犬瘟热狂犬病细小病毒三联活疫苗、毒种及制造方法

专利名称：犬瘟热狂犬病细小病毒三联活疫苗、毒种及制造方法
技术领域：
本发明涉及犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联活疫苗、毒种及制造方法，属于兽医药品技术领域。
关于犬的疫苗国内外近20年来研究较多，但二联及多联苗的研究不多，1983年美国CABABSTRACTS及AGRICOLA收集的文献有56篇，其中包括犬用细小病毒、狂犬病毒、犬瘟热病毒病三联疫苗的文献共有5篇，这些报告中所用细小病毒疫苗多数为猫细小病毒弱毒、灭活的猫细小病毒或灭活的犬细小病毒，对犬细小病毒强毒攻击并不能完全保护；联苗中的狂犬病毒疫苗多为灭活的或弱毒株(ERA SAD FLURY株)均为对幼犬及12-20克小白鼠脑内存在致病性，因此其应用范围及安全性受到限制；美国多联疫苗中，犬瘟热病毒利用的毒株为A-CDV对雪貉有致病性，因此其安全性存在一定间题。国内研制的五联疫苗、细小病毒株用貉细小病毒株、狂犬病毒用ERA株，也存在以上同样的问题。
从1970年到现在，美国及欧洲日本有关的专利共有四个，US P5000951为一种犬瘟热灭活疫苗专利。E P0023731A2为单一的细胞系制备多价疫苗的方法专利，为一种方法发明。E P0169958A2为犬细小病毒疫苗的专利。E P0044920A2为用猪睾丸细胞制备的狂犬病灭活疫苗专利，故无狂犬病、犬瘟热、犬细小病毒三联活疫苗的专利报道。
本发明的目的是提供一种犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联活疫苗、毒种以及与此相配套的制造方法本发明的一种犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联弱毒活疫苗毒种，是指犬瘟热弱毒毒种属副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbilliviridae)犬瘟热病毒(Caninedistemper virus)、编号为CDV-FAC株；狂犬病弱毒毒种属弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssa virus，or Rahies virus group)狂犬病毒(Rabies virus)、编号为CTNB12；犬细小病毒弱毒毒种属细小病毒科，又名微小病毒科(Pavoviridae)，细小病毒属，又名微小病毒属(Parvovirus)，犬细小病毒(CanineParvovirus)、编号为A2-CPV；这三种毒种均于1995年3月6日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO 0222。
本发明的一种犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联弱毒活疫苗，是将犬瘟热病毒，狂犬病病毒，犬细小病毒三种弱毒疫苗株分别制备的病毒液按比例混合而制备三联活疫苗。这种活疫苗能预防犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三种传染病；该三联弱毒活疫苗含有犬瘟热弱毒大于103.5TCID50/剂量，狂犬病弱毒大于105.0PFU/剂量、犬细小病毒弱毒大于103.5TCID50/剂量。
本发明的一种犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联弱毒活疫苗的制造方法，包括三种毒种标准、毒种传代及保存、疫苗制造配比及冻于检验。将分别生产犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联弱毒活疫苗，然后进行病毒滴定，依所含免疫剂量，按犬瘟热弱毒大于103.5TCID50，狂犬病弱毒大于105.0PFU、犬细小病毒弱毒大于103.5TCID50混合，过滤，冻干制成三联苗。
狂犬病弱毒的培养为将经无菌，支原体检验阴性的正常成片的BHK21细胞消化，加原培养液的3—5倍的培养液量，调pH至7.6—7.8，并加培养液2％的病毒，混匀分装于细胞瓶内或发酵罐内微载体培养，33℃-37℃培养3-10天收上清，再换维持液3天后再收毒一次。收毒时作无菌检验和用蚀斑法进行病毒滴定，收获液存于-20℃，保存时间不超过3个月。
