专利名称：通过发酵生产l-赖氨酸及l-谷氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及通过发酵生产L-赖氨酸及L-谷氨酸的方法。L-赖氨酸广泛用来作为食品添加剂等，并且L-谷氨酸广泛用来作为调味品等。
背景技术：
迄今为止工业生产的L-赖氨酸及L-谷氨酸是利用棒杆状细菌通过发酵方法来获得，这些细菌包括短颈细菌属及棒状杆菌属，它们具备产生这些氨基酸的能力。这些方法中，已知棒状细菌的生长需要生物素，但同时如果培养基中有过量生物素存在则L-谷氨酸不积累。因此，在常规生产L-谷氨酸方法中常采取下列方法之一。即在培养过程中限制培养基中生物素的浓度，或者在含有足够量的生物素的培养基中加入诸如表面活性剂或内酰胺抗生素作为生物素活性抑制剂使它们在培养过程的起始及中期阶段发挥作用。
然而，当使用诸如废糖浆这种廉价但含有过量生物素的原料在培养基中作为碳源，需要在培养基中加入生物素活性抑制剂，因而会增加产品费用。
另一方面，已知下列发酵方法可以用来同时生产L-赖氨酸及L-谷氨酸。即，在生产L-谷氨酸的条件下培养产生L-赖氨酸的细菌，或者将产生L-赖氨酸的细菌及产生L-谷氨酸的细菌混合后共同培养(日本专利公开号5-3793)。
然而，在通过发酵由生产L-谷氨酸的条件下培养产生L-赖氨酸的细菌，从而同时获L-赖氨酸及L-谷氨酸的方法之中，产生L-谷氨酸的条件是在含有低浓度生物素的培养基中培养短颈细菌属或棒状杆菌属生物素营养缺陷型细菌，或是在含有足够量生物素的培养基中在培养过程起始期及中期加入表面活性剂或内酰胺抗生素。尤其是使用诸如废糖浆这种廉价但富含过量生物素的原料作为培养基的碳源时，需要在培养基中加入表面活性剂或内酰胺类抗生素作为生物素活性抑制剂，这是增加产品费用的原因之一。
而且，在把产生L-赖氨酸细菌及产生L-谷氨酸细菌混合后共同培养的方法中，其存在的问题是培养过程控制有困难，发酵结果也不稳定。
发明的公开本发明的目标之一是提供通过发酵方法廉价且稳定地生产L-谷氨酸，即使在使用废糖浆这种富含过量生物素的原料作为培养基的碳源时也无需加入生物素活性抑制剂。
本发明的另一目标是提供通过发酵方法廉价且稳定地同时生产L-赖氨酸、L-谷氨酸，即使在使废糖浆这种富含过量生物素的原料作为培养基的碳源时也无需加入生物素活性制剂。
作为对上述目标的研究结果，本项发明的的发明者发现了一种常规用来产生L-谷氨酸的棒状细菌，它对生物素活性抑制剂温度敏感突变而产生变异菌株，即使无任何表面活性剂及内酰胺抗生素添加，变异菌株也能在富含过量生物素的培养基中产生并积累相当数量的L-谷氨酸。另外，发明者发现了通过赋于源自产生L-谷氨酸的棒状细菌以生物活性抑剂温度敏感特性的菌株，它即使在无任何表面活性剂或内酰胺抗生素添加也能由富含过量生物素的培养基中产生并积累相当数量的L-谷氨酸及L-赖氨酸。这样本发明就已完全实现了目标。
也即，本发明在于通过发酵产生L-谷氨酸的方法，它包括如下步骤由液体培养基培养突变株，在培养基中产生并积累L-谷氨酸，由培养基中收集L-谷氨酸，由产生L-谷氨酸的棒状细菌获得突变株，这种菌株对生物素活性抑制剂温度敏感突变，以及由无生物素活性抑制剂的富含过量生物素的任何培养基生产L-谷氨酸。
另一方面，本发明在于通过发酵生产L-赖氨酸及L-谷氨酸的方法，它包括如下的步骤由液体培养基培养突变株，在培养基中产生并积累L-赖氨酸及L-谷氨酸，由培养基中收集L-赖氨酸及L-谷氨酸，由产生L-谷氨酸的棒状细菌获得突变株，这种菌株有对生物素活性抑制剂温度敏感突变，以及由无生物素活性抑制剂的富含生物素的培养基生产L-赖氨酸和L-谷氨酸。
根据本发明的另一方面，它提供了源自产生L-谷氨酸的棒状细菌的突变株，这种菌株有对生物素活性抑制剂温度敏感突变，并具备由无生物素活性抑制剂的富含生物素培养基生产L-谷氨酸的能力。该突变株有时在此后称为“本发明的第一突变株”。
根据本发明的另一方面，它提供了源自产生L-谷氨酸的棒状细菌的突变株，该菌株有生物素活性抑制剂温度敏感突变，具备由无生物素活性抑制剂的富含生物素的培养基生产L-谷氨酸和L-赖氨酸的能力。该突变株有时在此后称为“本发明的第二突变株”。
根据本发明的另一方面，它提供了繁殖突变株的方法，该突变株具备由无生物素活性抑制剂的富含生物素的培养基生产L-谷氨酸的能力，本发明还赋予产生L-谷氨酸的棒状细菌对生物素活性抑制剂温度敏感的特点。
根据本发明的另一方面，它提供了繁殖突变株的方法，该突变株具备由无生物素活性抑制剂的富含生物素的培养基生产L-谷氨酸，L-赖氨酸的能力，本发明还赋予产生L-谷氨酸的棒状细菌对生物素活性抑制剂温度敏感的特点及其生产L-赖氨酸的能力。
本发明将于下面详细介绍其细节。
<1>源自产生L-谷氧酸细菌并具有生物素活性抑制剂温度敏感突变株的制备，以及L-谷氨酸的生产〔1〕源自产生L-谷氨酸细菌并具有生物素活性抑制剂温度敏感突变株的制备常规已知的产生L-谷氨酸的细菌是源自棒状中产生L-谷氨酸的细菌，当它们在含有不少于10μg/L浓度过量生物素的培养基中培养时，实际上并不能在液体培养基里产生L-谷氨酸，除非在培养过程起始阶段及中期的培养基内加入诸如表面活性剂或抗生素等生物素活性抑制剂。本发明的第一突变株即使在含有过量生物素的培养基中培养，也无需加入任何生物素活性抑制剂至培养基中就有产生L-谷氨酸的能力。即，本发明的第一突变株源自产生L-谷氨酸的棒状细菌，它带有生物素活性抑制剂的温度敏感突变，在无生物素活性抑制剂添加时可在富含过量生物素的培养基中产生L-谷氨酸。
上述突变株可通过赋予产生L-谷氨酸的棒状细菌以生物素活性抑制剂温度敏感特点诱导得到。生物素活性抑制剂包括表面活性剂及抗生素。
表面活性剂包括，饱和脂肪酸类如月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、棕榈酸；脂肪酸酯型非离子类表面活性剂如脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨聚糖酯、脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸聚乙二醇酯、脂肪酸聚乙二醇聚丙二醇酯、脂肪酸聚氧乙烯山梨聚糖酯；以及N-乙酰氨基酸类如N-棕榈酰甘氨酸、N-棕榈酰丙氨酸、N-棕榈酰缬氨酸、N-棕榈酰亮氨酸、N-棕榈酰苏氨酸、N-棕榈酰甲硫氨酸、N-棕榈酰天冬氨酸、N-棕榈酰谷氨酸、N-肉豆蔻酰谷氨酸、N-硬脂酰谷氨酸、N，N’-二棕榈酰乌氨酸、N，N’-二棕榈酰赖氨酸。
抗生素包括，内酰胺类抗生素如青霉素及头孢赖氨酸(cephalolysine)。
通常，产生L-谷氨酸的棒状细菌的生长会受到某个或更高浓度的生物素活性抑制剂的抑剂。在本发明中，对生物素活性抑制剂温度敏感的菌株具有一个特性，即当培养温度为33-37℃(最好不低于34℃)时，与不添加生物素活性抑制剂的培养过程相比，其生长受到明显抑制；而在培养温度为31.5℃(最适生长温度)、生物素活性抑制剂浓度最大时，我们可以看到，与无生物素活性抑制剂的培养过程相比，其生长状况相同。确切地说，下面定义的特性是所期望的。即当研究31.5℃及33-37℃时生物素活性抑制剂所施加的影响时，假定无生物素活性抑制剂时每个温度的生长程度均视为100，再由此计算每一个生物素活性抑制剂浓度下的相对生长程度，从而决定31.5℃时不少于80相对生长程度的最高浓度，以及33-37℃具有最高浓度生物素活性抑制剂时不多于50相对生长程度。
本发明涉及产生L-谷氨酸的棒状细菌包括迄今分类属于短颈细菌属但目前则划分属于棒状杆菌属的细菌(国标系统细菌学杂志，41卷，255页，1981年)，还包括属短杆细菌属但与棒状杆菌属较近的细菌。因此，本发明中所运用的突变菌株可以对下列属于短颈细菌属或棒状杆菌属的产生L-谷氨酸棒状细菌诱导得到。在此项说明中，如不涉及L-谷氨酸产量，属于棒状杆菌属或短杆细菌属的细菌均统称为“棒状细菌”。嗜乙酰乙酸棒状杆菌 ATCC 13870醋谷棒状杆菌 ATCC 15806颈棒状杆菌(callunae) ATCC 15991谷氨酸棒状杆菌 ATCC 13032(扩展短杆菌) ATCC 14020(乳发酵短杆菌) ATCC 13869(百合棒状杆菌) ATCC 15990(黄色短杆菌) ATCC 14067corynebacterium melassecolaATCC 17965解糖短杆菌 ATCC 14066Brevibacterium immariophilum ATCC 14068玫瑰色短杆菌 ATCC 13825生硫短杆菌 ATCC 19240嗜氨微杆菌 ATCC 15354嗜热产氨棒状杆菌(corynebacterium AJ12340(FERM BP-1539)thermoaminogenes)对生物素活性抑制剂温度敏感的细菌突变株可以通过下列突变处理的方法而得到紫外线辐射、X-光辐射、放射性辐射以及突变剂等处理上述细菌菌株，继而在含有生物素活性抑制剂的琼脂牛培养基上进行影印。即在33-37℃时观察生物素活性抑制剂在几个浓度时父代菌株的生长状况，较优选择是不低于34℃时决定最大浓度生物素活性抑制剂时仍有可见的细菌生长。分离得到的突变株，此株在上述同样温度及最大浓度生物素活性抑制剂中可能会不生长或生长速度显著下降。
通过上述方法已经赋予产生L-谷氨酸棒状细菌生物素活性抑制剂温度敏感特点。该突变株作为能够在无生物素活性抑制剂的富含过量生物素的培养基中生产L-谷氨酸的细菌加以繁殖。
〔2〕通过基团重组方法制备源自产生L-谷氨酸细菌的生物素活性抑制剂温度敏感突变株除了上述基于突变处理的方法以后，生物素活性抑制剂温度的敏感突变的突变菌株也可通过其它方法获得。例如，由产生L-谷氨酸的棒状细菌中获得生物素活性抑制剂相关抗性基因，该基因在体外进行突变处理以获得温度敏感性的生物素活性抑制剂抗性的突变表型基因。随后利用目前已经建立的同源重组方法将染色体上相应的野生型基因置换为突变型基因。这样即可获得生物素活性抑制剂温度敏感突变菌株。
下面所要描述的表面活性剂抗性相关基因也认为是生物素活性抑制剂相关抗性基因。源自棒状细菌的表面活性剂抗性相关基因可按如下方法分离(1)获取属于棒状细菌且表面活性剂敏感性增强的表面活性剂敏感突变株；(2)将野生型棒状细菌的各种染色体DNA片段与在棒状细菌中有效的载体连接以制备各种重组DNA；(3)将各种重组DNA导入棒状杆菌属表面活性剂敏感突变菌株完成转化；(4)由转化菌株筛选丧失表面活性剂敏感的菌株，即该菌株具增强的表面活性剂抗性；(5)由丧失表面活性剂敏感性的转化菌株中回收重组DNA；(6)分析与载体相连的野生型棒状细菌中染色体DNA片段的结构；由此所得的野生型棒状细菌的染色体DNA片段带有源自棒状细菌的表面活性剂抗性相关基因。该基因至少与棒状细菌在含有表面活性剂的培养基中产生L-谷氨酸的某一机制相关。同时，该基因还可能与添加青霉素或其它生物素限制物等方法产生L-谷氨酸有共同相关性。
