专利名称：同种异体和异基因蛋白的抗体，它们在诊断和治疗中的应用及其检测方法
技术领域：
本发明涉及检测那些能识别提取于哺乳动物器官中的且分子量约为14Kda的蛋白的天然抗体的诊断方法。该抗体在对异基因物种给药时具有抗肿瘤活性。
本发明还涉及纯化形式的该天然抗体以及它们在诊断和治疗中的应用。
WO92/10197公开了可通过用高氯酸和高渗盐溶液提取哺乳动物器官，特别是肝脏得到的蛋白物质。
已分离出分子量约为14Kda的其中一个该物质并进行了部分测序(意大利专利申请MI 94001469)且证明它是导致所观察到的生物学特性即抗肿瘤活性以及在对和它从其中提取的物种不同的动物给药时产生能够识别肿瘤抗原的抗体的能力的主要蛋白。
该意大利专利申请也公开了两种由保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(ECAcc)(Porton Donn，索里斯堡，英国，保藏号为930806103和930806104)的杂交瘤分泌的单克隆抗体，该抗体能识别肿瘤抗原的以及在该杂交瘤制备中用作抗原的从羊肝脏中提取的14Kda蛋白(以下称作UK114)的共同的抗原决定基。
现在已发现能识别从器官(特别是肝脏)中提取的同种异体和异种蛋白的天然抗体是有上述特性并在大约93％的人类实体瘤中存在且循环于哺乳动物血清中。在健康动物或人的血清中以低效价(＜1/100)正常存在的该抗体可通过注射相应的抗原被刺激，引起效价以及在血清中产生抗肿瘤细胞的胞毒效应的能力的显著提高。
跟观察结果以及天然抗-UK114抗体存在的意义的可能解释无关(这些解释和本发明的合法性无关)，该抗体及其检测可用于诊断，预后和治疗的目的。
在第一个实施方案中，本发明涉及一种免疫检测天然抗-UK114抗体的方法。本发明也涉及纯化的抗-UK114抗体及其在诊断，治疗和免疫细胞化学中的应用。该检测天然抗体的方法是常规型的且可以依靠直接的，竞争的或者“三明治”型的反应。而该方案既可以使用固体支持物也可以使用免疫沉淀技术。将在免疫测定中使用的抗体和/或者UK114-型抗原用酶(例如在ELISA技术中)或者用放射性或者荧光，化合物，染料或者色素等进行适当的标记。该免疫复合物信号可以选择性地利用生物素-抗生物素蛋白系统而增强。
该方法的构成以及相应的材料的选择完全属于普通技术人员的技能。
现已发现存在于已用WO92/10197公开的蛋白或者纯化的UK114处理的病人的血清中的抗-UK114抗体在体内和体外都具有抗人体肿瘤细胞的细胞毒和溶细胞的活性。在另一实施方案中，本发明还提供了包括单克隆或多克隆抗体或超免疫血清的溶细胞和细胞毒组合物，该抗体是通过用高氯酸从山羊肝脏中提取的并且被保藏于ECACC的登记号为930806103或者930806104的杂交瘤分泌的单克隆抗体所识别的蛋白免疫动物或者人而产生的。
在体内试验中，细胞毒活性在该抗原给药(UK114或者UK101)后几天即达到高峰并且在随后的几周缓慢降低。但是，根据ELISA法测评的IgG型的抗-UK114抗体的效价则是随着时间而缓慢提高。因此，可以推测细胞毒性的第一个峰是由于IgM-型抗体，和/或者其它现在还未知的血清成分而形成的。
无论如何，用于检测抗体和/或者细胞毒性从而使得治疗可以适当地监控的方法的重要性是明显的。
按照本发明无论施用天然抗体还是单克隆抗体都可以充足剂量在胃肠外进行以达到细胞毒效应。这些合适的给药方法基本上和那些已知的疫苗，抗体或者超免疫血清的给药方法相同。本发明和下列的实施例2-4为上述抗体的治疗和诊断应用提供了进一步的准则。