狂犬病弱毒毒种的传代及保存为毒种传代用BHK21细胞，BHK21细胞为经支原体、外源因子检验合格的150代以内细胞，长成单层后，换维持液，维持液加2％的病毒原液，放33℃-37℃培养3-10天收毒，将收获的病毒液加等量的保护剂(脱胎牛奶、小牛血清、6％明胶、6％麦芽糖均可)，冻干，并进行检验，达到毒种标准即可存于-30℃，每3年传代一次。
犬细小病毒弱毒的培养为选健康新生仔猫，无菌取肾，制成单层细胞于培养瓶中或发酵罐中，pH值为7.4—7.6，培养2-3天，接种犬细小病毒弱毒，A2-CPV繁殖条件为pH7.2-7.6，温度35-38℃条件下，培养3-6天，待40％以上细胞发生病变时冻融收毒或收上清；最佳条件为pH7.4，温度37℃，培养4-5天，待75％以上细胞发生病变时冻融3次收毒；保存于-20℃以下，保存时间不能超过3个月，如超过则冻干前应重新滴定病毒，液氮保存可存10年，每10年传代一次。
犬细小病毒弱毒毒种的传代及保存为毒种传代用A72细胞。常规将A72细胞培养成单层，接种维持液量2％的犬细小病毒36℃吸附1小时，加维持液37℃培养4—5天，待70％以上细胞发生病变时冻融收毒，经检无菌，加等量5％蔗糖脱脂奶冻干，并检验，达到毒种标准即存于-30℃，每3年传代一次。
犬瘟热弱毒的培养、传代及保存为选6-15日龄发育良好SPF鸡胚，制备鸡成纤维细胞，于细胞培养瓶或发酵罐中，36-39℃培养2-10天，吸附接种病毒，30-35℃培养2-10天，待40％以上细胞发生病变时，将细胞移至2-8℃过夜，收上清，与等量保护剂混合冻干，并检验达到毒种标准放-30℃保存，每三年传代一次；最佳条件为33℃，培养2-3天，待70％以上细胞发生病变时，将细胞移至3-5℃过夜，反复摇动后收上清，液氮保存可存10年，每10年传代一次。
制造冻干疫苗的保护剂为5％蔗糖脱脂乳、经110—116℃灭菌30—40分钟，经检验无菌后，并按每毫升加入青霉素100—500单位、链霉素100—500微克或庆大霉素100—500单位，用于配苗，最后将疫苗分装于有三叉胶塞的青瓶中，然后进行真空冻干。
本发明的优点和积极效果如下1、弱毒株的优点CDV-FAC株对雪貂小白鼠无毒性，可在鸡胚，鸡胚成纤维细胞繁殖，滴度高达107.3TCID50/ml，可在犬肾细胞，FL细胞Vero细胞上繁殖，对犬具有良好的免疫原性，对犬80％免疫保护剂量为101.4TCID50，100％免疫保护剂量为102.1TCID50。
CTNB12株对小白鼠(体重10-20g)脑内及幼犬不致的热稳定株，在BHK21细胞上滴度可达107.25PFU/ml，对犬、豚鼠、兔均无致病性，免疫原性与Flury株相近，对犬的最小免疫剂量为104.5PFU。
A2--CPV株适应新生猫原代肾细胞，滴度高达105.5TCID50/ml，对小白鼠脑内，腹腔注射均无致病性，对猫犬均无致病性，无反祖现象，对犬的最小免疫剂量为101.5TCID50。
2、疫苗的效力及免疫持久性好为了本证实本发明的效力及免疫持久性，对中试生产的五批疫苗随机取样(同安全试验)在上海、北京、广东、内蒙、河南等地作中试生产疫苗的区域性试验，接种犬39540只，试验所在地参加合作单位将试验数据收集同时对每批疫苗免疫的犬随机抽取20—35只在免前、免后一个月、12个月分别采血测RV及CEV的中和抗体、CPV的HI抗体。重点选择一个试验区进行观察，对免疫前后及对照区的流行病学情况进行比较。
以上地区收集的试验数据表明，免疫犬在一年内无狂犬病、犬瘟热及细小病毒性疾病发生，对其血清进行抗体检测。中试生产的5批疫苗经免后抗体监测免前抗体水平较低，或无抗体，免后1个月产生较高抗体，证明非自然感染所至，为疫苗免疫刺激机体产生。免后12个月血中抗狂犬病、犬瘟热病毒中和抗体及犬细小病毒血清抑制抗体水平均较高于保护抗体水平，故认为免后12个月犬应具有保护作用，疫苗的免疫持久性较好。
在对比接种疫苗前，对犬检测抗体每组平均为RV＜2、CDV＜1、CPV＜4。①免疫组接种疫苗犬，因卖出等原因减少348只，12个月追踪调查组表明均未出现犬瘟热、狂犬病、细小病毒性肠炎临床发病、防疫效果达到100％，试验证实疫苗效果良好安全可靠。②对照组因卖出等原因减少19只、兽医业务人员诊断为狂犬病临床发病扑杀1只(发病率0.94％)，犬瘟热17只(发病死亡率16％)。犬细小病毒引起传染性肠炎死亡9只(发病死亡率8.4％)。
