经进行了各种研究。例如，已知在慢性风湿性关节炎病人(RA)的滑膜血管和滑膜内层上表达一细胞间的粘附分子-1(在下文称之为LCAM-1)，此粘附分子是T细胞表面分子LFA-1的配体并与血管壁中细胞的粘附和迁移有关。〔Hale et al.；Arthritis Rheum.，3222(1989)，and Haynes et al.，Springer Sewn.Immunopathol.，11163(1989)〕。
同样地有人提出在慢性风湿性关节炎(RA)和变形性关节炎的类成纤维滑液细胞和滑膜上表达有血管细胞粘附分子-1(在下文称为VCAM-1)，此粘附分子是T淋巴细胞(尤其是记忆细胞)和单核细胞上表达的integrin VLA-4的配体，〔Morales-Ducret et al.，J.Immunol。1491424 (1992)〕，并且进一步在滑膜的内皮小静脉上表达有一被称为VAP-1的膜蛋白，该蛋白可能做为白细胞的专一性识别结构。〔Salmi et al.；Science，257，1407(1992)〕。
本发明者为调查骨髓微环境在引起B细胞机能异常的疾病中的作用，进行了广泛的研究，发现与正常人相比，来自于慢性风湿性关节炎(RA)和多发性骨髓瘤病人(MM)的骨髓基质细胞的前B细胞生长支持能力得以提高，并且前B细胞和基质细胞的直接接触对这种支持能力起一本质的作用。本发明者已建立了含有通过将病人的基质细胞，胞系来促进前B细胞生长的因子的基质细胞系(KASV5-5，MMSV3-3)，并发现这些基质细胞系的前B细胞生长支持活性可能是与不同于已知的干细胞因子(SCF)，ICAM，CD44，VCAM-1，LFA-1α，LFA-1β， NCAM和ELAM-1的其它未知粘附分子有关。〔J.Immunol.，1494088(1992)〕。
而且，有人提出来自慢性风湿性关节炎(RA)病人的滑液细胞建立的滑液细胞系Syn SV6-14，与来自慢性风湿性关节炎病人骨髓的基质细胞系RASV5-5，具有相似的前B细胞生长支持能力，本发明者已获得了与这些细胞系反应，但与来自人骨髓的不具有前B细胞生长支持能力的基质细胞系NFSV1-1不反应的新型单克隆抗体，并同时成功地克隆了编码抗原膜蛋白(BST-1)的基因。(Japanese Patent Application NO.5-141178/1993)。
本发明者在制备各种可识别在慢性风湿性关节炎(RA)患者的滑膜细胞中表达的而在正常细胞中未表达的膜蛋白的单克隆抗体的过程中，得到了可识别具有与Syn SV6-14反应，不与正常骨髓间质细胞株NFS V1-1反应的性质的、与上述的Bst-1不同的膜蛋白的新的鼠单克隆抗体RS38。然后，使用该RS38抗体筛选由慢性风湿性关节炎(RA)患者滑膜细胞株制备的cDNA文库，成功地分离得到编码和所述RS38反应的新的膜蛋白的克隆，从而完成了本发明。
即，本发明的目的是提供具有前B细胞生长支持能力的新型膜蛋白多肽、编码该多肽的基因、含有该基因的载体、由该载体转化的转化子及通过利用该基因产生新的膜蛋白的方法。
进一步，本发明的目的之一是提供识别具有前B细胞生长支持能力的新的膜蛋白的单克隆抗体。
为实现上述目的，本发明包括下面(1)-(7)。
(1)含有序列表的No.1序列所示的氨基酸序列或部分氨基酸序列的在风湿性关节炎病人的滑膜上表达的新的膜蛋白多肽。
(2)编码含序列表的No.1序列所示的氨基酸序列或部分氨基酸序列多肽的DNA。
(3)上面(2)中记载的DNA，特征为含有同序列表的No.2序列显示的碱基序列或来自所述碱基序列杂交的碱基序列，所述碱基序列至少有一取代的，移去或部分添加的氨基酸。
(4)含上面(2)或(3)中记载的DNA的重组载体。
(5)原核或真核宿主细胞，特征为由上述(4)中记载的重组载体转化得到。
(6)产生含序列表的No.1序列显示的氨基酸序列或部分氨基酸序列多肽的方法，特征是培养上述(5)记载的宿主细胞。
(7)识别含序列表的No.1序列显示的氨基酸序列或部分氨基酸序列多肽的单克隆抗体。
下面将详细描述本发明。
本发明的单克隆抗体基本上接下面方法制备。
将来自风湿性关节炎(RA)病人且具有前B细胞生长支持能力的滑液细胞作抗原，按照普通免疫方法免疫，根据普通的细胞融合方法细胞融合被免疫的细胞并按照常规克隆方法克隆融合细胞来制备本发明的抗体。
更加明确地，作为产生本发明单克隆抗体的优选方法可由如下方法加以说明，该方法包括利用来自风湿性关节炎病人(RA)滑膜并已建立培养细胞的细胞系Syn SV6-14作为上面提及的抗原，融合由该抗原免疫的哺乳动物的浆细胞(免疫细胞)和哺乳动物如鼠的骨髓瘤细胞，克隆获得的融合细胞(杂交瘤细胞)，从中选择产生识别Syn SV6-14的本发明的抗体，培养细胞以回收目的抗体。
在产生上述单克隆抗体的方法中，作为抗原免疫的哺乳动物并没有特别地限制；优选同进行细胞融合时使用的骨髓瘤细胞相容的动物，一般使用小鼠，大鼠和仓鼠。
按照一般方法进行免疫，例如，将得自上述慢性风湿性关节炎病人滑膜的细胞系Syn SV6-14的培养细胞注射引入到哺乳动物的腹膜腔。更加明确地，优选以PBS或生理盐水将其稀释或悬浮至-合适的量，并每隔4-21天分几次将其注射到动物体内，如果必需的话可以和普通的佐剂一起注射。并且在上述注射中可以使用常规载体(Schlepper)。作为免疫细胞优选使用上述细胞系最终注射后获得的脾细胞。