在上述条目(1)中，“属于棒状细菌且表面活性剂敏感性增强的表面活性剂敏感突变株”指的是属于棒状细菌的突变株，它在含有对正常野生型棒状细菌生长无影响浓度的表面活性剂的培养基中严重生长不良。例如，当使用聚氧乙烯山梨聚糖甘油-棕榈酸酯作为表面活性剂时，在培养基中其浓度为0.1-1mg/dl时，与正常野生型菌株相比，属于棒状细菌的表面活性剂敏感突变株生长不良。相反，即使在培养基中表面活性剂浓度加至0.1-1mg/dl时，野生型棒状细菌生长却未见任何变化。显然与通常情况相比，在培养表面活性剂敏感突变株时，添加表面活性剂以产生L-谷氨酸，为产生L-谷氨酸所需表面活性剂的量明显减少。据估测表面活性剂敏感细菌菌株的状态大致与野生型菌株接触表面活性剂之后状态相当。
制备表面活性剂敏感性相关基因为获得属于棒状细菌的表面活性剂敏感突变菌株，可利用日本专利出版号52-24593中描述的方法。即对产生L-谷氨酸的棒状细菌施以诸如紫外线照射，X光照射，辐射照射以及突变剂处理等诱导突变方法，以获得在含有父系菌株能够生长剂量表面活性剂的琼脂培养基中不能生长的突变菌株。
属于棒状细菌的表面活性剂敏感突变株的特例为乳发酵短杆菌AJ11060，它在日本专利公开号59-10797中已予公开。
制备野生型棒状细菌的各种染色体DNA片段的方法如下。即在液体培养基中培养野生型棒状细菌，采用Saito等相同的方法由收集的细胞中回收染色体DNA(H.Saito和K.Miura，生物化学及生物物理Acta，72卷，619页(1963))。用限制性酶消化回收的染色体DNA。用一种识别四个核苷酸的酶对DNA进行不完全降解可制备多种DNA片段。
在棒状细菌中可操纵的载体有能在棒状细菌内自主复制的质粒。其具体例子如下。
(1)PAM330(见日本专利公开号No.58-67699)(2)PHM1519(见日本专利公开号No.58-77895)(3)PAJ655(见日本专利公开号No.58-192900)(4)PAJ611(同上)(5)PAJ1844(同上)(6)PCG1(见日本专利公开号No.57-134500)(7)PCG2(见日本专利公开号No.58-35197)(8)PCG4(见日本专利公开号No.57-183799)(9)PCG11(同上)为将棒状细菌内可操纵的载体与野生型棒状细菌的各种染色体DNA片段连接。制备各种重组DNA，该载体应以消化染色体DNA的同一限制性酶加以消化，或以能产生与多种染色体DNA片段末端互补顺序的限制酶加以切割。消化的载体与染色体DNA片段相连时通常使用T4DNA连接酶。
为将各种重组DNA导入属于棒状细菌的表面活性剂敏感的突变株系，可采取常规报道的转化方法。例如，可采用的方法有大肠杆菌K-12作为受体菌株时用CaCl2(氯化钙)处理，从而提高DNA的透性(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物学杂志，53卷，159页(1970))，或由处于增殖阶段的枯草杆菌作感受态细胞来导入DNA(Puncan，C.H.，Wilson，G.A.和Yound，F.E，基因杂志，1卷，153页，(1977))。也可采用如下方法，已知枯草杆菌，放线菌及酵母等的DNA受体细胞可转化为原生质体、原生质球状态，这种状态的DNA受体细胞易整合重组DNA以将重组DNA导入DNA受体。(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168卷，111页(1979)；Bibb，M.J.，Wand，J.M.和Hopwood，O.A.，自然，274卷，398页(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，美国国家科学院院刊，75卷，1929页(1978))。
至于原生质体方法，即使是使用上述枯草杆菌方法也能获得足够高的转化率。但是正如日本专利公开号57-183799中所述那样，也能够运用将棒状细菌细胞的原生质体与二价金属离子及聚乙二醇或聚乙烯醇之一相接触的状态下将DAN导入的方法。当然，使DNA导入易化的方法还可使用羧甲基纤维素，葡聚糖，菲可(Ficoll)及Pluronic F68(Serva公司)等类代替聚乙二醇或聚乙烯醇。本发明中采用电脉冲法(见日本专利公开号2-207791)作为转化方法的实施例。
下面将要描述由转化菌株中筛选丧失对表面活性剂敏感性的方法。
由限制酶Sau 3AI部分消化得到的长度为4-6Kbp的野生型棒状细菌染色体DNA片段与能在大肠杆菌及棒状细菌体内增殖的质粒载体相连接后得到重组DNA，这些重组体进一步导入大肠杆菌DH5菌株的感受细胞中(Takara Shuzo有限公司生产)或其类似物中。培养转化菌株可建立一个野生型棒状细菌基因文库。
表面活性剂敏感的变异菌株AJ11060与在上述基因文库中的重组DNA一起被转化。将获得的转化物？次涂布在不含表面活性剂的M-CM2G琼脂片上(每1升纯水中含有葡萄糖5g，多聚胨10g，酵母浸出物10g，氯化钠5g，DL-甲硫氨酸0.2g，琼脂15g及氯霉素4mg，pH7.2)而形成大约40,000个菌群，将这些菌群在含30mg/L表面活性剂(聚山梨醇酯40)的M-CM2G片上复制以便获得呈良好生长状态的菌株，这样就得到了对表面活性剂不敏感的菌株。
制备野生型棒状细菌染色体DNA的方法也可以同样用于从失去表面活性剂敏感性的转化菌株中回收重组DNA。即在液体培养基中培养转化菌株，用Saito等(H.Saito，K.Miura，生物化学及生物物理进展，72卷，619页(1963年))的方法从收集的细胞中回收重组DNA。
与载体相连接的野生型棒状细菌染色体DNA片段的结构按如下方法分析。染色体DNA片段的全部核苷酸序列由常规的双脱氧链终止法进行序列分析。对DNA序列进行分析以确定增强子，启动子，操纵子，SD序列，引导肽，衰减子，起始密码子，终止密码子以及开放阅读框架等的位置。按照上面描述所得的源自棒状细菌的表面活性剂抗性相关基因在下述实施例3中称为“dts R基因”。该dts R基因至少包括序列表中SEQ ID No1中所示的由467-469位ATG至1985-1987位CTG之间的序列。由此序列所编码的氨基酸序列在序列表中SEQ IDNOS1及2示出。在上述467-469位ATG同一框架的上游位置存在另一个ATG(核苷酸序列号359-361)。不可否认这个多余的ATG可能是启动子。然而，根据对该基因上游共感序列的分析可推测上述467-469位ATG是起始密码子。即由此推测dts R基因编码的肽所具有的氨基酸序列包括SEQ ID No2中示出的氨基酸序列37-543位。这个肽称为“DTSR蛋白”。凡在本发明的设计说明书中及权利要求涉及DTSR蛋白的氨基酸和dtsR基因的核苷酸序列时，它们的描述通常以467-469位ATG作为起始密码子。当然，359-361位ATG作为起始密码子的可能性也需要考虑。例如，当将dts R基因引入属于短杆菌属的细菌中以扩大表达，可以设想包括SEQ ID No1中示出的核苷酸号467-1987序列将会表达。当然也很容易为本专业技术熟练人员所理解，如果SEQ ID No1中示出的编码区域和其上游区域中包括核苷酸号359-466也导入短杆细菌属的细菌内，DTSR蛋白以任何ATG作为起始密码子均能正确表达。dtsR基因在细菌细胞中表达，N末端由起始密码子编码的甲硫氨基有时会为氨肽酶切除。
正如下述实施例3中所述，DTSR蛋白的氨基酸序列表明它与已报道的蛋白质有同源性。该蛋白质在美国国家科学院院刊，83卷(1986年)，8049-8053页；美国国家科学院院刊，83卷(1986年)，4864-4868页；及基因，122卷(1992年)，199-202页等文章称为丙酮酸辅酶A羧化酶(PPC)蛋白的β-亚基。所有这些文章均未描述能表明该蛋白质涉及谷氨酸的生产。
丙酰辅酶A羧化酶是一种催化反应，其代谢途径是通过2-羟基戊二酸，丙酰辅酶A，D-甲基丙二酰辅酶A及L-甲基丙二酰辅A酶等将α-酮戊二酸转化为琥珀酰辅酶A。这条代谢途径可能是三羧酸循环中α-酮戊乙酸脱氢酶催化的反应的旁路。另外丙酰辅酶A羧化酶需要生物素作为辅酶。根据这些证据，显示丙酰辅酶A羧化酶催化的反应，上述代谢途径或其部分包含的某些反应涉及表面活性剂抗性。因此与表面活性剂抗性相关的基因极可能包括丙酰辅酶A羧化酶差的α-亚基，或者其它能催化上述代谢途径的其它酶或其部分亚基的编码基因，除本身的dtsR基因之外，另外，本发明者还发现DTSR蛋白缺陷株的培养需要油酸。乙酰辅酶A羧化酶也需生物素为辅酶并与丙酰辅酶A羧化酶有相同的结构。因此编码脂肪酸代谢途径中催化每一步反应的酶或其部分亚基的基因可能也都与表面活性剂抗性相关。本发明中“表现生物素活性抑制剂温度敏感突变”可能也包括这些基因的突变。
由基因替换法制备导入突变型dtsR基因的菌株表面活性剂温度敏感突变也可以由以上述所得到的dtsR基因为代表的，与表面活性剂抗性相关基因产生突变而得到。即可通过这样的步骤来实现，包括将所得基因通过体外引入突变使之能制备具有产生温度敏感功能的基因产物-突变型基因，并通过同源重组方法将染色体上已有的野生型基因替换。同源重组的基因替换方法已经建立。例如它可通过使用线性DNA方法，或温度敏感质粒的方法加以利用。
具体地说，将dtsR基因修饰为突变型基因包括在编码区或启动子区域的核苷酸序列中一或多个核苷酸位点上引起置换，缺失，插入，增加或倒位，使用的方法有定点突变法(Kramer，W.和Frits，H.J.，酶学方法，154卷，350页，(1987年))，或次氯酸钠及羟胺等化学诱变剂处理(Shortle，D.和Nathans，D.，美国国家科学院院刊，75卷，270页(1978年))。
定点突变方法中使用人工合成的寡聚核苷酸，它能够在可选及特定的碱基对中引入可选的置换，缺失，插入，增加及倒位。使用该方法时，首先将含有确切核苷酸序列并克隆的dtsR基因的质粒变性以制备单链DNA。然后使用欲改变其部分的寡聚核苷酸人工合成的互补片段。当然，该人工合成的寡聚核苷酸并非要完全互补，它应该允许可选的碱基置换，缺失，插入，增加及倒位。单链DNA与带有可选的碱基置换，缺失，插入，增加及倒位的人工合成的寡聚核苷酸共同退火。由T4连接酶及DNA聚合酶I的Klenow片段制备完整的双链质粒，将其导入感受态大肠杆菌细胞中。由此而得到的转化体中，其质粒携带的基因内可选的碱基置换，缺失，插入，增加或倒位将会固定。引入基因突变的类似方法包括PCR重组方法(PCR技术，Stockton出版社(1989))。
化学试剂处理方法是以次氯酸及羟胺等直接处理含有目标基因的DNA片段，它能在DNA片段中随机地引入碱基置换，缺失，插入，增加或倒位。
