专利名称：：高分辨图谱的做图方法及图谱探针的制作方法致谢本发明部分是在政府部门的支持下完成的，能源部(DepartmentofEnergy)的许可号为DE-FG603-92ER-61402，而国有健康人类基因组创始研究所(NationalInstitutesofHealthHumanGenomeInitiative)的许可号为R29HG00037-04。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术：
：本发明涉及用以鉴定与人疾病有关的基因的方法及试剂。本发明还涉及整个人基因组的高分辨遗传图的构建。本申请中的各种文献均注明在括号里。这些文献公开的内容以其全文引入本申请作为参考，以便对与本发明相关的
技术领域：
的状况作更全面的描述。
背景技术：
：由人类基因组工程(HumanGenomeProject)提供的资源正形成用来鉴定造成人类疾病的50-100,000个基因的策略。当前用高度多态的标记来快速和廉价地定位造成遗传疾病的基因的种种努力(Weissenbach，J.等，Nature359794-801，1992)已超过将可得到的标记与目前已知的10,000或更多的人cDNA联系起来的能力。目前已克隆了预计全部约50,000-100,000人基因中的近20,000个片段，并部分已被测序。虽然有了这些成功，仅约3000个这样的克隆被定位到它们各自的染色体位点上，大部分定位于包括多条带的10-20Mb大的区域。因此，不能将染色体上均匀间隔的提供大量信息的标记鉴定出来导致了当前做图技术的明显的弱点。物理图谱技术对遗传连锁提供了补充。例如，标准的琼脂糖凝胶电泳的分辨率的范围为1到10Kb。脉冲场技术使该范围延伸至兆碱基的水平。然而，凝胶电泳技术对于以前没有被定过位的DNA序列的初始定位是无用的。而且，这些方法不具备使相差多于几十万对碱基的DNA序列排序的能力，也不具备使DNA序列分配到特定染色体区域的能力。染色体显带技术使特定的人染色体的识别变得容易半且提供了诊断染色体异常的主要依据。最初的染色体分配和基因定位，已使用了几种技术来获得高度精确的定位。然而这些技术具有一些不利的方面。例如，部分依赖于在UV辐射后DNA丢失的显带技术会因此导致某些信号的丢失(Cherif等，Proc.Natl.Acad.SciUSA876639-6643(1990)；和Takahashi等，Hum.Genet8614-16(1990))。与其它技术相比，标准的DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)，或PI(碘化锭)染色产生不一致的图谱，并且通常分辨率较低(Pinkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA832934-2938(1986)；Lemieux等，CytogenetCellGenet.59311-312(1992)；Yamada等，Genomics15449-452(1993)；及Heng等，Chromosoma102325-332(1993))。其它技术产生强的好区分的图谱，适于强信号大探针的探测，但会模糊由小探针产生的微弱信号(Rowley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA879358-9362(1990))。最后，杂交后的吉姆萨染色，是其它染色技术的典型，必须经两轮的微观评价，一轮测杂交探针而另一轮定位信号到显带的染色体上(Klever等，Hum.Genet.86484-486(1991))。使用分散的重复序列的同时杂交方法也可用于标记带(Baldini等，Genomics9770-774(1991))，但经常证明难以获得既显示清晰的带图谱又显示由小探针产生的杂交信号的中期带图。鉴定人DNA片段在染色体上座位的最直接的方法是原位杂交。虽然小于1Kb长的单一序列可用同位素标记的探针来定位，但放射自显影的显影时间长(经常数周或数月)，需要大量的统计分析，并且图谱的精确性被为捕获放射的同位素信号而必须用感光乳胶剂覆盖所限制。相反，非同位素标记的探针，虽在速度和空间分辨方面得到了改进，但敏感性差。因此，虽然已描述了许多的染色体带分配技术，但这些现有技术均有弊端。例如，大多数的现有技术的分辨率比标准的吉姆萨显带要低，使用的荧光染料的光谱与标准FISH标记重叠，导致DNA的丢失，或仅被使用于插入到粘粒或噬菌体载体中的大基因组探针。尽管图谱技术有了前面所述的进展，为建立空间规则排列的覆盖人类基因组的克隆基因组序列而进行的快速、高效、和精确定位大量克隆的努力被在几种水平上遇到的各种限制所妨碍。