专利名称：人Criptin生长因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及新鉴定的多核苷酸，通过该多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸和多肽的用途以及该多核苷酸和多肽的生产。更具体地讲，本发明的多肽经推断鉴定为人Criptin生长因子，在下文中有时称作“CGF”。本发明也涉及抑制该多肽的作用。
生长因子和其他促分裂原包括转化癌基因能迅速诱导一系列基因被特定细胞表达(Lau，L.F.和Nathans，D.，细胞调节的分子方面，6165-202(1991))。这些基因被命名为立即早期或早期应答基因，其与生长因子或促分裂原接触几分钟后即被转录活化，不依赖于从头蛋白质合成。一组这样的立即早期基因编码分泌的胞外蛋白，这些蛋白是协调复杂生物学过程如分化和增殖、再生和伤口愈合所必需的(Ryseck，R.P.等，细胞生长分化，2235-233(1991))。
在由生长因子触发的级联事件中这些立即早期基因的表达作为“第三信使”。还认为它们是整合和协调复杂生物学过程如分化和伤口愈合所必需的，在这些过程中细胞增殖是一常见事件。
criptin生长因子由某些类型的癌细胞如胰腺癌过量表达和分泌。
本发明的CGF显示与美国专利No.5,256,643(以其全文作为参考)公开的cripto生长因子有氨基酸序列同源性，cripto生长因子已知是一种有用的肿瘤标记，其经常在结肠癌中被增量调节并在胰腺癌中表达。
根据本发明的一个方面，提供了一种新的成熟多肽及其具有生物学活性并在诊断学或治疗学上有用的片段，类似物与衍生物。
根据本发明的另一个方面，提供了编码本发明的多肽的分离的核酸分子，该核酸分子包括mRNA，DNA，cDNA，基因组DNA，及其类似物和其具有生物学活性并在诊断学或治疗学上有用的片段和衍生物。
根据本发明的另一个方面，提供了通过重组技术生产这种多肽的方法，该方法包括在促进所述蛋白表达及所述蛋白的随后回收的条件下培养含有编码本发明的多肽的核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞。
根据本发明的再一个方面，提供了一种利用该多肽或编码该多肽的多核苷酸用于治疗目的的方法，例如治疗肌肉消耗症、骨质疏松、辅助移植物固定、刺激伤口愈合和组织再生、促进血管生成以及刺激血管平滑肌增殖和内皮细胞产生。
根据本发明的又一个方面，提供了抗这种多肽的抗体。
根据本发明的另一个方面，提供了抗这种多肽的拮抗剂，其可用于抑制这种多肽的作用，例如在伤口愈合和肺纤维变性过程中限制过量结缔组织的产生。
根据本发明的另一个方面，提供了含有足够长的核酸分子的核酸探针，该探针可以特异地杂交到编码本发明的多核苷酸序列上。
根据本发明的又一个方面，提供了用于检测与本发明多肽的过度表达以及编码此多肽的核酸序列中的突变有关的疾病的诊断测定方法。
根据本发明的又一个方面，提供了一种利用这种多肽或编码这种多肽的多核苷酸用于与科学研究、DNA合成以及DNA载体的生产有关的体外目的的方法。
根据本文的教导，本发明的这些以及其它方面对于本领域的技术人员而言应该是显而易见的。
下面的附图仅仅意味着是对本发明的具体实施方案的说明，而并不意味着以任何的方式限制本发明。
图1示出了本发明的多肽的cDNA序列以及相应推导的氨基酸序列，使用了标准的单字母氨基酸缩写。测序用37 3自动DNA测序仪(Applied Biosystems，Inc.)进行。
图2示出本发明的多肽(上行)和cripto生长因子(下行)之间的氨基酸序列同源性。
根据本发明的一个方面，提供了分离的核酸(多核苷酸)，其编码具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的成熟多肽或者编码由1995年5月11日保藏于ATCC、保藏号为No.97142的克隆的cDNA所编码的成熟多肽。
编码本发明的多肽的多核苷酸最初从人胰腺癌组织所得到的cDNA文库中发现。它在结构上与人cripto生长因子相关，并且含有一个编码230个氨基酸残基的蛋白质的开放读框，其中该多肽起始的23个氨基酸残基为推定的信号序列，从而该成熟多肽包含207个氨基酸。如图2所示，本发明的多肽具有与cripto生长因子相同的保守半胱氨酸残基。
另外，本发明的多肽具有一包含SEQ ID NO2的45-128位氨基酸的推定的可溶部分，因此129-207位氨基酸是推定的转膜部分。
起始Northern印迹分析显示在胰腺癌细胞中有非常高的表达。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA，基因组DNA和合成DNA，该DNA可以是双链或者是单链的，如果是单链则可以是编码链和非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以与显示在图1中的编码序列(SEQ ID NO1)或者保藏克隆的编码序列相同，或者该序列可以是一个不同的编码序列，但由于遗传密码的丰余性或简并性它编码与图1的DNA(SEQ ID NO1)或保藏的cDNA相同的成熟多肽。
