具有更低吸附性和更高水解能力的枯草溶菌素bpn’变异体的制作方法

专利名称：具有更低吸附性和更高水解能力的枯草溶菌素bpn’变异体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于多种清洁组合物的新型的酶变异体(variant)，以及编码这些酶变异体的基因。背景酶构成了天然存在的蛋白质的最大一类。每类酶一般说来催化(加速一个反应而自身并没有损耗)一个不同类别的化学反应。一类通称为蛋白酶的酶，因为其水解(通过在被切开的化学键的两侧吸收水分子的H和OH部分而将一个化合物分解成两个或多个更简单的化合物)其它蛋白的能力而为人所知。通过将天然存在的和蛋白质工程化的蛋白酶作为添加剂掺入洗涤清洁剂制备物，可以利用其水解蛋白的能力。衣物上的许多污物是蛋白质类的，许多特定的蛋白酶可以从根本上改善对这类污物的清除。
遗憾的是，这些蛋白在它们天然的、细菌环境中的功效水平往往不能转移至相对非天然的洗涤环境。具体地说，蛋白酶的特性例如热稳定性、pH稳定性、氧化稳定性和底物特异性，对于该酶在天然环境之外使用来说并非必须是最优的。
蛋白酶的氨基酸序列决定了该蛋白酶的特性。蛋白酶氨基酸序列的变化可以在不同程度上改变酶的性质，或者甚至可以使酶失活，这依赖于氨基酸序列中变化的位置、性质和/或重要性。有几种途径已被用来改变野生型蛋白酶的氨基酸序列，以改善它们的特性，其目标是提高这些蛋白酶在洗涤环境中的功效。这些途径包括改变氨基酸序列，以便在完全不同的条件下增强热稳定性和改善氧化稳定性。
尽管本领域中描述的途径多种多样，对于用作清洁各种表面的蛋白酶的新的有效变异体仍存在着持续的需求。本发明的目标本发明的目标之一是提供枯草溶菌素(subtilisin)酶变异体，它与野生型的酶相比水解能力得到了改善。
本发明的另一个目标是提供包含这些枯草溶菌素酶变异体的清洁组合物。概述本发明涉及枯草溶菌素BPN’的变异体，它具有野生型BPN’氨基酸序列的经修饰的氨基酸序列，该野生型氨基酸序列包括一个第一环状区、一个第二环状区、一个第三环状区、一个第四环状区和一个第五环状区；其中经修饰的氨基酸序列在一个或多个环状区中的特定位点，包含与存在于野生型枯草溶菌素BPN’中的不同的氨基酸(即取代)，由此，BPN’变异体与野生型枯草溶菌素BPN’相比，对不可溶的底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。本发明还涉及编码该枯草溶菌素BPN’变异体的基因。本发明还涉及用于清洁多种表面的包含该枯草溶菌素BPN’的组合物。说明I.枯草溶菌素变异体本发明涉及枯草溶菌素酶，特别是BPN’，通过使编码该酶的不同核苷酸序列突变来修饰该酶的氨基酸序列。与野生型枯草溶菌素相比，本发明的修饰过的枯草溶菌素酶(以下称作“‘BPN’变异体”)对于不可溶的底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。本发明还涉及编码该BPN’变异体的突变基因。
本发明的枯草溶菌素酶属于一类通称为蛋白酶的酶类。蛋白酶是使肽键断裂的催化剂。蛋白酶中的一类是丝氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以通过如下事实辨别在酶的活性部位有一个必需的丝氨酸残基。
酶水解可溶性底物的速率随酶浓度而增加，这一发现已经被充分地证明了。于是，对于表面结合的底物，例如在许多清洁应用中所碰到的，水解的速率随表面浓度的增加而增加的结论似乎是合情合理的。这已被证明是事实。(P.F.布鲁德III和D.S.罗奇，LANGMUIR，“枯草溶菌素BPN’固定化底物上的活性”，第8卷，1325-1329页(1992))。实际上，当酶的表面浓度不同时，对于不可溶底物的反应速率与表面浓度线性相关。(D.N.罗宾和M.D.波尔，“蛋白酶对蛋白-溶液界面水解反应的催化作用”，收录于《(聚合物溶液、混合体和界面》，由I.诺达和D.N.罗宾编著，艾尔斯韦尔，464页(1992))。令人惊异的是，当力图将研究中的原理应用于突变体蛋白酶以便得到更好的清洁效果时，我们并没有发现吸附较多的酶有更好的清洁效果。实际上，我们吃惊地确认事实是相反的酶对底物的更低的吸附性导致对底物的更多的水解(即更好的清洁效果)。
但是我们不愿被理论所束缚，当用一种变异体与其它的比较时，我们相信改善的效果来源于如下的事实吸附性较低的酶也结合得更不紧密，因此该酶在将被清除不可溶蛋白质的底物表面上有更大的移动性。在可比的酶溶液浓度上，这种增加移动性的优点足以超过任何通过向表面释放更高浓度的酶所带来的好处。
这里描述的突变是为了改变(即降低)酶对表面结合的污物的吸附性而设计的。在BPN’中，一定的氨基酸构成了酶分子的外环。出于讨论的目的，这些环将被称为第一、第二、第三、第四和第五环状区。具体地说，位点59-66构成第一环状区；位点95-107构成第二环状区；位点126-133构成第三环状区；位点154-167构成第四环状区；位点187-191构成第五环状区；位点199-220构成第六环状区(位点编号类似于野生型枯草溶菌素BPN’氨基酸序列(SEQ ID NO1)中的位置)。
我们相信这些环状区在酶分子对表面结合多肽的吸附性中起了极其重要的作用，并且在一个或多个这些环状区上的特异性突变将对吸附性具有显著的影响。但是我们不愿被理论所束缚，相信至少有两个原因使环状区对BPN’分子的吸附性是非常重要的第一，包含环状区的氨基酸可以与分子所暴露的任何表面紧密接触；第二，环状区与BPN’分子的活性部位和结合区的相似性，使它们在酶对表面结合底物(多肽/蛋白质污物)的催化性吸附方面有一定作用。
如此处所使用的，“变异体”表示一种酶，它具有与野生型不同的氨基酸序列。
如此处所使用的，“突变BPN’基因”表示编码BPN’变异体的基因。
如此处所使用的，“野生型枯草溶菌素BPN”指被SEQ ID NO1所描述的枯草溶菌素酶。枯草溶菌素BPN’的氨基酸序列被J.A.韦尔斯、E.费拉里、D.J.亨那、D.A.艾斯泰尔和E.Y.陈在《(核酸研究)》第II卷，7911-7925(1983)中进一步描述，在此引入作为参考。
如此处所使用的，术语“野生型氨基酸序列”包含SEQ ID NO1，同样也包含在除59-66，95-107，126-133，154-167，187-191和199-220任一个之外的任何位点的氨基酸序列被修饰的SEQ ID NO1。
如此处所使用的，“更加亲水的氨基酸”指参考下表中的亲水性，与所提到的氨基酸相比具有更高的亲水性的任何氨基酸。下面的亲水性表(表1)按照亲水性增加量的降序排列氨基酸(见T.P.霍普.和K.R.伍兹.，“从氨基酸序列预测蛋白质抗原决定簇”，美国国家科学院院刊，第78卷，3824-3828页，1981，在此引入作为参考)。
表1

表1还表明了哪种氨基酸带有电荷(这一特性是基于大约8-9的pH值)。带有正电荷的氨基酸是精氨酸和赖氨酸，带有负电荷的氨基酸是谷氨酸和天门冬氨酸，其它的氨基酸是中性的。在本发明的优选实施方案中，取代氨基酸是中性的或者是带负电荷的，更优选的是带有负电荷的(即谷氨酸或天门冬氨酸)。
因此，举例来说，“用中性的或带有负电荷的，与谷氨酰胺亲水性相同或更强的氨基酸取代谷氨酰胺”是指谷氨酰胺将被天门冬酰胺(它与谷氨酰胺有相同的亲水性)，或丝氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸(它们比谷氨酰胺亲水性更强)取代；其中的每一种氨基酸都是中性的或带有负电荷的，并且与谷氨酰胺相比具有更高的亲水性值。类似的，“用中性的或带有负电荷的，与脯氨酸相比亲水性更强的氨基酸取代脯氨酸”是指脯氨酸将被谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、谷氨酸或天门冬氨酸取代。
在本发明的一个实施方案中，BPN’变异体具有一个野生型氨基酸序列的修饰的氨基酸序列，其中修饰的氨基酸序列包含一个位于第一、第二、第三、第四或第五环状区中一个或多个位置的取代；通过该取代，BPN’变异体与野生型枯草溶菌素BPN’相比，对于不可溶底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。
在本发明的另一个实施方案中，BPN’变异体还包含一个或多个位于第六环状区的取代。
在本发明优选的实施方案中，位于一个或多个环状区的一个或多个位点的取代氨基酸参照表1，是中性的或带有负电荷的，并且与野生型氨基酸序列主体位点的氨基酸相比，亲水性相同或更强，优选的是亲水性更强的。A.位于第一环状区的取代当取代发生在第一环状区时，该取代发生在位点59、60、61、62、63、65或66中的一个或多个位点。
当取代发生在位点59时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点60时，取代氨基酸是谷氨酸。
当取代发生在位点61时，取代氨基酸是天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点62时，取代氨基酸是天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点63时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点65时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点66时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸。B.位于第二环状区的取代当取代发生在第二环状区时，该取代发生在位点95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或107中的一个或多个位点。
当取代发生在位点95时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
当取代发生在位点96时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
当取代发生在位点97时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点98时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
当取代发生在位点99时，取代氨基酸是谷氨酸。
当取代发生在位点100时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点101时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点102时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点103时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点104时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
当取代发生在位点105时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点106时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或缬氨酸。
当取代发生在位点107时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。C.位于第三环状区的取代当取代发生在第三环状区时，该取代发生在位点126、127、128、129、130、131、132或133中的一个或多个位点。
当取代发生在位点126时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
当取代发生在位点127时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点128时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点129时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点130时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点131时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点132时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点133时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。D.位于第四环状区的取代当取代发生在第四环状区时，该取代发生在位点154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166或167中的一个或多个位点。
当取代发生在位点154时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点155时，取代氨基酸是天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点156时，取代氨基酸是天门冬氨酸。
当取代发生在位点157时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点158时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点159时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点160时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点161时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点162时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点163时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点164时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点165时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
当取代发生在位点166时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸。
当取代发生在位点167时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。E.位于第五环状区的取代当取代发生在第五环状区时，该取代发生在位点187、188、189、190或191中的一个或多个位点。
当取代发生在位点187时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
当取代发生在位点188时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点189时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或缬氨酸。
当取代发生在位点190时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点191时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。F.位于第六环状区的取代当取代发生在第六环状区时，该取代发生在位点199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或220中的一个或多个位点。
当取代发生在位点199时，取代199位的氨基酸是半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点200时，取代200位的氨基酸是组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点201时，取代201位的氨基酸是甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点202时，取代202位的氨基酸是脯氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点203时，取代203位的氨基酸是甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点204时，取代204位的氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点205时，取代205位的氨基酸是亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点206时，取代206位的氨基酸是脯氨酸、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点207时，取代207位的氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点208时，取代208位的氨基酸是脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点209时，取代209位的氨基酸是异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点210时，取代210位的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点211时，取代211位的氨基酸是脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点212时，取代212位的氨基酸是谷氨酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点213时，取代213位的氨基酸是色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点214时，取代214位的氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点215时，取代215位的氨基酸是苏氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点216时，取代216位的氨基酸是组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点217时，取代217位的氨基酸是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点218时，取代218位的氨基酸是谷氨酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点219时，取代219位的氨基酸是脯氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