结果，目前建立不起来由单一标记所定义的特定染色体区带的精细图谱，特别是缺失、易位、或重复定义的在医学上重要的基因位置的精细图谱。因此，需要简便地将基因精确分配到单个染色体带位点的方法和试剂。这些进展将推动基因序列信息与其生物学重要性的相关分析，并因此使适当的医学治疗的鉴定变得容易。本发明满足了这些需要，也提供了相关的长处。本发明概述根据本发明，高分辨的、快速和可重复的染色体带显带方法已被建立起来。本发明的方法能精确地将基因定位于单个染色体带上而不发生标记位移。根据本发明的另一实施方案，提供了易于定位序列的试剂。所述的试剂用于识别由特定DNA序列产生的染色体带。附图简述图1描述本发明的单个染色体带的定位策略。每条染色体带右侧的圆点代表独特的识别和标记染色体带上特异座位的分子细胞遗传学试剂。本发明的详细描述本发明提供了高分辨的、可重复的反带(R带)显带方法，该方法能快速确定和精确分配基因序列的单个染色体体带图位置。发明方法加快了具有生物学重要性的基因序列与特定染色体带位置的相关分析。本发明方法所产生的数据能构建人基因组的所有染色体的完整物理图谱，并因此能鉴定出治疗遗传紊乱的适当的医疗方法。另外，本发明方法提供的高分辨率可精准建立和评估与人遗传疾病相关的小鼠同源基因。本发明的教导能在多基因内或在含有约93％核苷酸水平同源性的假基因家族内精准探测转录位点。原位荧光杂交(FISH)是将单一基因分配到特定的人染色体带的最精确和快速的方法之一，并是人基因定位和临床细胞遗传学的基本要素。(Pinkel，D.等，ProcNatl.Acad.Sci.USA，832934(1986))。本发明提供了将敏感的原位荧光杂交与高分辨的染色体显带及随机cDNA测序结合起来的改进，以将具有平均大小＜2Kb的插入片段的cDNA定位到单个人染色体带上。还提供了产生与原位杂交相容的高分辨的R带的方法。在另一实施方案中，本发明提供了将大小范围在1-1,000Kb的DNA探针直接定位到显有R-带的人染色体上的方法和试剂。还提供了可与R-带显带方法相结合应用的染色体制备、杂交、及产生信号的方法。本发明的方法能构建人染色体的完整物理图谱。本发明的独特的反带(R)显带是通过原位杂交后的色霉素A3和远端霉素A的染色而得到的。本发明的杂交方法所得的清晰的带谱可同时看见荧光R带及使用标准显微照相术或自动成像系统的原位杂交信号。该技术的敏感性仅用标准的显微照相术就可使大小范围在1.2-3Kb的cDNA定位到单个染色体带上。本发明方法可在350-700之间快速而可重复地显带。本发明在实践中的重要问题是需要确定由微弱信号所产生的定位结果的置信标准。至于任何存在于明显小于100％染色体上的信号，已建立了保守的定位标准来使真正人信号从非特异的染色体背景中区分出来。只有那些在一条染色体的两条染色体单体上在同样的带位置均被看见的信号才被视为阳性结果。而且，因许多中期染色体可能重叠或在分析中丢失，不用第二染色体上的信号来增加定位的确定性。因此，在200个被检的中期细胞中，在多于或等于10％的细胞中存在至少一条染色体对单一位点的信号是阳性时，才考虑探针定位；当在5-10％的被检中期细胞中存在时，考虑探针初步定位；而当在2-5％的被检中期细胞中存在时尽可能地探针定位。当少于1％的细胞为阳性时，认为信号是背景。用仅在2-5％细胞中存在的信号已经且能精确地定位许多基因，例如，谷氨酰胺酶(＜5％-参见下面)显示，用本发明的方法被定位于2q32(以前被分配到2q32-34)。对FISH前和后得到的本发明的R-带图谱的比较揭示本发明方法，在杂交后需染色，但不改变染色体的形态。“前”和“后”的染色体显带图谱在分辨率和清晰度方面表现为基本相似。在给定制备的情况下在大于90％的中期细胞中观察到该图谱，并且与在有或无溴脱氧尿苷(BrdU)掺入的染色体的图谱一致。Magenis等对现有技术的显带技术进行了改进(Hum.Genet69300-303(1985))，用以防止使用现有技术而典型地遇到的快速褪色。例如，提高了McIlavane缓冲液的pH(Schweizer，D.等，Exp.CellRes.，111327(1979))；根据探针的大小改变色霉素A3的染色时间；及使用了色霉素A3/远端霉素的二轮染色。另外，为进行探针和显带图谱的同时照像或显影，按照信号的强度来调整曝光时间和染色强度。对产生弱信号的较小探针，当使用标准的显微照相术时所需的曝光时间在15-200秒之间变化。相比之下，记录强度更强的信号需要更短的时间。所有的标准显微照相均使用柯达100ASA胶卷以使分辨率最大。