专利名称：用htra启动子在减毒细菌中表达异源蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA构建物，含有该构建物的可复制表达载体，含有该构建物的减毒细菌和含有所述细菌的疫苗。
近年来出现了新一代的口服沙门氏活菌疫苗，这些疫苗是基于通过在细菌的芳香氨基酸生物合成途径的基因中引入不可逆突变而减毒的沙门氏菌株。这种菌株公开于例如EP-A-0322237中。前述口服沙门氏活菌疫苗正显示为人和动物沙门菌病的有希望的疫苗，它们还可有效地用作向免疫系统输送异源抗原的载体。重组沙门氏菌疫苗已被用于输送病毒、细菌和寄生虫抗原，激发对重组抗原的分泌、体液和细胞介导的免疫应答。作为单剂口服多疫苗输送系统，重组沙门氏菌疫苗显示出很大的潜力[C.Hormaeche等，FEMS Symposium No.63，Plenum，NewYork；pp71-83，1992]。
在重组沙门氏菌疫苗的开发中有些问题需要克服。主要的考虑是重组抗原在沙门氏疫苗中获得高水平的表达，以便足以引发免疫应答。但是外源抗原的失调高水平表达可以是毒性的并影响细胞的生存力[I.Charles and G.Dougan，TIBTECH8，pp117-21，1990]，致使该疫苗无效或造成重组DNA的损失。已经描述了这一问题的几种可能的解决办法，例如从带有必需基因、“开-关”启动子的质粒中表达或将外源基因引入沙门氏菌基因组中。
克服上述问题的另一方法可能是利用一种在体内可诱导的启动子，一种这样的启动子是大肠杆菌亚硝酸盐还原酶启动子nirB，它在厌氧生活下被诱导。在我们早先的国际专利申请PCT/GB93/01617中描述了含有用带nirB启动子的构建物转化之细菌的疫苗组合物。
本发明涉及含不同的可诱导启动子DNA构建物的制备，该启动子为编码一种应激诱导蛋白的htrA基因的启动子。
对htrA基因的描述见于K.Tohnson等Mol.Microbiol.1991；5401-7和其中所引的参考文献中，这是编码热激蛋白之基因的一个实例，在温度升至42℃以上时产生所述蛋白。
因此，本发明第一方面提供含有与编码一种或多种异源蛋白的DNA序列有效连接的htrA启动子序列的DNA构建物。
在一种实施方案中，本发明提供一种上述定义的DNA构建物，其中htrA启动子与编码两种或多种异源蛋白之融合蛋白的DNA序列有效地连接。
组成融合蛋白的蛋白间可借助一柔性绞链区连接。
另一方面，本发明提供一种含有与编码第一和第二异源蛋白的DNA序列有效连接的htrA启动子的DNA构建物，其中第一异源蛋白是一种含破伤风毒素片段C或其一个或多个表位的抗原序列。
另一方面，本发明提供一种含有如上定义的DNA构建物的适用于细菌的可复制表达因子。
另一方面，本发明提供一种融合蛋白，优选基本纯的融合蛋白，即由如上所定义的构建物所表达的融合蛋白。
另一方面，本发明提供一种制备减毒细菌的方法，包括用如上所定义的DNA构建物转化一种减毒细菌。
还有，本发明提供一种含有如上所定义DNA构建物的宿主细胞，如一种细菌细胞。DNA构建物可以染色体外形式存在，如质粒中，或可以按本身已知的方法整合在宿主(如细菌)染色体中。
本发明还提供一种含有如上所定义的减毒细菌或从中表达的融合蛋白以及药学上可接受载体的疫苗组合物。
第一和第二蛋白优选是异源蛋白，尤其是多肽免疫原；例如它们是源自病毒、细菌、真菌、酵母或寄生虫的抗原序列。具体讲，优选第一蛋白是一种含有破伤风毒素片段C或其表位的抗原序列。
第二蛋白优选是一种病原生物的抗原决定簇。例如，这种抗原决定簇可以是源自病毒、细菌、真菌、酵母或寄生虫的抗原序列。
作为第一和/或第二异源蛋白的病毒抗原序列的实例是源自以下的序列一种类型的人免疫缺陷病毒(HIV)如HIV-1或HIV-2，HIV(如HIV-1或HIV-2)的CD4受体结合位点，甲、乙或丙型肝炎病毒，人鼻病毒如2型或14型，单纯疱疹病毒，2或3型脊髓灰质炎病毒，口蹄疫病毒(FMDV)，狂犬病毒，轮状病毒，流感病毒，柯萨奇病毒，人乳头瘤病毒(HPV)如16型乳头瘤病毒、其E7蛋白及含有E7蛋白或其表位的片段；和猴免疫缺陷病毒(SIV)。