由导入突变的基因替换产生L-谷氨酸棒状细菌染色体上正常基因的方法为同源重组(分子遗传学实验，冷泉港实验室出版社(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，细菌学杂志，162卷，1196页(1985年))。在同源重组中，与染色体上某些序列有同源性的质粒等被引入细菌细胞，在有同源性序列的位置上发生一定频率的重组，这样整个质粒即可整合进入染色体。如在染色体同源序列处又发生新的重组，则该质粒会从染色体下脱落。此时，根据重组在染色体上产生位置的不同有时会导致导入突变的基因更加固定，而原来染色体上正常的基因则会随质粒从染色体上脱落。对这些细菌菌株进行筛选，可能会筛选到染色体上正常基因为具有碱基置换，缺失，插入，增加或倒位的导入突变的基因所替换的菌株。
增强谷氨酸生物合成系统基因以改进表面活性剂温度敏感突变株的L-谷氨酸生产能力产生L-谷氨酸细菌的表面活性剂温度敏感突变株的L-谷氨酸生产能力可通过增强谷氨酸生物合成系统的基因来实现。细胞内谷氨酸生物合成系统的基因得到增强的实施例有糖酵解途径中的磷酸果糖激酶(PFK，日本专利公开号63-102692)，糖回补途径中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC，日本专利公开号60-87788和62-55089)，三羧酸循环中的柠檬酸合成酶(CS，日本专利公开号62-201585和63-119688)，乌头酸水化酶(ACO，日本专利公开号62-294086)，异柠檬酸脱氢酶(ICDH，日本专利公开号62-166890和63-214189)及催化氨化反应的谷氨酸脱氢酶(GDH，日本专利公开号61-268185)。
下面叙述的几种方法可能获得上述基因。
(1)一个突变菌株的获得有如下表现，即目的基因发生突变后表现出可鉴别的特征，而再引入目的基因时则特征消失。与突变菌株特征互补的基因可由棒状细菌染色体上获得。
(2)如果已从其它生物中获得目的基因，并确证了它的核苷酸序列，可以高度同源区DNA序作探针以杂交的方法获得目的基因。
(3)如果目的基因的核苷酸序列已完全清楚，则可以棒状细菌染色体为模板通过聚合酶链式反应(PCR法)获得带目的基因的基因片段。
此处所用染色体可以按前面所述Saito等方法(H.Saito和K.Miura生物化学与生物物理进展，72卷，619页，(1963年))获得。任何可行的棒状细菌宿主-载体系统都可运用，上述描写的系统也能使用。上述条款(3)中提及的方法，在核苷酸序已清楚时可以使用，本发明中以此为实施例在下文加以描述。
按照上述条款(2)、条款(3)的方法所得目的基因有时没有独自的启动子。在这种情况下，可将棒状细菌中有活性启动子的DNA片段插入目的基因的上游以使目的基因表达。为使目的基因能增强表达，可将目的基因连接在强启动子下游。在棒状细菌细胞中可用的启动子中强启动子有大肠杆菌lac启动子、tac-启动子，及trp启动子(Y.Morinaga，M.Tsuchiya，K.Miwa及K.Saho，生物技术杂志，5卷，305-312页(1987年)。另外，棒状细菌的trp启动子也是较优选的启动子(日本专利公开号62-195294)。该启动子在本发明的下文中用来作为表达PEPC基因的实施例。
由源自产生L-谷氨酸细菌的表面活性剂温度敏感突变株生产L-谷氨酸本发明中生产L-谷氨酸的方法包括，在液体培养基中培养由上述方法制备的、源自产生L-谷氨酸细菌的表面活性剂温度敏感突变株，在培养基中产生并积累谷氨酸，最后由培养基中收集谷氨酸。
根据本发明，使用一种常规的含有碳源、氮源、无机盐及生长因子等营养成分的液体培养基来培养上述突变菌株。本发明的突变菌株在无生物素活性抑制剂的培养基中也能产生L-谷氨酸，即使该液体培养基中含有过量的生物素。
葡萄糖、果糖、蔗糖、废糖浆，淀粉水解物等碳水化合物；乙醇、甘油等醇类；乙酸等有机酸均可用来作为碳源。硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、磷酸铵、乙酸铵、氨水、胨、肉膏浸出物，酵母浸出物，谷物浸渍液等可用来作为氮源。当使用的突变菌株是营养缺陷型时，加入所需成分的制备物或含该成分的天然材料。
发酵在有氧状态进行2-7天，培养过程中振荡、搅动培养物并使之通气，保持培养液pH为5-9。用尿素、碳酸钙、氨气、氨水等调节pH值。培养温度为24-37℃。然而只有在起始培养温度为31.5℃，进而升温至33-40℃，最优选的是培养中期为37℃，这才能获得好的培养结果。即细菌在最适生长温度附近得到充分增殖，随后培养中再升温。这样生产L-谷氨酸从开始就不需加入任何生物素活性抑制剂，L-谷氨酸能在液体培养基中有相当量的产生与积累。
本发明者发现一种DTSR蛋白缺陷的菌株，它能在无任何生物素活性抑制剂的培养基中产生L-谷氨酸，即使该液体培养基中含有过量的生物素。该DTSR蛋白缺陷的菌株培养需油酸。然而，表面活性剂温度敏感突变株在常规培养温度即31.5℃时不需油酸。
由液体培养基中收集产生与积累的L-谷氨酸可按常规方法进行。例如，可用阴离子交换树脂方法，结晶化方法等。具体地说，L-谷氨酸通过阴离子交换树脂被吸附和分离，或通过中和作用被结晶化。
<2>制备能产生L-赖氨酸的表面活性剂温度敏感突变株，以及生产L-赖氨酸，L-谷氨酸当在含过量的不低于10μg/L生物素的培养基中培养源自产生L-谷氨酸的棒状细菌的常规已知产生L-赖氨酸细菌时，它像其它上述提及的产生L-谷氨酸细菌一样只产生和积累L-赖氨酸和其它非L-谷氨酸，除非在培养起始或中期过程中的培养基内加诸如表面活性剂或抗生素等生物素活性抑制剂。本发明所得的突变菌株即使在含有过量生物素的任何液体培养基中生长并同时产生L-赖氨酸、L-谷氨酸也无需向其中添加任何生物素活性抑制剂。这样的变异株具有上述L-谷氨酸细菌的变异株对表面活性剂温度敏感的特性，并能产生L-赖氨酸。即本发明的第二突变株源自产生L-谷氨酸的棒状细菌，带有产生L-赖氨酸及生物素活性抑制剂温度敏感的突变，具有在含过量生物素的培养基中同时产生L-赖氨酸、L-谷氨酸而无需生物素活性抑制剂的能力。
L-赖氨酸的生产能力可通过对S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(此后简称为“AEC”)抗性突变而得到(日本专利出版号48-28078)。其它一些产生L-赖氨酸的突变菌株有需要氨基酸如L-高丝氨酸才生长的突变菌株(日本专利出版号56-6499)；对AEC表现抗性且需要氨基酸如L-亮氨酸，L-高丝氨酸，L-辅氨酸，L-丝氨酸，L-精氨酸，L-丙氨酸，L-缬氨酸等氨基酸才生长的突变株(美国专利号3,708,395和3,825,472)；对DL-α-氨基-ε-己内酰胺，α-氨基-月桂酰内酰胺，天冬氨酸类似物，磺胺类药物，醌类，N-月桂酰亮氨酸等表现抗性的产生L-赖氨酸的突变株；对含氧乙酸(oxyaloacetate)脱羧酶或呼吸系统酶等的抑制剂表现抗性的产生L-赖氨酸的突变菌株(日本专利公开号50-53588，50-31093，52-102498，53-9394，53-86089，55-9783，55-9759，56-32995和56-39778，和日本专利出版号53-43591及53-1833)；需要肌醇或乙酸才能生长的产生L-赖氨酸的突变菌株(日本专利公开号55-9784和56-8692)；对氟代丙酮酸及不低于34℃温度敏感的产生L-赖氨酸突变菌株(日本专利公开号55-9873和53-86090)；和产生L-赖氨酸突变菌株(美国专利号4,411,997)等等。
本发明的第二突变株可以通过诱导所产生L-赖氨酸且源自产生L-谷氨酸的棒状细菌，赋予它们以表面活性剂及抗生素等生物素活性抑制剂温度敏感特征。
它们的温度敏感特征可采用上述条款<1>中在本发明第一突变株引入温度敏感的方法。即可采用下列突变处理的方法获得生物素活性抑制剂温度敏感突变株，它包括紫外线照射，X-光照射，辐射照射及诱变剂等处理具产生L-赖氨酸活性的产生L-谷氨酸的棒状细菌，再以含生物素活性抑制剂的琼脂平板培养基重复该过程。即在33-37℃培养条件下观察几个浓度下父系菌株的生长情况，优化选择是在不低于34℃时选择可识别细胞生长的最大生物素活性抑制剂浓度。分离所得的突变菌株，该株在上述同样温度及最大生物素活性抑制剂浓度下不生长或缓慢生长。或者如条款<1>[2]中所示，生物素活性抑制剂温度敏感突变株也能通过基因重组方法获得。
或者本发明的第二突变株也能通过以下方法得到，即先诱导生物素活性抑制剂温度敏感突变株，该株由产生L-谷氨酸的棒状细菌而得，再赋予该突变株生产L-赖氨酸的能力。
按照上述方法赋予产生L-谷氨酸的棒状细菌以生物素活性抑制剂温度敏感特性及生产L-赖氨酸的能力。进而对这种突变菌株进行繁殖，该菌株在含过量生物素且无任何生物素活性抑制剂的培养基中既能产生L-赖氨酸又能产生L-谷氨酸。
如同条款<1>[3]中所述，本发明第二突变株产生L-谷氨酸的能力可按上述谷氨酸生物合成系统基因的增强来改善。同样，产生L-赖氨酸的能力也可通过赖氨酸生物合成系统基因的增强来改善。
细胞内赖氨酸生物合成系统基因增强已知的实施例对L-赖氨酸和L-苏氨酸所抑制协同反馈基本不反应的编码天冬氨酸激酶α-亚基或β-亚基蛋白基因基本不反应(WO94/25605国际公开本)，源自棒状细菌的野生型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(日本专利公开号60-87788)，源自棒状细菌的编码野生型二氢吡啶二羧酸合成酶基因(日本专利出版号6-55149)等。
一种常见的培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子等，它的成分与上述用来培养第一突变株相同，它被用作本发明中第二突变株培养的液体培养基。本发明的第二突变株具有在即使含过量生物素也无任何生物素活性抑制剂的任何液体培养基中同时产生L-赖氨酸及L-谷氨酸的能力。
发酵在有氧状态进行2-7天，培养过程中振荡，搅动培养物并使用之通气，保持培养液pH为5-9。用尿素、碳酸钙、氨气、氨水等调节pH值。培养温度为24-37℃。然而只有在起始培养温度为31.5℃，进而升温至33-40℃，最优化的是培养中期为37℃，这样才能获得好的培养结果。即L-赖氨酸主要在31.5℃时产生，而产生L-谷氨酸的速度会随着培养过程中温度的升高而增加。利用此现象，可根据期望来调控L-赖氨酸与L-谷氨酸在液体培养基中最后的比例。