可使用快显胶卷以减少曝光时间，然而这却使带的分辨率变低。本文提供的方法可获得高分辨率的图谱，所述的图谱可重复产生并可被本领域的技术人员做为常规技术成功地用来对大小范围在＞1Kb到1Mb的DNA序列进行染色体带的定位。本发明可使用宽范围的探针，即，如酵母人工染色体(YACs)、细菌人工染色体(BACs)的大探针，和如基因组质粒和cDNA的小探针。目前，YACs，或称为酵母人工染色体，被用于大多数的人基因组的定位。YACs允许≥约500Kb片段的克隆。然而，YAC文库的操纵已遇到了一些难题。例如，在各种YAC文库中，一部分的克隆得自于共克隆事件，即它们在单一克隆内包括不连续的DNA片段。大部分的YAC克隆，特别是具有高分子量插入片段的克隆是嵌合体。嵌合克隆定位染色体上的多位点，并因此上，阻碍了做图及分析的进展。YAC克隆的另一个特有的问题是由DNA片段引起的，所述的片段是不能克隆或不稳定的并倾向于重排和缺失。细菌人工染色体(BACs)，提供了YAC系统的替代物。BACs使YACs最棘手的问题，例如高比率的嵌合现象和克隆的不稳定性得到了缓解。BACs基于大肠杆菌的单拷贝质粒F因子，并能可靠地扩增大于约300Kb大小的DNA片段。BACs具有许多物理性质，这些性质，包括容易操纵及嵌合缺乏，使它们适于物理做图。嵌合的缺乏及能扩增大的外源DNA插入片段的能力使BACs成为染色体散步及产生连续的物理图谱手段的佼佼者。不象YACs是线性的，具有插入片段的BACs在大肠杆菌中以超螺旋环状质粒存在。这种构象通过较小的切割使大DNA易于分离和操纵，而酵母染色体却难以分离其完整的形式，因为线性DNA更容易剪切。在此所用的BAC克隆系统提供了物理做图中介系统，该系统可在YACs和粘粒之间分散。虽然YAC系统仍然还是大规模做图的强有力的工具(因为已克隆了大于一兆碱基的分子)，但BACs比YACs更容易使用而且更适于进行精细物理图谱的做图和染色体散步。实际上，已发现那些在YAC载体中不能克隆或不稳定的DNA片段，即，YAC上具有缺失或缺口的区域，可很好地被克隆于BACs中。而且，BACs同粘粒一样易于操作，但含有的插入片段大小可大10倍。BACs具有高的克隆效率使克隆的DNA容易操作，并可稳定维持插入的DNA。本发明极大地增加和改进了FISH的潜力。因此，现有技术的约2-3Mb范围的探测限度被显著地改善到约1-10Kb范围的探测限度。本发明技术，因此上能使本领域的技术人员快速地产生转录序列的高分辨图谱。本发明还提供了人基因组独特单带染色体位点(参见图1)的序列已定位的试剂。本发明试剂是独特的分子细胞遗传学标记，识别和标记染色体带的特定位置。本文所用的本发明试剂是指短的DNA或cDNA序列，易于被探测，独特地识别物理基因组位置。这些试剂可用作适于标记的探针，并可用于疾病决定基因的精确染色体位置的鉴定。另外，本发明试剂提供用于基因组大规模测序的底物。在此还提供了本发明试剂的集合或试剂盒。还提供了重叠试剂的集合，所述重叠试剂涵盖基因组的非间断的区段，即连续的cDNA。本发明试剂盒含有多种试剂，每种试剂对应于或识别染色体带的特异座位。本发明试剂盒的试剂内容可依据被定位的DNA序列而改变。例如，任何给定的染色体的单一的带可具有大约40到80个的独特的图谱位点，每个位点由与其相对应的特异试剂代表。因此，本发明试剂盒可包含对应于单条染色体带的多种试剂，对应于中心粒的多种试剂，对应于端粒的多种试剂，或针对单条染色体的多种试剂。本发明较其它方法的优点可通过例如，将包括130个cDNA、30个质粒、50个粘粒、500条细菌人工染色体(BACs)和150条YACs的900多个DNA序列定位到人单个染色体的带上而得到说明。另外，已定位了39个新克隆的在人脑中表达的基因，其中的26个定义了与已知基因具有明显同源性的新座位；这些中的20个代表高等生物的多基因家族的新成员，而6个代表与低等生物的那些多基因家族相关的基因新成员。它们包括与磷酸二酯酶、磷酸酶、蛋白激酶、钠通道、极低密度脂蛋白(VLDL)受体、轴突糖蛋白、膜运输蛋白、APP(淀粉样蛋白前体)家族成员(一个定位到以前建议的阿尔茨海默氏连锁区域，第二个为进一步的研究提供了候选座位)等等有关的基因。当与其图谱位置结合时，如表1所示，这些基因为人或小鼠的同源区域内的神经生物学疾病提供了直接的候选目标。