当哺乳动物的骨髓瘤细胞作为另一亲本细胞和上述免疫细胞融合时，优选地使用已知的各种细胞系包括P3(p3×63Ag8.653)I J.Immunol.，1231548(1978)〕，P3-U1Icurrent Topics in Micro-biology and Immunolosy，811-7(1978)〕，NS-1〔Eur.J.Immunol.，6511-519(1976)〕，Mpc-11〔cell，8405-415(1976)〕，SP2/0〔Natune，276269-270(1978)〕，FO〔J.Immunol.Meth.，351-21(1980)〕，S194〔J.Exp.Med.，148313-323(1978)〕和R210〔Nature，277131-133(1979)〕。
上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合可基本上按照已知的方法进行，如Milstein等的方法〔Methols Enzymol.，733-46(1981)〕。
更加明确地，例如上述的细胞融合可以在融合促进剂存在下在普通的营养培养基中进行。作为融合促进剂可以使用例如聚乙二醇(PEG)和仙台病毒(HVJ)等，并且为了提高融合效果根据需要可以适当加入辅助试剂如二甲基亚砜。考虑到使用的免疫细胞和和骨髓瘤细胞的比例，优选前者使用量为后者的1-10倍。作为上述细胞融合使用的培养基可以使用例如适于上述骨髓瘤细胞系增殖的RPMI-1640培养基和MEM培养基及其它通常用来培养这种细胞的培养基，并且可以同时使用补加血清如胎牛血清(FCS)。
把上面规定数量的免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养基中充分混合，加入预热至约37℃的PEG，例如平均分子量为1000-6000范围的PEG，至培养基中，通常使之浓度约为30-60(w/v)并混合进行细胞融合。随后通过重复连续添加适当培养基的操作并离心反应混合物，移去上清液即可形成目的杂交瘤。
通过在普通选择培养基如HAT培养基(含有次黄嘌呤，氨基蝶呤和腺嘧啶脱氧核苷的培养基)中培养选择所述杂交瘤。在所述HAT培养基中的培养继续足够长的时间以使非目的杂交瘤细胞(非融合细胞)死亡，通常持续从几天到几个星期。随后按照常规的无限稀释分析进行筛选和单克隆产生目的抗体的杂交瘤。
由此制备的产生本发明单克隆抗体的杂交瘤可以在普通培养基中传代培养并在液氮中贮存很长一段时间。
为了从所述杂交瘤中收集本发明的单克隆抗体，可以采用根据常规方法培养所述杂交瘤并从上清液中获得抗体的方法，或把杂交瘤注射进适当哺乳动物中使其繁殖并从腹水中获得抗体的方法。前者适于获得高纯度的抗体而后者适于抗体的大量生产。
而且根据上述方法获得的抗体通过采用常规的纯化方法如盐析技术、凝胶过滤和亲和层析可以纯化至很高的纯度。
由此制备的本发明单克隆抗体，按照常规免疫学方法如放射免疫分析(RIA)，酶免疫分析(EIA)和免疫荧光分析可以高灵敏度和高精确度地识别表达新的膜抗原蛋白的风湿性关节炎病人的滑液细胞。
通过从表达有人的前B细胞生长支持活性的慢性风湿性关节炎(RA)病人的滑液细胞膜蛋白中制备mRNA，然后按照已知方法把其转化成双链cNDA而可以获得本发明的基因。可以作为用来制备mRNA的细胞，例如用细胞系Syn SV6-14作为杂交瘤RS38的免疫源，但并不限于这个细胞系，表达具有人前B细胞生长支持能力膜蛋白的任何类型细胞均可使用。另外本发明中使用了Syn SV6-8。
为获得mRNA的总RNA的调制方法包括用硫氰酸胍处理后进行氯化铯密度梯度离心〔chirgwin et al；Biochemistry，185294(1979)〕得到总RNA的方法及在核糖核酸酶抑制剂钒复合物存在条件下进行表面活性剂处理和酚处理的方法〔Berger &.Birkenmeier，Biochemistry，185143(1979)〕、及其他已知的方法。
利用结合寡聚(dT)的载体如琼脂糖或纤维素按照亲和柱层析方法或分批方法通过从总RNA中回收Poly(A)+RNA，可以从总RNA中制备mRNA。而且根据蔗糖密度梯度离心可进一步纯化poly(A)+RNA。另外，还可以使用不必制备RNA而直接获得poly(A)+RNA的方法或利用市售的试剂盒的简便方法。
为从由上述得到的mRNA获得双链cDNA，例如可以将mRNA作为模板，利用和位于3’末端的poly-A-链互补的寡聚(dT)作为引物，然后在逆转录酶作用下可以合成和mRNA互补的DNA(cDNA)。
将mRNA通过碱处理方法分解、除去后，使得到的单链cDNA作为模板，以逆转录酶或DNA聚合酶作用(如klenow片段)，然后以S1核酸酶等处理，或直接以RnaseH及DNA聚合酶〔Maniatis et al.，Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory (1982)和Gubler & Hoffman，Gene，25263(1983)〕处理也可以获得双链cDNA。目前方便的试剂盒已经上市、通过使用它们也可以获得双链cDNA。
通过把由此获得的cNDA插入到合适的载体例如Ek一类质粒载体pBR322和psC101，和噬菌体载体如λgt10中，然后以所述载体转化大肠菌(如X1776，HB101，DH1，DH5等)等，可以得到cDNA文库(例如参见上述的“分子克隆”)。
另一方面通过利用在合适的表达载体中插入按照上面提及的方法获得的双链cNDA，可以转化其它一些原核和真核生物的宿主细胞。