当取代发生在位点220时，取代220位的氨基酸是脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。G.酶变异体的制备实施例1变异的BPN’基因包含野生型枯草溶菌素BPN’基因的噬菌体质粒(pSS-5)(C.米钦森和J.A韦尔斯，(1989)，“枯草溶菌素BPN’中二硫键的蛋白质工程”，《生物化学》，第28卷，4807-4815页)被转化至大肠杆菌ung株CJ236内，并且使用VCSM13助手噬菌体生成一个单链的包含尿嘧啶的DNA模板(T.A.库克尔，J.D.罗勃兹和R.A.扎库，“不用表型选择的快速、有效的位点特异性突变”，《(酶学方法》第154卷，367-382页，(1987)；被P.D.约肯伯格、F.惠特尼、J.盖思索德和J.迈可克来所修改，“使用包含尿嘧啶的DNA和噬菌体质粒载体的位点特异性的体外突变”，收录于《特异性突变-一种实施方案》，由M.J.迈克佛森编著，第27-48页，(1991)；二者均在此引入作为参考)。使用采莱和史密斯的单链引物位点特异性的基因突变修饰的方法(M.J.采莱、和M.史密斯，“使用M13衍生载体的寡聚核苷酸特异性突变在DNA任何片段中产生点突变的有效的和通用的过程”，收录于《核酸研究》第10卷，第6487-6500页，(1982)，在此引入作为参考)生成所有的突变体(基本上如上文中约肯伯格等人所介绍，1991)。寡聚核苷酸的使用应用生物系统公司380B DNA合成仪生成。基因突变反应产物被转化至大肠杆菌株MM294内(美洲型培养收集物大肠杆菌33625)。所有的突变体都通过DNA测序确认，并且分离出的DNA被转化至枯草杆菌表达株BG2036中(M.Y.扬、E.费拉里和D.J.亨那，(1984)，“枯草杆菌核蛋白酶基因的克隆以及使用克隆的基因在体外产生缺陷型突变”，收录于《微生物学杂志》第160卷，15-21页)。对某些突变体，尿嘧啶模板是使用框架终止密码子突变的修饰过的pSS-5来产生，该突变位于氨基酸217位。寡聚核苷酸被设计为在217位恢复正常的阅读框架，并且还编码位于59、60、61、62、63、64、65、66；95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107；126、127、128、129、130、131、132、133；154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167；187、188、189、191、191；199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219和220位的随机取代(在这些密码子上，用来编码三个碱基的所有四种核苷酸的等克分子量的和/或不相等的混合物)。改正框架终止子并能够生成功能性酶的突变被它们消化酪蛋白的能力所鉴别。随机取代由DNA测序所确定。实施例2发酵包含枯草溶菌素有益突变的枯草杆菌细胞(BE2036)在1升的LB-葡萄糖培养基培养基中生长至中对数期，然后接种至总体积为10升的BiostatED发酵器中(B.布劳恩生物技术公司，艾伦镇，宾夕法尼亚)。发酵介质包含酵母提取物、淀粉、消泡剂、缓冲液和痕量矿物质(见《发酵一种实施方案》，B.迈克尼尔和L.M.哈韦编著，1990)。在发酵过程中，培养基的pH值恒定保持在7.0。加入氯霉素用于对突变质粒的抗生素筛选。细胞在37℃生长过夜至A600达到约60，然后收获。实施例3纯化发酵培养基经过如下的步骤来获取纯化的酶。培养基通过离心清除枯草杆菌细胞，用一个100K的隔断膜除去细小的微粒而获澄清。之后在一个10K的隔断膜上离心，然后用0.025M的MES缓冲液(2-(N-吗啉)乙烷磺酸)进行流动透析以降低离子强度并将pH值调至5.5。将酶加于阳离子交换层析柱或者亲和吸附层析柱进行进一步纯化，用氯化钠或丙烯乙二醇梯度液从层析柱上将酶洗脱(见R.K.司寇普思，《蛋白质纯化原理和实践》，斯普林格-弗拉格，纽约(1984)，此处作为文献引用)。
pNA检测法(E.G.德尔玛、C.拉格曼、J.W.布鲁德里克和M.C.乔卡斯，《分析生物化学》第99卷，316-320页，(1979)，此处作为文献引用)被用来测定在梯度洗脱过程中所收集的分部中的活性酶的浓度。该方法测量的是当酶水解可溶性合成底物——琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-p-肖基苯胺(sAAPF-pNA)时硝基苯胺释放的速率。水解反应所产生的黄颜色的速率用分光光度计在410nm测量，它于活性酶的浓度成比例。另外，在280nm的吸收度测量用于测定总蛋白浓度。活性酶/总蛋白比率给出了酶的纯度，并且用于鉴别将被合并作为贮存液的分部。
为了避免在贮存过程中酶的自我分解，在从层析柱上收获的合并分部中加入等重量的丙烯乙二醇。纯化步骤一旦结束，就用SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测酶贮液的纯度，并且通过使用II-T型酪氨酸抑制剂的活性位点滴定法测定绝对酶浓度，该抑制剂是从西格玛化学公司购买的火鸡蛋清(圣路易斯，密苏里州)。测量出的转换因子将表明在酶分子不同位点的哪一种变化导致的酶变异体比野生型的酶对可溶性底物pNA具有更高的活性。
在使用前的准备中，酶贮液要经过Sephadex-G25(法玛西亚公司，匹兹堡，新泽西州)分子大小分离柱洗脱以去除丙烯乙二醇并转换缓冲液。酶贮液中的MES缓冲液被转换成0.1M的包含0.01M CaCl2的Tris缓冲液(三(羟甲基氨基甲烷)，并且pH值用HCl调至8.6。所有的实验都是在恒温25℃时，pH值8.6的Tris缓冲液中进行的。H.酶变异体的特性实施例4模型表面制备从CPG公司(法菲尔德，新泽西州)购买的氨丙基控制的多孔玻璃(CPG)被用于共价结合从比切姆公司(托伦斯，加里福尼亚)购买的sAAPF-pNA底物。反应进行于二甲亚砜中，(1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐)(EDC)作为偶联试剂。完成之后(用pNA检测法监控)，除去多余的溶剂，CPGsAAPF-pNA用二甲亚砜(DMSO)和双蒸水清洗。随后用N2净化的烘箱在70℃左右干燥。反应方案和固定底物的制备如P.F.布鲁德III和D.S.罗奇，“枯草溶菌素BPN’固定化底物上的活性”，拉格缪，第8卷，1325-1329页，(1992)描述所进行，此处作为文献引用。
CPG表面将拥有62,000+7,000个pNA分子/μm2。与收到的CPG公司报告的CPG的表面区域的值50.0m2/g相比，保持不变。这表明加入sAAPF-pNA的过程没有损坏多孔结构(平均直径为486A)。实施例5表面水解检测法通过使用CPGsAAPF-pNA，对酶变异体的吸附和结合CPG的多肽的水解可以在一个简单的实验中测量。取少量的酶变异体加入除气的含有CPGsAAPF-pNA的烧瓶中。烧瓶放于腕状动作摇床上振摇90分钟，在此期间，摇床于不同的时间间隔停止(例如，在吸附水解的早期阶段-如前20分钟，每2分钟-在接近实验结束的阶段每10分钟)。CPGsAAPF-pNA可以下沉，在澄清液中取样。实验步骤和吸附及水解的计算方法如上述Brodeet al.，1992描述所进行。
在本实验的过程中，监控所有的酶抗自我分解的稳定性，并且不应显示有可觉察的自我分解损失。因此，酶的吸附可以通过测量溶液的消耗来检测。最初的酶变异体的浓度与在每个独立的时间点测量的浓度之差给出酶变异体被吸附的量。pNA从表面被水解的量通过读取样品在410nm的吸收度的整数部分来测量。pNA的总量是通过计算将取样的量与残留在烧瓶中的量相加得出。该值通过减去没有酶时pNA被Tris缓冲液水解的量来修正。基本水解量占总水解量的比例随酶的效率的不同而在7-29％的范围内变化。实施例6可溶性底物的动力学分析可溶性底物sAAPF-pNA的水解的速率通过在DU-70分光光度计上测量410nm处光吸收度随时间的增加值来检测。每次动力学测定，当底物浓度从90-700μM sAAPF-pNA变化时，酶浓度保持不变，在6-10纳摩尔之间。在900秒的时间内，每秒取一个吸收度数据点，并且这些数据被转换成一个LOTUSTM表单(LOTUS开发公司，剑桥，马萨诸塞州)。动力学常数的分析是通过执行标准的兰唯沃·布克分析法进行的，该法将实验初始部分(通常是第一分钟)的数据拟合成线性复原曲线而得出v0值。用v0和s0数据按标准倒数法绘图得出KM和kcat值。I.BPN’变异体举例本发明的对表面结合的底物具有更低的吸附性和更高的水解能力的枯草溶菌素BPN’变异体示例于如下的表2-25。在描述特定突变时，野生型的原始氨基酸列在第一，位点号列在第二，取代氨基酸在第三。
表2第一环状区——单突变变异体Gln59AsnGln59AspGln59GluGln59SerAsp60GluAsn61AspAsn61GlnAsn61GluAsn61SerAsn62AspAsn62GlnAsn62GluAsn62SerSer63AspSer63GluGly65AsnGly65AspGly65GlnGly65GluGly65ProGly65SerThr66AsnThr66AspThr66GlnThr66GluThr66GlyThr66ProThr66Ser
表3第一环状区——双突变变异体Gln59Ser + Asn62GluAsp60Glu + Asn61SerAsn61Glu + Asn62SerGln59Ser + Gly65GlnAsn61Gln + Gly65AsnAsn61Ser + Asn62AspGln59Glu + Asn61GlnAsp60Glu + Gly65GlnGln59Asp + Gly65ProAsn61Asp + Gly65AsnGln59Ser + Asn62AspGln59Asn + Gly65GlnAsn62Asp + Thr66GlyGln59Asn + Asn62GluAsn61Ser + Ser63GluGln59Ser + Asp60GluAsp60Glu + Thr66GlnAsn61Glu + Thr66GlyAsp60Glu + Asn62GlnAsn62Gln + Gly65ProAsn61Ser + Thr66SerAsp60Glu + Gly65ProSer63Glu + Gly65ProAsp60Glu + Thr66SerGln59Ser + Asn61GluAsn62Asp + Gly65GlnAsn61Gln + Ser63AspGln59Asp + Gly65AsnSer63Asp + Thr66ProSer63Glu + Thr66AsnAsn62Glu + Thr66AsnAsn61Asp + Gly65SerGly65Pro + Thr66SerGln59Ser + Asn62SerAsp60Glu + Gly65SerSer63Asp + Gly65SerAsn61Gln + Ser63GluAsn61Asp + Asn62SerGln59Glu + Gly65ProGln59Ser + Asn61AspGln59Asp + Asn62SerGln59Asn + Gly65SerSer63Glu + Thr66SerAsn61Ser + Ser63AspAsn62Ser + Gly65Pro
表4第一环状区——三突变变异体Gln59Ser + Ser63Asp + Gly65ProAsn62Gln + Gly65Ser + Thr66AspGln59Ser + Asp60Glu + Thr66GlnGln59Asn + Ser63Glu + Thr66ProAsn61Ser + Gly65Asn + Thr66GluSer63Glu + Gly65Ser + Thr66AsnAsn62Asp + Gly65Ser + Thr66GlyGln59Ser + Asn62Asp + Thr66ProGln59Ser + Asp60Glu + Asn61GlnAsn61Gln + Ser63Asp + Gly65SerAsn62Glu + Gly65Asn + Thr66GlnAsp60Glu + Gly65Asn + Thr66SerAsn62Ser + Ser63Asp + Thr66GlnGln59Asp + Asn62Gln + Gly65ProAsn62Ser + Ser63Glu + Thr66GlyAsn61Asp + Asn62Ser + Gly65AsnAsp60Glu + Asn61Gln + Asn62SerAsp60Glu + Asn61Gln + Gly65SerAsp60Glu + Gly65Pro + Thr66AsnGln59Ser + Asn61Glu + Asn62AspAsn61Asp + Asn62Asp + Gly65ProAsn61Glu + Asn62Glu + Thr66GlnGln59Asp + Asp60Glu + Thr66GlnGln59Asp + Asp60Glu + Thr66ProAsn62Asp + Ser63Asp + Gly65AsnAsn62Glu + Ser63Glu + Gly65AsnAsn62Asp + Ser63Glu + Gly65GlnGln59Ser + Asn62Asp + Ser63GluAsn62Glu + Ser63Asp + Gly65SerAsn61Asp + Asn62Asp + Ser63GluGln59Glu + Asp60Glu + Asn61GluAsp60Glu + Asn62Glu + Ser63AspAsp60Glu + Asn61Glu + Ser63GluGln59Ser + Asp60Glu + Asn62Glu表5第一环状区——四突变变异体Gln59Ser + Asp60Glu + Gly65Gln + Thr66GlnGln59Ser + Asn62Ser + Ser63Asp + Gly65GlnAsp60Glu + Asn62Ser + Gly65Pro + Thr66GlnAsn62Gln + Ser63Glu + Gly65Pro + Thr66GlnAsn61Gln + Asn62Gln + Ser63Asp + Gly65ProGln59Asn + Asp60Glu + Asn61Gln + Gly65AsnGln59Glu + Asn62Ser + Gly65Pro + Thr66Ser
Gln59Asn + Asn61Asp + Asn62Asp + Thr66AsnGln59Asp + Asp60Glu + Asn62Ser + Gly65SerAsn61Gln + Asn62Asp + Ser63Glu + Thr66GlnAsp60Glu + Asn61Asp + Asn62Glu + Gly65SerAsn61Asp + Asn62Glu + Ser63Glu + Thr66SerAsn61Asp + Asn62Glu + Ser63Asp + Gly65SerGln59Glu + Asp60Glu + Asn61Asp + Gly65SerAsp60Glu + Asn62Asp + Ser63Glu + Thr66ProAsp60Glu + Asn62Glu + Ser63Glu + Thr66AsnAsp60Glu + Asn62Glu + Ser63Asp + Gly65SerAsp60Glu + Asn61Asp + Ser63Glu + Thr66AsnGln59Ser + Asp60Glu + Asn61Asp + Ser63AspAsp60Glu + Asn61Asp + Ser63Asp + Gly65ProAsp60Glu + Asn61Asp + Ser63Asp + Thr66GlyAsp60Glu + Asn61Asp + Ser63Glu + Gly65AsnGln59Ser + Asp60Glu + Asn62Asp + Thr66GlyAsp60Glu + Asn62Asp + Gly65Ser + Thr66ProAsp60Glu + Asn61Gln + Asn62Glu + Gly65SerGln59Ser + Asp60Glu + Asn62Asp + Gly65GlnAsp60Glu + Asn61Ser + Asn62Gln + Ser63GluAsp60Glu + Asn61Ser + Ser63Asp + Thr66ProGln59Ser + Asp60Glu + Asn61Gln + Ser63GluAsp60Glu + Ser63Glu + Gly65Ser + Thr66AsnGln59Asn + Asp60Glu + Ser63Asp + Gly65GlnAsp60Glu + Ser63Glu + Gly65Pro + Thr66Ser表6第二环状区——单突变变异体Val95AlaVal95AsnVal95AspVal95CysVal95GlnVal95GluVal95GlyVal95HisVal95MetVal95ProVal95SerVal95ThrLeu96AlaLeu96AsnLeu96AspLeu96CysLeu96GlnLeu96GluLeu96GlyLeu96HisLeu96Ile
Leu96MetLeu96ProLeu96SerLeu96ThrLeu96ValGly97AsnGly97AspGly97GlnGly97GluGly97ProGly97SerAla98AsnAla98AspAla98GlnAla98GluAla98GlyAla98HisAla98ProAla98SerAla98ThrAsp99GluGly100AsnGly100AspGly100GlnGly100GluGly100ProGly100SerSer101AspSer101GluGly102AsnGly102AspGly102GlnGly102GluGly102ProGly102SerGln103AsnGln103AspGln103GluGln103SerTyr104AlaTyr104AsnTyr104AspTyr104CysTyr104GlnTyr104GluTyr104GlyTyr104HisTyr104IleTyr104LeuTyr104Met
Tyr104ProTyr104SerTyr104ThrTyr104ValSer105AspSer105GluTrp106AlaTrp106AsnTrp106AspTrp106CysTrp106GlnTrp106GluTrp106GlyTrp106HisTrp106IleTrp106LeuTrp106MetTrp106PheTrp106ProTrp106SerTrp106ThrTrp106TyrTrp106ValIle107AlaIle107AsnIle107AspIle107CysIle107GlnIle107GluIle107GlyIle107HisIle107LeuIle107MetIle107ProIle107SerIle107ThrIle107Val表7第二环状区——双突变变异体Val 95Gln + Ser101GluGly 97Ser + Gly100GlnSer105Glu + Trp106GlyAsp 99Glu + Gln103AsnAla 98Gln + Trp106ThrGly 97Asp + Ile107ThrGly100Ser + Gly102GlnLeu 96Ser + Ser101GluAsp 99Glu + Ile107Ala
Leu 96Asn + Asp 99GluGly102Gln + Trp106AspTyr104Leu + Trp106GluTyr104Pro + Ile107AspGly 97Ser + Ser101AspGly100Pro + Ser101GluVal 95Asn + Ala 98AspVal 95Met + Ilel07GlyAsp 99Glu + Trp106CysGly100Asn + Trp106ThrGln103Ser + Trp106ProGly102Asp + Gln103SerGly102Ser + Trp106GlnSer101Asp + Gly102ProLeu 96Cys + Trp106AspAsp 99Glu + Gly102SerGly102Asp + Trp106ValGly 97Ser + Trp106PheGln103Asp + Tyr104ThrAla 98His + Gly100GlnSer105Glu + Trp106LeuLeu 96His + Tyr104ThrGly 97Pro + Ser101GluVal 95Thr + Trp106IleGly100Asp + Tyrl04IleVal 95Pro + Gln103AsnGln103Asn + Trp106IleAla 98His + Gly102ProTrp106Asn + Ile107HisVal 95Gln + Leu 96AspGly 97Asp + Ala 98GlnGly100Ser + Ser101GluVal 95Asp + Tyr104GlyTyr104Ala + Ser105AspGly100Pro + Ser105GluLeu 96Cys + Tyr104LeuVal 95Gly + Gly100SerGly102Gln + Tyr104SerAla 98Gly + Trp106PheGly100Asp + Trp106PheVal 95Glu + Ala 98GlnSer101Glu + Tyr104AsnLeu 96Val + Ser101AspGly102Glu + Gln103AsnGly102Glu + Trp106GlyAla 98Gln + Gly100AspGly100Gln + Gln103SerGly 97Glu + Tyr104LeuSer101Asp + Gly102SerAla 98His + Ser101Asp