表1基因名称插入片段大小图谱位置推测的APP-c10011Kb(*C)Xq24盘状大肿瘤抑制子17p12-13.1边缘人Folyl多聚谷氨酸酶2.1Kb(c)9q34.1Fibulin2.2Kb(c)22q13.3钠通道31.6Kb(c)2q24VLDL受体1.2Kb(c)2q24Fibromodulin3个不同的序列1q32Aggrecan(c)15q26Tg737(c)13q12精氨琥珀酸合成酶1.5Kb(c)9q34.1胞液丝氨酸2.0Kb(c)11p11.2羟甲基转移酶线粒体丝氨酸羟甲2.0Kb(c)12q13.2基转移酶钾通道11p14-15边缘G蛋白质CONE&Gai3(c)1p13.1OD&Gai2(c)3p21.3*c＝cDNA此处所示的结果证明本发明可用于大规模的cDNA定位。这些结果使本发明与其它方法在精确度(包括高分辨染色体带分配、多种信号的获得及分析)、敏感性及cDNA序列的定位速度方面区别开来。为说明多位点的信号的重要性，人们可假设靶大小或同源性的减小将导致出现阳性信号的细胞或染色体比例的减少。对那些试验变量大体保持不变的同样的细胞或细胞群内的第二位点杂交尤其如此。因为代表潜在的假基因和多基因家族信号的靶序列的大小恒定或可能更小些，因此，具有较大比例阳性细胞的位点更可能代表转录座位。例如，预期在具有93.5％或更高同源性的多基因家族内，测定产生阳性信号的细胞的比例可定义转录座位。阳性细胞的百分数与转录的对假基因座位之间的关系测试如下。(参见实施例11-12)。对大多数的未加工的假基因来说，由于假基因靶大小减小(因为截短和重排)，其信号较小；由于因靶序列对转录探针的序列位移而导致的同源性减小，出现信号的可能性也较小。对加工的假基因来说，结果却不同，同源性虽仍然很高但基因组的排列却不同了。关注点是，例如，尽管序列的同源性减低，新产生的加工的假基因，具有成簇排列的外显子，可比转录基因的基因组座位能更好地用作杂交靶子，因在转录基因内的内含子将外显子杂交靶打断了。由于已知的在Southern印迹中的观察结果，高度同源的假基因座位产生的带比与转录座位有关的那些带明显地要强，使该关注点得到了极大地加强。当然，在Southern印迹中，带的强度反映了靶大小及序列同源性，因此，用cDNA探测相关的转录座位所得的假基因带，可代表比从转录座位而得到的类似大小的带更多的外显子(较低同源性的)，并可被分成几个强度较弱的带。在原位荧光杂交的中期染色体的分辨率水平，所有的外显子均被检测为一个点。因此，序列同源性及外显子靶大小(外显子的数目)是信号大小的重要的决定因素。其它的决定因素，例如，包括易接近性、盐浓度、碱基组成、片段的二级结构、及其它。仅由于同源性降低，预计大多数的加工的假基因产生的信号将比那些预计从转录座位获得的信号小。认识到本发明的方法，在一定程度上，与传统的Cot曲线的相关比溶液杂交的固定化膜的相关更甚是很重要的。这是因为每条染色体代表一个分子，并且具有特异杂交信号的染色体比例敏感地反映杂交的概率，即在一定Cot时杂交分子的比例。虽然密度有一些近似，在非线性信号密度和多条带的标准的Southern印迹中，信息大多被丢失了。FISH对信号的放大对非线性有贡献，可使大小增加，而强度显然对探测有贡献。因为转录基因及可能的假基因座位均在同样的制备中被检测，应保持其两者及具有大体上反映同源程度和靶大小信号的细胞比例的探针浓度及杂交条件，Viz，Cot的恒定。因此，可预期，给定假基因的序列位移和重排，在转录座位具有阳性信号的细胞比例将比假基因的大。靶与探针大小之间的关系对杂交信号的特异性也是重要的。例如，假定探针和靶均比约50-100bp(在所用条件下单击稳定杂交所需的大小)大，对相同大小的靶(假基因和转录座位)来讲，具有高度同源性和稳定性的座位将产生大的信号。根据靶大小而增大探针的大小，如同小外显子(＜50-100bp)，大部分的探针吻合性差。例如，对含有不止一个外显子的杂交的cDNA片段来讲，第二个外显子保持不配对，将可能降低完全匹配的稳定性。因此，大探针(＞200bp)有利于具有连续外显子的靶的信号产生，所述的外显子是小外显子。这对于外显子比探针大的信号不是主要的影响因素。因此，小探针(50-200bp)的使用，在按本发明所述使用时，可使转录的对加工的假基因的相应检测变得简便。本发明的方法使极为相关的序列和在cDNA大小范围内的可重复的图谱较小片段间的信号强度差异最大化。因此，本发明方法在几个方面区别于现有技术方法，如，高严谨条件(包括提高洗涤温度)的使用，多种放大、及平均范围在100-200bp内的较小片段探针的使用。较小片段的使用及高严谨条件的洗涤趋于增加杂交形成的特异性，可敏感定义如精氨琥珀酸合成酶系统所示的同源性差异小至6％的转录座位。(参见实施例11)。如本发明所提供的相对完整的一套顺序转录的序列的易于获得性，将极大地促进得到完整的人基因组图谱的努力。使用含有本发明的序列已定位的试剂的连续的cDNA，可使靶的平均大小增加，使该方面的研究成为产生人基因组精细结构转录图谱的快速而经济的基因定位方法。