通过添加合适的化学合成的DNA衔接子并在预先用限制酶裂解的载体DNA及ATP存在下以T4噬菌体DNA连接酶处理，使双链cDNA和载体连接。
本发明的表达载体含一复制原点，一选择标记、一位于待表达基因上游区域的启动子，一RNA剪接位点和一多聚腺苷酸信号。
作为哺乳动物细胞中的基因表达启动子，可以使用病毒启动子如逆转录病毒，多形瘤病毒，腺病毒和猿猴病毒(SV)40，及来自于如人多肽链延伸因子1α(HEF-1α)细胞的启动子。例如在使用SV40启动子的情况下，可以根据Mulligan et al〔Nature，227108(1979)〕的方法容易地进行。
作为复制原点可以使用来自SV40多形瘤病毒，腺病毒和牛乳头瘤病毒的复制原点，作为选择标记可使用磷酸转移酶APH(3’)II或I(neo)基因，胸苷激酶(TK)基因， 大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因及二氢叶酸还原酶(DHFk)基因。
为了以原核细胞作为宿主细胞表达目的基因，最好用来自于能适于宿主的种类的复制子即含一个复制原点和一调节序列的质粒载体来转化宿主细胞。优选具有能赋予被转化细胞类型选择性的标记基因的载体。例如在使用大肠菌作宿主细胞的情况下，可以用起源于宿主细胞的载体进行转化〔Boliver et al.，Gene，295(1975)〕。该pBR322含有一个氨苄青霉素抗性基因和一个四环素抗性基因，因此利用任何一个抗性性能都可以鉴定转化子。
作为原核宿主细胞基因表达所必需的启动子例如优选β-乳糖酶基因〔chang et al.，Nature，275615 (1978)〕，乳糖启动子〔Goeddle et al.，Nature，275615(1978)〕，色氨酸启动子〔Goeddle et al.，Nucleic Acid Res.84057(1980)〕，tac启动子等，但并不限于这些启动子。
在本发明的表达系统中使用的原核宿主细胞优选大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，嗜热芽孢杆菌等；但并不限于这些宿主细胞。
此外作为真核宿主细胞优选真核微生物如酿酒酵母及来自于哺乳动物的细胞如cos细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，C127细胞，373细胞，Hela细胞，BHK细胞，namalwa细胞和人胎儿肾细胞(293细胞)，但并非限于这些细胞。
另外，最好通过适当选择适于宿主细胞的培养条件进行本发明转化子的培养。
例如以前B细胞生长支持能力作指数或按照用抗体直接表达克隆的方法可以进行编码具有本发明的前B细胞生长支持能力的膜蛋白的cDNA的分离。
利用鼠前B细胞系DW34可进行前B细胞生长支持能力的测定〔Eur.J.Imunol.，181767(1988)〕。即，培养表达具有前B生长支持能力的膜蛋白的细胞直至其在24孔板接近汇合(优选密度约为50％)，随即加以适量的辐射，在每孔中加入1到2×103个的DW34，在含有10％FCS的RDMI-1640培养基中，在5％CO237℃条件下培养4至6天。根据锥虫蓝染色检查每孔DW34活细胞的数量可以发现生长支持能力提高的程度。
本发明中通过重复步骤可以克隆目的基因，步骤包括借助利用识别慢性风湿性关节炎病人(RA)滑液细胞上新的膜蛋白的单克隆抗体RS38的RACScan，根据流式细胞计数选择表达膜蛋白的转化子，通过分选用来制备转化子的质粒DNA再制备转化子，然后根据流式细胞计数来筛选转化子。
具体地，在孔板上培养转导的转化子(293T细胞)，并以含0.02％EDTA的PBS从板上移去细胞，以含2％FCS和0.02％NaN3的PBS组成的FACS缓冲溶液洗涤细胞后，使其与做为初级抗体的RS38反应。随后以FACS缓冲溶液洗涤去除未反应的初级抗体后，进一步使其与次级抗体FITC标记抗体(FITC标记的羊抗鼠I8抗体)反应，死细胞以碘化丙烷染色，以TACScan分析活细胞，选择用RS38强烈反应的转化子。
进一步，编码具有新的前B细胞生长支持能力的膜蛋白多肽的如序列表No.2所示的全长cDNA(PRS38-BOS)可通过重复以下这些步骤获得，这些步骤包括以碱处理含有用来制备同抗体反应的转化子的cDNA的大肠杆菌(DH5)，以挑选一组含有目的基因的质粒，把这组质粒再分成几组质粒，重新转导入293T细胞r然后利用上述的单克隆抗体RS38根据FACScan分析挑选转化子。
另外，含有将该cDNA插入PUC19载体的XbaI切断部位的PRS-PUC19的大肠菌(E.Coli)DH5α菌株已委托作为布达佩斯条约国际保藏单位的工业技术院生命工学工业技术研究所(日本国茨城县フくぱ市东1丁目番3号(邮编305)〕保藏，保藏日期为1993年10月5日，保藏菌株为Escherichia Coli.DH5α(PRS-pUC19)，保藏编号为FERMBP-4434。
一般地，根据已知的人干扰素基因等可认为真核生物基因表现出多态性〔e.g.Nishi et al.，J.Biochem.，97153(1985)〕，在某些情况下由于这种多态性，至少一个或1个以上的氨基酸被取代，在另外一些情况下虽然碱基序列有变化但氨基酸完全不改变。
进一步，某些比序列表的No.1序列显示的氨基酸序列至少多一个或少一个氨基酸的多肽，或氨基酸至少被一个或一个以上氨基酸取代的多肽可能也具有与本发明的新的膜蛋白相同的功能(前B细胞生长支持能力)。实际上例如从人白细胞介素-2(IL-2)基因获得的多肽，也保持IL-2活性，而在该基因中相应于半胱氨酸的DNA序列转变成相应于丝氨酸的序列〔Wang et al.，Science，2241431(1984)〕。