下述实施例进一步阐明了本发明。
实施例1
将2.5％SDS和5％巯基乙醇加入10μl的山羊肝脏的高氯酸抽提液(W092/10197；UK101)中。将样品加热至100℃，5分钟，并且取4μl用PHAST SYSTEM仪器(Pharmacia)进行聚丙烯酰胺8/25梯度凝胶(Pharmacia)的SDS-PAGE分析。另外还可以使用高密度的均相凝胶。用Phast-转移(Pharmacia)仪器将分离的蛋白电泳转移。硝化纤维素膜(0.22μ)事先在加入了20％甲醇的Tris(25mM)甘氨酸(192mM)缓冲液中平衡。电泳在5V×20分钟条件下进行(IA/cm2)。为了防止非特异性结合，在饱和步骤后，将膜与检测的血清一起温育。
选择性存在的抗体的结合可用适当标记的第二抗人A3b以比色法，放射免疫测定法或化学发光法进行检测。
实施例2酚联免疫吸附测定法(ELISA)检测UK114抗体。
使用以下缓冲液(A)50mM碳酸氢钠pH8.5，(B)50mM磷酸钠 pH7.2，(C)50mM磷酸钠 pH7.4，0.1％(w/v)NaN3(D)40mM磷酸钾 pH7.4，150mMNaCl，0.02％(w/v)NaN3，0.05(v/v)Tween 20，(E)50mM磷酸钠 pH7.4，0.1％(w/v)NaN3，0.1％(w/v)BSA，(F)50mM磷酸钠 pH7.4，150mM NaCl，0.1％(w/v)NaN3，0.5％(w/v)无蛋白酶的BSA，0.05％(v/v)Tween20，0.％％(v/v)正常山羊。
将3.5ml UK114(3.5mg)的缓冲液A溶液和9μl的NHS-LC生物素(S.P.A.，米兰)的二甲基亚砜溶液(2mg/ml)混合。将混合物于22℃温育3小时并于4℃在Spectrapor6透析管中对缓冲液B进行透析(除去3500D)，中间更换几次缩冲液B。
将微量滴定孔于4℃用100μlBSA-生物素(5μg/ml的缓冲液C溶液)包被24小时，然后洗涤并用100μl抗生蛋白链菌素(5μg/ml的缓冲液E的溶液)处理。在第二次4℃过夜温育后，洗涤各孔并于4℃用100μl的UK114-生物素以不同浓度(2，1和0.5μg/ml的缓冲液E的溶液)处理24小时。洗涤后，各孔被封闭。
除了在第三次温育步骤中使用缓冲液E代替UK114-生物素溶液外，可按照相同的步骤制作未包被抗原孔。
该洗涤步骤可通过加入300μl/孔的缓冲液D三次而进行。封闭可以通过加入300μl的含有10％的蔗糖和不同的封闭剂(1％和5％的牛血清白蛋白，1％的甘氨酸，加入3％的聚乙烯吡咯烷酮的1％的BSA，5％的正常山羊血清)的缓冲液C而进行。室温30分钟后，弃去封闭液并在真空室干燥，然后包入聚乙烯和钻箔中4℃贮存备用。
ELISA步骤在测定前将血清样品和阴性对照按1∶21用缓冲液F稀释。将100μl样品和标准溶液(1，2，4和8μ/ml的缓冲液F的溶液)加入包被孔中并在水平振荡器上(400-500rpm)于室温温育1小时。用300μl缓冲液D洗涤各孔四次，然后加入100μl的溶解于Stabilgen缓冲液中的1∶3000的山羊抗人IgG辣根过氧化物酶标记的抗体溶液。在水平振荡器(400-500rpm)上室温温育1小时后，洗板并用100μlBlueStar溶液(H2O2/TMB)展开。在室温下(18-24℃)温育15分钟后，加入100μl1MH2SO4终止反应，在双波长光度计上以630nm为参比波长读取450nm处的光密度(OD)。
OD值高于8μml的标准液的样品可在测定前作进一步稀释。