产生的cDNA框架将定位和证实精细YAC图谱及遗传图，并将即时提供大量的定位的人基因，所述的人基因可被用于研究其在人类遗传疾病中所起的作用。下面的实施例用以说明，而不是限制本发明。实施例1中期相的制备用经过一些改进的BrdU阻断来制备染色体(Zabel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，806932-6936(1983))。简言之，使人外周血淋巴细胞在补加了L-谷氨酰胺(2mM)，15％的胎牛血清、青霉素(100IU/ml)，链霉素(0.05mg/ml)及0.02％的植物凝血素的RPMI1640(GIBCOBRL，Gaithersbury，MD)中于37℃生长72小时。通过加入5-溴-脱氧尿苷(0.8mg/ml)达16小时将细胞阻断在S期。然后用HBSS(Hanks平衡盐溶液)(GIBCOBRL，Gaithersburg，MD)将它们洗涤一次，以除去同步化试剂，并通过将它们在补加有2.5μg/ml胸苷的培养基中温育而将其释放。通过加入0.1μg/ml的乙酰甲基秋水仙碱10分钟，接下来以0.075MKCl低渗溶液于37℃处理15分钟，然后用3∶1的甲醇和乙酸的混合物固定1-5分钟。实施例2高质量染色体的制备为制备高质量的染色体，可通过将一滴悬液滴到乙醇-清洁的、平展的、完全没有细胞质的载玻片上而制备中期伸展相。然后，根据环境湿度将载玻片放到加有热水的容器上20-60秒。通过在相差显微镜下先检查几张载玻片来确定最佳条件。为得到最佳结果，在原位杂交前，应将载玻片在室温下老化至少2-3周。最好将载玻片在老化后贮存于-70℃。在变性前的那天，将载玻片从-70℃取出并于4℃过夜保存。然后将载玻片于室温放置1-2小时，接下来将其在55-60℃焙烧2小时，然后在70％的甲酰胺(于66-70℃)中变性。为得到最佳结果，将新鲜的载玻片于66℃变性。实施例3用于定位小DNA探针的探针片段大小以缺口翻译标记的探针的片段大小应在100-200bp之内，且在杂交混合物中的探针DNA的浓度应在20-40ng/μl(即，200-400ng/载玻片)的范围内。这能增加非-特异性结合，但通常将产生好的信/噪比。为减少重复序列的非-特异性背景杂交，应将少量的CotIDNA与cDNA探针(即，1-3μg的CotI与200-400ng的探针DNA)一起使用。实施例4探针的生物素标记用生物素-14-dATP通过缺口翻译(GIBCOBRL)标记DNA探针。用层析(交联萄聚糖G-50)将未掺入的核苷酸分离。通过非变性的琼脂糖凝胶使所有的DNA探针的片段平均大小为约200bp，在100-600bp的范围内。实施例5原位杂交为得到单拷贝序列与小DNA探针的特异杂交，将Lichter等描述于Science24764-69(1990)的FISH方法加以改进。对在使用前一年多以前制备的载玻片，不必进行RNase处理。必要时，RNase处理为100μg/ml的RNase在载玻片上于37℃停留20分钟，然后以70％、90％和100％的系列冷乙醇脱水。载玻片在70％的甲酰胺/2×SSC(0.15MNaCl，0.015M柠檬酸钠)中于67-70℃变性1-2分钟(新鲜制备的染色体需要较短的时间)。每张载玻片上置含有生物素标记的探针及3μgCot1DNA和7μg超声断裂的鲑精DNA(探针Cot1DNA的比率为1∶15-30；总DNA浓度为1μg/μl)的杂交缓冲液。然后盖上盖玻片并用橡胶粘剂密封之，接下来于37℃在湿化室内将其温育过夜。实施例6探针信号的免疫荧光探测杂交过夜后，将载玻片在50％的甲酰胺(V/V)/2×SSC中于44℃洗涤(4×5分钟)，然后在2×SSC中于50-60℃洗涤(3×5分钟)。对于小探针(插入片段大小＜1.5Kb)，漂洗时间应短些(3×2分钟)。为提高由小探针产生的荧光信号的强度，有必要降低杂交后洗涤的严谨程度(2×SSC，45-50℃)。然后将载玻片在含有3％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％Tween20的4×SSC的100μl中于37℃放置10-20分钟进行封闭。然后将缓冲液用FITC-亲合素(0.5μg/ml，溶于4×SSC/1％BSA/0.1％Tween20)来替换，37℃30分钟。经过3次各5分钟的在2×SSC/0.1％Tween20中于45℃的洗涤后，通过加入生物素标记的羊抗-亲合素抗体层(5μg/ml)在37℃30分钟将杂交信号放大。为减少免疫学的非特异结合，在放大步骤前将载玻片在5％羊血清/2×SSC/3％BSA/0.1％Tween20中预温育10-20分钟。