Gly 97Asp + Gln103Asn表8第二环状区——三突变变异体Val 95Gln + Leu 96Thr + Ser101GluAla 98His + Gln103Glu + Trp106CysAla 98Gln + Ser101Glu + Tyr104MerSer101Asp + Gln103Ser + Ile107CysAla 98Pro + Asp 99Glu + Gly102ProVal 95Pro + Gly 97Glu + Gly100GlnSer101Glu + Gly102Pro + Ile107HisLeu 96Pro + Gly100Pro + Gly102AsnGly100Glu + Gly102Asn + Trp106TyrAla 98Asn + Gln103Glu + Ile107SerGly 97Pro + Gly100Asp + Trp106MetGln103Asn + Tyr104Leu + Ser105AspGly 97Pro + Ala 98Gln + Tyr104CysAla 98Gly + Gly100Glu + Gln103SerLeu 96Ile + Gly 97Pro + Ser105AspAla 98Pro + Gly100Pro + Ile107AlaVal 95Pro + Gln103Asp + Ile107MetVal 95Gln + Ser101Glu + Trp106PheLeu 96Val + Ser101Glu + Ile107ProLeu 96Gly + Gly 97Glu + Trp106ThrGly 97Asp + Tyr104Ser + Trp106HisGly 97Ser + Gly100Pro + Tyr104CysGln103Ser + Ser105Asp + Ile107HisAla 98Glu + Tyr104Cys + Trp106PheVal 95Gln + Gly100Pro + Gly102SerVal 95Ala + Gly102Asp + Tyr104SerVal 95Ala + Leu 96Met + Ser105AspGly102Gln + Trp106Leu + Ile107GlyLeu 96Asn + Gly 97Glu + Ile107ProGly100Pro + Gly102Gln + Gln103GluGly 97Asp + Ala 98Asn + Trp106LeuAla 98Gln + Gly100Pro + Trp106HisLeu 96Thr + Gly100Asn + Ser105GluVal 95Ser + Leu 96Asn + Gly 97ProGly100Gln + Ser105Glu + Trp106GlnGly 97Glu + Tyr104Thr + Trp106ValLeu 96Ala + Ala 98Gln + Gly100GluVal 95His + Gly 97Gln + Ser101GluVal 95Pro + Gly102Asn + Gln103GluGln103Asn + Trp106Ile + Ile107AlaGly 97Ser + Ala 98Glu + Tyr104GlnVal 95Glu + Leu 96Ile + Ile107GlnLeu 96Gln + Ala 98Ser + Asp 99GluLeu 96Pro + Ser101Glu + Gly102ProGly 97Asn + Ala 98Pro + Gly100Pro
Gly 97Asn + Ala 98Glu + Gly100AsnGly102Pro + Trp106Ala + Ile107ProGly100Ser + Gly102Glu + Trp106CysLeu 96Thr + Gly102Glu + Ile107ValLeu 96Cys + Trp106Leu + Ile107ProLeu 96Thr + Ser105Glu + Trp106TyrLeu 96Ala + Gly100Asp + Ser101AspGly 97Asn + Ser101Glu + Gly102AspVal 95Gln + Ser101Asp + Gly102AspAsp 99Glu + Gly100Asp + Trp106PheTyr104Glu + Ser105Asp + Ile107AspLeu 96Glu + Ser101Glu + Trp106ValTyr104Met + Ser105Asp + Ile107AspGly 97Asp + Gly100Asp + Trp106ProVal 95Ala + Gly 97Asp + Asp 99Glu表9第二环状区——四突变变异体Leu 96Gln + Gly 97Ser + Ser101Glu + Trp106ValVal 95Ala + Ala 98Gln + Gly100Asn + Gln103AspVal 95Gln + Tyr104Ile + Trp106Gly + Ile107ProVal 95Met + Leu 96Gly + Gly100Pro + Trp106GlyAla 98Gln + Gly100Pro + Tyr104Thr + Trp106HisGly 97Pro + Ala 98His + Gly100Pro + Ile107AspAla 98Pro + Gly100Glu + Trp106Ser + Ile107MetLeu 96Gln + Gly 97Ser + Ser105Asp + Ile107ValAla 98Gly + Ser101Asp + Trpl06Ala + Ile107GlnVal 95Ser + Gly 97Ser + Asp 99Glu + Gln103SerLeu 96Thr + Gly 97Ser + Asp 99Glu + Tyr104AsnVal 95Thr + Leu 96Gln + Ala 98Pro + Ser105GluVal 95Gly + Gly 97Ser + Tyr104Asn + Trp106GluLeu 96Gln + Gly 97Ser + Tyr104Thr + Ile107GluVal 95Ser + Leu 96Pro + Gly100Gln + Ser101AspLeu 96Met + Gly100Ser + Ser101Asp + Trp106AsnLeu 96Ile + Ala 98Ser + Gly100Pro + Gly102GluVal 95Asn + Ala 98Gly + Gln103Ser + Tyr104ValGly 97Asn + Asp 99Glu + Gly102Asn + Trp106HisGly 97Ser + Gly102Asp + Gln103Asp + Ile107HisVal 95Pro + Gly100Glu + Ser101Glu + Tyr104GlyAla 98Pro + Gly100Asp + Ser101Asp + Ile107CysLeu 96Gly + Ser101Asp + Gly102Asp + Ile107GlyVal 95His + Tyr104Asp + Ser105Asp + Trp106AlaGly102Pro + Ser105Asp + Trp106Asp + Ile107ThrLeu 96Glu + Ala 98Gln + Gly102Asp + Tyr104ProAla 98Thr + Asp 99Glu + Gly100Glu + Ser101GluGly 97Ser + Ala 98Glu + Asp 99Glu + Gly100GluLeu 96Asp + Gly 97Glu + Gly100Glu + Ile107AsnLeu 96Asn + Gly100Asp + Ser101Asp + Gly102GluVal 95Gly + Ser101Glu + Gly102Asp + Gln103Asp
Val 95His + Leu 96Glu + Gly100Gln + Ser101GluLeu 96Glu + Gly100Gln + Ser101Asp + Gly102SerGly 97Asp + Gly100Asp + Gly102Pro + Ile107GlyGly 97Glu + Asp 99Glu + Gly100Pro + Tyr104SerLeu 96Ile + Gly 97Gln + Gln103Glu + Ser105GluGln103Asp + Ser105Asp + Trp106Asn + Ile107HisVal 95Pro + Ala 98Pro + Gln103Glu + Ser105AspVal 95His + Asp 99Glu + Ser101Glu + Gly102ProLeu 96Asn + Asp 99Glu + Gly100Asn + Ser101GluAla 98Asp + Asp 99Glu + Ser101Asp + Ile107ProLeu 96Thr + Gly 97Glu + Gly100Glu + Gly102AspVal 95Glu + Gly102Asp + Tyr104Ser + Ile107GluLeu 96Gly + Gly102Asp + Gln103Asp + Ser105GluGly102Glu + Gln103Glu + Ser105Glu + Trp106CysAsp 99Glu + Ser101Glu + Gly102Glu + Gln103AsnAsp 99Glu + Ser101Glu + Gly102Glu + Trp106GlyGly102Glu + Gln103Asn + Tyr104Asp + Ile107ThrVal 95His + Leu 96Val + Gln103Glu + Ile107GluGly 97Ser + Gly102Ser + Gln103Glu + Ile107GluVal 95Glu + Leu 96Asp + Gln103Asp + Ile107AsnVal 95Thr + Gly102Glu + Trp106Tyr + Ile107AspVal 95Glu + Gly 97Glu + Ala 98Gly + Gly100AspLeu 96Ala + Gly 97Pro + Ala 98Asp + Ser101AspVal 95Asp + Leu 96Asp + Tyr104Glu + Ile107SerVal 95Pro + Gly102Glu + Tyr104Pro + Ser105AspLeu 96Asn + Gly102Asp + Gln103Asn + Ser105GluLeu 96Asn + Gly102Asp + Tyr104Ala + Ser105GluLeu 96Ser + Gly 97Gln + Gly102Glu + Ser105AspLeu 96Thr + Asp 99Glu + Gly102Asp + Ile107Gly表10第三环状区——单突变变异体Leu126AlaLeu126AsnLeu126AspLeu126CysLeu126GlnLeu126GluLeu126GlyLeu126HisLeu126IleLeu126MetLeu126ProLeu126SerLeu126ThrLeu126ValGly127AsnGly127AspGly127Gln
Gly127GluGly127ProGly127SerGly128AsnGly128AspGly128GlnGly128GluGly128ProGly128SerPro129AsnPro129AspPro129GlnPro129GluPro129GlyPro129SerSerl30AspSer130GluGly131AsnGly131AspGly131GlnGly131GluGly131ProGly131SerSer132AspSer132GluAla133AsnAla133AspAla133GlnAla133GluAla133GlyAla133HisAla133ProAla133SerAla133Thr表11第三环状区——双突变变异体Leu126Gln + Ser130GluGly131Gln + Ala133AsnPro129Asp + Gly131GlnGly128Ser + Ser130GluLeu126Pro + Ala133GlyGly127Asp + Ala133GlyLeu126Asp + Pro129GlnGly131Asn + Ala133GlnGly127Pro + Gly131GluGly128Asn + Gly131AspPro129Gln + Ser130GluGly128Pro + Ser130Asp
Gly128Gln + Pro129SerGly128Asn + Pro129GlyLeu126Val + Ser130AspLeu126Val + Pro129SerLeu126Cys + Pro129GluGly127Asp + Ala133ThrGly128Pro + Pro129GluGly127Ser + Gly131AspLeu126His + Pro129AspGly131Pro + Ala133GluGly127Ser + Gly128SerPro129Asn + Gly131GluLeu126Val + Pro129AspPro129Gly + Ala133AspLeu126Val + Ser130GluPro129Glu + Ala133ProPro129Gly + Ser130AspLeu126His + Gly128GluGly128Asn + Ser132GluGly127Pro + Ser132AspGly127Gln + Pro129GlnGly128Pro + Pro129AspGly128Asn + Ser130GluLeu126Cys + Pro129AsnPro129Asn + Ser132GluLeu126Ser + Ser132AspGly128Glu + Gly131SerPro129Asn + Ser130AspLeu126Ser + Ser132GluPro129Gln + Gly131ProGly127Asp + Gly128GlnGly128Gln + Pro129GluGly127Pro + Pro129GlyPro129Gln + Ala133GlnLeu126Val + Gly128AspGly128Ser + Ser132GluLeu126Asn + Pro129GlyLeu126Ile + Ala133GlyGly128Ser + Gly131GlnGly127Ser + Ser130AspLeu126Cys + Ser132AspGly127Pro + Ser130GluLeu126His + Ala133AspGly131Ser + Ala133GluGly131Pro + Ala133GlnGly131Asp + Ala133SerLeu126Asp + Ala133AsnLeu126Glu + Pro129Gln
表12第三环状区——三突变变异体Leu126His + Pro129Glu + Ala133AsnLeu126Asp + Gly128Ser + Gly131GlnPro129Asn + Gly131Ser + Ser132GluGly128Pro + Pro129Asn + Ser130GluGly128Gln + Ser130Glu + Ala133SerGly131Gln + Ser132Glu + Ala133GlnGly128Asp + Gly131Ser + Ala133AsnGly131Ser + Ser132Asp + Ala133ProPro129Ser + Glyl31Gln + Ala133GluGly128Asn + Ser130Glu + Gly131GlnLeu126Gly + Gly127Gln + Gly131ProLeu126Pro + Gly127Glu + Gly128ProLeu126Ser + Pro129Ser + Ser132AspGly128Ser + Ser132Glu + Ala133AsnLeu126Val + Ser132Glu + Ala133GlnPro129Gly + Ser130Glu + Gly131ProLeu126Thr + Gly127Pro + Ala133AsnLeu126His + Ser130Asp + Ala133ProLeu126Cys + Gly127Ser + Pro129SerLeu126Gly + Ser132Asp + Ala133SerGly128Gln + Pro129Gln + Gly131AsnGly128Asp + Gly131Asn + Ala133HisLeu126Cys + Ser130Glu + Ala133GlyGly127Ser + Ser130Asp + Ala133GlyLeu126His + Pro129Asn + Ser130AspLeu126Asn + Gly131Asp + Ala133GlnLeu126Met + Gly128Asn + Ser132AspLeu126Glu + Gly127Gln + Ala133HisLeu126Met + Ser132Asp + Ala133HisSer130Glu + Gly131Gln + Ala133GlnGly127Pro + Gly128Ser + Ala133SerLeu126Ala + Pro129Gly + Ser132GluGly131Asn + Ser132Asp + Ala133AsnLeu126Val + Gly131Asp + Ala133SerLeu126Ser + Gly127Asn + Ala133GlnPro129Gln + Ser130Glu + Ala133HisLeu126Met + Gly127Ser + Ser130AspLeu126Cys + Pro129Asn + Gly131AspPro129Ser + Ser130Asp + Ala133AsnLeu126Ser + Pro129Gly + Ser132GluGly127Ser + Pro129Gln + Ser132AspGly127Pro + Gly128Asn + Pro129GlnLeu126His + Ser132Asp + Ala133AsnGly128Pro + Pro129Glu + Ala133ThrPro129Ser + Glyl31Glu + Ala133ProLeu126His + Gly128Pro + Pro129Gln