源自细菌的抗原实例是以下细菌的抗原百日咳博德特氏菌(如P69蛋白和丝状血凝集素(FHA)抗原)，霍乱弧菌，炭疽芽孢杆菌，和大肠杆菌抗原如大肠杆菌热不稳定毒素B亚单位(LT-B)、大肠杆菌K88抗原和肠毒性大肠杆菌抗原。其他抗原实例包括细胞表面抗原CD4、曼氏裂体吸虫P28谷胱甘肽S-转移酶抗原(P28抗原)和以下寄生虫的抗原吸虫、菌质、线虫、绦虫、沙眼衣原虫和疟疾寄生虫，如疟原虫属或巴贝虫属的寄生虫，例如恶性疟原虫，以及编码上述抗原免疫原性表位的肽。
具体抗原包括全长曼氏裂体吸虫P28，免疫原性P28aa115-131肽(其含有B细胞和T细胞表位)的寡聚物(如2、4和8聚物)，人乳头瘤病毒E7蛋白，单纯疱疹抗原，口蹄疫病毒抗原，猴免疫缺陷病毒抗原，和白喉毒素抗原，如白喉毒素神经节苷脂结合区。
本文所用术语“htrA启动子”指该启动子本身或其能够促进编码基因表达的部分或衍生物。含htrA启动子的优选序列是AATTCTATTCCGGAACTTCGCGTTATAAAATGAATCTGACGTACACAGCAATTTA(SEQ.ID.NO.1)在本发明的构建物中，DNA序列可以编码两种或多种蛋白的融合蛋白，其中相邻蛋白被一绞链区分隔开。绞链区是一种设计为通过在功能区之间提供空间和时间上的分离而促进第一和第二蛋白两者独立折叠的区域。
绞链区一般是编码高比例脯氨酸和/或甘氨酸的序列。绞链区可以完全由脯氨酸和/或甘氨酸组成，可以含有一个或多个甘氨酸-脯氨酸二肽单元。
例如，绞链区可含有最多约15个氨基酸，例如至少4个，优选6-14个氨基酸，氨基酸的数目应能在第一和第二蛋白之间提供柔性。
在一种实施方案中，绞链区基本相当于抗体免疫球蛋白的绞链区。具体讲，IgG抗体的绞链区富含脯氨酸[T.E.Michaelson等，J.Blol.Chem.252，883-9，1977]，认为它在抗原结合区和尾区之间提供一个柔性关节。
虽不希望拘于任何理论，但认为脯氨酸形成绞链的刚性部分，因为该氨基酸的环结构特征阻碍围绕连接脯氨酸残基和相邻氨基酸的肽键的旋转。认为这一特征阻止了脯氨酸和相邻残基采取α螺旋或β链的有序结构。柔性被认为是由甘氨酸带来的，这是最简单的氨基酸，空间要求很有限。认为甘氨酸的功能是作为绞链的柔性弯头。其他氨基酸可以取代甘氨酸，尤其是那些没有大侧链的氨基酸，如丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺和苏氨酸。
在一优选实施方案中，绞链区是构成以下序列的四个或更多个氨基酸的链-[X]p-Pro-[Y]q-Pro-[Z]r-其中Pro是脯氨酸，X和Y各为甘氨酸或无大侧链的氨基酸；Z是任何氨基酸；p是正整数；q是1-10的正整数；r为零或大于零的正整数。
绞链区可以是与第一和第二蛋白两者都异源的分立区域，或由第一蛋白的羧基末端部分或第二蛋白的氨基末端部分构成。
在一最优选的方案中，本发明提供一种含有与编码由绞链区连接的第一和第二多肽免疫原的DNA序列有效连接的htrA启动子的DNA分子，其中第一多肽免疫原包含破伤风毒素片段C或其表位。
在本发明的另一优选方案中，提供一种适于细菌中使用的可复制表达载体，其含有htrA启动子和与之有效连接的编码由绞链区连接的第一和第二多肽免疫原的DNA序列，其中第一多肽免疫原包含破伤风毒素片段C或其表位。
另一方面，本发明提供一种含有htrA启动子和与之有效连接的编码第一蛋白的DNA和从其3′末端延伸的编码绞链区的DNA序列及其下游的一个或多个限制性内切酶位点的DNA构建物。
所述蛋白优选是如前文所定义的抗原蛋白，尤其是TetC片段或其表位。
由绞链区连接的第一和第二异源蛋白可在体内获得稳定表达。可以在减毒细菌中表达异源蛋白，这种细菌从而可用作疫苗。