洗涤后，如前所述加入第二层的FITC-亲合素到载玻片上。为提高杂交信号的强度，如必要可进行第二轮的放大。然后将载玻片在2×SSC/0.1％Tween20中于45℃洗涤3次，并直接进行干燥。实施例7染色体R-带显带为同时看见染色体带和荧光信号，用染料色霉素A3和远端霉素A作为复染剂(Schweizer，Chromosoma58307-324(1976)；Schweizer，Hum.Genet571-14(1981)；及Magenis等，Hum.Genet69300-303(1985))。在最后的探测后在染色前立即将载玻片以Schweizer等所述的McIlavane缓冲液(pH8.5-9.0)(以蒸馏水1∶1进行稀释)进行漂洗。结果，将100μl的色霉素A3(0.5mg/ml，溶于1/2的McIlavane缓冲液pH8.5-9.0中)于暗中置于载玻片上室温下10分钟-1小时。所需的染色时间依赖于载玻片的新鲜程度；较新鲜的载玻片需要较长的染色时间，而老化的载玻片仅需要10分钟。经过第一轮的染色后，将载玻片在1/2的McIlavane缓冲液中漂洗1分钟，并将过量的液体甩掉。接下来通过将50μl的0.1mg/ml的远端霉素A置于载玻片上，并将其于室温温育1-2分钟，然后进行如上所述的漂洗而进行第二轮的染色。如果所用的DNA探针具有小的插入片段(即，预计产生微弱的信号)，在此，可用一薄层在磷酸盐缓冲液中含有对-苯二胺的抗褪色溶液将载玻片固定(Johnson等，J.Immunol.Methods43349-350(1981))。通过两轮的色霉素A3和远端霉素A染色所得到的图带分辨率最佳且褪色最小。另外，通过在探测步骤后立即染色，而不是迟后2-3天，可得最好的显带结果。染色后最好立即进行显微镜观察，对于小探针(1.0Kb-2.5Kb)不迟于3天而对于大探针(＞2.5-3Kb)不迟于1-2周。在用相差显微镜检查载玻片之前只需轻轻地复染。事实上，该显带技术的优点在于，如必要可在杂交之后的任何时候重复复染步骤以使染色体更明亮些。而且，在图像捕获后，用计算机化的系统，为使FITC杂交信号更清晰地被看见可选择性地将显带图谱漂白。实施例8显微术和照相术用ZeissAxiophot100或Axiovert135荧光显微镜(Zeiss，Inc，Thomwood，NY)观察载玻片。用400-490nm带通过的激发器、460nm二色，及470nm阻片(Zeiss滤器型号#05)来激发FITC和色霉素A3。杂交的片段显现为亮蓝绿色或亮黄绿色的圆点，而其余的染色体带显现为暗绿色。柯达技术的pan(ASA100)胶片用于黑白照相。用BDS(生物探测系统，Pittsburgh，PA)成像软件通过冷却的CCD照相机(PhotometricsCH250，PhotometricsLtd.，Tuscon，AZ)捕获彩色图像。实施例9cDNAs通过标准的小型制备培养物来获得cDNAs(Sambrook，J.等，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第二版(ColdSpringHarbor1989))。它们是从克隆在bluescript(Stratagene，LaJolla，CA)上的胎脑文库中随机分离并测序的。用FISH定位，定义了含有大于1Kb大小范围的插入片段的cDNA，所述cDNA包括表II和表III所示的那些与数据库匹配的序列。表2.新基因的FISH定位表3.通过FISH对座位图谱位置的证实/细化来源细胞(+)百分数基因符号/基因产物插入片段大小(Kb)以前或预测的图谱位置FISH的定位ATCC(*HGM)85C3/补体组分34.319p13.3-9p13.219p13.370F8VWF/vonWillebrand因子2.912pter-12p12+ps12p13.145HMGCR/3-羟基-3-甲基二酰基CoA还原酶4.35q13.3-5q14+ps5q13.315ASS/精氨琥珀酸合成酶1.59q34-9qter+ps9q34.1Venter等(#1)50MAP-1B/Neuraxin/微管相关蛋白1B1.85q135q1330醛缩酶A216q22-16q2416q22(主要)16q11(次要)25α-烯醇化酶1.51pter-1p36.31p36.320胶质细胞原纤维酸性蛋白质2.117q2117q21ATCC(*HGM)85C3/补体组份34.319p13.3-9p13.219p13.370F8VWF/vonWillebrand因子2.912pter-12p12+ps12p13.18谷氨酰胺酶2HSA2q32-q342q32Venter等(#2)45淀粉样蛋白前体样蛋白质1/APLP21.619q11-q1319q1230淀粉样蛋白前体样蛋白质2/APLP21.511q2611q25</table></tables></tables>实施例10定位单个基因通过对已知图谱分配的单个基因和已知为多基因或假基因家族成员的基因的定位能力来测试本发明的精确性。