Leu126Met + Gly127Asp + Gly128AspGly128Pro + Gly131Glu + Ser132AspGly131Asp + Ser132Glu + Ala133ProGly128Glu + Pro129Glu + Ala133AsnPro129Ser + Ser132Glu + Ala133GluLeu126Asn + Ser130Glu + Gly131AspPro129Asn + Ser130Glu + Gly131AspLeu126His + Ser130Glu + Gly131GluPro129Glu + Ser130Asp + Gly131AsnGly127Ser + Pro129Asp + Ser130AspSer130Asp + Gly131Asp + Ser132AspGly128Asp + Ser130Glu + Gly131AsnLeu126Met + Gly128Glu + Ser130AspGly128Asp + Pro129Asn + Ser130Glu表13第三环状区——四突变变异体Leu126Ser + Pro129Asn + Ser130Asp + Ala133HisLeu126Met + Pro129Ser + Ser132Glu + Ala133AsnGly127Ser + Gly131Gln + Ser132Glu + Ala133GlnLeu126Asn + Gly127Pro + Gly128Glu + Pro129GlyLeu126Asn + Pro129Gly + Gly131Asp + Ala133GlyLeu126Gly + Pro129Gly + Ser132Glu + Ala133ProLeu126Gly + Gly127Asp + Pro129Gly + Gly131ProGly127Asn + Pro129Gln + Gly131Asp + Ala133GlyLeu126Pro + Gly127Ser + Gly128Gln + Ser130GluLeu126Ala + Gly127Gln + Pro129Asn + Ser130GluLeu126Asn + Gly127Ser + Ser130Glu + Ala133ThrGly128Gln + Pro129Gln + Ser130Asp + Gly131SerLeu126His + Gly128Ser + Gly131Ser + Ser132AspLeu126Gln + Pro129Ser + Ser130Asp + Ala133HisLeu126Val + Gly128Pro + Pro129Asn + Ala133AspLeu126Val + Pro129Gly + Ser130Glu + Ala133ThrLeu126Thr + Gly127Pro + Ser132Glu + Ala133ThrGly128Asp + Pro129Gly + Gly131Pro + Ala133SerLeu126Asn + Gly128Glu + Pro129Gln + Gly131ProLeu126Pro + Gly127Pro + Pro129Ser + Ser130AspGly127Pro + Gly128Gln + Gly131Glu + Ser132GluLeu126Ile + Gly127Gln + Gly131Asp + Ser132GluLeu126Val + Gly131Asp + Ser132Asp + Ala133ProGly128Asp + Pro129Asp + Gly131Asn + Ala133ProPro129Asn + Gly131Ser + Ser132Asp + Ala133AspLeu126Gln + Gly131Pro + Ser132Asp + Ala133AspGly127Pro + Ser130Glu + Gly131Glu + Ala133HisLeu126Gln + Pro129Gln + Ser130Asp + Gly131GluGly127Ser + Ser130Asp + Gly131Glu + Ala133GlnLeu126Ser + Gly127Pro + Pro129Glu + Ser130GluSer130Glu + Gly131Glu + Ser132Glu + Ala133SerGly127Gln + Ser130Glu + Gly131Asp + Ser132Asp
Gly128Gln + Ser130Glu + Gly131Asp + Ser132AspGly127Asn + Ser130Glu + Gly131Asp + Ser132AspGly127Ser + Pro129Asp + Ser130Glu + Gly131GluGly127Asn + Pro129Asp + Ser130Asp + Gly131AspGly128Asn + Pro129Glu + Ser130Glu + Gly131AspLeu126Ser + Gly128Asp + Ser130Glu + Ala133ProGly127Asn + Gly128Asp + Ser130Glu + Ala133ProGly128Glu + Ser130Glu + Gly131Pro + Ala133HisLeu126Val + Ser130Asp + Ser132Asp + Ala133AsnPro129Ser + Ser130Glu + Ser132Asp + Ala133GlyLeu126His + Ser130Glu + Ser132Asp + Ala133HisLeu126Ala + Ser130Glu + Ser132Glu + Ala133AsnGly127Pro + Gly128Gln + Ser130Asp + Ser132GluLeu126Ser + Ser130Asp + Gly131Pro + Ser132AspSer130Glu + Gly131Pro + Ser132Glu + Ala133SerGly128Gln + Ser130Asp + Gly131Ser + Ser132GluLeu126Ala + Pro129Asn + Ser130Asp + Ser132GluGly127Gln + Gly128Pro + Pro129Glu + Gly131AspGly128Gln + Pro129Asp + Gly131Glu + Ala133AsnLeu126Asn + Pro129Glu + Gly131Asp + Ala133SerLeu126Met + Pro129Glu + Gly131Glu + Ala133ThrGly127Asp + Gly128Gln + Pro129Asp + Ala133GlnLeu126His + Pro129Gly + Gly131Glu + Ala133GluGly128Glu + Pro129Gly + Gly131Asp + Ala133AsnPro129Gly + Ser130Glu + Ser132Asp + Ala133GluLeu126Gln + Ser130Glu + Ser132Glu + Ala133GluLeu126Gly + Pro129Asp + Ser130Glu + Ser132GluPro129Asp + Ser130Glu + Gly131Ser + Ser132Asp表14第四环状区——单突变变异体Gly154AsnGly154AspGly154GlnGly154GluGly154ProGly154SerAsn155AspAsn155GlnAsn155GluAsn155SerGlu156AspGly157AsnGly157AspGly157GlnGly157GluGly157ProGly157SerThr158Asn
Thr158AspThr158GlnThr158GluThr158GlyThr158ProThr158SerSer159AspSer159GluGly160AsnGly160AspGly160GlnGly160GluGly160ProGly160SerSer161AspSer161GluSer162AspSer162GluSer163AspSer163GluThr164AsnThr164AspThr164GlnThr164GluThr164GlyThr164ProThr164SerVal165AlaVal165AsnVal165AspVal165CysVal165GlnVal165GluVal165GlyVal165HisVal165MetVal165ProVal165SerVal165ThrGly166AsnG1y166AspGly166GlnGly166GluGly166ProGly166SerTyr167AlaTyr167AsnTyr167AspTyr167CysTyr167Gln
Tyr167GluTyr167GlyTyr167HisTyr167IleTyr167LeuTyr167MetTyr167ProTyr167SerTyr167ThrTyr167Val表15第四环状区——双突变变异体Asn155Ser + Glu156AspGly154Ser + Tyr167GlnGly154Glu + Va1165AlaAsn155Glu + Thr164ProGly157Pro + Ser159AspGly154Ser + Ser161AspSer161Glu + Val165ProGly154Gln + Ser161GluAsn155Asp + Thr158ProThr164Asn + Gly166GlnAsn155Glu + Tyr167HisGlu156Asp + Thr158GlyGly154Pro + Gly157GluAsn155Ser + Tyr167AspThr158Pro + Gly166AspThr164Gln + Tyr167GluGly157Gln + Thr158GluThr158Asn + Ser162AspGly154Asn + Tyr167GluGly157Gln + Ser161AspThr164Asp + Tyr167AlaGly160Asp + Val165HisGly154Glu + Gly157SerGlu156Asp + Tyr167IleAsn155Ser + Thr158AspGly157Gln + Thr164ProThr164Ser + Tyr167IleSer159Glu + Tyr167ThrThr164Glu + Val165GlnThr158Gly + Gly160SerSer161Asp + Gly166ProGly154Glu + Gly166SerGly160Asp + Val165AsnSer162Glu + Val165GlnGly157Asn + Ser159GluSer161Asp + Val165Asn
Asn155Asp + Val165ProGlu156Asp + Gly166SerGly154Pro + Ser159AspGly154Ser + Tyr167CysGly160Pro + Thr164AspSer161Glu + Val165GlySer162Glu + Tyr167AsnGly154Asn + Gly166GluSer161Glu + Tyr167AlaGly160Gln + Val165ProGly154Glu + Val165GlyGly160Ser + Ser163AspGly157Glu + Thr158AsnGly160Asp + Val165ProGlyl60Asn + Ser162AspThr164Gln + Gly166GlnAsn155Ser + Thr158GlnSer161Glu + Tyr167GlySer162Asp + Gly166SerGly154Glu + Thr158GlyGly1545er + Thr158SerGly157Asp + Gly160ProSer163Glu + Val165HisGly154Pro + Gly166Asp表16第四环状区——三突变变异体Gly154Gln + Asn155Ser + Glu156AspGly154Ser + Gly160Asp + Tyr167GlnAsn155Glu + Gly157Ser + Thr164ProGly157Asn + Ser159Asp + Gly160SerGlu156Asp + Gly160Ser + Val165ThrGly160Pro + Ser162Glu + Thr164AsnGly154Ser + Glu156Asp + Thr158GlnGly160Asn + Ser162Glu + Gly166SerGly160Ser + Val165Gly + Gly166GlnThr158Gln + Ser162Asp + Tyr167ValGly157Gln + Ser162Glu + Tyr167LeuSer162Glu + Thr164Gln + Val165CysGly157Ser + Val165Met + Gly166GluGly154Ser + Glu156Asp + Gly166ProThr158Ser + Ser161Asp + Thr164GlyGlu156Asp + Gly157Ser + Gly160AsnGly154Gln + Asn155Asp + Gly166SerSer163Glu + Val165Thr + Tyr167ProGly157Asp + Thr158Gln + Val165SerGly157Asn + Ser159Asp + Gly166SerGly160Gln + Ser163Glu + Val165MetGly154Asn + Asn155Asp + Gly157Pro
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Glu156Asp + Thr158Pro + Thr164Gln + Val165ProAsn155Gln + Glu156Asp + Thr164Gly + Val165ThrThr158Gly + Gly160Ser + Ser163Asp + Tyr167AsnSer159Asp + Gly160Gln + Gly166Ser + Tyr167ProGly154Pro + Thr164Gln + Val165Gly + Gly166AspGly154Asn + Gly160Pro + Ser161Glu + Gly166ProAsn155Ser + Gly157Asn + Thr164Gln + Tyr167AspGly157Asn + Thr158Asn + Ser163Glu + Val165GlnGly160Glu + Ser161Asp + Val165Met + Tyr167ProAsn155Glu + Glu156Asp + Thr158Gln + Gly166ProAsn155Asp + Glu156Asp + Val165Asn + Gly166AsnAsn155Asp + Glu156Asp + Gly160Ser + Thr164AsnGly154Ser + Thr158Gln + Ser162Glu + Ser163GluGly154Asn + Asn155Gln + Ser163Glu + Thr164GluGlu156Asp + Gly157Glu + Gly160Gln + Thr164GlyGlu156Asp + Gly157Glu + Thr1585er + Val165CysGly154Pro + Gly157Pro + Thr158Asp + Ser159AspGly154Ser + Gly157Asn + Thr158Glu + Ser159GluGly157Pro + Gly160Pro + Gly166Asp + Tyr167GluGly154Asn + Ser161Glu + Ser162Glu + Tyr167AsnGly154Asp + Asn155Asp + Thr164Gln + Gly166AsnGly154Gln + Ser159Glu + Gly160Glu + Ser161AspThr158Ser + Ser159Asp + Gly160Asp + Ser161AspAsn155Ser + Glu156Asp + Gly157Asp + Thr158GluGly157Asn + Ser159Asp + Ser161Glu + Ser162GluGly154Asn + Glu156Asp + Gly157Glu + Thr164GluGly157Gln + Gly160Asp + Ser162Asp + Val165ThrGly160Glu + Ser162Asp + Thr164Asn + Gly166GlnGly154Asp + Asn155Ser + Glu156Asp + Thr164SerGly154Asp + Glu156Asp + Gly157Glu + Thr158GlyGly154Gln + Gly157Pro + Ser159Asp + Ser161AspSer159Glu + Ser161Asp + Gly166Ser + Tyr167HisSer159Asp + Ser161Asp + Gly166Pro + Tyr167SerGlu156Asp + Thr158Glu + Val165Ala + Gly166GlnGlu156Asp + Thr158Asp + Gly166Pro + Tyr167AlaAsn155Gln + Thr158Asp + Thr164Asp + Tyr167ValSer163Glu + Thr164Asp + Val165Met + Gly166GluSer161Asp + Ser163Asp + Val165Thr + Tyr167HisSer161Asp + Ser163Glu + Thr164Gln + Gly166AsnGly157Pro + Ser159Glu + Ser161Asp + Ser163GluGly154Pro + Glu156Asp + Ser163Asp + Thr164GluAsn155Asp + Glu156Asp + Thr158Asp + Thr164AsnGlu156Asp + Ser159Asp + Thr164Asp + Val165AlaThr158Gln + Ser159Asp + Ser163Glu + Va1165CysGly154Gln + Ser159Asp + Ser163Asp + Gly166ProAsn155Ser + Gly160Asp + Ser162Glu + Thr164AspGly154Gln + Gly160Asp + Ser162Glu + Thr164GluGlu156Asp + Gly160Pro + Va1165Pro + Gly166GluGly160Glu + Ser163Asp + Thr164Gly + Tyr167LeuGly160Glu + Ser163Glu + Thr164Pro + Gly166Gln
Asn155Asp + Thr158Pro + Ser163Glu + Thr164AspAsn155Ser + Glu156Asp + Ser163Asp + Gly166Glu表18第五环状区——单突变变异体Ala187AsnAla187AspAla187GlnAla187GluAla187GlyAla187HisAla187ProAla187SerAla187ThrSer188AspSer188GluPhe189AlaPhe189AsnPhe189AspPhe189CysPhe189GlnPhe189GluPhe189GlyPhe189HisPhe189IlePhe189LeuPhe189MetPhe189ProPhe189SerPhe189ThrPhe189TyrPhe189ValSer190AspSer190GluSer191AspSer191Glu表19第五环状区——双突变变异体Ala187Asp + Pne189GlnAla187Ser + Ser188AspSer188Glu + Phe189ProAla187Asp + Phe189HisAla187Asn + Ser191GluAla187Gln + Ser191AspAla187Glu + Phe189ProAla187Pro + Phe189Asp
Ser188Asp + Phe189CysPhe189His + Ser191AspSer188Glu + Phe189AlaAla187His + Ser188AspAla187Asn + Ser188GluSer188Glu + Phe189GlnAla187Asp + Phe189SerSer188Asp + Phe189ValAla187Gln + Ser188GluAla187Ser + Ser188GluAla187Pro + Ser191AspSer188Glu + Phe189ValPhe189Ser + Ser191GluAla187Gly + Ser191GluAla187Asn + Ser191AspAla187Thr + Ser191AspAla187His + Ser188GluSer188Glu + Phe189GlyAla187Ser + Phe189IleSer188Glu + Phe189MetPhe189Asn + Ser191AspAla187Gln + Phe189TyrAla187Gln + Ser191GluAla187Ser + Phe189AlaPhe189Val + Ser191AspSer188Glu + Phe189LeuAla187Pro + Ser188GluPhe189Asn + Ser191GluPhe189Ile + Ser191AspAla187Glu + Phe189MetAla187His + Ser191GluSer188Asp + Phe189TyrAla187Gly + Phe189ValSer188Asp + Phe189GlnAla187Gly + Phe189TyrAla187Gln + Phe189AspPhe189Tyr + Ser191GluAla187Ser + Ser191AspAla187Thr + Ser188GluAla187Asn + Ser188AspAla187Gly + Ser188AspAla187Gly + Phe189CysPhe189Cys + Ser191GluAla187Asp + Phe189GlySer188Asp + Phe189LeuSer188Asp + Phe189GlyAla187Asn + Phe189AspAla187Pro + Ser191GluPhe189Met + Ser191AspAla187Thr + Ser188Asp