一种常规的方法可用来收集在液体培养基中产生与积累的L-赖氨酸和L-谷氨酸。例如，离子交换树脂方法，结晶法等都可使用。当使用离子交换树脂方法时，L-赖氨酸首先在培养基中由阳离子交换树脂吸附并分离，随后L-谷氨酸由阴离子交换树脂吸附并分离，或由中性化使其结晶。当使用L-赖氨酸及L-谷氨酸混合物时，自然就无需将两者分开。
附图简述
图1示出PESP在31.5℃、35℃时对乳发酵短杆菌AJ13029及其亲代菌株ATCC13869生长情况的影响。
图2示出已导入携dts R基因质粒的乳发酵短杆菌AJ11060的表面活性剂抗性。
图3示出了PESP在31.5℃、34℃时对乳发酵短杆菌AJ12993生长情况的影响。
实施发明的最佳方式本发明将参照下列实施例明确加以解释。
实施例1制备原自产L-谷氨酸棒状细菌的生物素活性抑制剂温度敏感突变株1.通过影印法测量产生L-谷氨酸细菌对生物素活性抑制剂的敏感性按照影印法测量乳发酵短杆菌ATCC13869对聚氧乙烯山梨聚糖-棕榈酸酯(PESP)的敏感性。
乳发酵短杆菌ATCC13869于31.5℃在CM2B琼脂平板培养基中生长过夜以获得细菌细胞，该培养基成分在表1中示出。细菌在无菌的生理盐水中悬浮，接种至上述琼脂平板培养基，在31.5℃培养20-30小时至形成克隆。它们影印至加有每一浓度PESP的CM2B琼脂培养基上，在35℃培养20-30小时观察其生长状态。
表1成分 浓度蛋白胨(polypeptone)(Nihon药厂生产)1.0％酵母浸出物(Difo生产) 1.0％氯化钠0.5％D-生物素 10μg/L琼脂 1.5％pH7.2结果表明在35℃培养时，允许细菌生长的PESP浓度在3mg/dl附近为其阈值，如表2所示。
表2PESP浓度 0 0.1 0.3 1.0 3.0 10 30(mg/dl)克隆形成 + ++++- -
2.诱导时生物素活性抑制剂表现温度敏感的突变菌株乳发酵短杆菌ATCC13869于31.5℃在琼脂肉汤培养基中培养24小时以获得细菌细胞。所得细菌细胞置30℃在250μg/ml的N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍水溶液中处理30分钟。存活率为1％的悬浮细菌细胞随后接种于CM2B琼脂平板培养基上，在31.5℃培养20-30小时以形成克隆。它们被相应地影印至CM2B琼脂培养基及加有3mg/dl PESP的CM2B琼脂培养基上，在35℃培养20-30小时。由此获得细菌菌株，它们能在CM2B培养基上生长但在含3mg/dl PESP的CM2B培养基上无可见的生长。从约10,000个克隆中获得720个菌株。每一个获得的细菌菌株在35℃时在含3mg/dl PESP的CM2B琼脂培养基上是否生长，对其进行再次验证。明显无敏感性的菌株被排除，获得435株表现敏感性的菌株。
3.验证生物素活性抑制剂温度敏感突变株生产L-谷氨酸的能力在条款2中所得435个突变菌株及其亲代菌株ATCC13869按如下方法验证它们生产L-谷氨酸的能力。
ATCC13869菌株及每一突变菌株于31.5℃，分别在CM2B琼脂培养基上培养20-30小时，随之将所得细菌细胞接种至成分如表3所示培养基A的液体培养基中，在31.5℃温度中振荡培养。大约22小时后，再重新加入培养基使最终浓度同表3中的培养基B，随后于31.5℃培养24小时或将培养温度调至35℃或37℃再培养同样时间。培养完毕后，用Asahi化学工业公司生产的生物技术分析器(Biotech Analyzer)检测L-谷氨酸产生与否。结果表明435个突变株中有106个突变株可产生谷氨酸。
表3成分 培养基A 培养基B葡萄糖 3g/dl5g/dlKH2PO40.14g/dl 0.14g/dlMgSO4·7H2O 0.04g/dl 0.04g/dlFeSO4·7H2O 0.001g/dl0.001g/dlMnSO4·4H2O 0.001g/dl0.001g/dl硫酸铵(NH4)2SO41.5g/dl 2.5g/dl大豆蛋白水解液1.5ml/dl0.38ml/dl盐酸硫胺素 0.2mg/l 0.2mg/l生物素 0.3mg/l 0.3mg/l消泡剂0.05ml/l 0.05ml/lCaCO35g/dl5g/dlpH7.0(以氢氧化钾调pH值)表4中示出了ATCC13869菌株及其它突变株的代表株在每一温度下积累产生的L-谷氨酸数量。
表4突变菌株积累的L-谷氨酸数量(g/dl)细菌菌株温度转换后的培养温度31.5℃35℃37℃ATCC13869 0.0 0.0 0.2No.21 0.3 2.8 2.9No.36 2.4 2.6 2.7No.58 0.2 1.9 2.7No.100 0.4 1.5 2.8No.121 0.5 1.7 1.94.验证生物素活性抑制剂的温度敏感活性上述条款3中所述对PESP温度敏感在液体培养中由如下方法验证。
每一个突变株及其亲代菌株在CM2B琼脂平板培养基于31.5℃培养24小时以获得细菌细胞。所得细菌细胞接种至CM2B液体培养基及含浓度为3mg/dl PESP的CM2B液体培养基中，在31.5℃和37℃中振荡培养24小时。在660nm处测定液体培养基光密度值。假定无PESP的培养基在每一温度的生长程度为100，据此确定添加PESP培养基中细菌的相对生长程度。结果在表5中示出
表5细菌菌株 相对生长程度31.5℃37℃ATCC 13869 9885No.21 8133No.36 5215No.58 8532No.1008232No.1219540如表中所示，乳发酵短杆菌ATCC13869作为亲代菌株在3mg/dl的PESP浓度、37℃时其相对生长程度为85，而每一突变株在有PESP时相对生长程度为40或更低，表明它们对3mg/dl浓度的PESP的敏感性。
上述条款3中提及的突变株之一-21号突变株及其亲代菌株ATCC13869，它们在几个浓度的PESP及31.5℃和35℃时的相对生长程度由图1示出。
突变菌株中21号称为乳发酵短杆菌AJ13029，1994年9月2日保藏于通产和科学技术省国立生命科学和人体技术研究所，其贮存号为FERM P-14501，根据布达佩思公约1995年8月1日转至国际保藏库，其保藏号为FERM BP-5189。
实施例2生产L-谷氨酸1.培养温度转换时间设定的研究乳发酵短杆菌ATCC13869或AJ13029接种至成分如表中所示的种子培养基中，在31.5℃中振荡培养24小时以获得种子培养物。成分如表6中所示的进行大量培养的培养液每份为300ml加至容积为500ml的玻璃发酵罐中，加热消毒。此后向其中加入40ml种子培养物。培养时搅动速率为800-1,300rpm，通气量为1/2或1/1vvm，培养温度为31.5℃。使用氨气使培养液体pH值保持在7.5。在开始培养后8小时、12小时或16小时将培养温度转为37℃。同时也设置了一个培养温度不变的对照，这样该培养物仍在31.5℃中继续培养。
表6成分 浓度种子培养物大量培养物葡萄糖5g/dl 15g/dlKH2PO40.1g/dl0.2g/dlMgSO4·7H2O 0.04g/dl 0.15g/dlFeSO4·7H2O1mg/dl 1.5mg/dlMnSO4·4H2O1mg/dl 1.5mg/dl大豆蛋白水解液 2ml/dl 5ml/dl生物素 50μg/l 200μg/l盐酸硫铵素 200μg/l 300μg/l在每一试验中，培养过程在20-40小时之间的某一时间点终止，此时葡萄糖已完全耗尽。对培养液中产生与积累的L-谷氨酸数量测定。结果在表7中示出。
表7温度转换时间选择(小时)产生L-谷氨酸数量(g/dlATCC13869AJ1302980.5 8.3120.1 7.0160.0 5.4- 0.0 2.1据此结果，可以认为当培养温度由31.5℃转至37℃时，AJ13029菌株即使在含有过量生物素的且无任何生物素活性抑制剂的培养基中仍能产生L-谷氨酸，且L-谷氨酸量的增加与培养温度转换时间早晚成比例。相反，其亲代菌株ATCC13869即使转换培养温度也几乎不产生L-谷氨酸。
离心去取已经过8小时温度转换后的1升液体培养物中细菌细胞。运用常规的离子交换树脂法从所得上清中分离与提纯L-谷氨酸。所得L-谷氨酸钠晶体为64.3克。
2.研究转换温度按照上述条款1中同样方式使用容积为500ml玻璃发酵罐在31.5℃下培养乳发酵短杆菌ATCC13869和AJ13029。在开始培养后8小时将培养温度转换至34℃，37℃或39℃。培养温度不转换的对照继续在31.5℃中培养。在每一实验中，培养过程在20-40小时之间的某一时间点终止，此时葡萄糖已完全耗尽。对培养液中产生与积累的L-谷氨酸数量进行测定。结果在表8中示出。
表8转换后温度(℃) 产生L-谷氨酸数量(g/dl)ATCC13869 AJ1302934 0.05.837 0.58.339 0.99.2- 0.02.1据此结果，可以认为当温度转换后随着温度升高，AJ13029菌株产生L-谷氨酸数量有增加的趋势。
实施例3用基因重组方法制备源自产生L-谷氨酸的棒状细菌对生物素活性抑制剂温度敏感的突变株1.制备乳发酵短杆菌ATCC13869(产生L-谷氨酸棒状细菌的野生株)的染色体DNA将乳发酵短杆菌ATCC13869接种至100ml T-Y培养基中(细菌培养用胰化蛋白胨(Difco)1％、Bacto-酵母浸出物(Difco)0.5％、氯化钠0.5％(pH7.2))，于31.5℃培养8小时获得培养物。将培养物以3,000r.p.m.离心15分钟获0.5g湿润细菌细胞。用Saito和Miura(生物化学、生物物理学报，72卷，619页(1963年))方法从该湿润细菌细胞中获得染色体DNA。下一步，将60μg的染色体DNA及3个单位的限制性酶Sau 3AI分别与10mM Tris-盐酸缓冲液(含50mM氯化钠，10mM硫酸镁及1mM二硫苏糖醇(pH7.4))混合，于37℃反应30分钟。用常规酚提取及乙醚沉淀法处理完全反应后的溶液以获得50g被Sau 3AI消化的乳发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA片段。
2.利用质粒载体DNA构建乳发酵短杆菌ATCC13869基因文库为使制备的基因文库既能导入大肠杆菌细胞又能导入棒状细菌属的细菌细胞，制备了能在两者胞内自主复制的质粒。确切地说，能在棒状细菌内自主复制且已获得的质粒pHM1519(农业生物化学，48卷，2901-2903页，(1984年))的复制起点，被包含在质粒pHK4(日本专利公开号5-7491)中。这种质粒以限制性酶Bam HI及Kpn I消化后得到带有复制起点的基因片段。用产生平滑末端试剂盒(TakaraShuzo公司生产Blunting Kit)获得平滑末端基因片段，使用生产Sal I衔接物(Takara Shuzo公司生产)将其插入质粒载体pHSG399(Takara Shuzo公司生产)的Sal I位点以构建pSAC4。带有pHK4的大肠杆菌HB101菌株称为大肠杆菌AJ13136，于1995年8月1日保藏于通产和科学技术省国立生命科学和人体技术研究所，其保藏号为FERM BP-5186。