减毒细菌可选自以下的属沙门氏菌属、博德特氏菌属、弧菌属、嗜血菌属、奈瑟氏球菌属和耶尔森氏菌属。或者，减毒细菌可以是肠毒性大肠杆菌的减毒株。尤其可提及下列菌种伤塞沙门氏菌-人伤寒的病因；鼠伤寒沙门氏菌-数种动物沙门菌病的病因；肠炎沙门氏菌-人食物中毒的病因；猪霍乱沙门氏菌-猪沙门菌病的病因；百日咳博德特氏菌-哮咳的病因；流感嗜血菌-脑膜炎的病因；淋病奈瑟氏球菌-淋病的病因；和耶尔森氏菌-食物中毒的病因。
细菌的减毒可归因于细菌芳香氨基酸生物合成途径基因中不可逆的突变。分支酸的合成中涉及至少10个基因，分支酸是芳香氨基酸生物合成途径中的分支点化合物。几种这样的图谱在细菌基因组上定位大不相同，例如aroA(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)、aroC(分支酸合成酶)、aroD(3-二氢奎尼酸脱氢酶)和aroE(莽草酸脱氢酶)。因此可在aroA、aroC、aroD或aroE基因中发生突变。
但优选减毒细菌在其芳香氨基酸生物合成途径中两个独立基因中有不可逆突变，或在其芳香氨基酸生物合成途径中和在调节基因如htrA、OmpR或OsmC中都有不可逆突变。合适的减毒细菌实例公开于如EP-A-0322237和EP-A-0400958中。
含有本发明DNA构建物的减毒细菌可用作疫苗。由该细菌表达的融合蛋白(优选基本纯的形式)也可用于制备疫苗。例如，已发现纯化的TetC-P28融合蛋白本身为免疫原性的。因此本发明另一方面提供含有药学上可接受载体或稀释剂以及作为活性成分的如上所定义的减毒细菌或融合蛋白的疫苗组合物。
该疫苗可含有一种或多种适宜的佐剂。
该疫苗最好以冷冻干燥形式(例如胶囊形式)存在用于给患者口服给药。这种胶囊可以带有肠衣，包括如Eudragit“S”、Eudragit“L”、乙酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素或羟丙基甲基纤维素。这些胶囊可以就此使用，或者在给药前将冻干物重新配制成如悬液。最好在适当pH的缓冲液中进行重配，以保证生物的存活。为了保持减毒细菌和疫苗不受胃酸性的破坏，在每次服用疫苗前最好服用碳酸氢钠制剂。或者，可制备疫苗使其适于胃肠外给药、鼻内给药或乳房内给药。
优选使该疫苗组合物适于粘膜输送，如通过口服给药、鼻内给药或支气管内给药。
含有本发明DNA构建物的减毒细菌可以用于宿主的预防或治疗，尤其是人，也可能是动物。因此可通过服用有效剂量的本发明减毒细菌可以防止由微生物(特别是病原体)引起的感染。服用后该细菌表达能够激发对所述微生物抗体的异源蛋白。所用剂量将取决于各种因素，包括宿主的大小和重量、所配疫苗的类型和异源蛋白的性质。
可通过用以上所定义的DNA构建物转化减毒细菌而制备本发明的减毒细菌。可以使用任何合适的转化技术，例如电穿孔。这样可获得能够表达与此细菌异源之蛋白的减毒细菌。该减毒细菌的培养物可在有氧条件下生长。这样制备足量的细菌用于配制成疫苗，而异源蛋白的表达很少。
表达载体带有适当的转录和翻译控制元件，除htrA启动子外包括，转录终止位点和翻译起始和终止密码子，还带有适当的核糖体结合位点。该载体一般包含复制起始区，及需要时还有选择性标志如抗生素抗性基因。例如该载体可以是质粒。
下面将参照实施例和
本发明，但不限制本发明。
图1说明根据本发明的一个方面构建含htrA启动子的质粒pHTRA1；图2说明如何构建含htrA启动子和编码与绞链区连接之破伤风毒素C片段的DNA的质粒pHTRA2；图3说明质粒pTECH2的结构；图4说明中间质粒pBD907的结构；图5显示按图1所示方案所制质粒pHTRA1的结构；图6显示按图2所示方案所制产物质粒pHTRA2的结构；图7A和图7B说明温度变化对启动子nirB、groE和hrtA的影响；及图8显示LacZ在巨噬细胞中从htrA、nirB和groE的表达。
实施例1htrA-TetC-绞链结构的制备从图1可以看出，用于制备含htrA启动子和破伤风毒素C片编码基因的载体的起始物是质粒pTETnir15，其结构和制备公开于我们的早先申请PCT/GB93/01617(
发明者M·A·翰, S·N·查特费尔德, J·李 申请人:麦迪瓦赫丁公司