3、安全可靠性好在上海、广东、广西、内蒙、河南、北京等地对中试疫苗进行了区域性试验，共接种犬39540只，收集到的有关疫苗安全性的数据表明犬注射三联疫苗后局部发生红肿的犬占0.02％，发生全身过敏反应的占0.0025％，试验中在北京发生一例在第二次注射三联疫苗时发生全身过敏反应，经抢救已康复，经调查发现该犬已经在6个月内免疫过两次国产的单价疫苗。故分析原因可能与免疫次数过多、且单价疫苗中含牛血清及细胞成份过多有关。总之经安全试验观察证明该三联疫苗应用39540剂量无一例因注射疫苗而造成发病死亡。本发明的疫苗安全可靠性好。


图1为本发明的工艺流程图下面叙述
具体实施例方式一、毒种实施例本发明的犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联弱毒活疫苗毒种的分类，编号和保藏号为犬瘟热弱毒毒种属副粘病毒科麻疹病毒属、编号为CDV-FAC株，狂犬病弱毒毒种属弹状病毒科狂犬病病毒属、编号为CTNB12，犬细小病毒弱毒毒种属细小病毒科细小病毒属、编号为A2-CPV，这三种毒种均于1995年3月6日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，三种毒种的保藏号为CGMCC NO 0222。
二、产品实施例本发明的犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联弱毒活疫苗产品，该三联弱毒活疫苗产品含有犬瘟热弱毒大于103.5TCID50/剂量，狂犬病弱毒大于105.0PFU/剂量、犬细小病毒弱毒大于103.5TCID50/剂量。
三、制造方法实施例本发明的一种犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联弱毒活疫苗的制造方法，包括三种毒种标准、毒种传代及保存、疫苗制造配比及冻干检验。本发明先分别生产犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三种弱毒活疫苗，然后进行病毒滴定，依所含免疫剂量，按犬瘟热弱毒大于103.5TCID50，狂犬病弱毒大于105.0PFU、犬细小病毒弱毒大于103.5TCID50混合，过滤，冻干制成三联苗。
(一)、毒种制造犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联活疫苗的毒种于1995年3月6日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，由该中心负责本发明毒种的保存和供给。
1、制造狂犬病弱毒疫苗毒种必须符合下列标准(1)、毒种必须纯净，冻干毒种开封后每次传代后均须做细菌、霉菌、支原体及外源病原检验(方法见兽医生物制品制造及检验规程85年1月版本)合格者方可用于疫苗生产。
(2)、效力标准按《兽医生物制品制造及检验规程》85年1月版本方法进行效力试验对小白鼠保护指数应不低于10000LD50。
(3)、毒力标准对1—3日龄乳鼠脑内感染LD50不少于105.0/0.03ml。对12—14克小白鼠脑内感染LD50为0。
(4)、安全标准用10个疫苗剂量的病毒浸润5只易感犬的坐骨神经，90天内不应发现狂犬病症状或死亡。
(5)、免疫原性标准对易感犬的免疫保护一年的最小免疫剂量不高于为104.5PFU。
2、制造犬细小病毒弱毒疫苗毒种必须符合下列标准(1)、纯净检验，冻干毒种开封后每次传代后均须做细菌、霉苗、支原体及外源病原检验，合格者方可用于疫苗生产。
(2)、毒种对3—12月龄犬口服及滴鼻接种105.5TCID50，经幼犬体内传代5代毒力不变，即对犬不致病。
(3)、毒种在A72细胞的滴度不低于105.0TCID50/ml。在新生猫肾原代细胞上传代滴度不低于105.0TCID50/ml。
(4)、毒种对幼犬免疫保护一年的最小免疫剂量不高于103.5TCID50。
(5)、毒种以最小免疫剂量免疫易感犬20只，免后21天攻毒，攻毒后抗感染保护率不低于95％。
3、制造犬瘟热病毒弱毒疫苗毒种必须符合下列标准(1)、纯净检验冻干毒种开封后每次传代后均须做细菌、霉菌、支原体及外源病原检验，合格者方可用于疫苗生产。