上述构建的质粒pSAC4(20μg)与限制性酶Bam HI(20单位)在50mM Tris-盐酸缓冲液中(含有100mM氯化钠及10mM硫酸镁(pH7.4))，在37℃反应2小时以获得消化液。该溶液按常规方法以酚抽提及乙醇沉淀。此后，为防止来自质粒载体的DNA自身重新环化连接，运用分子克隆第二版中(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，p1.56(1989年))的细菌碱性磷酸酶处理，使DNA片段去除磷酸基团方法，然后再运用常规的酚抽提及乙醇沉淀处理的方法。
将Bam HI消化的pSAC4(1μg)，条款1中所得Sau 3AI消化的乳发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA片段，及T4DNA连接酶(2单位)(Takara Shuzo公司生产)加入含有66mM氯化镁，10mM二硫苏糖醇和10mM ATP的66mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)中，于16℃反应16小时使DNA进行连接。下一步，用常规方法使DNA混合物转化大肠杆菌DH5，转化后该菌在含170μg/ml氯霉素的L-琼脂培养基上涂布生长。最终得到约20,000个克隆。至此建成基因文库。
3.转化乳发酵短杆菌AJ11060由上述约20,000个克隆中回收重组DNA。回收方法同上述Saito及Miura的方法。
重组DNA混合物分成50批运用常规的电脉冲(日本专利公开号2-207791)转化法导入表面活性剂敏感性增加的突变菌株AJ11060。转化体接种至添加有葡萄糖的L-琼脂培养基中，在31.5℃中连续培养。最后出现了20,000个转化体。这些转化体影印至含30mg/l表面活性剂的平板上。从上可得到对表面活性剂有抗性且能在上述平板上生长的一些菌株。
4.检验带有多个拷贝dts R基因菌株的表面活性剂抗性由一些生长的菌株中提取相应的重组DNA，用它们再次转化AJ11060菌株。由此实验也获得表面活性剂抗性的菌株。该菌株带有的重组DNA称为“pDTR6”，质粒中带有的表面活性剂抗性基因称为“dts R”。导入该质粒的AJ11060菌株在添加有3g/L表面活性剂的液体培养基(80克葡萄糖，1g KH2PO4，0.4g MgSO4·7H2O，30g(NH4)2SO4，0.01g FeSO4·7H2O，0.01g MnSO4·7H2O，15毫升大豆水解液，200μg盐酸硫胺素，300μg生物素，4mg氯霉素，3.0g聚氧乙烯山梨聚糖-棕榈酸酯及50g CaCO3等溶于1升纯水中(用氢氧化钾调培养基pH值至8.0))中。其生长抑制作用受到抑制(见图2)。
5.制备质粒DNA按常规方法从上述所得含有重组DNA的AJ11060/pDTR6中制备质粒，然后导入大肠杆菌JM109。所得JM109/pDTR6于37℃在20毫升培养基中预培养24小时。该培养基组成为1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸出物和0.5％氯化钠。所得培养液体(20毫升)接种上述同样组成的培养基(1升)中在37℃培养3小时，随后加入氯霉素(0.2g)。同样温度下再培养20小时得到液体培养物。然后将该培养物3,000rpm离心10分钟，再将获得的每2g湿润细菌细胞悬浮于含25％蔗糖的350mMTris-盐酸缓冲液中(20毫升，pH8.0)。然后分别加入溶菌酶(Sigma公司生产)10mg，0.25M EDTA溶液(8ml，pH8.0)，以及20％十二烷基磺酸钠(8ml)。60℃保温处理30分钟得到细菌裂解液。向溶液中再加5M氯化钠(13ml)后于4℃保温处理16小时，随后15,000r.p.m.离心30分钟。所得上清按常规沉淀DNA的方法用酚抽提及乙醇沉淀。
沉淀物在减压条件下干燥，以含1mM EDTA的10mM Tris-盐酸缓冲液(6ml，pH7.5)溶解。向其中加入氯化铯(6g)及溴化乙锭(0.2ml，19mg/ml)。利用超速离心机在39,000r.p.m.平衡密度梯度离心42小时来分离DNA。用正丁醇除去溴化乙锭，随后对含1mMEDTA的10mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)透析得到约500μg纯化的pDTR6重组DNA。私人命名大肠杆菌JM109.pDTR6为AJ12967。该菌株于1994年2月22日保藏在通产和科技省国立生命科学和人体技术研究所，其保藏号为FERM P-14168，根据布达佩思公约于1995年2月9日转存至国际保藏库，其保藏号为FERM BP-4994。
6.含有dts R基因DNA的核苷酸序列分析用上述条款5中所得重组DNA确定核苷酸序列。利用Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing试剂盒(Applied Biochemical公司生产)按照Sanger的方法确定核苷酸序列。所得带有dts R基因的DNA其核苷酸序列在序列表中以SEQ ID No1示出。在该序列中存在的最长开放阅读框架在SEQ ID No1序列中从359位A起至1987位G止。然而，根据该基因上游存在的共有序列分析推测467-469位的ATG可能是起始密码子。由开放阅读框架359位A至1987位G编码的氨基酸序列，在序列表中SEQ ID No1内与其相应的核苷酸序列共同示出。序列表中以SEQ ID No2单独示出其氨基酸序列。由包含467-1987位核苷酸的核苷酸序列编码的蛋白质称为“DTSR蛋白质”。
众所周知，蛋白质N末端存在的甲硫氨酸在翻译之后被肽酶所除去。这是因为N末端的甲硫氨酸来源于作为翻译起始密码子的ATG，它实际上与蛋白质主要功能并不相关。很可能在本发明中的DTSR蛋白质也被除去甲硫氨酸。
核苷酸序列及氨基酸序列分别与所知的序列比较它们的同源性。以EMBL及SWISS-PROT为资料库。结果发现序列表中SEQ IDNo1所示基因及其编码的蛋白质是新序列。当然，结果也显示它与已报道蛋白质有同源性。这种蛋白质在美国国家科学院院刊，83卷，8049-8053页，1986年；美国国家科学院院刊，83卷，4864-4868页，1986年；及基因，122卷，199-202页，1992年等刊物中称为丙酰基-辅酶A羧化酶(PPC)蛋白质β亚基。
7.制备突变型dts R基因。
按照下述方法获得编码温度敏感突变型DTSR蛋白质的dts R基因。参照文献Shortle，D.和Nathans，D.，美国国家科学院院刊，75卷，270页(1978年)中描述方法在体外用羟胺处理质粒pDTR6，再将其通过上述电脉冲方法导入AJ11060细胞中。在M-CM2G琼脂培养基上于25℃培养30小时约有20,000个转化体形成克隆。每一平板上的克隆都影印至另外两块含30mg/l表面活性剂的培养基平板上，分别在31.5℃及35℃中培养20小时。此后得到两株在31.5℃时生长而在35℃时不生长的菌株。用常规方法从此两株菌株中提取质粒。因此获得pDTR6-11及pDTR6-77。
8.通过基因替换法构建导入突变型dts R基因的菌株使用日本专利公开号5-7491中所述的温度敏感质粒，按照同源重组方法获得突变型dts R基因替换菌株。确切地说，上述pDTR6-11及pDTR6-77以Xba I及Kpn I消化，所得到的含有dts R基因的片段按上述方法分别与Xba I及Kpn I消化的pHSG398(Takara SHuzo公司生产)相连接，最后相应地得到pHSGX-K-11及pHSGX-K-77。
其次，由能在棒状细菌中自主复制的质粒中获得pHSC4质粒，它带有温度敏感自主复制能且具有突变型复制起点(日本专利公开号5-7491)。用限制性酶Bam HI及Kpn I消化pHSC4质粒，得到带复制起点的基因片段。使用形成DNA平末端试剂盒(Takara Shuzo公司生产，平末端试剂盒)得到带平末端DNA片段，利用Kpn I衔接物(Takara公司生产)将其插入pHSGX-K-11及pHSGX-K-77质粒中Kpn I识别的位点，从而构成质粒pKTCX-K-11及pKTCX-K-77。带有pHSC4质粒的大肠杆菌AJ12571菌株于1990年10月11日保藏于通产和科技省，国立生命科学和人体技术研究所，其保藏号为FERM P-11763，根据布达佩思公约于1991年8月26号转存至国际保藏库，其保藏号为FERM BP-3524。
运用电脉冲法分别将两个质粒导入乳发酵短杆菌ATCC13869，按照日本专利公开号5-7491中所述方法将染色体上dts R基因替换为突变型。确切地说，乳发酵短杆菌ATCC13869/pKTCX-K-11及ATCC13869/pKTCX-K-77在M-CM2G液体培养基中于25℃振荡培养6小时，随后在含有5μg/ml氯霉素的M-CM2G培养基中涂布生长。在34℃能形成克隆的菌株被认为是已导入质粒的菌株。其次，通过影印的方法由导入质粒的菌株中得到34℃对氯霉素敏感菌株。由敏感菌株中获得第11号及第77号菌株，它们在34℃时丧失表面活性剂抗性。在这些菌株中，其染色体上dts R基因已被替换为突变型。以质粒pHSGX-K-11为模板，使用聚合酶链式反应(PCR)扩增带有第11号菌株中的突变型dts R基因得到DNA片段，并将它插入质粒pHSG299(TakaraShuzo公司生产)中Hinc II位点，最终得到质粒pHSGDTSR11。导入质粒pHSGDTSR11的大肠杆菌JM109菌株称为AJ13137，1995年8月1日保藏于通产和科技省，国立生命科学和人体技术研究所，其保藏号为FERM BP-5187。可通过限制性酶Sph I及Kpn I消化质粒pHSGDTSR11，从而得到第十一号菌株的突变型dts R基因。
9.第11号菌株及第77号菌株的L-谷氨酸生产能力上述条款8中得到的第11号菌株及第77号菌株其L-谷氨酸生产能力按照实施例2中同样方法进行评估。确切地说，使用实施例2中同样的培养基，开始培养后第8个小时培养温度转换为37℃。结果表明带有突变型基因的菌株其L-谷氨酸生产能力得到改进，由表9示出。