况且通过一合适的限制酶或衔接子可以连接一正知的蛋白基因和序列表的No.2序列显示的基因以产生和已知蛋白结合的多肽。对已知的蛋白基因可提及免疫球蛋白，由此利用序列表的No.2序列显示的基因它可以结合Fc部分而不是可变区位点〔(Zettlmeissl et al.，DNA AND CELL BIOLOGY，9347-353(1990)〕。
而且如果在真核细胞中表达多肽，在许多情况中发生糖基化，并且糖基化可根据改变至少一个氨基酸加以调节。在这种情况下它也可具有和本发明的新膜蛋白多肽相同的功能。因此即使按照上述各种方法对基因中编码本发明膜蛋白法多肽的位点进行人工修饰，只要从此基因获得的多肽具有和本发明的膜蛋白多肽相同的功能，本发明就可以包括此多肽。
另外，从和序列表的No.2序列所示的基因杂交的基因表达的多肽具有和本发明的膜蛋白多肽相同的功能(前B细胞生长支持能力)，此基因和多肽也包含在本发明中。在这种情况中，杂交可以采用常规杂交条件(例如，参照上面提到的“MolecularCloning”)进行。
通过培养由编码多肽基因转化的转化子可以获得所需的具有前B细胞生长支持能力的，均一的纯化可溶性膜蛋白多肽，以适当的增溶剂溶解产生的多肽，对得到的多肽进行分离和纯化。优选的增溶剂例子包括乙基苯基聚乙二醇(NP-40)，十二磺基硫酸钠(SDS)，曲拉通X-100，吐温20及类似增溶剂。
此外，也可以按照基因工程方法获得可溶性膜蛋白。即如图3所示，由于推测RS38是一个具有细胞膜穿透结构域和在N-末端的细胞内结构域的膜透过类蛋白，通过采用PCR-突变方法可以制备序列表中No.1序列49位Asn为N末端的可溶性RS38〔M.Kamman et al.，Nucl.Acids Res.，155404(1989)〕。在此情况下，作为信号序列可以使用已知的信号序列例如包括Bst-1(Japanese Patent Application No.5-141178/1993)的信号序列和G-CSF (Japanese Patent Paslication No.2-5395/1990)的信号序列。
作为分离和纯化膜蛋白多肽的方法，可以采用普通蛋白使用的方法。例如，利用上面提及的单克隆抗体，超滤、盐析、透析及类似技术通过选择和组合各类层析如亲和层析来适当地分离和纯化本发明的膜蛋白多肽。
附图的简单说明

图1显示出根据Northern杂交分析对本发明实施例中得到的基因的分析结果(根据琼脂糖凝胶电泳的照片)。
图2显示了本发明实施例得到的膜蛋白的鼠前B细胞系DW34的生长支持能力。
图3显示了借助DNA分析软件Gene Works对本发明实施例中得到的基因的疏水区域和亲水区域的分析结果。
本发明将根据参考实施例和以后的实施例详细描述，但本发明并不限于这些实施例。
参考例1来自于键康人的基质细胞系的建立以含SV40的大T抗原cDNA和鸡肌动蛋白启动子〔BBRC，186129-134(1992)〕的pAct-SVT质粒借助Gene Pulser(Biolad制造)电穿孔来自于健康供试者的基质细胞。即将PBS中的健康人的基质细胞1×107细胞/ml的0.8ml等分试样同10μg质粒混和，混合物于冰上放置10分钟，在250V和250uF电容的条件下进行电穿孔，进而于冰上放置10分钟，悬浮于含10％FCS(Bioproducts生产)的RPMI-1640培养基中(G1BCO生产)，并于一10毫米培养皿中培养。每三天更换培养基，约两个星期后用浸渗胰蛋白酶的一小片滤纸收集生长良好的贴附细胞的克隆以获得来自健康供体骨髓的基质细胞系(NFSV1-1)〔J.Immnol.1494088(1992)〕。
参考例2来自风湿性关节炎(RA)病人的滑液细胞系的建立以含有SV40大T抗原cDNA和鸡β-肌动蛋白启动子〔BBRC，1986129-134(1992)〕的pAct-SVT质粒借助Gene Pulsen (Biolad制造)对来自风湿性关节炎病人的滑液细胞电穿孔。即将来自RA患者的PBS中的滑膜细胞1×107细胞/ml的0.8ml等分试样与10μg质粒混合，混合物于冰上放置10分钟，在250V和250μF电容的条件下进行电穿孔，进而于冰上放置10分钟，悬浮于含10％FCSC Bioproducts生产)的RPMI-1640培养基中(G1BCO生产)，并于一10毫米培养皿中培养。每隔三天更换培养液，约两星期后以浸渗胰蛋白酶的小片滤纸收集生长良好的贴附细胞的克隆以获得来自风湿性关节炎病人的滑液细胞系(Cyn SV6-8和Syn SV6-14)。
本发明的实施例将在下面详细描述。
实施例1单克隆抗体的制备1)抗原和免疫上述参考例2中获得的来自风湿性关节炎病人且具有前B细胞生长支持能力的滑液细胞系Syn SV6-14用作免疫的抗原。以含10％胎牛血清(FCS，Bioproducts生产)和50μM 2-巯基乙醇的RPMI-1640培养基(G1BCO生产)作为培养基)在含5％cos，37℃的培养箱中传代培养细胞系。
以0.02％EDTA和PBS处理细胞。轻轻从培养箱的培养瓶中吸取细胞。以约1×107细胞/毫升的比例将细胞悬浮于RPMI培养基中，并以其免疫BALB/C鼠(4星期大，雌性，日本S.L.C制备)。在初次免疫中，约1×107/毫升细胞注射入鼠的腹膜腔中，两至三个星期后，作为再次免疫注射1×107/毫升细胞。进一步，在2至3个星期的间隔中作为再次免疫注射两至三次1×107/毫升细胞，最后免疫三天后，杀死鼠并摘出脾脏。