首先，以前已知或预测过图谱位置的15个基因的图谱位置得到了证实，并且所有的测试均在cDNA克隆的FISH分析的基础上得到相当的细化。关于单个基因的进一步的结果及其探测的敏感性在下面描述。对于多基因家族，定位转录基因位点的精确度由靶大小、同源程度、及可能的基因组重排决定。用该技术对由15个G-蛋白质α亚基组成的多基因家族(Wilkie等，NatureGenetics185-90(1992))进行定位，所有的人cDNA被独立地定位到由已知的小鼠同源性预测的区域。而且，尽管在Gai2和Gai3之间的核苷酸序列的同源性高达75％，任何cDNA均未观测到第二位点。用2.0Kb片段进行醛缩酶A的定位，不仅提高了分辨率而且在已知的与醛缩酶C有关的基因位点均未检测到次级信号，而在整个编码区其同源性将近74％(Costanzo等，1988)。这些数据提示对于在多基因家族内相似基因组重排的序列，既使是在有约75％的核苷酸同源性(高于已知多基因家族的大多数成员的同源性)，总体上相当于大约90％的蛋白质同源性存在的情况下，用本发明方法可定义单一的图谱位置。实施例11假基因信号的探测严谨试验作为对来自转录的对加工的假基因座位信号的可能的优选探测，用与14个加工的假基因家族相关的，精氨琥珀酸合成酶(AS)转录基因和cDNA描述本发明在信号间区分信号的能力。三个假基因在2139bp内具有(与表达序列)93.5％(AS1pl)、92.9％(ASp3)和89.4％(ASp7)的序列同源性。尽管如此同源，用1.5KbcDNA同AS杂交揭示在9q34.1，即转录座位出现信号的染色体(15％)，占200个细胞的比例最高，并且次级位点阳性的占细胞的3％(染色体6p21)和1％(7q32)，定义了假定的假基因座位。实施例12转录座位的探测在相关的假基因存在下探测转录座位时，在cDNA对pp52的定位中注意到了有趣的实例，人淋巴细胞特异的基因与在一个外显子内具有高于90％同源性的四个不同的基因组座位相关，而其中的三个可能为假基因(May等，1993)。虽然与座位相关的粘粒识别一个以上的座位，而且一些频率近于相等，但cDNA探针主要在染色体11p15.5，即转录座位产生信号。实施例13淀粉样蛋白质4-样基因的定位定位于19q13.1的淀粉样蛋白质前体蛋白质样基因(APLP1)，与迟发型家族性阿耳茨海默式病(AD2)间的潜在关系令人感兴趣。在21号染色体上的淀粉样蛋白质前体基因(APP)的突变与一种形式的家族性阿耳茨海默式病AD1相对应。Pericak-Vance等，Cytogenet.CellGenet.，58751(1991)已得到了AD2和在19q近端的几个标志连琐的证据。在这些家族中，受影响者仅在分析时使用，在近ATP1A3(19q13.2)和D19S13(19中心粒-13.1)得到了4.4的最大多点LOD值。虽然载脂蛋白E的基因，定位于19q13.2(端粒至APLP1)的等位基因APOE4的剂量增加，与AD2风险的增加有关，但认为，如Wasco等，Genomics，15237(1993)所建议的，该风险相关可能部分起因于与另一基因的连琐不平衡不是没有道理的，所述的另一基因可能是我们定位到该区域的APLP1基因。第二个APLP基因(命名为CDE-1-BP，因为它与酵母中心粒的一致性序列相结合)，定位于11q26，也令人感兴趣，但关于阿耳茨海默氏病其令人感兴趣的程度稍小，因为，尽管与APP同源性高，但目前没有任何遗传连琐的提示。尽管如此，这两个图谱位置对估测与家族性阿耳茨海默氏疾病有关的基因为那些与21号染色体和19号染色体无关的家族提供了候选座位(瑞典家族Lannfelt等，NatureGenetics，4218-219(1993)；和Volga德国家族Schellenberg等)。实施例14蛋白质磷酸酶2A，β-亚基的定位有相当多的证据证明蛋白质磷酸酶2A在细胞加工过程中起作用。这包括主要代谢途径的调控、翻译、转录、G2-M细胞周期转换、及肿瘤发生(参见Jones等，CytogenetCellGenet.6335-41(1993))。因此，将其图谱位置分配到染色体4P16.3为研究其在Wolf-Hirschhom综合症(WHS)(其特征为生长过度而智力迟钝)中的可能角色提供了直接的基因候选座位。