表9细菌菌株 L-谷氨酸(g/dl)ATCC 138690.5第11号(No.11)菌株 7.5第77号(No.77)菌株 6.9实施例4源自产L-谷氨酸细菌且带有表面活性剂温度敏感突变株中谷氨酸生物合成系统的基因的增强1.克隆gdh、gltA及icd基因乳发酵短杆菌的gdh(谷氨酸脱氢酶基因)，gltA(柠檬酸合成酶基因)以及icd(异柠檬酸脱氢酶基因)用聚合酶链式反应的方法克隆。聚合酶链式反应中所用引物根据已报道的谷氨酸棒状杆菌中gdh基因序列(分子微生物学，6卷第3期，317-326页，(1992年))，glt A基因序列(微生物学，140卷，1817页-1828页，(1994年))以及icd基因序列(细菌学杂志，177卷，774-782页，(1995年))来合成。序列表中SEQ ID No3(5’端)及SEQ ID No4(3’端)所示寡核苷酸用作扩增gdh基因的引物，SEQ ID No5(5’端)及SEQ ID No6(3’端)所示寡核苷酸用作扩增glt A基因的引物，SEQ ID No7(5’端)及SEQ ID No8(3’端)所示寡核苷酸用作扩增icd基因的引物，将它们分别合成并使用。
按照上述实施例3所述的方法制备乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体组DNA，利用上述寡核苷酸作为引物，以此DNA为模板进行聚合酶链式反应。使用商用的DNA平末端形成试剂盒(Takara Shuzo公司生产，Blunting Kit)使获得的扩增产物两末端平，随后将它们的克隆进入载体质粒pHSG 399的Sma I位点最后分别得到pHSG-gdh，pHSG-gltA以及pHSG-icd。
2.克隆PPC基因按照实施例3中所述方法制备乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体组DNA，以它为模板通过聚合酶链式反应(PCR)方法获得编码PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶蛋白)的ppc基因约34Kbp的DNA片段。PCR方法中所用引物根据已报道谷氨酸棒状杆菌(基因，77卷，237-251页(1989年))中ppc基因序列合成。PCR反应按照上述同样方式进行。所用引物的序列在SEQ ID No9(5’端)及ID No10(3’端)中示出。
PCR反应的扩增产物由限制酶Sal I(Takara Shuzo公司生产)消化后插入质粒pHSG 399的SalI位点得到质粒pHSG-ppc’。pHSG-ppc’的ppc基因插入方向与pHSG 399质粒中lac启动子方向相反。
其次，已知在乳发酵短杆菌中可操纵的色氨酸操纵子的启动子(基因，53卷，191-200页，(1987年))。将其插入pHSG-ppc’中ppc基因上游。该启动子表现活性的序列在序列表中SEQ ID No11示出，包括51个核苷酸。合成具备SEQ ID No11中所示序列的核苷酸链及SEQ ID No12中所示的与其互补的序列的核苷酸链，以得到表现启动子活性的51个碱基对形成的双链DNA，它们两端与限制性酶Kpn I和Xba I消化得到的片段相吻合。
合成的DNA各以约10pmol/μl浓度混合，100℃加热10分钟，然后降至室温以退火。pHSG-ppc’用限制性酶Kpn I及Xba I消化(Takara Shuzo公司生产)，与上述启动子相连接。使用连接试剂盒(Takara Shuzo公司生产)进行连接反应。由此得到在ppc基因上游插入一个色氨酸操纵子的pHSG-ppc质粒。
3.构建导入gdh、gltA及icd等三类基因的质粒将gdh、gltA及icd等三类基因连接以构建质粒。确切地说，质粒pHSG-gdh由限制性酶EooR I消化，使用商用DNA平末端形成试剂盒(Takara Shuzo公司生产，Blunting Kit)得到平末端，它与按上述方法产生平末端的glt基因的PCR扩增产物 连接后得到质粒pHSG－gdh＋gltA。进而，质粒pHSG－gdh＋gltA用限制性酶Kpn I消化，并按同样方法形成平末端，它与按照上述在两端得到平末端的icd基因的PCR扩增产物连接后得到质粒pHSG－gdh＋gltA＋icd。
4.构建导入gdh、gltA及ppc等三类基因的质粒将gdh、gltA及ppc等三类基因连接以构建质粒。确切地说，质粒pHSG－gdh＋gltA以限制性酶Kpn I消化。质粒pHSG-ppc以限制性酶Kpn I及Sal I消化以得到在其上游有色氨酸操纵子的启动子的ppc基因片段。所得片段使用DNA平末端形成试剂盒(Takara Shuzo公司生产，Blunting Kit)产生平末端，随后使用Kpn I接头(Linker)将其插入质粒pHSG－gdh＋gltA的Kpn I位点得到质粒pHSG－gdh＋gltA＋ppc。
5.在上述质粒中导入棒状细菌复制起点为使质粒pHSG-gdh，pHSG-gltA，pHSG-ppc，pHSG-icd，pHSG－gdh＋gltA＋icd以及pHSG－gdh＋gltA＋ppc等能在棒状细菌细胞内自主复制，将能在棒状细菌内自主复制且源自质粒pHM1519(农业生物化学，48卷，2901-2903页，(1984年))中已获得的复制起点导入上述质粒。
确切地说，带有源自pHM1519复制起点的质粒pHK4(日本专利公开号5-7491)用限制性Bam HI酶及Kpn I消化得到含复制起点的基因片段。所得片断使用平末端形成试剂盒产生平末端(Takara Shuzo公司生产，Blunting Kit)，随后利用Kpn I衔接物(Takara Shuzo公司生产)分别插入pHSG-gdh，pHSG-gltA，pHSG-ppc和pHSG-icd等质粒的Kpn I位点中去得到质粒pGDH，pGLTA，pPPC，及pICD。源自pHM1519的复制起点利用Sal I衔接物以相同方法分别插入质粒pHSG－gdh＋gltA＋icd及pHSG－gdh－gltA＋PPc等质粒的Sal I位点中得到质粒pGDH＋GLTA＋ICD及pGDH＋GLTA＋PPC。
6.确证质粒pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH＋GLTA＋ICD和pGDH＋GLTA＋PPC等所包括的每个基因的表达本发明验证了质粒pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH＋GLTA＋ICD和pGDH＋GLTA＋PPC等所包括的每个基因均能在乳发酵短杆菌的细胞中表达，并且这些质粒能进行基因扩增。
确切地说，将上述每个质粒根据电脉冲法(日本专利公开号2-207791)导入乳发酵短杆菌所得转化体在含4μg/ml氯霉素的CM2G平板培养基(每升纯水中含蛋白胨10g，酵母浸出物10g，葡萄糖5g，氯化钠5g及15g琼脂，pH7.2)上筛选。所得转化体在CM2G琼脂培养基上培养，然后接种至下列培养基中于31.5℃培养16小时，该培养基每升纯水中含葡萄糖80g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.4g，硫酸铵30g，七水硫酸亚铁0.01g，七水硫酸锰0.01g，大豆水解液15ml，盐酸硫铵素200μg，生物素300μg，碳酸钙50g(使用氢氧化钾调pH至8.0)。按常规方法离心培养液收集细菌细胞。
按照分子微生物学6卷(3期)，317页-326页(1992年)中所述方法用破碎细菌细胞后所得粗提液检测下列菌株ATCC13869/pGDH，ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD及ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC的GDH(谷氨酸脱氢酶)活性。结果表明，与正常对照ATCC13869/pSAC4相比，每一转化体其GDH活性要高约13倍(见表10)。
ATCC13869/pGLTA，ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD，和ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC等菌株的CS(柠檬酸合成酶)活性按照微生物学140卷，1817-1828页(1994年))中所述方法进行检测。ATCC13869/pICD及ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD菌株的ICDH(异柠檬酸脱氢酶)活性按照细菌学杂志177卷，774-782页(1995年))中所述方法进行检测。ATCC13869/pPPC及ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC菌株的PEPC活性按照基因77卷，237-251页(1989年))中所述方法进行检测。检测结果在表11-13中示出。结果表明以ATCC13869/pSAC4为对照，转化体中每一目的酶的活性约升高2-20倍。据此认为pGDH，pGLTA，pPPC，pICD，pGDH＋GLTA＋ICD和pGDH＋GLTA＋PPC等质粒所带每一基因均能在乳发酵短杆菌中表达并实现其功能。
表10细菌菌株 GDH活性(△Abs/min/mg蛋白)ATCC13869/pGDH 1.36ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD 1.28ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC 1.33ATCC13869/pSAC4 0.11表11细菌菌株 CS活性(μmol/min/mg蛋白)ATCC13869/pGLTA 5.5ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD 4.8ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC 4.8ATCC13869/pSAC4 0.7表12细菌菌株PEPC活性(Units/min/mg蛋白)ATCC13869/pPPC 1.12ATCC13869/pGDH＋GLTA＋PPC 1.04ATCC13869/pSAC4 0.11表13细菌菌株ICDH活性(Units/min/mg蛋白)ATCC13869/pICD 3.5ATCC13869/pGDH＋GLTA＋ICD 2.8ATCC13869/pSAC4 1.07.用AJ13029菌株及携带扩增的gdh，gltA，ppc及icd基因的AJ13029菌株生产L-谷氨酸在1升水中含有如下成分葡萄糖60g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.4g，硫酸铵30g，七水硫酸亚铁0.01g，七水硫酸锰0.01g，大豆水解液15ml，盐酸硫铵素及生物素450μg的培养基置容积为1升的发酵罐中，加热灭菌。将在CM2G琼脂培养基上培养所得的各个菌株的细菌细胞接种至其内，在31.5℃培养30小时并利用氨气控制pH为7.0。