(2)、毒力标准1个犬使用剂量接种2只易感雪貂，接种后21天无不良反应。对犬及小白鼠均无致病性。
(3)、毒种对鸡胚成纤维细胞的滴度不低于105.0TCID50/0.05ml。
(4)、毒种对犬最小免疫剂量不高于102.1TCID50。
(5)、毒种以最小免疫剂量免疫易感犬，免后21天用500ID50CDV强毒攻毒，攻毒保护率不低于95％。
4、毒种的传代及保存
(1)、狂犬病弱毒毒种的传代及保存毒种传代用BHK21细胞，BHK21细胞为经支原体、外源因子检定合格的150代以内细胞，长成单层后，换维持液，维持液加2％的病毒原液，放33℃培养6天收毒。将收获的病毒液加等量的小牛血清，冻干，并进行检验，达到毒种标准即可存于-30℃，每3年传代一次。
(2)、犬细小病毒弱毒毒种的传代及保存毒种传代用A72细胞。常规将A72细胞培养成单层，接种维持液量2％的犬细小病毒36℃吸附1小时，加维持液37℃培养4—5天，待70％以上细胞发生病变时冻融收毒，经检无菌，加等量5％蔗糖脱脂奶冻干，并检验，达到毒种标准即存于-30℃，每3年传代一次。
(3)、犬瘟热弱毒的传代及保存选用9日龄发育良好SPF鸡胚，无菌取胎儿，去头及内脏，剪碎，用0.25％胰酶溶液37℃消化30分钟，然后吸出酶液用Hank′s液洗3次，加适量营养液吹打后，静置10分钟，吸出上部无可见组织块液体于无菌瓶内再次吹打，静置10分钟，吸出上部液与第一次吸出的混合，制成细胞悬液，营养液为含5—10％牛血清的199培养基。稀释成每毫升含细胞数80—100万，分装于培养瓶中，于37℃培养2—3天长成良好单层细胞，弃培养液，按生长液的2—2.5％加入毒种，吸附1小时，中间摇1次，换入维持液35℃培养4—5天，等70％以上细胞发生病变时，将细胞移至4℃过夜，收上清。经无菌检验合格，即与等量的小牛血清混合，分装冻干，并检验，达到毒种标准-30℃保存，每3年传代一次。
(二)、疫苗的制造1、狂犬病弱毒的培养将经无菌，支原体检验阴性的正常成片的BHK21细胞用0.25％的胰酶消化，加原培养液的3—5倍的培养液量(50％的MEM培养液，50％的0.5％水解乳蛋白Earle氏缓冲液，10％小牛血清、青、链霉毒各100单位/ml用7.5％碳酸氢钠调pH至7.6—7.8)，并加培养液2％的病毒，混匀分装于细胞瓶内，37℃培养6天收上清，再换维持液3天后再收毒一次。收毒时每三瓶混合分别作无菌试验和用饮斑法(见附录)进行病毒滴定。收获液存于-20，保存时间不超过3个月。
2、犬细小病毒弱毒的培养选健康新生仔猫，乙醚麻醉，水淹死，适当消毒液洗3次，最后一次泡20分钟，无菌取肾，去包膜剪碎，用Eagle氏液洗3次，加0.25％胰酶37℃消化40分钟，去掉胰酶液，用Eagle氏液洗3次，吹打加入适量营养液(50％199培养基、40％0.5％的水解乳蛋白、10％小牛血清、庆大霉毒100单位/ml、1.1/万的谷氨酰氨7.5％NaHCO3调pH至7.4—7.6)、静置10分钟，将上部液体倒入营养液瓶中，再次加入营养液吹打，静置10分钟，再倒出上部液体，如此重复3次；上部液体都收集到同一个瓶中，每只猫肾细胞加营养液约500—1000ml，再分装于培养瓶中，37℃培养2—3天长成单层，接种培养液量2％的犬细小病毒弱毒，36℃吸附1小时，加维持液(3％小牛备清的199培养基，内含100单位庆大毒素/ml，pH为7.4)，37℃培养4—5天，待70％以上细胞发生病变时冻融收毒，收毒时每三瓶混合分别作无菌试验和病毒滴定，保存于-20℃，保存时间不能超过3个月，如超过则冻于前应重新滴定病毒。
3、犬瘟热的毒弱培养培养方法同毒种制造。
(三)、疫苗的配比及冻干1、以上法制备并经检验合格的病毒原液方可用于冻干。
2、制造冻干疫苗的保护剂为5％蔗糖脱脂乳、经110—116℃灭菌30—40分钟，经检验无菌后用于配苗。
3、配苗方法根据每种病毒的滴度决定配苗比例，将苗充分混合后，过滤即可分装冻干。为了抑制杂菌，每毫升加入青霉素100—500单位、链霉素100—500微克或庆大霉素100—500单位。
4、疫苗的冻干将疫苗分装于有三叉胶塞的青瓶中，然后进行真空冻干。
5、冻干完毕即在冻干机内处于真空装态下压上三叉胶塞，取出后压上铝帽。
6、每瓶疫苗应标明疫苗名称、批量、装量。若干瓶疫苗装于包装盒内，并附有说明书。每盒疫苗标签，注明制品名称、制苗成分、批准文号、批号、装量、检验号树、用法，以及保存方法、效期、制造日期及厂名等。