编码图1的成熟多肽(SEQ ID NO2)或者编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括仅编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列与附加的编码序列，诸如一个前导或分泌序列或者一个蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(以及任选的附加的编码序列)与非编码序列，如内含子或者成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包括仅含有该多肽编码序列的多核苷酸以及含有附加的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明进一步涉及如上所述的多核苷酸的变异体，其编码具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的多肽的片段、类似物与衍生物或者由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物与衍生物。该多核苷酸的变异体可以是该多核苷酸的一种天然发生的等位基因变异体，或者是该多核苷酸的一种非天然发生的变异体。
因此，本发明包括编码如图1所示的相同成熟多肽(SEQ ID NO2)或由保藏克隆的cDNA编码的相同成熟多肽的多核苷酸及其变异体，其中该变异体编码图1的多肽(SEQ ID NO2)或者由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或者类似物。该核苷酸变异体包括缺失变异体，取代变异体以及添加或插入变异体。
如上文所示，该多核苷酸可以具有是图1所示的编码序列(SEQ ID NO1)或者保藏克隆的编码序列的天然发生的等位基因变异体的编码序列。正如在本领域中已知的，一种等位基因变异体是一个多核苷酸序列的可变形式，它可以具有一个或多个核苷酸的取代，缺失或添加，但它基本上不改变所编码多肽的功能。
本发明也包括多核苷酸，其中可以在同一读框内将该成熟多肽的编码序列与这样一种多核苷酸序列融合，所述多核苷酸序列协助多肽从宿主细胞表达与分泌，例如作为控制多肽从细胞转运的分泌序列发挥作用的前导序列。具有前导序列的多肽是一种前蛋白质，它可以经宿主细胞裂解前导序列而形成该多肽的成熟形式。该多核苷酸也可以编码一种为成熟蛋白加上附加的5’氨基酸残基的蛋白原。具有序列原的成熟蛋白是一种蛋白原并且是该蛋白的一种非活性形式。一旦该序列原被裂解，一种活性成熟蛋白便保留下来。
因此，例如本发明的多核苷酸可以编码一种成熟蛋白，或者编码一种具有序列原的蛋白，或者编码一种具有序列原与前序列(前导序列)的蛋白。
本发明的多核苷酸也可以具有在读框中与一个标记序列融合的编码序列，该标记序列便于本发明的多肽纯化。在细菌宿主的情况下该标记序列可以是由pQE-9载体所提供的六组氨酸标记物从而保证与该标记物融合的成熟多肽的纯化，或者例如当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，该标记序列可以是血凝素(HA)标记物。该HA标记对应于从流感血凝素蛋白得到的一个表位(Wilson，I.，等，细胞，37767(1984))。
术语“基因”是指参与产生一个多肽链的DNA区段；它包括在编码区之前与之后的区域(前导区与尾区)以及在各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
全长的CGF基因的片段可以用作一个cDNA文库的杂交探针，以便于分离该全长的基因并且分离与该基因具有高的序列相似性或相似的生物学活性的其它基因。这种类型的探针优选具有至少30个碱基并且可以含有例如50或更多个碱基。该探针也可以用于鉴定对应于一个全长转录物的cDNA克隆以及含有完整的CGF基因的一个基因组克隆或多个基因组克隆，其中完整的CGF基因包括调节区与启动子区，外显子和内含子。一个筛选的实例包括通过使用已知的DNA序列合成寡核苷酸探针以分离出CGF基因的编码区。具有互补于本发明基因序列的序列的标记寡核苷酸可以用于筛选人cDNA、基因组DNA或mRNA的文库，从而测定与该探针杂交的文库成员。
本发明进一步涉及与上述序列杂交的多核苷酸，条件是序列间存在至少70％、优选至少90％且更优选至少95％的相同性。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。文中所使用的术语“严格条件”是指只有序列间存在至少95％且优选至少97％的相同性时才发生杂交。在一个优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽基本上保留了与由图1的cDNAs(SEQ ID NO1)或保藏的cDNA(s)所编码的成熟多肽所具有的同样的生物学功能或活性。