按照上述同样方法检测培养后培养基中细菌细胞的密度及累积的L-谷氨酸数量。结果在表14中示出。
表14细菌菌株 质粒细胞密度L-谷氨酸(OD) (g/l)AJ13029 - 0.95 33AJ13029 pGDH 1.01 35AJ13029 pGLTA 0.93 37AJ13029 pICD 0.93 37AJ13029 pPPC 0.84 38AJ13029 pGDH＋GLTA＋ICD 1.05 39AJ13029 pGDH＋GLTA＋PPC 0.95 41AJ13029 pSAC4 0.93 33实施例5由源自产L-谷氨酸的棒状细菌产L-赖氨酸株制备对生物素活性抑制剂温度敏感的突变型菌株1.通过影印方法检测产L-赖氨酸菌株的生物素活性抑制剂的敏感性由乳发酵短杆菌ATCC13869通过诱导突变后得到的乳发酵短杆菌AJ11446菌株(日本专利公开号62-24073)，该菌能产生L-赖氨酸并有AEC抗性，它对聚氧乙烯山梨聚糖-棕榈酸酯(PESP)的敏感性利用影印法按如下进行。
乳发酵短杆菌AJ11446在表15所示成分的MCM2G琼脂平板培养基上于31.5℃培养过夜以得到细菌细胞。它们在灭菌的生理盐水中悬浮后，接种至上述琼脂平板培养基于31.5℃培养20-30小时以形成克隆。它们被影印至添加有不同浓度PESP的MCM2G琼脂培养基上，在34℃培养20-30小时以观测其生长状态。
表15成分浓度葡萄糖 0.5％蛋白胨(polypeptone)(Nihon制药厂生产)1.0％酵母浸出物(Difco公司生产) 1.0％氯化钠 0.5％DL-甲硫氨酸 0.02％琼脂1.5％pH7.2结果表明这种情况下PESP浓度在3mg/dl附近为细菌生长的阈值，由表16示出。
表16PESP浓度 00.10.31.03.01030(mg/dl)生长状况 ++ + + + - -2.诱导对生物素活性抑制剂表现温度敏感的突变菌株乳发酵短杆菌AJ11446在琼脂肉汤培养基中于31.5℃培养24小时以获得细菌细胞。所得细菌细胞在30℃用含250μg/ml N-甲基N’-硝基-N-亚硝基胍的水溶液处理30分钟。存活率为1％的细菌细胞悬液接种至MCM2G琼脂平板培养上，于31.5℃培养20-30小时以形成克隆。它们分别被影印至MCM2G琼脂培养基以及含3mg/dl PESP的MCM2G琼脂培养基上，然后在34℃培养20-30小时。收集在MCM2G培养基上生长而在添加有3mg/dl PESP的MCM2G培养基上却不生长的细菌菌株。由10,000个克隆中共获得250个这样的菌株。对所得的每一个细菌菌株在3mg/dl PESP的MCM2G培养基上于34℃再次验证其生长与否。无明显敏感性的菌株被排除，最终得到166个表现温度敏感的菌株。
3.确证生物素活性抑制剂温度敏感突变株同时生产L-赖氨酸及L-谷氨酸的能力由条款2中所得166个突变株及其亲本AJ11446按如下方法验证它们产生L-赖氨酸及L-谷氨酸的能力。
AJ11446菌株及每一突变菌株分别在MCM2G琼脂培养基上于31.5℃培养20-30小时以获得细菌细胞，随后将其接种至表17所示成分的液体培养基中于31.5℃振荡培养。16小时后培养温度转换为34℃并培养使整个培养过程达48小时。通过薄层色谱法分析培养完毕后L-赖氨酸与L-谷氨酸产生与否。结果显示166个突变菌株中有31个菌株能同时产生两种氨基酸。这31个菌株如在31.5℃培养48小时而不转换培养温度，则仅有3个菌株能同时产生L-赖氨酸及L-谷氨酸。
表17成分 浓度葡萄糖 10g/dl磷酸二氢钾0.1g/dl七水硫酸镁 0.04g/dl七水硫酸亚铁0.001g/dl四水硫酸锰 0.001g/dl硫酸铵 2g/dl大豆蛋白水解液 3ml/dlDL-丙氨酸 0.35g/d烟酰胺 5mg/l盐酸硫铵素0.2mg/l生物素0.3mg/l消泡剂 0.05ml/l碳酸钙 5g/dlpH7.0
突变菌株的代表菌株及AJ11446菌株所积累L-赖氨酸及L-谷氨酸数量在表18中示出。
表18细菌菌株 温度转换 赖氨酸谷氨酸(g/dl)(g/dl)AJ11446 是2.09 0.00否2.41 0.00EK-015 是2.17 0.07否2.35 0.00EK-036 是2.35 0.34否2.20 0.14EK-100 是1.69 0.93否1.71 0.47EK-112 是1.96 0.69否2.50 0.00EK-117 是0.99 1.88否1.70 0.004.确证生物素活性抑制剂温度敏感性在上述条款3中得到的同时产生L-赖氨酸及L-谷氨酸细菌，其对PESP的温度敏感性按下述在液体中培养的方法验证。
每一突变株及其亲本株在MCM2G琼脂平板培养基上于31.5℃培养24小时以获得细菌细胞，所得细菌细胞接种至MCM2G液体培养基及含1mg/dl浓度PESP的MCM2G液体培养基中于31.5℃及34℃振荡培养24小时。在660nm处测定所得液体培养物的光密度值(O.D.)。以未添加PESP的培养基中的细菌生长状况为100，据此决定添加PESP的培养基中细菌的相对生长程度。结果由表19示出。
表19细菌菌株 相对生长程度31.5℃ 34℃AJ11446 95 90EK-01590 27EK-03684 45EK-10087 22EK-11298 36EK-11784 47如表中所示，在1mg/dl PESP存在时，每一个突变菌株在31.5℃时其相对生长程度大于等于80，而在34℃时它的相对生长程度小于等于50，明显显示了对PESP的敏感性。
图3示出了PESP在31.5℃及34℃对于条款3中所得菌株之一EK-112的生长状况的影响。在添加不超过1mg/dl PESP浓度时，31.5℃培养的生长状况与无PESP时大致相当。然而，与无PESP时培养相比，添加1mg/dl PESP的细菌生长状况在34℃时受到显著抑制。这表明该突变株有温度敏感特性。
在这些突变菌株中，EK-112称为乳发酵短杆菌AJ12993，1994年6月3日保藏于通产和技术省，生命科学与人体技术研究所，其保藏号为FERM P-14348，根据布达佩思公约于1995年8月1日转存至国际保藏处，其保藏号为FERM BP-5188。
实施例6共同发酵生产L-赖氨酸和L-谷氨酸1.培养温度转换时间的研究乳发酵短杆菌AJ11446或AJ12993接种至上述表6所示成分的种子培养物培养基中，在31.5℃振荡培养24小时以获得种子培养物。成分如表6所示的大规模培养基分装为每份300ml加至容积为500ml的玻璃发酵罐中，加热灭菌。此后，接种进40ml的种子培养物，开始培养时振荡速度为800-1,300rpm，通气量为1/2-1/1vvm，培养温度为31.5℃。使用氨气将培养液的pH值维持在7.5。在开始培养后8，12或16小时将温度转换至34℃。设置对照使其培养温度始终保持为31.5℃不变。
在每一实验中，培养过程在40-50小时之内某一时间点终止以使葡萄糖完全耗尽。检测流体培养基中产生并积累的L-赖氨酸及L-谷氨酸的数量。结果如表20所示。
表20温度转换时间(小时) AJ11446AJ12993赖氨酸谷氨酸赖氨酸 谷氨酸(g/dl)(g/dl)(g/dl) (g/dl)8 5.4 0.0 4.4 1.812 5.5 0.0 4.5 1.616 5.6 0.0 4.7 1.2- 5.9 0.0 6.0 0.0据此结果可知AJ12993菌株即使在有过量生物素且无任何生物素活性抑制剂的培养基中生长，它可通过培养温度由31.5℃转换为34℃同时产生L-赖氨酸及L-谷氨酸，并且L-谷氨酸的产量与随着转换培养温度时间的提前增加，L-赖氨酸的产量则随着转换温度时间的推后而增加。至于亲代菌株AJ11446则相反，它只产生L-赖氨酸，即使进行温度转换也无L-谷氨酸的产生。
在开始培养8小时后进行温度转换的培养完毕的流体培养物1升，通过离心除去细菌细胞。使用离子交换树脂通过常规方法由所得上清中提纯L-赖氨酸及L-谷氨酸。所得L-盐酸赖氨酸晶体为31.7克，L-谷氨酸钠晶体为13.9克。
2.转换温度的研究按照条款1中所述同样方法使用容积为500ml的玻璃发酵罐在31.5℃开始培养乳发酵短杆菌AJ11446及AJ12993。在开始培养8小时后，将培养温度转换至33℃，34℃及35℃。设置对照使其培养温度不变而始终保持为31.5℃。在每一实验中，培养过程在40-50小时后结束。检测液体培养物中产生和积累的L-赖氨酸及L-谷氨酸数量。结果如表21所示。
表21转换后温度(℃) AJ11446AJ12993赖氨酸 谷氨酸 赖氨酸 谷氨酸(g/dl) (g/dl) (g/dl) (g/dl)33 5.6 0.04.9 1.134 5.4 0.04.4 1.835 5.2 0.03.8 2.1-5.9 0.06.0 0.0据此结果可知在AJ12993菌株的培养过程中存在这样一种趋势，即L-谷氨酸产量随着转换后温度的升高而增加，而L-赖氨酸的产量则随着转换后温度的降低而增加。
工业实用性据此发明，赋予产生L-谷氨酸的棒状细菌对生物素活性抑制剂温度敏感特性。即使使用含过量生物素的原料作为碳源时，仍能通过发酵方法稳定且廉价地制备L-谷氨酸。
另外，还赋予它生产L-赖氨酸能力。因此即使使用含过量生物素的原料作为碳源时，仍能通过发酵方法稳定且廉价地制备L-赖氨酸和L-谷氨酸。