Phe189Ala + Ser191GluPhe189Leu + Ser191Glu表20第五环状区——三突变变异体Ala187Pro + Phe189Cys + Ser191GluAla187Thr + Phe189Tyr + Ser191GluAla187Ser + Ser188Glu + Phe189SerAla187Gln + Phe189Asn + Ser191GluAla187Gln + Ser188Asp + Phe189HisAla187Gln + Ser188Glu + Phe189HisAla187Gly + Ser188Asp + Phe189MetAla187Gly + Ser188Asp + Phe189CysAla187Pro + Phe189His + Ser191GluAla187Pro + Phe189Gln + Ser191GluAla187Asn + Ser188Asp + Phe189AsnAla187Gly + Ser188Glu + Phe189SerAla187Gln + Phe189Met + Ser191AspAla187Gly + Ser188Asp + Phe189ProAla187Thr + Phe189His + Ser191AspAla187Asn + Ser188Glu + Phe189CysAla187Gln + Phe189Val + Ser191GluAla187Pro + Phe189Met + Ser191GluAla187Ser + Ser188Glu + Phe189HisAla187Ser + Phe189Gln + Ser191AspAla187Gln + Ser188Asp + Phe189ProAla187Gly + Ser188Asp + Phe189GlyAla187His + Phe189Gln + Ser191GluAla187Thr + Ser188Glu + Phe189IleAla187Pro + Phe189Gly + Ser191GluAla187Thr + Phe189Met + Ser191GluAla187Gly + Phe189Thr + Ser191GluAla187Gln + Phe189Leu + Ser191GluAla187Thr + Phe189Thr + Ser191AspAla187Gln + Ser188Asp + Phe189MetAla187Pro + Phe189Ser + Ser191GluAla187Asp + Ser188Glu + Phe189ValAla187Glu + Ser188Glu + Phe189SerAla187Asp + Ser188Glu + Phe189MetAla187Asp + Ser188Asp + Phe189GlnAla187Asp + Ser188Glu + Phe189CysAla187Asp + Ser188Glu + Phe189TyrAla187Glu + Ser188Glu + Phe189TyrAla187Asp + Ser188Asp + Phe189GlyAla187Glu + Ser188Glu + Phe189LeuAla187Asp + Ser188Glu + Phe189SerAla187Glu + Ser188Asp + Phe189GlyAla187Asp + Ser188Asp + Phe189ProAla187Asp + Ser188Glu + Phe189HisAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Thr
Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189IleAla187Glu + Ser188Asp + Phe189AsnAla187Ser + Ser188Glu + Phe189GluAla187Gly + Ser188Asp + Phe189GluAla187Gly + Ser188Glu + Phe189AspAla187Pro + Ser188Glu + Phe189AspAla187Asp + Ser188Glu + Phe189GluAla187Glu + Ser188Asp + Phe189AspAla187Asp + Ser188Glu + Phe189AspAla187Glu + Ser188Glu + Phe189GluAla187Gly + Phe189Glu + Ser191AspAla187Gly + Phe189Glu + Ser191GluAla187Thr + Phe189Glu + Ser191GluSer188Glu + Phe189Glu + Ser191GluSer188Glu + Phe189Glu + Ser191Asp表21第五环状区——四突变变异体Ala187Ser + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191AspAla187Pro + Ser188Glu + Phe189Glu + Ser191GluAla187His + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191GluAla187Gly + Ser188Asp + Phe189Asp + Ser19lGluAla187His + Ser188Glu + Phe189Glu + Ser191AspAla187Thr + Ser188Asp + Phe189Asp + Ser191GluAla187Asn + Ser188Glu + Phe189Glu + Ser191GluAla187Pro + Ser188Asp + Phe189Glu + Ser191GluAla187Pro + Ser188Asp + Phe189Asp + Ser191AspAla187Ser + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191GluAla187His + Ser188Asp + Phe189Glu + Ser191AspAla187Thr + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191AspAla187Asn + Ser188Asp + Phe189Glu + Ser191GluAla187Gln + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191GluAla187Gly + Ser188Asp + Phe189Glu + Ser191GluAla187Glu + Ser188Asp + Phe189Gly + Ser191AspAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Met + Ser191AspAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Ile + Ser191GluAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Leu + Ser191AspAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Thr + Ser191AspAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Leu + Ser191AspAla187Glu + Ser188Asp + Phe189Tyr + Ser191AspAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Gln + Ser191AspAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Cys + Ser191GluAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Gln + Ser191GluAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Pro + Ser191GluAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Ser + Serl91GluAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Cys + Ser191AspAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Leu + Ser191AspAla187Glu + Ser188Asp + Phe189Ile + Ser191AspAla187Asp + Ser188Asp + Phe189His + Ser191Glu
Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189His + Ser191AspAla187Glu + Ser188Asp + Phe189Val + Ser191AspAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Gly + Ser191GluAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Cys + Ser191AspAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Asn + Ser191GluAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Thr + Ser191GluAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Ile + Ser191AspAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Ala + Ser191GluAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Val + Ser191GluAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Ala + Ser191GluAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Ser + Ser191AspAla187Glu + Ser188Asp + Phe189Asn + Ser191AspAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Cys + Ser191GluAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Cys + Ser191AspAla187Glu + Ser188Asp + Phe189Ser + Serl9lGluAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Tyr + Ser191GluAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Ala + Ser191AspAla187Gly + Ser188Glu + Phe189Thr + Ser191AspAla187His + Ser188Asp + Phe189Met + Ser191GluAla187Thr + Ser188Asp + Phe189Ser + Ser191AspAla187Ser + Ser188Glu + Phe189Met + Ser191AspAla187Ser + Ser188Asp + Phe189Ser + Ser191AspAla187Thr + Ser188Asp + Phe189Tyr + Ser191GluAla187Ser + Ser188Glu + Phe189Ala + Ser191AspAla187Asn + Ser188Glu + Phe189Gly + Ser191AspAla187Gln + Ser188Asp + Phe189Asn + Ser191GluAla187Asn + Ser188Asp + Phe189His + Ser191GluAla187Gly + Ser188Asp + Phe189Ser + Ser191GluAla187His + Ser188Asp + Phe189Val + Ser191Asp表22多环双突变变异体Leu 96Gly + Ser204GluGln 59Ser + Asn 62SerVal 95Gln + Asn218AspTyr104Cys + Lys213GluGly127Gln + Ala216ProSer188Glu + Gly215AsnGly 97Gln + Ile107AlaGln206Asp + Tyr217ThrAsp 60Glu + Gln206AsnThr158Asp + Gln206SerPro210Gln + Gly21SAsnTyr104Glu + Ile107LeuTyr167Pro + Gly211GluIle107Leu + Ala187AspGly 97Glu + Thr164ProThr 66Pro + Val203CysAla133Gly + Tyr217Ser
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Ala133Asp + Ser161Glu + Thr164Asp + Ser204Asp + Asn218SerGln103Glu + Tyr104Cys + Ser161Glu + Thr164Asp + Lys213GluSer 63Glu + Gly160Asp + Tyr167Met + Lys213Asp + Asn218AspSer101Glu + Leu126Glu + Ser188Glu + Lys213Asp + Ala216AsnAsp 60Glu + Leu 96Glu + Gly128Asn + Ser130Glu + Gln206GluGln103Ser + Ser130Asp + Ala133Gly + Gln206Glu + Gly219AspGly102Asn + Ser162Asp + Gln206Asp + Tyr217Gly + Gly219AspThr 66Gln + Asp 99Glu + Gln103Glu + Val203Ser + Tyr217AspAsp 99Glu + Gln103Asp + Gly157Asn + Lys213Asp + Ala216GlnThr 66Asp + Pro129Asp + Ser159Glu + Lys213Asp + Tyr217HisSer 63Asp + Gly 97Asp + Tyr167Ala + Ser188Asp + Ser204GluGly102Pro + Tyr104Ala + Glu156Asp + Tyr167Glu + Ser204GluGln 59Glu + Asn 62Gln + Glnl03Glu + Gly131Glu + Phe189LeuAsp 60Glu + Ser162Glu + Ala200Gln + Val203Glu + Gly211AspAsp 60Glu + Ile107Glu + Gly157Asp + Gly160Glu + Phe189SerSerl01Asp + Gly102Ser + Tyrl04Glu + Phe189Asp + Lys213GluSer101Asp + Serl05Asp + Val203Asp + Ala216His + Tyr217HisSer132Asp + Asn155Glu + Gly211Pro + Lys213Glu + Asn218AspGln103Asp + Gly128Asp + Ser163Asp + Ala187Glu + Tyr217IleLeu 96Ile + Gly128Asp + Ser191Glu + Gly202Asn + Gln206GluThr 66Glu + Gln103Asp + Ser204Glu + Lys213Asp + Gly219SerAla 98Asp + Ser132Asp + Gly166Glu + Pro210Asp + Tyr214GlnSer 63Glu + Pro129Glu + Val203Met + Lys213Glu + Gly219AspGln 59Glu + Gly 97Asp + Gly128Asp + Ser159Glu + Ala216SerSer 63Glu + Gln103Glu + Ile107Ser + Glu156Asp + Lys213AspGly102Asp + Gly157Asn + Ser162Glu + Ser191Glu + Ser204GluSer105Asp + Ser162Asp + Ser191Asp + Pro210Gly + Gly211GluAsp 60Glu + Val 95Glu + Trp106Gly + Pro129Glu + Ser159AspSer101Glu + Trp106Asp + Thr164Glu + Ser204Asp + Pro210SerGln 59Glu + Gly100Gln + Gly157Asp + Gly211Asp + Tyr217GluGly 97Asp + Ser130Asp + Gln206Asp + Lys213Asp + Ala216AsnTyr104Asp + Gly154Asp + Gly160Asn + Ser163Asp + Ser204GluSer132Glu + Gly154Glu + Ser163Glu + Pro210Gly + Asn212AspLeu 96Thr + Ala133Glu + Asn155Glu + Lys213Asp + Ala216AspAsp 60Glu + Asp 99Glu + Leu126Gly + Ser130Asp + Ser162GluII.清洁组合物在本发明的另一个实施方案中，有效量的一种或多种酶变异体被包含于用于清洁各种表面，去除蛋白质类的污物的组合物中。这样的清洁组合物包括用于清洁硬表面的清洁剂组合物，不限形式(例如液体或颗粒)；用于清洁织物的清洁剂组合物，不限形式(例如颗粒、液体和条状固体配方)；洗涤碗碟组合物(不限形式)；口腔清洁组合物，不限形式(例如牙粉、牙膏和口腔洗涤剂配方)；假牙清洁组合物，不限形式(例如液体、片剂)；和接触透镜(contact lens)清洁组合物，不限形式(例如液体、片剂)。
除了前述的BPN’变异体，清洁组合物还包括一种或多种与蛋白酶相容的清洁组合物材料。此处使用的名词“清洁组合物材料”意思是为所需要的特定类型的清洁组合物而选择的任何液体、固体或气体材料，以及产品的形式(例如液体、颗粒、条状固体、喷剂、棒状固体、糊剂、乳胶剂)，该材料还还与组合物中使用的BPN’变异体相容。清洁组合物材料的特定选择是在考虑了将被清洁的表面材料，以及为使用过程中清洁状况而选定的组合物形式(例如，通过清洁剂使用)。此处使用的名词“相容”意思是清洁组合物材料没有在如下程度上降低BPN’变异体的蛋白水解活性，即蛋白酶不象在正常的使用情况下使用时那么有效。下面将举例说明特定的清洁组合物材料。