7、所有制造及冻干过程，均须详细记录于专用表册中，并注有实验人及核对人。
(四)、疫苗的检验1、无菌检验按《兽医生物制品制造及检验规程》中的《成品检验有关规定》进行。冻干疫苗有菌生长时应作杂菌计数和病原性鉴定。杂菌病原性鉴定按《成品检验有关规定》。杂菌计数每毫升疫苗的非病原菌数不超过1000个。
2、安全检验小白鼠安全试验取8只18—20克小白鼠，各脑内接种0.03ml疫苗，另取同样重量的8只各腹腔注射0.5ml，观察7天。观察期间，若任何一组有2只或2只以上小白鼠出现了疫苗本身所致的不良反应，为不合格。若2只或2只以上小自鼠出现非疫苗本身所致的不良反应，则为无结果，应重检；若不重检判为不合格。
狗安全试验取3只易感犬，按瓶签上注明的途径，各注射10个使用剂量的疫苗，逐日观察至21天。出现疫苗本身所致的不良反应，判不合格；若不良反应并非本品所致，判无结果，可重检，若不重检则判不合格。
3、效力检验
犬瘟热病毒用鸡胚成纤维细胞对疫苗中犬瘟热病毒含量进行组织细胞半数致死量(TCID50)测定TCID50滴度不低于103.5判为合格，不合格可重检一次。
狂犬病毒用微量蚀斑法测定疫苗中狂犬弱毒的蚀斑单位(PFU)，设有标准狂犬病血清中和试验对照。对照试验成立情况下，每批和每两批疫苗中狂犬病毒含量不低于105.0PFU/头剂。疫苗对小鼠保护指数测定按《兽医生物制品制造及检验规程》85年1月版本《狂犬病疫苗制造及检验规程》中的效力检定进行，对小白鼠的保护指数不得低于10000LD50为合格，不合格者可重检两次。
犬细小病毒用A72细胞对疫苗中犬细小病毒的含量进行微量组织细胞半数致死量测定(TCID50)，测定前将疫苗与等量的无犬细小病毒抗体的抗狂犬病血清37℃水浴中和1个小时。TCID50测定滴度不低103.5判为合格，不合格可重检一次。
4、剩余水份检验每批冻干苗任抽4个样品，按《兽医生物制品制造及检验规程》85年1月版本《剩余水份测定法》测定水份。各样品剩余水份应不超过4％。
5、真空度测定按《兽医生物制品制造及检验规程》85年1月版本《成品检验的有关规定》进行。
6、物理性状检验冻干疫苗按《兽医生物制品制造及检验规程》85年1月版本《成品检验有关规定》进行。
7、所有检验过程及检验结果，均须详细记录于专用的表册中。
8、成品留样按《兽医生物制品制造及检验规程》85年1月版本《成品检验的有关规定》进行。
(五)、疫苗的保存及使用1、冻干疫苗的有效保存期自效力检验开始日期算，2—8℃保存最长不超过1年。10—30℃保存最长不超过2个月。
2、本疫苗专供用于动物预防犬瘟热、狂犬病及犬细小病毒肠炎三种传染病。
3、用1ml生理盐水或蒸馏水溶解l瓶三联冻于疫苗为一只犬一次皮下或肌肉接种量，幼犬8周龄首次免疫，隔3—4周二次免疫，以后间隔1年免疫一次。成年犬初次免疫注射2次，间隔3—4周，以后每年免疫一次。
4、免疫使用的针头及注射器必须消毒，但不可用化学药物消毒，否则严重影响疫苗效力。怀孕期母犬及不健康犬勿使用。对个别犬可能出现过敏反应，可使用肾上腺素治疗。
权利要求
1.一种犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联弱毒活疫苗毒种，其特征在于犬瘟热弱毒毒种属副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbilliviridae)犬瘟热病毒(Caninedistemper virus)、编号为CDV-FAC株；狂犬病弱毒毒种属弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒属(Lyssa virus，or Rabies virus group)狂犬病毒(Rahies virus)、编号为CTNB12；犬细小病毒弱毒毒种属细小病毒科，又名微小病毒科(Pavoviridae)细小病毒属，又名微小病毒属(Parvovirus)，犬细小病毒(Canine Parvovirus)、编号为A2-CPV；这三种毒种的保藏号为CGMCC NO 0222。
2.一种犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联弱毒活疫苗，其特征在于该三联弱毒活疫苗含有犬瘟热弱毒大于103.5TCID50/剂量，狂犬病弱毒大于105.0PFU/剂量、犬细小病毒弱毒大于103.5TCID50/剂量。