序列表(1)一般信息(i)申请人AJINOMOTO有限责任公司(ii)发明名称生产L-赖氨酸和L-谷氨酸的方法(iii)序列数目12(iv)通迅地址(A)收信人(B)街(C)城市(D)州(省)(E)国家(F)邮政编码(v)计算机可读表格(A)介质类型软盘(B)计算机IBC PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patentln Release #1.0，Version#1.30(EPO)(vi)当前申请资料(A)申请号(B)备档日期(C)分类(vii)以前申请资料(A)申请号JP6/195465(B)提交日期1994，8，19(viii)律师/代理人信息(A)姓名(B)登记号(C)参考/存档号(ix)电信信息(A)电话(B)传真(2)SEQ ID No1的信息(i)序列特征(A)长度2733碱基对(B)类型核苷酸(C)链型双链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(脱氧核糖核酸)(基因组)(iii)假设无(iv)反义链无(vi)原始材料来源(A)生物体乳发酵短杆菌(B)菌株ATCC13869(ix)特征(A)名称/键CDS(B)位置359..1987(xi)序列描述SEQ ID No1GATCTTGGAA CTCGACAGTT TTCACCGTCC AGTTTGGAGC GCCTGAGCTT GCAAGCTCCA 60GCAAGTCAGC ATTAGTGGAG CCTGTCACTT TTTCGTAAAT GACCTGGCCA AAGTCACCGT120TTTGGAGCAA TTTTTCCTTC AGGAGCTCAA CGTTTAGCGG CTCTCTGGAT CGTGAAATGT180CAACGTTCAT GGAAGCCAAT GTAGTGGGGT CGCGTCGAAA AGCGCGCTTT AAGGGCGACA240CGCCCAAAAA GTTTTACCTT TAAAAACTAC CCGCACGCAG CACGAACCTG TTCAGTGATG300TAAATCACCG CGGAAATATT GTGGACGTTA CCCCCGCCTA CCGCTACGAT TTCAAAAC 358ATG ACC ATT TCC TCA CCT TTG ATT GAC GTC GCC AAC CTT CCA GAC ATC 406Met Thr Ile 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Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala35 40 45Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly50 55 60Ser Phe Ile Glu Thr Asp Gln Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ala Phe65 70 75 80Gly Leu Gly Ala Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly Ile Val Thr Gly Trp85 90 95Gly Thr Ile Asp Gly Arg Glu Val Cys Ile Phe Ser Gln Asp Gly Thr100 105 110Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Glu Lys Met Ile Lys115 120 125Ile Met Glu Leu Ala Ile Asp Thr Gly Arg Pro Leu Ile Gly Leu Tyr130 135 140Glu Gly Ala Gly Ala Arg Ile Gln Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe145 150 155 160Ile Ser Gln Thr Phe Tyr Gln Asn Ile Gln Ala Ser Gly Val Ile Pro165 170 175Gln Ile Ser Val Ile Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly180 185 190Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met195 200 205Phe Val Thr Gly Pro Asp Val Ile Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu Ile210 215 220Thr Gln Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly225 230 235 240Asn Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp 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(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子结构其它类型核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义链无(xi)序列描述SEQ ID No5TAATGCCACC GACACCCACC 20(2)SEQ ID No6序列信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子结构其它类型核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义链有(xi)序列描述SEQ ID No6TCAACGCCCA CATAGTGGAC 20(2)SEQ ID No7序列信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型其它核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无
(iv)反义链无(xi)序列描述SEQ ID No7GAATTCGCTC CCGGTGACGC 20(2)SEQ ID No8序列信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型其它核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义链有(xi)序列描述SEQ ID No8GATGCAGAAT TCCTTGTCGG 20(2)SEQ ID No9序列信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核苷型(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型其它类型核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义链无(xi)序列描述SEQ ID No9GTCGACGGCG GACTTGTCGG 20(2)SEQ ID No10序列信息(i)序列特征
(A)长度20个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型其它核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义链有(xi)序列描述SEQ ID No10GTCGACAAAA CCCAAAAAAA 20(2)SEQ ID No11序列信息(i)序列特征(A)长度51个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓补结构线性(ii)分子类型其它核苷酸(A)描述/desc＝“合成DNA”(iii)假设无(iv)反义链无(xi)序列描述SEQ ID No11CTGCGGAAAC TACACAAGAA CCCAAAAATG ATTAATAATTGAGACAAGCT T 51(2)SEQ ID No12序列信息(i)序列特征(A)长度59个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型其它合成DNA
(iii)假设无(iv)反义链有(xi)序列描述SEQ ID No12CTAGAAGCTT GTCTCAATTA TTAATCATTT TTGGGTTCTTGTGTAGTTTC CGCAGGTAC 59
权利要求
1.一种通过发酵生产L-谷氨酸的方法，这包括如下的步骤在液体培养基中培养一种突变菌株；在培养基中产生并积累L-谷氨酸；以及由培养基中收集L-谷氨酸，该菌株源自产生L-谷氨酸的棒状细菌，对生物素活性抑制剂有温度敏感突变，具备在含过量生物素的任何培养基中不需任何生物素活性抑制剂来生产L-谷氨酸的能力。
2.根据权利要求1的一种生产L-谷氨酸的方法，其中生物素活性抑制剂为聚氧乙烯山梨聚糖-棕榈酸酯。
3.根据权利要求1及2的一种生产L-谷氨酸的方法，其中选自谷氨酸脱氢酶基因，柠檬酸合成酶基因，磷酸烯醇式丙酮酸脱氢酶基因及异柠檬酸脱氢酶基因等基因中一个或多个基因其表达被增强。
4.一种通过发酵生产L-赖氨酸及L-谷氨酸的方法，它包括如下的步骤在液体培养基中培养一种突变菌株；在培养基中产生并积累L-赖氨酸及L-谷氨酸；以及由培养基中收集L-赖氨酸及L-谷氨酸，该菌株源自产生L-谷氨酸的棒状细菌，具备产生L-赖氨酸能力及对生物素活性抑制剂的温度敏感突变，具备在含过量生物素的任何培养基中不需任何生物素活性抑制剂来生产L-赖氨酸及L-谷氨酸的能力。
5.根据权利要求4的一种产生L-赖氨酸、L-谷氨酸的方法，其中生物素活性抑制剂为聚氧乙烯山梨聚糖-棕榈酸酯。
6.一种源自产生L-谷氨酸的棒状细菌的突变株，对生物素活性抑制剂有温度敏感突变，具备在含过量生物素的培养基中不需任何生物素活性抑制剂来生产L-谷氨酸的能力。
7.根据权利要求6的一个突变菌株，其中生物素活性抑制剂为聚氧乙烯山梨聚糖-棕榈酸酯。
8.一种源自产生L-谷氨酸的棒状细菌的突变株，它具备产生L-赖氨酸能力及对生物素活性抑制剂的温度敏感突变，具备在含过量生物素的培养基中不需任何生物素活性抑制剂来生产L-赖氨酸和L-谷氨酸的能力。
9.根据权利要求8的一种突变菌株，其中生物素活性抑制剂为聚氧乙烯山梨聚糖-棕榈酸酯。
10.一种繁殖突变菌株的方法，该菌株具备在含过量生物素的培养基中无需任何生物素活性抑制剂产生L-谷氨酸的能力，该方法包括赋予产生L-谷氨酸棒状细菌以生物素活性抑制剂温度敏感特点。
11.一种繁殖突变菌株的方法，该菌株具备在含过量生物素的培养基中无需任何生物素活性抑制剂产生L-赖氨酸和L-谷氨酸的能力，该方法包括赋予产生L-谷氨酸的棒状细菌以生物素活性抑制剂温度敏感特点及产生L-赖氨酸的能力。
全文摘要
通过赋予产生L-谷氨酸棒状细菌以生物素活性抑制剂温度敏感突变，从而得到具备在含过量生物素的培养基中无需任何生物素活性抑制剂产生L-谷氨酸能力的突变菌株。该菌株在液体培养基中培养以在培养基中产生和积累L-谷氨酸。通过赋予产生L-谷氨酸棒状细菌以生物素活性抑制剂温度敏感和产生L-赖氨酸的突变，从而得到具备在含过量生物素的培养基中无需任何生物素活性抑制剂产生L-赖氨酸和L-谷氨酸能力的突变菌株。该菌株在液体培养基中培养以在培养基中同时产生和积累L-谷氨酸与L-赖氨酸。
文档编号C12N1/21GK1161059SQ95195728
公开日1997年10月1日 申请日期1995年8月9日 优先权日1994年8月19日
发明者木村英一郎, 朝仓阳子, 上原章敬, 井上寿美男, 河原义雄, 吉原康彦, 中松亘 申请人:味之素株式会社 被以下专利引用 (1),