此处所使用的名词“有效量的酶变异体”指在特定的清洁组合物中达到必要的酶活性的必要的酶变异体的数量。该有效量可以被本领域中一种普通的方法很容易地测定，有效量基于许多因素，例如所使用的特殊的酶变异体，清洁应用，特定的清洁组合物，以及是否需要液体或干组合物(例如颗粒、条状固体)，以及类似的因素。优选的清洁组合物包含大约0.0001％至大约10％的一种或多种本发明的酶变异体，更优选的是从大约0.001％至大约1％，还要优选的是从大约0.01％至大约0.1％。下面是进一步详细讨论各种清洁组合物的几个实例，其中可能用到酶变异体。对于所有的部分，除非特别说明，此处使用的百分比和比例都是重量比。
此处所使用的名词“非织物清洁组合物”包括硬表面清洁组合物、碗碟洗涤组合物、口腔清洁组合物、假牙清洁组合物以及接触透镜清洁组合物。A.用于硬表面、碗碟和织物的清洁组合物本发明的酶变异体可以被用于多种多样的，需要有高泡并清除溶解性良好的底物的清洁剂组合物。于是酶变异体可以与许多常规成分一起使用，来提供全配方的硬表面清洁剂、碗碟洗涤组合物、织物清洁组合物以及其它类似的清洁剂。这样的组合物可以以液体、颗粒、条状固体以及其它类似的形式存在。这样的组合物可以被描述为现代的“浓缩”清洁剂，它包含有重量百分比为30％-60％的表面活性剂。
此处的清洁组合物可以有选择地、优选地包含各种阴离子、非离子、两性离子等表面活性剂。这样的表面活性剂的含量水平通常是组合物的5％至35％。
此处有用的表面活性剂的非限定性的实施例包括常规的C11-C18烷基苯磺酸盐和伯烷基的以及无规烷基硫酸盐、分子式为CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3-M+)CH2CH3的C10-C18仲(2，3)烷基硫酸盐，其中的x和(y+1)是不小于大约7的整数，最好不小于9，并且M是水溶阳离子，尤其是钠，C10-C18烷基烷氧基硫酸盐(尤其是EO 1-5乙氧基硫酸盐)，C10-C18烷基烷氧基羧酸盐(尤其是EO 1-5乙氧基羧酸盐)、C10-C18烷基多聚糖苷以及它们相应的多聚糖苷硫酸盐，C12-C18α磺化脂肪酸酯，C12-C18烷基和烷基酚烷氧基化物(尤其是乙氧基化物和混合的乙氧基/丙氧基)，C12-C18甜菜碱和硫代甜菜碱(“sultaines”)，C10-C18胺氧化物等。烷基烷氧基硫酸盐(AES)和烷基烷氧基羧酸盐(AEC)在此处是优选的。(与上文提及的胺氧化物和/或甜菜碱或硫代甜菜碱这样的表面活性剂结合使用也是优选的，这依赖于配制者的需要。)其它常规的有用的表面活性剂被列于标准文本中。特别有用的表面活性剂包括C10-C18N-甲基葡萄糖酰胺，它公开于美国专利第5,194,639号，Connor等，颁布于1993年3月16日，此处作为文献引用。
清洁剂清洁组合物中有多种多样的其它的有用成分可以包含于此处的组合物中，包括其它的活性成分、载体、水溶助长剂、加工助剂、染料或色素、液体制剂的溶剂等。如果想要更多的发泡量，泡沫增强剂例如C10-C16链烷酰胺(alkolamides)可以加入该组合物中，通常是约1％至约10％的水平。C10-C14单乙醇和二乙醇酰胺代表这类包沫增强剂的一个典型类别。将这样的泡沫增强剂与高泡添加剂表面活性剂，例如上文提及的胺氧化物、甜菜碱和硫代甜菜碱一起使用也是有益的。如果需要，可以加入可溶性镁盐，如MgCl2、MgSO4等，通常从约0.1％至约2％的水平，以提供更多的泡沫。
此处的液体清洁剂组合物可以包含水和其它的溶剂作为载体。低分子量的伯或仲醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇是适合的。一元醇是加溶表面活性剂的优选物，但是多元醇例如那些含有约2至6个碳原子的和约2至6个羟基团的(例如，1，3-丙二醇、乙二醇、甘油和1，2-丙二醇)醇类也可以使用。组合物中可能包含约5％至90％这样的载体，典型的是约10％至50％。
这里的清洁剂组合物优选地被配制为是在水溶液洗涤操作过程中使用时，洗涤水的pH值将是从约6.8至约11.0。终产品典型地被配制在此范围之内。在推荐的使用水平控制pH值的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，并且是本领域的专业人员所熟知的。
当配制本发明的硬表面清洁组合物和织物清洁组合物时，配制者可能希望在约5％至50％重量比水平的使用各种助洗剂。典型的助洗剂包括1-10微米的沸石、多聚羧化物，例如柠檬酸盐和羟基丁二酸氢盐、层积硅酸盐、磷酸盐等。其它的常规的助洗剂列于标准配方表中。
同样地，配方师可能希望在这样的组合物中使用各种常规的添加酶，例如纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶，典型的含量水平是重量比从约0.001％至约1％。各种清洁剂和织物清洁酶是洗衣清洁剂领域所熟知的。
各种漂白物质可以被用于该组合物，例如过碳酸盐、过硼酸盐等，典型的含量水平是重量比从约1％至约15％。如果需要，这样的组合物还可以包含漂白激活剂，例如四乙酰乙二胺、壬酰苯酚磺酸盐等，它们也是本领域熟知的。使用量的典型范围是重量比从约1％至10％。
各种污物清除剂，尤其是阴离子寡酯类，各种螯合剂，尤其是氨基磷酸盐和乙二胺二琥珀酸盐、各种粘土污物清除剂，尤其是乙氧基化的四乙基戊胺，各种分散剂，尤其是聚丙烯酸酯和聚天门冬氨酸酯，各种增白剂，尤其是阴离子增白剂，各种消泡剂，尤其是硅氧化和仲醇，各种织物柔顺剂，尤其是绿土，以及类似物都可以被用于该组合物，含量水平范围从重量比约1％至约35％。标准的配方表和公开的专利包含这些常规物质的多种、详尽的描述。
酶稳定剂也可以被用于该清洁组合物。这样的酶稳定剂包括丙二醇(优选的是从约1％至约10％)、甲酸钠(优选的是从约0.1％至约1％)和甲酸钙(优选的是从约0.1％至约1％)。1.硬表面清洁组合物这里所使用的“硬表面清洁组合物”是指用于清洁例如地板、墙壁、卫生间瓷砖等硬表面的液体的和颗粒的清洁剂组合物。本发明的硬表面清洁剂组合物包括有效量的一种或多种本发明的酶变异体，优选的活性酶在该组合物中的含量是重量比从约0.001％至约10％，更优选的是从约0.01％至约5％，还要优选的是从约0.05％至约1％。除包含一种或多种酶变异体之外，这样的硬表面清洁组合物通常包括表面活性剂和水溶性螯合助洗剂。但是在一些特殊的产品中，例如窗户喷洒清洁剂，有时并不使用表面活性剂，因为它们可能在玻璃表面产生薄膜状的/斑点状的残迹。
当含有表面活性成分时，它的含量可能只有该组合物的0.1％，但是典型的组合物中含有从约0.25％至约10％的表面活性剂，优选的是从约1％至约5％。
典型的组合物包含从约0.5％至约50％的清洁助洗剂，优选的是从约1％至约10％。
优选的pH值是在8至12的范围内。如果需要调节，可以使用常规的pH值调节剂，例如氢氧化钠、碳酸钠或盐酸。
组合物中可能包含溶剂。有用的溶剂包括但不限于乙二醇醚，例如二甘醇单己基醚、二甘醇单丁基醚、乙二醇单丁基醚、丙二醇单丁基醚、二丙基乙二醇单丁基醚，和二醇例如2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇和2-乙基-1，3-己二醇。当使用时，这样的溶剂的典型含量从约0.5％至约15％，优选的是从约3％至约11％。
另外，在表面上“全浓度”使用该组合物之后若没有清洗表面，可以在本发明的组合物中使用例如异丙醇或乙醇的高挥发溶剂，使得组合物从表面的蒸发得更快、更容易。当使用时，挥发溶剂在组合物中的典型含量水平从约2％至约12％。
本发明的硬表面清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。
实施例7-12液体硬表面清洁组合物实施例编号成分7 8 9 10 11 12Ser105Glu0.050.500.020.030.100.03Gly127Gln+-- - - 0.200.02Ala216ProNa2DIDA*EDTA**-- 2.902.90 - -柠檬酸钠 -- - - 2.902.90十二烷基苯磺酸钠 1.95 - 1.95 - 1.95 -十二烷基硫酸钠- 2.20 - 2.20 - 2.20十二烷基(乙氧基)硫- 2.20 - 2.20 - 2.20酸钠十二烷基二甲胺氧 - 0.05 - 0.05 - 0.05化物异丙基苯磺酸钠 1.30 - 1.30 - 1.30 -己基卡必醇***6.306.306.306.306.306.30水****补充至100％*N-二甘醇-N，N-亚氨基二乙酸二钠**乙二胺二乙酸钠***二甘醇单己基醚****所有配剂调至pH7在实施例7-10中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被丝氨酸105谷氨酸所取代，结果大体上相同。
在实施例11-12中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被甘氨酸127谷氨酰胺+丙氨酸216脯氨酸所取代，结果大体上相同。
实施例13-18用于清洁硬表面和家居除霉的喷洒组合物实施例编号成分131415161718Tyr104Ile+Gly215Pro0.50 0.05 0.60 0.30 0.20 0.30Asp99Glu - - - - 0.30 0.10辛基硫酸钠 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00十二烷基硫酸钠 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00氢氧化钠 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80硅酸(钠)盐 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04香味剂 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35水 补充至100％产物pH调至7。
在实施例17-18中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被酪氨酸104异亮氨酸+甘氨酸215脯氨酸所取代，结果大体上相同。在实施例17-18中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被酪氨酸104异亮氨酸+甘氨酸215脯氨酸所取代，结果大体上相同。2.碗碟洗涤组合物在本发明的另一个实施方案中，碗碟洗涤组合物中包含本发明的一种或多种酶变异体。这里所使用的“碗碟洗涤组合物”是指用于洗涤碗碟的组合物的所有形式，包括但不限于颗粒和液体形式。本发明的碗碟洗涤组合物的实施方案用下列实施例说明。
实施例19-24
碗碟清洁组合物实施例编号成分 192021222324Glu59Ser+Leu96Gly+S 0.05 0.50 0.02 0.40 0.10 0.03er204GluLys96Gly+Ser204Glu- - - - 0.40 0.0212-14烷基-N-甲基-葡 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90萄糖酰胺十二烷基乙氧基(1)12.00 12.00 12.00 12.00 12.00 12.00硫酸盐2-甲基十-烷酸 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50十二烷基乙氧基(2)羧 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50酸盐十二烷醇乙氧酸盐(4) 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00十二烷基胺氧化物 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00异丙基苯碳酸钠 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00乙醇 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00Mg++(如氯化镁)0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20Ca++(如氯化钙)0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40水补充至100％产物pH调至7。
在实施例19-22中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被谷氨酰胺59S丝氨酸+亮氨酸96甘氨酸+丝氨酸204谷氨酸所取代，结果大体上相同。
在实施例23-24中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被谷氨酰胺59S丝氨酸+亮氨酸96甘氨酸+丝氨酸204谷氨酸和赖氨酸96甘氨酸+丝氨酸204谷氨酸所取代，结果大体上相同。3.织物清洁组合物在本发明的另一个实施方案中，织物清洁组合物包含一种或多种本发明的酶变异体。这里所使用的“织物清洁组合物”是指用于清洗织物的清洁剂组合物的所有形式，包括但不限于颗粒、液体和条状形式。优选的织物清洁组合物是液体形式的。a.颗粒状织物清洁组合物本发明的颗粒状的织物清洁组合物包含有效量的一种或多种本发明的酶变异体，优选的活性酶在该组合物中的含量是重量比从约0.001％至约10％，更优选的是从约0.005％至约5％，还要优选的是从约0.01％至约1％。除包含一种或多种酶变异体之外，该颗粒状的织物清洁组合物通常包括至少一种表面活性剂、一种或多种助洗剂，并且在某些情况下，包含漂白剂。
本发明的颗粒状的织物清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。
实施例25-28颗粒状织物清洁组合物实施例编号成分 25 26 27 28Ser101Asp 0.10 0.20 0.03 0.05Thr66Glu - - 0.02 0.05十三链烷基苯磺酸 22.00 22.0022.0022.00磷酸盐(如三聚磷酸钠) 23.00 23.0023.0023.00碳酸钠 23.00 23.0023.0023.00硅酸钠 14.00 14.0014.0014.00沸石 8.20 8.20 8.20 8.20螯合剂(二亚乙基三胺五乙0.40 0.40 0.40 0.40酸)硫酸钠 5.50 5.50 5.50 5.50水 补充至100％
在实施例25-26中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体被丝氨酸101天门冬氨酸所取代，结果大体上相同。
在实施例27-28中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被丝氨酸101天门冬氨酸和苏氨酸66谷氨酸所取代，结果大体上相同。
实施例29-32颗粒状织物清洁组合物实施例编号成分 29303132Val95Asp+Leu126Ser+Asn155Gln 0.10 0.20 0.03 0.05Gly65Ser+Gly102Asn+Val203Glu--0.02 0.05十二烷基苯磺酸12.00 12.00 12.00 12.00沸石A(1-10μm)26.00 26.00 26.00 26.002-丁基辛酸4.00 4.00 4.00 4.0012-14仲(2，3)烷基硫酸盐，钠盐 5.00 5.00 5.00 5.00柠檬酸钠 5.00 5.00 5.00 5.00光学增亮剂0.10 0.10 0.10 0.10硫酸钠17.00 17.00 17.00 17.00水和微量物质 补充至100％在实施例29-30中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体被缬氨酸95天门冬氨酸+亮氨酸126丝氨酸+天门冬酰胺155谷氨酰胺所取代，结果大体上相同。
在实施例31-32中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被缬氨酸95天门冬氨酸+亮氨酸126丝氨酸+天门冬酰胺155谷氨酰胺和甘氨酸65丝氨酸+甘氨酸102天门冬酰胺+缬氨酸203谷氨酸所取代，结果大体上相同。
实施例33-36颗粒状织物清洁剂实施例编号成分 33 34 35 36Ser63Glu0.100.200.030.05Leu96Asn+Lys213Asp - - 0.020.05十三链烷基苯磺酸 22.00 22.00 22.00 22.00磷酸盐(如三聚磷酸钠)23.00 23.00 23.00 23.00碳酸钠 23.00 23.00 23.00 23.00柠檬酸钠14.00 14.00 14.00 14.00沸石8.208.208.208.20螯合剂(二亚乙基三胺五乙 0.400.400.400.40酸)硫酸钠 5.505.505.505.50水补充至100％在实施例33-34中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体被丝氨酸63谷氨酸所取代，结果大体上相同。
在实施例35-36中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被丝氨酸63谷氨酸和亮氨酸96天门冬酰胺+赖氨酸213天门冬氨酸所取代，结果大体上相同。
实施例37-40颗粒状织物清洁组合物实施例编号成分373839 40Asn62Ser+Ser163Asp+Phe189Ser+ 0.10 0.20 0.03 0.05Ala216GluGly97Ser+Trp106Ile+Tyr217Leu- -0.02 0.05十二烷基苯磺酸 12.00 12.00 12.00 12.00沸石(1-10μm) 26.00 26.00 26.00 26.002-丁基辛酸 4.00 4.00 4.00 4.0012-14仲烷基(2，3)硫酸盐，钠盐 5.00 5.00 5.00 5.00柠檬酸钠 5.00 5.00 5.00 5.00光学增亮剂 0.10 0.10 0.10 0.10硫酸钠 17.00 17.00 17.00 17.00水和微量物质 补充至100％在实施例37-38中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体被天门冬酰胺62丝氨酸+丝氨酸163天门冬氨酸+苯丙氨酸189丝氨酸+丙氨酸216谷氨酸所取代，结果大体上相同。
在实施例39-40中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被天门冬酰胺62丝氨酸+丝氨酸163天门冬氨酸+苯丙氨酸189丝氨酸+丙氨酸216谷氨酸和甘氨酸97丝氨酸+色氨酸106异亮氨酸+酪氨酸217亮氨酸所取代，结果大体上相同。
实施例41-42颗粒状织物清洁组合物实施例编号成分 41 42链烷基苯磺酸盐11.410.70动物脂烷基硫酸盐1.802.4014-15烷基硫酸盐 3.003.107倍乙氧基化14-15烷醇 4.004.0011倍羟乙基化动物脂肪醇1.801.80分散剂0.070.1液体聚硅氧烷 0.800.80柠檬酸三钠14.00 15.00柠檬酸3.002.50沸石 32.50 32.10马来酸丙烯酸共聚物 5.005.00二亚乙基三胺五亚甲基磷酸 1.000.20Ala98Asp+Ala187Ser0.300.30脂肪酶0.360.40淀粉酶0.300.30硅酸钠2.002.50硫酸钠3.505.20聚乙烯吡咯烷酮0.300.50过硼酸盐 0.51苯磺酸盐 0.10.2过氧化物酶0.10.1
微量物质 加至100 加至100实施例43-44颗粒状织物清洁组合物实施例编号成分 43 4412链烷基苯磺酸钠6.5 8.0硫酸钠 15.018.0沸石A 26.022.0次氮基三乙酸钠 5.0 5.0聚乙烯吡咯烷酮 0.5 0.7四乙酰乙二胺3.0 3.0硼酸4.0 -过硼酸 0.5 1酚磺酸 0.1 0.2Gln59ser+Asn62Ser+Leu96Gly+Ser204Gln0.4 0.4填充剂(例如硅酸盐、碳酸盐、香味剂、水)加至100加至100