另一方面，多核苷酸可以含有至少20个碱基，优选30个碱基并且更优选至少50个碱基与本发明的多核苷酸杂交且与之具有如上所述相同性，并且可以保留或不保留活性。例如这样的多核苷酸可以用作SEQ ID NO1的多核苷酸的探针，例如用于回收多核苷酸或用作诊断探针或PCR引物。
因此，本发明涉及与一种编码SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸及其片段具有至少70％的相同性、优选至少90％的相同性且更优选至少95％的相同性的多核苷酸，以及该多核苷酸所编码的多肽，其中所述的片段具有至少30个碱基并且优选至少50个碱基。
本文所涉及的保藏物将按照关于国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约进行保存。这些保藏物仅为了本领域技术人员的方便而提供，不是对按35 U.S.C.§112要求保藏物的许可。包含在保藏材料中的多核苷酸的序列及其所编码的多肽的氨基酸序列在本文中作为参考而附入，并且在与本文序列描述有冲突的任意的一种情况下起决定作用。制造、使用或销售该保藏材料需要许可证，并且此处不颁发这样的许可证。
本发明进一步涉及一种具有图1的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO2)或者具有由保藏的cDNA所编码的氨基酸序列的多肽以及该多肽的片段、类似物和衍生物。
当涉及图1的多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的cDNA编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”与“类似物”是指基本上保留了该多肽的同样的生物学功能或活性的多肽。因此，一种类似物包括可以通过该蛋白原部分的裂解而激活从而产生有活性的成熟多肽的蛋白原。
本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。
图1的多肽(SEQ ID NO2)或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)一种多肽，其中一个或多个氨基酸残基被一个保守的或非保守的氨基酸残基(优选一个保守的氨基酸残基)所取代并且被取代的氨基酸残基可以是或可以不是由该遗传密码所编码，或者(ii)一种多肽，其中一个或多个氨基酸残基包含一个取代基，或者(iii)一种多肽，其中成熟多肽与另一种化合物，诸如一种提高该多肽的半寿期的化合物(例如聚乙二醇)融合，或者(iv)一种多肽，其中成熟多肽与附加的氨基酸融合，诸如融合一个前导或分泌序列或者一个用于该成熟多肽的纯化的序列或者一个蛋白原序列，或者(v)成熟多肽的剪接变异体，其缺少了某些氨基酸残基但仍保持生物学活性。从本文的教导出发，这样的片段、衍生物与类似物视为是在本领域的技术人员所熟知的范围内的。
本发明的多肽与多核苷酸优选以一种分离的形式而提供，并且优选将其纯化成均一物质。
术语“分离的”是指从其原始环境(例如如果该物质是天然存在的，即指天然环境)中分离出该物质。例如，一种存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未分离的，但是从天然系统中一些或所有的共存物质里分离出的同样的多核苷酸或DNA或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以是一个载体的一部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是一种组合物的一部分，并且如果该载体或组合物并非是其天然环境的一部分，则其仍然是分离的。
本发明的多肽包括SEQ ID NO2的多肽(特别是成熟多肽)以及与SEQ IDNO2的多肽具有至少70％的相似性(优选至少70％的相同性)的多肽、更优选与SEQ ID NO2的多肽具有至少90％的相似性(更优选至少90％的相同性)的多肽、并且特别优选与SEQ ID NO2的多肽具有至少95％的相似性(特别优选至少95％的相同性)的多肽，本发明的多肽也包括该多肽的部分，其中该多肽的这些部分通常含有至少30个氨基酸并且更优选至少50个氨基酸。
正如在本领域中已知的，两种多肽之间的“相似性”是通过把一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代与第二个多肽的序列进行比较而测定的。
通过肽合成，本发明多肽的片段或部分可以用于生产相应的全长的多肽；因此，该片段可以用作生产全长多肽的中间体。本发明的多核苷酸的片段或部分可以用于合成本发明的全长的多核苷酸。
本发明也涉及含有本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体遗传改造的宿主细胞以及通过重组技术生产本发明的多肽。