在4P16.3关键区域缺失的2.5Mb的范围内用cDNA定位定位了蛋白质磷酸酶(Gandelman等，1992)。实施例15轴突糖蛋白(TAG-1/轴突蛋白1)的定位最近几年，已鉴定出细胞表面蛋白质如TAG-1在神经组织中表达，并认为在神经网络的发育过程中起至关重要的作用。人TAG-1/轴突蛋白已被独立地克隆，并发现其表达限制在正在发育的神经系统中的神经分化区域(Hasler等，Biochem211329-339(1993))。因此，将人TAG-1/轴突蛋白定位于染色体带1q32为VanderWotede综合症(裂唇/腭，下唇为粘液细胞)提供了令人感兴趣的基因候选座位，所述的综合症由该区域的缺失而引起。实施例16硫氰酸生成酶的定位作为为线粒体蛋白质编码的核基因，该基因在染色体22q13.1的图谱位置为研究其与以常染色体显性方式遗传的线粒体疾病之间的关系提供了基础。小鼠在此区域的突变是神经性的，并包括灰色震颤、摇摆及致盲，对于该基因而言所有的这些突变均会令人感兴趣。实施例17肌醇1、4、5三磷酸激酶的定位与肌肉的中央核疾病(CCO)连琐的19号染色体区域的图谱令人感兴趣(Mulley等，Am.J.ofHum.Genet52398-405(1993))。可用当前的连琐图及物理数据对此关系进行直接评估。实施例18钙调蛋白-依赖的βII型蛋白质激酶的座位虽然在染色体的7p13区域没有发生候选疾病，除钙调蛋白样序列外，该基因是在该区域被鉴定的第二或第三个蛋白质激酶(PRKAR1B)。实施例19Nod1膜运输超家族的定位该基因与参与结节形成的根瘤菌属基因具有高度的同源性，并与ATP-依赖的细菌运输蛋白有很强的同源性。提供了在6q21区域内少有的几个已知基因及其它两个神经受体中的一个。很明显具有如此高度保守序列的基因很可能参与重要的功能。实施例20多粘菌素B抗性蛋白质的定位该基因是与酵母具有很高同源性的可能的蛋白质激酶，定位于12q21，提供了最初已知的基因之一。实施例21AMP脱氨酶的定位该基因在能量代谢过程中起着至关重要的作用，定位于5q32，该区域是受体和与小鼠的区域具有同源性的人区域，所述的小鼠区域内已发现了神经学突变，包括Vt(退化尾，全垂体机能减退)、dt(侏儒突变)。实施例22cAMP-特异的磷酸二酯酶的定位与以前定义的人基因同源，此新基因定位于1P31-32，基因富含区，该基因是其族中被首先定位的基因。实施例23XPR2的定位碱性细胞外蛋白酶，定位于15q22，是定位于整条图带的第一个基因的代表。该成核区，提供了第一个定位的细胞外蛋白酶，并可能成为与15q22相关的染色体重排有关的关注点，而15q22相关的染色体重排与前髓细胞白血病有关。虽然结合公开的实施方案对本发明进行了描述，应理解为在不背离本发明精神的前提下可进行各种修改。权利要求1.将核酸序列定位到人染色体的单条带的做高分辨图的方法，所述的方法包括(a)用所述的核酸序列与人伸展的染色体杂交，其中所述的核酸序列是生物素标记的，(b)使杂交的伸展染色体与至少一种荧光标记及至少一种复染剂相接触，及(c)检测所述的核酸序列的存在，并确定其染色体带的位置。2.权利要求1的方法，其中所述的核酸序列为大约1Kb至大约1Mb。3.将cDNA和基因组探针定位到人染色体单条带座位的做高分辨图的方法，所述的方法包括原位荧光杂交和反带(R)显带。4.含有多种试剂的组合物，其中每种试剂均包含从人基因组中衍生的核酸序列，并且其中的每种试剂与染色体带的特异座位相对应。5.根据权利要求4的组合物，其中组合物内的所有试剂来自单条的染色体带。6.根据权利要求4的组合物，其中组合物内的所有试剂来自单条染色体。7.根据权利要求4的组合物，其中所述的试剂含有自中心粒衍生的核酸序列。8.根据权利要求4的组合物，其中所述的试剂含有自端粒衍生的核酸序列。9.根据权利要求4的组合物，其中组合物内的所有试剂均含有连续的cDNA。10.根据权利要求4的组合物，其中组合物内的所有试剂均为非嵌合体。11.根据权利要求10的组合物，其中所述的试剂为BACs。全文摘要按照本发明，高分辨的、快速而可重复的染色体显带方法已被建立起来。本发明方法能将基因精确定位到单条染色体图带上而不发生标记位移。根据本发明的另一实施方案，还提供了独特地识别物理基因组位置的DNA或cDNA探针。所述的试剂用于鉴定从特定的DNA序列衍生的染色体带。文档编号C12Q1/68GK1153535SQ95193054公开日1997年7月2日申请日期1995年5月9日优先权日1995年5月9日发明者朱利·R·科瑞恩伯格,陈晓宁申请人:塞达斯-西奈医疗中心