实施例45紧密型颗粒状织物清洁组合物成分重量％烷基硫酸 8.0烷基乙氧基硫酸 2.03位和7倍乙氧基化25和45烷醇的混合物 6.0聚羟基脂肪酰胺 2.5沸石 17.0层状硅酸/柠檬酸盐 16.0碳酸盐 7.0马来酸丙烯酸共聚物 5.0去污聚合物 0.4羧甲基纤维素 0.4聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物 0.1乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮共聚体 0.1聚乙二醇2000 0.2Val95Gln+Tyr104Glu+Gly127Gln+Lys213Glu+0.5Ala216Asp脂肪酶 0.2纤维素酶 0.2四乙酰乙二胺 6.0过碳酸盐 22.0乙二胺二琥珀酸 0.3消泡剂 3.54，4’-双(2-吗啉代-4-苯胺基-均三嗪-6-基氨基) 0.25茋-2，2’-二磺酸二钠4，4’-双(2-sulfostyril)二苯基二钠0.05水、香味剂和微量物质 加至100实施例46颗粒状织物清洁组合物成分 重量％链烷基苯磺酸盐 7.616-18烷基硫酸盐 1.37倍乙氧基化14-15烷醇 4.0椰子烷基二甲基羟乙基氯化铵 1.4分散剂 0.07液体聚硅氧烷 0.8柠檬酸三钠 5.0沸石4A 15.0马来酸丙烯酸共聚物 4.0二亚乙基三胺五亚甲基磷酸 0.4过硼酸盐 15.0四乙酰乙二胺 5.0蒙脱石粘土 10.0聚(氧乙烯)(分子量300,000)0.3Ser63Glu+Thr104Asn+Gln206Ser+Tyr217Thr 0.4脂酶 0.2淀粉酶 0.3纤维素酶 0.2硅酸钠 3.0
碳酸钠 10.0羧甲基纤维素 0.2增亮剂 0.2水、香味剂和微量物质 加至100实施例47颗粒状织物清洁组合物成分重量％链烷基苯磺酸 6.92动物脂肪烷基硫酸盐2.057倍乙氧基化14-15烷醇 4.43倍乙氧基化12-15烷基乙氧基硫酸盐 0.16沸石 20.2柠檬酸盐 5.5碳酸盐15.4硅酸盐3.0马来酸丙烯酸共聚物4.0羧甲基纤维素酶0.31去污共聚物0.30Asn62Ser+Trp106Gly+Ser132Asp+Ala187Ser0.2+Phe189Ser脂酶 0.36纤维素酶 0.13过硼酸盐四水合物 11.64过硼酸盐单水合物 8.7
四乙酰乙二胺5.0二亚乙基三胺五甲基磷酸 0.38硫酸镁 0.40增亮剂 0.19增亮剂、聚硅氧烷、消泡剂0.85微量物质 加至100b.液体织物清洁组合物本发明的液体织物清洁组合物包含有效量的一种或多种本发明的酶变异体，优选的活性酶在该组合物中的含量是重量比从约0.005％至约5％，更优选的是从约0.01％至约1％。该液体织物清洁组合物通常还包括一种阴离子表面活性剂、一种脂肪酸、一种水溶性清洁助洗剂和水。
本发明的液体织物清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。
实施例48-52液体织物清洁组合物实施例编号成分 4849505152Ser161Glu+Gly219Asn0.05 0.03 0.30 0.03 0.10Asn62Ser+Ile107Ala -- - 0.01 0.20+Glu206Asp+Tyr217Thr12-14烷基硫酸盐，钠20.00 20.00 20.00 20.00 20.002-丁基辛酸 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00柠檬酸钠 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00十烷醇乙氧酸盐(3)13.00 13.00 13.00 13.00 13.00单乙醇胺 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50水/丙二醇/乙醇(100∶1∶1) 补充至100％在实施例48-50中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被丝氨酸161谷氨酸+甘氨酸219天门冬酰胺所取代，结果大体上相同。
在实施例51-52中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被丝氨酸161谷氨酸+甘氨酸219天门冬酰胺和天门冬酰胺62丝氨酸+异亮氨酸107丙氨酸+谷氨酸206天门冬氨酸+酪氨酸217苏氨酸所取代，结果大体上相同。
实施例53-57液体织物清洁组合物实施例编号成分 5354555657Ser101Asp+Ile107Ala 0.05 0.03 0.30 0.03 0.10+Gly202SerVal95Thr+Thr208Gly - - - 0.01 0.2012-14烷基硫酸盐，钠 20.00 20.00 20.00 20.00 20.002-丁基辛酸5.00 5.00 5.00 5.00 5.00柠檬酸钠 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00十烷醇乙氧酸盐(3) 13.00 13.00 13.00 13.00 13.00单乙醇胺 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50水/丙二醇/乙醇(100∶1∶1) 补充至100％在实施例53-55中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被丝氨酸101天门冬氨酸+异亮氨酸107丙氨酸+甘氨酸202丝氨酸所取代，结果大体上相同。
在实施例56-57中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被丝氨酸101天门冬氨酸+异亮氨酸107丙氨酸+甘氨酸202丝氨酸和缬氨酸95苏氨酸+苏氨酸208甘氨酸所取代，结果大体上相同。
实施例58-59颗粒状织物清洁组合物实施例编号成分 585912-14碳链烯基琥珀酸 3.0 8.0柠檬酸单水合物 10.0 15.012-15烷基硫酸钠 8.0 8.02倍乙氧基化12-15烷醇硫酸钠 -3.07倍乙氧基化12-15烷醇 -8.05倍乙氧基化12-15烷醇 8.0 -二亚乙基三胺五(亚甲基磷酸) 0.2 -油酸1.8 -乙醇4.0 4.0丙二醇 2.0 2.0Asp60Glu+Gln206Asn 0.2 0.2聚乙烯吡咯烷酮 1.0 2.0消泡剂 0.15 0.15氢氧化钠调至pH7.5过硼酸盐0.5 1酚磺酸盐0.1 1过氧化物酶 0.4 0.1水和微量物质 加至100
在实施例58和59中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被天门冬氨酸60谷氨酸+谷氨酰胺206天门冬酰胺所取代，结果大体上相同。
实施例60-62液体织物清洁组合物实施例编号成分 606162柠檬酸 7.10 3.00 3.00脂肪酸 2.00 -2.00乙醇1.93 3.20 3.20硼酸2.22 3.50 3.50单乙醇胺0.71 1.09 1.091，2丙二醇 7.89 8.00 8.00异丙基苯磺酸钠 1.80 3.00 3.00甲酸钠 0.08 0.08 0.08氢氧化钠6.70 3.80 3.80硅消泡剂1.16 1.18 1.18Asn61Glu0.0145 - -Gly97Glu+Thr164Pro- 0.0145 -Asn62Glu+Thr158Ser+Gly215Ser -- 0.0145脂酶0.200 0.200 0.200纤维素酶 - 7.50 7.50去污共聚物 0.29 0.15 0.15消泡剂 0.06 0.085 0.085增亮剂360.095 - -增亮剂3 - 0.05 0.05
12烷基苯磺酸 9.86 - -12-15烷基聚乙氧基(2，5)硫酸盐 13.80 18.00 18.0012烷基葡萄糖酰胺 - 5.005.0012-13烷基聚乙氧基化物(9) 2.002.002.00水、香味剂和微量物质补充至100％c.条状织物清洁组合物用于手工洗涤脏织物的本发明的条状织物清洁组合物包含有效量的一种或多种本发明的酶变异体，在组合物中的优选的含量是重量比从约0.01％至约1％。
本发明的条状织物清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。
实施例63-66条状织物清洁组合物实施例编号成分 6364 65 66Gly97Glu+Thr164Pro 0.3-0.1 0.02Ala98Ser+Gly154Asn - -0.4 0.0312-16烷基硫酸钠 20.020.020.020.012-14碳N-甲基葡萄糖酰胺 5.0 5.0 5.0 5.0011-13烷基苯磺酸钠 10.010.010.010.0碳酸钠 25.025.025.025.0焦磷酸钠 7.0 7.0 7.0 7.00三聚磷酸钠 7.0 7.0 7.0 7.00沸石A(0.1-10μ) 5.0 5.0 5.0 5.00羧甲基纤维素 0.2 0.2 0.2 0.20聚丙烯酸酯(分子量1400) 0.20.20.20.20椰子单乙醇胺5.05.05.05.00增亮剂、香味剂0.20.20.20.20硫酸钙 1.01.01.01.00硫酸镁 1.01.01.01.00水 4.04.04.04.00填充物* 补充至100％*可选自如碳酸钙、滑石粉、粘土、硅酸盐等。
在实施例63-64中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被甘氨酸97谷氨酸+苏氨酸164脯氨酸所取代，结果大体上相同。
在实施例65-66中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被甘氨酸97谷氨酸苏氨酸164脯氨酸和丙氨酸98丝氨酸+甘氨酸154天门冬酰胺所取代，结果大体上相同。
实施例67-70条状织物清洁组合物实施例编号成分 67686970Val203Glu 0.3-0.1 0.02Gly100Glu+Ile107Ser -0.3 0.4 0.0312-16烷基硫酸钠 20.0 20.0 20.0 20.0012-14碳-N-甲基葡萄糖酰胺 5.0 5.0 5.0 5.0011-13烷基苯磺酸盐，钠 10.0 10.0 10.0 10.00碳酸钠25.0 25.0 25.0 25.00焦磷酸钠 7.0 7.0 7.0 7.00
三聚磷酸钠 7.07.07.07.00沸石A(0.1-10μ) 5.05.05.05.00羧甲基纤维素 0.20.20.20.20聚丙烯酸酯(分子量1400) 0.20.20.20.20椰子单乙醇胺 5.05.05.05.00增亮剂、香味剂 0.20.20.20.20硫酸钙 1.01.01.01.00硫酸镁 1.01.01.01.00水 4.04.04.04.00填充物*补充至100％*可选自如碳酸钙、滑石粉、粘土、硅酸盐等。
在实施例67中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被缬氨酸203谷氨酸所取代，结果大体上相同。
在实施例68中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被甘氨酸100谷氨酸+异亮氨酸107丝氨酸所取代，结果大体上相同。
在实施例69-70中，列举于表2-25之中的任何BPN’变异体的组合，被缬氨酸203谷氨酸和甘氨酸100谷氨酸+异亮氨酸107丝氨酸所取代，结果大体上相同。B.其它清洁组合物除了以上所讨论的硬表面清洁组合物、碗碟清洁组合物和织物清洁组合物以外，当需要水解不溶性底物时，一种或多种本发明的变异体可以加入许多其它清洁组合物。这样的清洁组合物包括但不限于口腔清洁组合物、假牙清洁组合物，和接触透镜清洁组合物。1.口腔清洁组合物在本发明的另一个实施方案中，组合物中包含药物学可接受量的一种或多种本发明的酶变异体，所述组合物可以用来除去牙齿或假牙上的蛋白质类污物。这里所使用的“口腔清洁组合物”是指牙粉、牙膏、牙胶、牙粉、口腔清洗剂、口腔喷剂、口腔胶、口香糖、糖锭、袋装剂、片剂、生物胶、预防膏、牙科治疗液等。口腔清洁组合物包含一种或多种本发明的酶变异体，在组合物中的优选的含量是重量比从约0.001％至约20％，更优选的是从约0.001％至约10％，还要优选的是从约0.01％至约5％，以及药物学可接受的载体。这里所使用的“药物学可接受”的意思是术语中描述的药品、药剂或无活性的成分适用于接触人类和低级动物的组织，并且没有过度的毒性、不相容性、不稳定性、刺激、过敏反应等，具有合理的利益/风险比。典型地，口腔清洁组合物中口腔清洁成分中的药用口腔清洁载体成分的重量比通常是从约50％至约99.99％，优选的是从约65％至约99.99％，更优选的是从约65％至约99％。
可以包含于本发明的口腔清洁组合物的药用载体成分和可选的成分对于本领域的专业人员是熟知的。口腔清洁组合物中有用的许多不同的组合物类型、载体成分和可选成分公开于美国专利5,096,700，西贝尔，颁布于1992年3月17日；美国专利5,028,414，桑帕库马，颁布于1991年7月2日；和美国专利5,028,415，贝尼笛格、布什和桑伯格，颁布于1991年7月2日；所有这些在此处作为文献引用。
本发明的口腔清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。
实施例71-74牙粉组合物实施例编号成分71 72 73 74Gln59Asp+Ala98Glu+Gly102Asp 2.000 3.500 1.500 2.000+Ser105Glu+Leu109Thr山梨醇(70％水溶液) 35.000 35.000 35.000 35.000PEG-6*1.000 1.000 1.000 1.000
硅石牙科擦粉**20.000 20.000 20.000 20.000氧化钠0.243 0.243 0.243 0.243二氧化钛 0.500 0.500 0.500 0.500糖精钠0.286 0.286 0.286 0.286烷基硫酸钠(27.9％水溶液) 4.000 4.000 4.000 4.000香味剂1.040 1.040 1.040 1.040羧乙烯聚合物***0.300 0.300 0.300 0.300角叉胶****0.800 0.800 0.800 0.800水 补充至100％*PEG-6＝分子量为600的聚二醇**冷凝的硅石鉴别为Zeodent119，由J.M.胡伯提供。
***Carbopol由B.F.古德里希化学公司提供。
****Iota角叉胶由何库斯化学公司提供。
在实施例71-74中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被谷氨酰胺79天门冬氨酸+丙氨酸98谷氨酸+甘氨酸102天门冬氨酸+丝氨酸105谷氨酸+亮氨酸209苏氨酸所取代，结果大体上相同。
实施例75-78口腔清洁组合物实施例编号成分75767778Leu96Thr+Gly128Asp3.00 7.5 1.00 5.00+Ala133Glu+Asn155Glu+Lys213Asp+Ala216AspSDA 40醇 8.00 8.00 8.00 8.00
香味剂0.08 0.08 0.08 0.08乳化剂0.08 0.08 0.08 0.08氟化钠0.05 0.05 0.05 0.05甘油 10.00 10.00 10.00 10.00甜味剂0.02 0.02 0.02 0.02安息香酸 0.05 0.05 0.05 0.05氢氧化钠 0.20 0.20 0.20 0.20染料0.04 0.04 0.04 0.04水 补充至100％在实施例75-78中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被亮氨酸96苏氨酸+甘氨酸128天门冬氨酸+丙氨酸133谷氨酸+天门冬酰胺155谷氨酸+赖氨酸213天门冬氨酸+丙氨酸216天门冬氨酸所取代，结果大体上相同。
实施例79-82锭剂组合物实施例编号成分 79 8081 82Ser132Asp+Tyr217Leu 0.01 0.03 0.10 0.02山梨醇17.5017.5017.5017.50甘露醇17.5017.5017.5017.50淀粉 13.6013.6013.6013.60甜味剂1.20 1.20 1.20 1.20香味剂11.7011.7011.7011.70色素 0.10 0.10 0.10 0.10玉米浆 补充至100％
在实施例79-82中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被丝氨酸132天门冬氨酸+酪氨酸217亮氨酸所取代，结果大体上相同。
实施例83-86口香糖组合物实施例编号成分83848586Thr66Pro+Gln103Asn 0.030.02 0.10 0.05+Lys213Asp山梨醇晶体 38.44 38.00 38.00 38.00Paloja-T口香糖基质*20.00 20.00 20.00 20.00山梨醇(70％水溶液) 22.00 22.00 22.00 22.00甘露醇 10.00 10.00 10.00 10.00甘油7.567.56 7.56 7.56香味剂 1.001.00 1.00 1.00*由L.A.德里夫斯公司提供。
在实施例83-86中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被苏氨酸66脯氨酸+谷氨酰胺103天门冬酰胺+赖氨酸213天门冬氨酸所取代，结果大体上相同。2.假牙清洁组合物在本发明的另一个实施方案中，用于在口腔外清洁假牙的假牙清洁组合物包含一种或多种本发明的酶变异体。该假牙清洁组合物包含有效量的一种或多种酶变异体，在组合物中含量为重量比从约0.0001％至约50％，优选的含量是占组合物的重量比从约0.001％至约35％，更优选的是从约0.01％至约35％，以及假牙清洁载体。各种假牙清洁组合物的配方对本领域是熟知的，例如发泡片等(例见美国专利5,055,305，扬，此处作为文献引用)，并且是适合于与一种或多种酶变异体共同使用以从假牙上清除蛋白质类的污物。
本发明的假牙清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。
实施例87-90双层起泡牙科清洁片实施例编号成分87888990酸性层Gln59Glu+Ser63Glu+Val95Met 1.01.5 0.01 0.05+Gly97Pro+Tyr217Ala酒石酸 24.0 24.0 24.00 24.00碳酸钠 4.04.0 4.00 4.00磺酸 10.0 10.0 10.00 10.00PEG20,0004.04.0 4.00 4.00双碳酸钠 24.5 24.5 24.50 24.50过硫酸钾 15.0 15.0 15.00 15.00焦磷酸钠酸式盐 7.07.0 7.00 7.00焦化硅石 2.02.0 2.00 2.00TAED*7.07.0 7.00 7.00蓖麻碱磺基琥珀酸 2.02.0 2.00 2.00香味剂 7.07.0 7.00 7.00碱性层过硼酸钠单水合物 32.0 32.0 32.00 32.00二碳酸钠 19.0 19.0 19.00 19.00EDTA 3.03.0 3.00 3.00
三聚磷酸钠 12.0 12.0 12.00 12.00PEG 20,000 2.0 2.0 2.00 2.00过硫酸钾26.0 26.0 26.00 26.00碳酸钠2.0 2.0 2.00 2.00焦化硅石 2.0 2.0 2.00 2.00染料/香味剂 2.0 2.0 2.00 2.00*四乙酰乙二胺在实施例87-90中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被谷氨酰胺59谷氨酸+丝氨酸63谷氨酸+缬氨酸95甲硫氨酸+甘氨酸97脯氨酸+酪氨酸217丙氨酸所取代，结果大体上相同。3.接触透镜清洁组合物在本发明的另一个实施方案中，接触透镜清洁组合物包含一种或多种本发明的酶变异体。该接触透镜清洁组合物包含有效量的在组合物中含量为重量比从约0.01％至约50％的一种或多种酶变异体，优选的含量是占组合物的重量比从约0.01％至约20％，更优选的是从约1％至约5％，以及接触透镜清洁载体。各种接触透镜清洁组合物的配方对本领域是熟知的，例如片剂、液体等(例见美国专利4,863,627，戴韦思、米肯和力丝，颁布于1989年9月5日；美国专利Re.32,672，胡斯、拉木和其拉，重颁布于1988年5月24日；美国专利4,609,493，沙福，颁布于1986年9月2日；美国专利4,690,793，欧干比里和史密斯，颁布于1987年9月1日；美国专利4,614,549，欧干比里、里德海墨和史密斯，颁布于1986年9月30日；以及美国专利4,285,738，奥卡塔，颁布于1981年8月25日；其中每篇都在此处作为文献引用)，并且是适合于与一种或多种酶变异体共同使用以从接触透镜上清除蛋白质类的污物。