2)细胞融合将自鼠摘出的脾脏切成碎片，离心分离的脾细胞，悬浮于RPM1-1640培养基中(G1BCO生产)并充分洗涤。另一方面通过在含10％胎牛血清(FCS；F1LTRON生产)的DMEM培养基(G1BCO生产)中培养鼠杂交瘤细胞系p3×63Ag 8.653〔J.Immunol.，123；1548(1979)〕获得的1×107细胞同样在上述DMEM培养基中洗涤，并和1×108所述脾细胞一起加入一离心管中并混合，然后以聚乙二醇1500(Boehringen生产)按常规方法〔Clin.Exp.Immunol.，42458-462(1980)〕进行细胞融合。
将得到的融合细胞分别注入到含有10％FCS的DMEM培养基的96孔板上，在含5％CO2的恒温箱内37℃下培养。从第二天起在HAT选择培养基(在含有1.0×104M次黄嘌呤、4.0×10-7M氨基喋呤、1.6×10-5M胸腺嘧啶的全RPMI-1640培养基中加入10％FCS及50μM2-巯基乙醇的培养基)中缓慢置换，继续培养。培养开始后，每周2次用新的HAT培养基置换一半的上清液，继续培养以维持增殖。
由此获得的融合细胞利用有限稀释法进行克隆。
即利用上述融合细胞的培养上清液中的抗体，检测与抗原的结合性，只将与抗原具有强结合性的克隆利用有限稀释法形成克隆。
为了进行克隆，上述杂交瘤和BALB/C鼠的脾细胞制成规定的量，以每孔1至10个杂交瘤的比例接种到96孔板上、并在含5％CO2恒温箱内37℃培养。按一般的有限稀释法，以同样的方法重复克隆生长的杂交瘤的操作，直至它们成为理论上的单一克隆。用上述抗原筛选产生目的抗体的克隆。
3)筛选根据间接荧光抗体技术，通过流式细胞仪(Flow Cytometer)进行融合细胞(杂交瘤)的筛选。
使用a)Syn SV6-16(用于免疫的抗原)和b)来自健康供体作为靶细胞的骨髓基质细胞系NFSV1-1来进行产生目的抗体的克隆筛选。即，免疫来自风湿性关节炎(RA)病人的具有对BALB/C系鼠的前B细胞生长支持能力的分泌滑液细胞系(Syn SV6-14)之后，对与Syn SV6-14反应但不与来自健康供体不具备前B细胞生长支持能力的骨髓基质细胞系(NFSV1-1)反应的单克隆抗体的筛选可如下进行。使用Syn SV6-14进行第一次筛选，该细胞作为用于免疫的抗原可进行反应。首先根据与Syn SV6-14反应的培养上清液的筛选来选择与所述Syn SV616反应的融合细胞，并接着进行初筛。
即，在悬浮于反应缓冲液(含2％FCS和0.02％NaN3的PBS)细胞中加入20μl杂交瘤培养液(约5×105/20μl)，并4℃反应20分钟。
用上述缓冲液洗两次，在其中加入FITC标记的抗鼠Ig抗体，混合物孵育20分钟。反应产物洗三次后，用流式细胞仪(FACScan，由Becton Dickinson制造)来分析。
接着，将来自健康供体的骨髓基质细胞系NFSV1-1用作进行反应的细胞，并如上述用流式细胞仪进行分析。根据结果，并获得产生与Syn SV6-14反应更强的抗体的杂交瘤。
因此，产生与Syn SV6-14反应但不与来自健康供体的骨髓基质细胞系NFSV1-1反应的抗体的杂交瘤(RS38)可被分离，由杂交瘤产生的抗体为IgM，K型。
另外，产生上述单克隆抗体的杂交瘤RS38是一新的融合细胞，它是由作为亲本的BALB/C鼠脾细胞和鼠骨髓瘤P3×63Ag8.653制成的，并于1993年10月5日保存于作为微生物保存布达佩斯条约的国际保藏单位的工业技术院生命工学工业技术研究所，名称为Mouse-Mouse hybridoma RS38，保藏编号为FERM BP-4433。
4)抗体的纯化按常规方法培养上述2)中制备的融合细胞，并按常规方法纯化产生于培养上清液中的抗体。
即从孔中收集具有对上述抗原的最高抗体滴度的杂交瘤，并挑出可识别细胞生长的孔，将得到的培养细胞扩大到一组织培养瓶中，在5％CO2，37℃的条件下生长。以Pristain剂量，将得到的细胞注射到BALB/C系鼠(6周，雌性，日本S.L.C.生产)的腹腔中。10至14天后，收集腹水，用50％硫酸铵盐析，用PBS透析并用QAE粒纯化。将抗体进一步盐析并充分透析，以获得约6mg/ml的纯品。
实施例2单克隆抗体的性质1)细胞系的分布通过FACScan分析在各种细胞系(表1所示的不同细胞系)中RS38抗原的分布。即将各种细胞系的每一种悬浮于含2％FCS和0.02％NaN3的PBS的FACS缓冲液中，其中存在10μg/ml的实施例1中得到的作为第一抗体的鼠单克隆抗体RS38，冰上孵育20分钟，用FACS缓冲液洗两次，以FITC标记的羊抗鼠Ig抗体(Cappel制造)作为第二抗体，将终产物进一步在冰上孵育15分钟，其中加入碘化丙锭(propidium Iodide)，使其终浓度为1μg/ml，将混合物再在冰上孵育5分钟，终产物用FACS缓冲液洗三次后，用光散射测定法分析细胞，并用FACScan(由BectonDickinson制造)分析单个活细胞。鼠单克隆抗体SG2和RF3(特愿平5-141178/1993)用作对照。结果如表1所示。从表2可明显地发现RS38的分布与SG2和RF3是不同的。
表1 细胞系的FACS分析结果