3.一种犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联弱毒活疫苗的制造方法，包括三种毒种标准、毒种传代及保存、疫苗制造配比及冻干检验，其特征在于将分别生产犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒弱毒活疫苗，然后进行病毒滴定，依所含免疫剂量，按犬瘟热弱毒大于103.5TCID50，狂犬病弱毒大于105.0PFU、犬细小病毒弱毒大于103.5TCID50混合，过滤，冻干制成三联苗。
4.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于狂犬病弱毒的培养为将经无菌，支原体检验阴性的正常成片的BHK21细胞消化，加原培养液的3—5倍的培养液量，调pH至7.6—7.8，并加培养液2％的病毒，混匀分装于细胞瓶内或发酵罐内微载体培养，33℃-37℃培养3-10天收上清，再换维持液3天后再收毒一次；收毒时作无菌检验和用蚀斑法进行病毒滴定，收获液存于-20℃，保存时间不超过3个月。
5.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于狂犬病弱毒毒种的传代及保存为毒种传代用BHK21细胞，BHK21细胞为经支原体、外源因子检验合格的150代以内细胞，长成单层后，换维持液，维持液加2％的病毒原液，放33℃-37℃培养3-10天收毒，将收获的病毒液加等量的保护剂(脱胎牛奶、小牛血清、6％明胶、6％麦芽糖均可)，冻干，并进行检验，达到毒种标准即可存于-30℃，每3年传代一次。
6.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于犬细小病毒弱毒的培养为选健康新生仔猫，无菌取肾，制成单层细胞于培养瓶中或发酵罐中，pH值为7.4—7.6，培养2-3天，接种犬细小病毒弱毒，A2-CPV的繁殖条件为pH7.2-7.6，35-38℃，培养3-6天，待40％以上细胞发生病变时冻融收毒或收上清；最佳条件为pH7.4，温度37℃，培养4-5天待75％以上细胞发生病变时冻融3次收毒；保存于-20℃以下，保存时间不能超过3个月，如超过则冻干前应重新滴定病毒，液氮保存可存10年，每10年传代一次。
7.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于犬细小病毒弱毒毒种的传代及保存为毒种传代用A72细胞，常规将A72细胞培养成单层，接种维持液量2％的犬细小病毒36℃吸附1小时，加维持液37℃培养4—5天，待70％以上细胞发生病变时冻融收毒，经检无菌，加等量5％蔗糖脱脂奶冻干，并检验，达到毒种标准即存于-30℃，每3年传代一次。
8.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于犬瘟热弱毒的培养、传代及保存为选6-15日龄发育良好SPF鸡胚，制备鸡成纤维细胞，于细胞培养瓶或发酵罐中，36-39℃培养2-10天，吸附接种病毒，30-35℃培养2-10天，待40％以上细胞发生病变时，将细胞移至2-8℃过夜，收上清，与等量保护剂混合冻干，并检验达到毒种标准放-30℃保存，每三年传代一次；最佳条件为33℃，培养2-3天，待70％以上细胞发生病变时，将细胞移至3-5℃过夜，反复摇动后收上清，液氮保存可存10年，每10年传代一次。
9.根据权利要求3所述的制造方法，其特征在于制造冻干疫苗的保护剂为5％蔗糖脱脂乳、经110—116℃灭菌30—40分钟，经检验无菌后，并按每毫升加入青霉素100—500单位、链霉素100—500微克或庆大霉素100—500单位，用于配苗，最后将疫苗分装于有三叉胶塞的青瓶中，然后进行真空冻干。
全文摘要
一种犬瘟热、狂犬病、犬细小病毒病三联弱毒活疫苗、毒种及制造，三种毒种的保藏号为CGMCC NO 0222。该三联弱毒活疫苗含有犬瘟热弱毒大于10
文档编号C12N7/04GK1117081SQ95102239
公开日1996年2月21日 申请日期1995年3月16日 优先权日1995年3月16日
发明者郑海发, 杨培豫, 高云 申请人:高云