宿主细胞可以是用本发明的载体进行遗传改造的(转导或转化或转染)，其中载体例如可以是克隆载体或表达载体，载体例如可以呈质粒、病毒颗粒、噬菌体等的形式。改造的宿主细胞可以在经改良以适于激活启动子、筛选转化体或扩增CGF基因的常规营养培养基上培养。培养条件(诸如温度、pH及其它)是为了表达而选择的宿主细胞以前所采用的条件，并且对本领域的普通技术人员来讲是显而易见的。
通过重组技术，本发明的多核苷酸可以用于生产多肽。因此，例如该多核苷酸序列可以包含在表达多肽的多种表达载体中的任意一种中，具体而言如载体或质粒中。这样的载体包括染色体、非染色体及合成DNA序列，例如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；质粒与噬菌体DNA结合所得到的载体、病毒DNA(诸如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒与假狂犬病)。但是，只要任意一种其它的载体或质粒在宿主中可以复制并且存活便可以使用它们。
可通过许多种方法把合适的DNA序列插入到载体中。一般而言，通过本领域已知的方法可以把DNA序列插入到一个合适的限制性内切酶位点上。该方法及其它方法被视为是在本领域的技术人员所熟知的范围之内。
表达载体中的DNA序列可操作地与一个合适的表达调控序列(启动子)连接以指导mRNA的合成。作为上述启动子有代表性的实例可以提到的有LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp，噬菌体λPL启动子以及其它已知调控原核细胞或真核细胞或其病毒中基因表达的启动子。表达载体也含有一个用于翻译起始的核糖体结合位点与一个转录终止子。载体也可以包括用于扩增表达的合适序列。
此外，表达载体优选含有一种为转化宿主细胞的筛选而提供一种表型性状的基因，诸如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者诸如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。
含有如上所述的合适的DNA序列以及一个合适的启动子或调控序列的载体可以用于转化一种合适的宿主从而允许该宿主表达蛋白。作为合适宿主有代表性的实例可以提到的有细菌细胞，诸如大肠杆菌，链霉菌属，鼠伤寒沙门氏杆菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，诸如果蝇S2与苜蓿银纹夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO，COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等等。根据本文的教导，选择合适的宿主被认为是在本领域的技术人员所熟知的范围之内。
更具体地讲，本发明也包括含有一个或多个如上广义所述的序列的重组构建体。构建体包括将本发明的序列以正向或逆向插入其中的载体，如质粒或病毒载体。在这一实施方案一个优选方面，构建体进一步包括可操作地与序列连接的调节序列，例如启动子。许多合适的载体与启动子是本领域的技术人员所熟知的并且可以通过商业途径得到。下面的载体以举例的方式提供细菌pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，psiX174，pbluescript SK，pBSKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；pTRC99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)；真核细胞pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。但是，只要任意一种其它的质粒或载体在该宿主中可以复制并存活便可以使用它们。
采用具有选择标记的CAT(氯霉素转移酶)载体或其它载体，可以从任意一种所需要的基因中筛选出启动子区域。两个合适的载体为pKK232-8与pCM7。特别指出的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λPR，PL和trp。真核启动子包括CMV立即早期，HSV胸苷激酶，早期与晚期SV40，来自逆转录病毒的LTRs和小鼠金属硫蛋白-I。选择合适的载体与启动子在本领域普通的技术水平上是可以完成的。
在更进一步的实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞(如哺乳动物细胞)，或是低等真核细胞(如酵母细胞)，或者宿主细胞可以是原核细胞(如细菌细胞)。通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔可以实现该构建体向宿主细胞的引入(Davies，L.，Dibner，M.，Battey，I.，分子生物学基本方法，(1986))。