实施例31.cNDA文库的制备1)Poly (A)+RNA的制备使用Fast TrackTMmRNA提取试剂盒Version 3.2(由Invitrogen制造)制备来自风湿性关节炎(RA)病人的分泌滑液细胞系Syn SV6-8的Poly(A)+RNA。即将20个10cm培养皿的Syn SV6-8细胞匀浆，接着按试剂盒所附的方法制备总RNA。按试剂盒所附的方法，使用试剂盒所附的寡聚d(T)纤维素进一步纯化Poly(A)+RNA。
2)cDNA文库的建立将5μg上述Poly(A)+RNA用作材料，根据Time SaverTMcDNA合成试剂盒(Pharmacia制造)所附的方法合成双链cDNA。使用DNA连接试剂盒(宝酒造社制造)，按试剂盒所附的方法，连上一BstXI衔接子(由Invitrogen制造)。使用试剂盒所附的Size Sep 400 Spin Column，根据试剂盒所附的方法，去除游离的BstXI衔接子，得到约100μl的连有衔接子的双链cDNA。
然后，将约100ul如此制备的连接衔接子的双链cDNA中的2μl用于连接反应，通过使用cDNA连接试剂盒(宝酒造社制造)，将其连接到预先用限制酶BstXI和碱性磷酸酶处理的PEF-BOS载体上，以建立cDNA文库。建立的cDNA文库转化到大肠杆菌菌株DH5(由Toyobo制造)中，文库假定为总数约2×105个单独克隆。制备50个文库，每个文库包含2000至4000个转化大肠杆菌克隆，并接着用于下面的试验。
2.根据定向表达方法的克隆1)转染至293T细胞通过在含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养上述混合的大肠杆菌，进行cDNA的扩增〔Molecular CloningA LaboratoryManual. Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)〕，并根据碱裂解法〔Molecular CloningA LaboratoryManual.Sambrook et al.Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)从大肠杆菌中提取质粒DNA。根据氯化铯/溴化乙锭密度梯度离心，通过反复超离心提高所得质粒DNA的纯度，并按磷酸钙法将纯化的质粒DNA转染至293T细胞〔通过转染SV40大T抗原cDNA到293细胞(转化的原代胚肾细胞，人ATCC CRL 1573)而制得的细胞系〕。
即，将2μg纯化的质粒DNA溶于100μl含1mM Tris-HCl和0.1mM EDTA的缓冲液中，加入14μl2M CaCl2后，所得混合物与由50mMHEPES(PH7.1)、280mM NaCl和1.5mM磷酸钠的缓冲液缓慢混合，将所得混合物室温孵育30分钟，并加到在24孔板中的293T细胞中。用含10％小牛血清(FCS，Bioproducts制造)的DMEM培养基(GIBCO制造)，在37℃和5％CO2的条件下，培养该293T细胞2天。
2)根据FACScan分析将转化的293T细胞从24孔板中转入含0.02％EDTA的PBS中，用含2％FCS和0.02％NaN3的PBS的FACS缓冲液洗涤，接着悬浮于20μl含10μg/ml的作为第一抗体的上述单克隆抗体RS38的FACS缓冲液中，冰上孵育20分钟。用FACS缓冲液洗两次后，FITC标记的羊抗鼠Ig抗体(由Cappel制造)用作第二抗体又在冰上孵育15分钟。加入碘化丙锭，使其终浓度为1μg/ml，混合物进一步在冰上孵育5分钟，用FACS缓冲液洗三次，用光散射测定法分析细胞，用FACScan(由Becton Dickinson制备)分析单个活细胞。
3)cDNA文库的克隆利用碱裂解法从2000到4000个克隆作为一个库的大肠杆菌中提取的质粒DNA，根据上述方法转染到293T细胞中，并按上文FACS分析筛选转染的细胞。在第25库的293T细胞中发现一由鼠单克隆抗体RS38强染色峰。该质粒重新转化到大肠杆菌DH5)由(GIBCO BRL制造)中，并接种在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平皿上。
以每个平皿100个克隆的比例，将2000个形成的克隆依次接种到底部划分成网状的琼脂平皿上，使得每个克隆接种的位置可以识别，并且每个平皿制备两套。以同样的方法制备20个库，每个库含100个克隆，在含50μg/ml氨苄培养基上培养大肠杆菌。按碱裂解法提取质粒DNA后，用磷酸钙法将其转染至293T细胞中，用上述同样的方法对转染细胞进行FACScan分析。根据FACScan分析结果，从一鉴定为阳性的库中，将100个大肠杆菌克隆依次分离，并按碱裂解法提取质粒DNA。根据磷酸钙法用每一质粒DNA转染293T细胞。用上述同样方法进行FACScan分析，以得到单一阳性克隆，其被称为pRS38-BOS。
使用Auto Real测序试剂盒(由Pharmacia制造)和Auto Cycle测序试剂盒，根据试剂盒所附方法，将克隆进行测序反应，并利用A.L.F.TMDNA测序仪(Pharmacia制造)进行其DNA序列的测定。根据结果发现，这是全长为966bp(序列表中序列No.2)的基因，根据最长的开放读码框架，推测该基困编码180个氨基酸残基序列。应用基因分析软件Genetex，根据数据库SWISSPLOT和NBRL，进行同源性比较，结果发现其为一新基因。