本发明的接触透镜清洁组合物的实施方案用下列实施例说明。
实施例91-94酶促接触透镜清洁组合物实施例编号成分91929394Serl91Glu+Gly219Ser 0.01 0.5 0.1 2.0葡萄糖50.00 50.0 50.0 50.0非离子表面活性剂(聚氧 2.00 2.0 2.0 2.0乙烯-聚氧丙烯共聚物)阴离子表面活性剂(聚氧 1.00 1.0 1.0 1.0乙烯-烷苯基醚硫醚钠)氯化钠1.00 1.0 1.0 1.0硼砂 0.30 0.3 0.3 0.3水补充至100％在实施例91-94中，列举于表2-25之中的BPN’变异体被丝氨酸191谷氨酸+甘氨酸219丝氨酸所取代，结果大体上相同。
在描述过本发明的具体实施方案之后，对于本领域的专业人员来说显而易见的是，各种针对本发明的改变和修改可以在本发明的主旨和范围的情况下完成。在后面的权利要求中，所有这样的修改将包含在本发明的范围内。
序列表(1)一般资料(i)申请人菲力浦F.布鲁德等(ii)发明名称具有更低的吸附性和更高的水解能力的BPN’变异体，其中一个或多个环状区被取代(iii)序列数1
(iv)联系地址(A)收件人PROCTER&GAMBLE公司(B)街道迈阿密河东路11810号(C)城市罗丝(D)州俄亥俄(E)国家美国(F)邮编45061(v)计算机可读格式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件专利发布#1.0，#1.25版(vi)现有申请数据(A)申请号(B)申请日期(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)姓名布蓝穆·J科丝坦洁(B)注册号34,804(C)代理人参考号5597(ix)通讯信息(A)电话513-627-2858(B)传真513-627-0260(2)第一号序列信息(i)序列特征(A)长度275个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO1丙氨酸 谷氨酰胺 丝氨酸 缬氨酸 脯氨酸 酪氨酸 甘氨酸1 5缬氨酸 丝氨酸 谷氨酰胺 异亮氨酸 赖氨酸 丙氨酸 脯氨酸10丙氨酸 亮氨酸 组氨酸 丝氨酸 谷氨酰胺 甘氨酸 酪氨酸1520苏氨酸 甘氨酸 丝氨酸 天门冬酰胺 缬氨酸 赖氨酸 缬氨酸25丙氨酸 缬氨酸 异亮氨酸 天门冬酰胺 丝氨酸 甘氨酸 异亮氨酸30 35天门冬酰胺 丝氨酸 丝氨酸 组氨酸 脯氨酸 天门冬酰胺 亮氨酸40赖氨酸 缬氨酸 丙氨酸 甘氨酸 甘氨酸 丙氨酸 丝氨酸45甲硫氨酸 缬氨酸 脯氨酸 丝氨酸 谷氨酸 苏氨酸 天门冬酰胺50 55脯氨酸 色氨酸 谷氨酰胺 天门冬氨酸 天门冬酰胺 天门冬酰胺 丝氨酸60组氨酸 甘氨酸 苏氨酸 组氨酸 缬氨酸 丙氨酸 甘氨酸65 70苏氨酸 缬氨酸 丙氨酸 丙氨酸 亮氨酸 天门冬酰胺 天门冬酰胺75丝氨酸 异亮氨酸 甘氨酸 缬氨酸 亮氨酸 甘氨酸 缬氨酸80丙氨酸 脯氨酸 丝氨酸 丙氨酸 丝氨酸 亮氨酸 酪氨酸85 90丙氨酸 缬氨酸 赖氨酸 缬氨酸 亮氨酸 甘氨酸 丙氨酸95天门冬酰胺 甘氨酸 丝氨酸 甘氨酸 谷氨酰胺 酪氨酸 丝氨酸100 105色氨酸 异亮氨酸 异亮氨酸 天门冬酰胺 甘氨酸 异亮氨酸 谷氨酸110色氨酸 丙氨酸 异亮氨酸 丙氨酸 天门冬酰胺 天门冬酰胺 甲硫氨酸115天门冬氨酸 缬氨酸 异亮氨酸 天门冬酰胺 甲硫氨酸 丝氨酸 亮氨酸120 125甘氨酸 甘氨酸 脯氨酸 丝氨酸 甘氨酸 丝氨酸 丙氨酸130丙氨酸 亮氨酸 赖氨酸 丙氨酸 丙氨酸 缬氨酸 天门冬氨酸135 140赖氨酸 丙氨酸 缬氨酸 丙氨酸 丝氨酸 甘氨酸 缬氨酸145缬氨酸 缬氨酸 缬氨酸 丙氨酸 丙氨酸 丙氨酸 甘氨酸150天门冬酰胺 谷氨酸 甘氨酸 苏氨酸 丝氨酸 甘氨酸 丝氨酸155 160丝氨酸 丝氨酸 苏氨酸 缬氨酸 甘氨酸 酪氨酸 脯氨酸165甘氨酸 赖氨酸 酪氨酸 脯氨酸 丝氨酸 缬氨酸 异亮氨酸170 175丙氨酸 缬氨酸 甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 天门冬酰胺 丝氨酸180丝氨酸 天门冬酰胺 谷氨酰胺 精氨酸 丙氨酸 丝氨酸 色氨酸185丝氨酸 丝氨酸 缬氨酸 甘氨酸 脯氨酸 谷氨酸 亮氨酸190 195天门冬酰胺 缬氨酸 甲硫氨酸 丙氨酸 脯氨酸 甘氨酸缬氨酸200丝氨酸 异亮氨酸 谷氨酰胺 丝氨酸 苏氨酸 亮氨酸 脯氨酸205 210甘氨酸 天门冬酰胺 赖氨酸 酪氨酸 甘氨酸 丙氨酸 酪氨酸215天门冬酰胺 甘氨酸 苏氨酸 丝氨酸 甲硫氨酸丙氨酸丝氨酸220脯氨酸 组氨酸 缬氨酸 丙氨酸 甘氨酸 丙氨酸 丙氨酸225 230丙氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 丝氨酸 赖氨酸 组氨酸235脯氨酸 天门冬酰胺 色氨酸 苏氨酸 天门冬酰胺 苏氨酸 谷氨酰胺240245缬氨酸 精氨酸 丝氨酸 丝氨酸 亮氨酸 谷氨酸 天门冬酰胺250苏氨酸 苏氨酸 苏氨酸 赖氨酸 亮氨酸 甘氨酸 天门冬酰胺255丝氨酸 色氨酸 酪氨酸 酪氨酸 甘氨酸 赖氨酸 甘氨酸260 265亮氨酸 异亮氨酸 天门冬酰胺 缬氨酸 谷氨酰胺 丙氨酸 丙氨酸270丙氨酸 谷氨酰胺27权利要求
1.一种具有野生型氨基酸序列的经修饰的氨基酸序列的BPN’变异体，该野生型氨基酸序列包含第一环状区、第二环状区、第三环状区、第四环状区和第五环状区；其特征为修饰氨基酸序列在一个或多个环状区的一个或多个位点有取代；其中A.当取代发生在第一环状区时，该取代发生在位点59、60、61、62、63、65或66中的一个或多个位点；其中a.当取代发生在位点59时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸；b.当取代发生在位点60时，取代氨基酸是谷氨酸；c.当取代发生在位点61时，取代氨基酸是天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丝氨酸；d.当取代发生在位点62时，取代氨基酸是天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丝氨酸；e.当取代发生在位点63时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；f.当取代发生在位点65时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸；并且g.当取代发生在位点66时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸；B.当取代发生在第二环状区时，该取代发生在位点95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或107中的一个或多个位点；其中a.当取代发生在位点95时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸；b.当取代发生在位点96时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸；c.当取代发生在位点97时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸；d.当取代发生在位点98时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸；e.当取代发生在位点99时，取代氨基酸是谷氨酸；f.当取代发生在位点100时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸；g.当取代发生在位点101时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；h.当取代发生在位点102时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸；i.当取代发生在位点103时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸；j.当取代发生在位点104时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸；k.当取代发生在位点105时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；l.当取代发生在位点106时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或缬氨酸；并且m.当取代发生在位点107时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸；C.当取代发生在第三环状区时，该取代发生在位点126、127、128、129、130、131、132或133中的一个或多个位点；其中a.当取代发生在位点126时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸；b.当取代发生在位点127时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸；c.当取代发生在位点128时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸或丝氨酸；d.当取代发生在位点129时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸或丝氨酸；e.当取代发生在位点130时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；f.当取代发生在位点131时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸或丝氨酸；g.当取代发生在位点132时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；并且h.当取代发生在位点133时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸；D.当取代发生在第四环状区时，该取代发生在位点154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166或167中的一个或多个位点；其中a.当取代发生在位点154时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸；b.当取代发生在位点155时，取代氨基酸是天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或丝氨酸；c.当取代发生在位点156时，取代氨基酸是天门冬氨酸；d.当取代发生在位点157时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸；e.当取代发生在位点158时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸；f.当取代发生在位点159时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；g.当取代发生在位点160时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸；h.当取代发生在位点161时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；i.当取代发生在位点162时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；j.当取代发生在位点163时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；k.当取代发生在位点164时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸或丝氨酸；l.当取代发生在位点165时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸；m.当取代发生在位点166时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸或丝氨酸；并且n.当取代发生在位点167时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸；E.当取代发生在第五环状区时，该取代发生在位点187、188、189、190或191中的一个或多个位点；其中a.当取代发生在位点187时，取代氨基酸是天门冬酰胺、天门冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸；b.当取代发生在位点188时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；c.当取代发生在位点189时，取代氨基酸是丙氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或缬氨酸；d.当取代发生在位点190时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；并且e.当取代发生在位点191时，取代氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；通过这些取代，与野生型枯草溶菌素BPN＇相比，BPN’变异体对不可溶底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。
2.如权利要求1中的BPN’变异体，其中一个或多个取代发生在第一环状区。
3.如权利要求1中的BPN’变异体，其中一个或多个取代发生在第二环状区。
4.如权利要求1中的BPN’变异体，其中一个或多个取代发生在第三环状区。
5.如权利要求1中的BPN’变异体，其中一个或多个取代发生在第四环状区。
6.如权利要求1中的BPN’变异体，其中一个或多个取代发生在第五环状区。
7.如权利要求1-6中的任何一种BPN’变异体，其中野生型氨基酸序列还包含一个第六环状区，其特征在于修饰的氨基酸序列在第六环状区也包含一个或多个取代；其中该取代发生在位点199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或220中的一个或多个位点；其中a.当取代发生在位点199时，取代199位的氨基酸是半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；b.当取代发生在位点200时，取代200位的氨基酸是组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；c.当取代发生在位点201时，取代201位的氨基酸是甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；d.当取代发生在位点202时，取代202位的氨基酸是脯氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；e.当取代发生在位点203时，取代203位的氨基酸是甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；f.当取代发生在位点204时，取代204位的氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；g.当取代发生在位点205时，取代205位的氨基酸是亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；h.当取代发生在位点206时，取代206位的氨基酸是脯氨酸、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；i.当取代发生在位点207时，取代207位的氨基酸是天门冬氨酸或谷氨酸；j.当取代发生在位点208时，取代208位的氨基酸是脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；k.当取代发生在位点209时，取代209位的氨基酸是异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；l.当取代发生在位点210时，取代210位的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；m.当取代发生在位点211时，取代211位的氨基酸是脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；n.当取代发生在位点212时，取代212位的氨基酸是谷氨酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；o.当取代发生在位点213时，取代213位的氨基酸是色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；p.当取代发生在位点214时，取代214位的氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；q.当取代发生在位点215时，取代215位的氨基酸是苏氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；r.当取代发生在位点216时，取代216位的氨基酸是组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；s.当取代发生在位点217时，取代217位的氨基酸是亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、组氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；t.当取代发生在位点218时，取代218位的氨基酸是谷氨酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；u.当取代发生在位点219时，取代219位的氨基酸是脯氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸；并且v.当取代发生在位点220时，取代220位的氨基酸是脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺、丝氨酸、天门冬氨酸或谷氨酸。
8.一种从包含硬表面清洁组合物、碗碟清洁组合物或口腔清洁组合物、假牙清洁组合物、接触透镜清洁组合物以及织物清洁组合物的组合物组中筛选出的清洁组合物，其特征在于该清洁组合物包含权利要求1-7中任何一项要求的BPN’变异体和清洁组合物载体。
9.如权利要求8中的清洁组合物，其中该清洁组合物是硬表面清洁组合物。
10.如权利要求8中的清洁组合物，其中该清洁组合物是织物清洁组合物。
11.编码权利要求1-7中任何一项权利要求的BPN’变异体的突变BPN’基因。
全文摘要
本发明涉及枯草溶菌素BPN′的变异体，它具有野生型BPN′氨基酸序列的修饰氨基酸序列，该野生型氨基酸序列包括第一环状区、第二环状区、第三环状区、第四环状区和和第五环状区；其中修饰的氨基酸序列在一个或多个环状区中的特定位点，包含与存在于野生型枯草溶菌素BPN′中的不同的氨基酸(即取代)，通过这些氨基酸的作用，BPN′变异体与野生型枯草溶菌素BPN′相比，对不可溶的底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。本发明还涉及编码这样的枯草溶菌素BPN′变异体的基因。本发明还涉及用于清洁多种表面的包含该枯草溶菌素BPN′的组合物。
文档编号C12N15/57GK1151761SQ95193941
公开日1997年6月11日 申请日期1995年3月16日 优先权日1994年5月2日
发明者P·F·博罗德三世, B·L·巴内特, D·N·卢宾, C·K·戈什 申请人:普罗格特-甘布尔公司 被以下专利引用 (1),