样品的浓度可从标准曲线上计算出。
测定受过免疫治疗的病人体内的效价对那些经受UK101治疗的病人进行抗UK114抗体效价测评发现仅仅在UK101给药(4次皮下注射)15天后，抗体应答在28％乳癌患者和46％结肠癌患者体内比背景值高。从开始UK101治疗40天后，可以分别在63％结肠癌和97％乳癌患者体内检测出抗UK114抗体效价的增加(
图1和2)。
实施例3抗UK114抗体对肿瘤细胞系的细胞毒效应该细胞毒性研究使用分别用由保藏于ECACC的第930806103号杂交瘤P3D1DII分泌的单克隆抗体和兔多克隆抗UK114抗体(rAb)间接免疫荧光表面染色阳性和阴性的KATO-III(胃癌)和NICH(小细胞肺癌)肿瘤细胞系。该细胞毒性是在异源的(豚鼠)或者同源的补体存在下或者在纯化的人单核细胞存在下，将细胞系和不同浓度的mAbP3D1DII，Rb抗114Ab或者作为对照和无关的单克隆或多克隆抗体一起培养不同的时间，以该细胞系中释放的51Cr的百分数来测评的。现已发现除了无关的对照抗体外，mAb P3D1DII和抗UK114rAb都能诱导KATO-III的补体依赖性细胞毒性，但当热灭活或者C9缺陷性血清用作补体源时则没有这种情况。当C9缺陷性血清用纯化的C9再生时，细胞毒性便得到恢复。此外，当KATO-III用作靶细胞时，Rb抗UK114Ab而并非无关的RbAb诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。用纯化的抗原预吸收抗UK-114Ab消除了抗体诱导的细胞毒性。相反，对于NICH没有观察到补体细胞毒性或者ADCC。这些结果提示抗UK114抗体对表面表达UK114抗原的肿瘤细胞系具有潜在的补体和抗体细胞依赖性细胞毒性。
实施例4用人肿瘤细胞系异种移植的裸鼠体内的抗UK114抗体的细胞毒性用1×106HT29人结肠腺癌细胞皮下注射以攻击裸鼠。8小时后，在它们的肿瘤部位注射0.2ml的用UK114免疫兔而产生的抗UK114兔超免疫(1/12效价)血清。分别在攻击后第7，11，14，18，21，25天重复以上处理过程。另一组小鼠则用已对UK-114给药发生临床反应并产生抗UK114抗体的肿瘤病人的血清进行类似的处理。
权利要求
1.一种免疫检测天然抗体的方法，该天然抗体能识别那些提取于哺乳动物器官并被保藏于ECACC的保藏号为930806103或者930806104的杂交瘤分泌的单克隆抗体所识别的蛋白并且存在于大约93％的人类实体瘤中，该方法包括所述天然抗体和选择性标记的蛋白间的免疫复合物的检测。
2.按照权利要求1的方法，其中的免疫复合物用第二个标记的抗物种抗体检测。
3.能识别那些提取于哺乳动物器官并被保藏于ECACC的保藏号为930806103或者930806104的杂交瘤分泌的单克隆抗体所识别的蛋白的且存在于大约93％的人类实体瘤中的天然抗体。
4.包括抗体或者超免疫血清的细胞毒性组合物，该抗体或者超免疫血清是通过用高氯酸从羊肝脏中提取的并被保藏于ECACC的保藏号为930806103或者930806104的杂交瘤分泌的单克隆抗体所识别的蛋白免疫动物或者人而产生的。
全文摘要
本发明涉及检测那些能识别提取于哺乳动物器官中的且分子量约为14Kda的蛋白的自然抗体的诊断方法。该抗体在对异基因物种给药时具有抗肿瘤活性。
文档编号C12P21/08GK1166838SQ95195990
公开日1997年12月3日 申请日期1995年10月30日 优先权日1994年11月4日
发明者A·巴托雷利 申请人:泽特希斯有限公司