4)根据Northern Blotting分析对表达的研究使用Fast TrackTMmRNA分离试剂盒变体3.2(由Invitrogen制造)制备来自RA病人的分泌滑液细胞系Syn SV6-14的、来自RA病人的骨髓基质细胞系RASV5-5的和来自健康供体的骨髓基质细胞系NFSV1-1的Poly(A)+RNA，以进行Northen印迹分析(Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Sambrooket al.，Cold Spring Habor Laboratory Pree，1989)。即收集并匀浆培养于10个10cm培养皿的细胞系，接着按试剂盒所附的方法制备总RNA，进一步按试剂盒所附的方法，使用试剂盒所附的寡聚d(T)纤维素纯化Poly(A)+RNA。
使用多引物DNA标记系统(由Amersham制造)标记探针。即通过用限制酶Hind III使被认为是编码被插入在PEF-BOS的Bst XI位点上的RS38的插入物消化，调制315bp的片段，接着按试剂盒所附方法制法备标记探针。由Syn SV6-14，RASV5-5和NFSV1-1制得的Poly(A)+RNA进行琼脂糖凝胶电泳，每个泳道3μg，Gene Screen PlusTM(Du Pont制造)用作杂交转移膜，按毛细法进行印迹。使用含0.5M NaPO4，1mM EDTA，7％SDS和1％BSA，pH7.0的Gilbert & Church缓冲液，65℃杂交过夜。完成杂交后，室温下用2×SSC将膜洗四次，55℃下再用0.1×SSC和0.1％SDS洗两次，接着与一张X光片重合，进行放射自显影过夜。结果发现，如图1所示在Syn SV6-14中检测到约1.0kb的明显条带。
3.用BALB 3T3细胞表达将新分子转染到BALB3T3细胞中，并检测在哺乳动物细胞中的表达。
即将20μg的PRS38-BOS和含新霉素抗性基因的PSVzneo〔P.J.Souethem和P.Berg.J.Mol.Appl.Genet.，1327(1982)〕加入到0.8ml的1×107细胞/ml的水溶液中，冰上孵育10分钟，然后用Gene Pulser(BioLad制造)在250V和250μF静电压的条件下进行转染，以完成共转导。
又在冰上孵育10分钟后，将细胞悬浮于含2mg/mlG418和10％FCS(Bioproducts制造)的DMEM培养基(GIBCO制造)中，在24孔板上培养。每三天换培养基，约两周后，从孔中得到与上述鼠单克隆抗体RS38反应的转化细胞系BALB 3T3 38-1，38-3和38-9，这些细胞已形成具有新霉素抗性的生长良好的贴壁细胞的单一菌落。另外，作为对照细胞得到与RS38不反应但具有新霉毒抗性的转化细胞系BALB3T3 38-4。
4.新分子的生物学性质根据以下的方法，以成熟细胞的数目作指标，用依赖基质细胞生长的鼠前B细胞系DW34来分析新分子的生物学性质。
首先，转导细胞系BALB3T338-1，38-3及38-9和对照细胞系BALB3T3及BALB3T338-4，在24孔板上培养直到基本长满，以30Gy的放射线照射，每孔中加入2×103DW34，终产物在含有10％FCS(Bioproducts生产)的RPMI-1640(GIBCO制造)培养基中培养，其条件为37℃和5％CO2，培养4天。每孔中DW34可见细胞的数目用锥虫蓝染色计数，用以分析生长支持能力。结果发现，如图2所示，在转导细胞系BALB3T338-1，38-3及38-9中与对照细胞系BALB3T3及BLB3T338-4相比，DW34的生长得到了增强。
5.新分子的物化性质1)N-末端的分析以上所得的基因的疏水区及亲水区的分析用DNA分析软件Gene Works来进行。分析的结果如图3所示。结果发现，序列表中No.1序列所示的第21位的Lys至第48位Ala的28个氨基酸残基区具有高度疏水特性，因此，推测它属于能够通过细胞膜的蛋白类型，具有通过细胞膜的结构域及位于成熟蛋白N末端侧的细胞内结构域。
工业应用如以上所详细描述，本发明涉及一编码新的具有前B细胞生长支持能力的膜蛋白多肽的基因、含有该基因的载体及由该载体转化的转化子及通过利用该基因产生新的具有前B细胞生长支持能力的膜蛋白的方法。因此，本发明的基因可以编码在慢性风湿性关节炎(RA)患者的滑膜细胞上的膜蛋白。
将本发明的基因插入适当的载体中后，通过将常用的宿主细胞进行转化，可以大量制备均一的新的膜蛋白多肽，另外可以使用得自慢性风湿性关节炎(RA)患者的滑膜细胞作为抗原，可以制得识别该膜蛋白多肽的单克隆抗体，因此利用本发明可以鉴定慢性风湿性关节炎(RA)及制备临床上的诊断用试剂。
序列表序列号 No.1序列长度 180序列类型氨基酸拓扑结构直链状序列种类肽序列Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly5 10 15Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu20 25 30Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala35 40 45Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg50 55 60Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly65 70 75 80Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met85 90 95Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys100 105 110Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gln115 120 125Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu130 135 140Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser145 150 155 160Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser165 170 175Ala Leu Leu Gln序列号No.2序列长度996序列类型核酸链数双链拓扑结构直链状序列种类cDNA到mRNA确定特征的方法E序列GTGGAATTC ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC AGA GTG CCC ATG GAA51GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG ATA GGA ATT CTG GTG 99CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG ATT ATC TTC ACC ATC 147AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT CGG GCA GTG ATG GAG 195TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG CTG ACC GAG GCC CAG 243AAG GGG TTT CAG GAT GTG GAG GCC CAG GCC GCC ACC TGG AAC CAC ACT 291GTG ATG GCC CTA ATG GCT TCC CTG GAT GCA GAG AAG GCC CAA GGA CAA 339AAG AAA GTG GAG GAG CTT GAG GGA GAG ATC ACT ACA TTA AAC CAT AAG 387CTT CAG GAC GCG TCT GCA GAG GTG GAG CGA CTG AGA AGA GAA AAC CAG 435GTC TTA AGC GTG AGA ATC GCG GAC AAG AAG TAC TAC CCC AGC TCC CAG 483GAC TCC AGC TCC GCT GCG GCG CCC CAG CTG CTG ATT GTG CTG CTG GGC 531CTC AGC GCT CTG CTG CAG TGAGATCCCA GGAAGCTGGC ACATCTTGGA AGGTCCGTCC 589TGCTCGGCTT TTCGCTTGAA CATTCCCTTG ATCTCATCAG TTCTGAGCGG GTCATGGGGC 649AACACGGTTA GCGGGGAGAG CACGGGGTAG CCGGAGAAGG GCCTCTGGAG CAGGTCTGGA 709GGGGCCATGG GGCAGTCCTG GGTGTGGGGA CACAGTCGGG TTGACCCAGG GCTGTCTCCC 769TCCAGAGCCT CCCTCCGGAC AATGAGTCCC CCCTCTTGTC TCCCACCCTG AGATTGGGCA 829TGGGGTGCGG TGTGGGGGGC ATGTGCTGCC TGTTGTTATG GGTTTTTTTT GCGGGGGGGG 889TTGCTTTTTT CTGGGGTCTT TGAGCTCCAA AAAATAAACA CTTCCTTTGA GGGAGAGCAA 949AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGAATTC CACCACA 99权利要求
1.多肽，具有序列表的序列号No.1中所示的氨基酸序列或其中的一部分。
2.编码多肽的DNA，该多肽具有序列表的序列号No.1中所示的氨基酸序列或其中的一部分。
3.权利要求2中记载的DNA，具有与序列表的序列号No.2中所示的碱基序列、或与将该碱基序列的一部分取代、缺失或插入而形成的碱基序列杂交的碱基序列。
4.含有权利要求2或3中任一项记载的DNA的重组载体。
5.被权利要求4中记载的重组载体转化的原核或真核宿主细胞。
6.具有序列号No.1中所示的氨基酸序列或其中一部分的多肽的制造方法，其特征在于培养权利要求5中记载的宿主细胞。
7.单克隆抗体，可识别具有序列表的序列号No.1中所示的氨基酸序列或其中的一部分的多肽。
全文摘要
编码具有前B细胞生长支持能力的新的膜蛋白多肽的基因和由180个氨基酸残基组成的具有前B细胞生长支持能力的新的膜蛋白多肽。通过用含该基因的载体转化宿主细胞制备转化子并培养该转化子生产该新的膜蛋白多肽的方法、及识别该新的膜蛋白多肽的单克隆抗体。上述基因编码具有前B细胞生长支持能力的膜蛋白。均一和纯化的新的膜蛋白多肽可大量生产，而且识别该多肽的单克隆抗体也能生产，因此使风湿性关节炎的鉴定及其临床诊断试剂的制备成为可能。
文档编号C12P21/08GK1135759SQ94194257
公开日1996年11月13日 申请日期1994年10月14日 优先权日1993年10月15日
发明者平野俊夫, 改正恒康 申请人:平野俊夫