宿主细胞中的构建体可以以常规的方式使用从而生产由该重组序列所编码的基因产物。另一方面，本发明的多肽也可以通过常规的肽合成仪合成生产。
在合适的启动子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达。采用从本发明的DNA构建体得到的RNAs，也可通过无细胞翻译系统生产该蛋白。用于原核与真核宿主的合适的克隆与表达载体在Sambrook等人的《分子克隆实验室手册第二版》(纽约冷泉港，1989)中进行了描述，此处以参考文献引用其公开内容。
通过向载体中插入一个增强子序列可提高通过高等真核生物对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子为DNA的顺式作用元件，一般大约从10至300bp，它作用于启动子以提高其转录。它的例子包含有位于复制起点晚期一侧的SV40增强子(bp100至270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，位于复制起点晚期一侧的多瘤增强子与腺病毒增强子。
一般而言，重组表达载体包括复制起点与允许宿主细胞转化的选择标记(例如大肠杆菌的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母TRP1基因)以及从一个高度表达的基因中得到的指导下游结构序列的转录的启动子。这些启动子可以从编码如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)这样的糖酵解酶、α因子、酸性磷酸酶、或热休克蛋白等的操纵子中得到。异源结构序列以合适的方式与翻译起始和终止序列，以及优选地一个能够指导被翻译的蛋白分泌至周质空间或胞外培养基中的前导序列进行装配。异源序列可以任选地编码一种融合蛋白，该蛋白含有一个N-末端鉴定肽，其中的鉴定肽赋予了表达的重组产物所需要的特征，例如稳定性或易于纯化的特性。
通过将编码一种所需蛋白的结构DNA序列与合适的翻译起始与终止信号以可操纵的阅读方式和一个功能启动子一起插入，可以构建对细菌的使用而言有用的表达载体。该载体将包括一个或多个表型选择标记和一个复制起点，以确保维持该载体并且如果需要的话可以保证在宿主中进行扩增。用于转化的合适的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌以及属于假单胞杆菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中的许多种，当然其它种的生物也可以采用。
作为代表性但却无限制性的例子，对细菌的使用而言有用的表达载体可以包括一个选择标记和来自含有所熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传因子的商购质粒的细菌复制起点。这些商购载体包括如pKK223-3(Phamacia精细化学公司，Uppsala，瑞典)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。这些pBR322“骨架”部分与一种合适的启动子和待表达的结构序列相结合。
进行合适的宿主株系的转化并且该宿主株系生长至合适的细胞密度后，通过合适的方法(例如温度变动或化学诱导)诱导所选择的启动子并且再将细胞培养一段时间。
细胞通常经离心收获，通过物理或化学方法进行破碎，并且保留得到的粗提物以便进一步的纯化。
在蛋白表达中所使用的微生物细胞可以通过任意一种方便的方法进行破碎，该方法包括冷冻-融化循环，超声处理，机械破碎，或者使用细胞裂解剂。
各种哺乳动物细胞的培养系统也可以用于表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的实例包括由Gluzman(细胞，23175(1981))所述的猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系以及可以表达相容载体的其它细胞系，例如C127，3T3，CHO，HeLa与BHK细胞系。哺乳动物表达载体包括复制起点、合适的启动子和增强子、以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。从SV40病毒基因组中得到的DNA序列，例如SV40起点，早期启动子，增强子，剪接与聚腺苷酸化位点可以用于提供所需要的非转录遗传因子。
本发明的多肽可以通过迄今为止所使用的方法从重组的细胞培养物中回收并纯化，该方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析与凝集素层析。如果需要的话，在完成该成熟蛋白的构型中可以采用蛋白重折叠步骤。最后，可以采用高效液相层析(HPLC)用于最终的纯化步骤。
本发明的多肽可以是一种天然纯化的产物，或者是一种化学合成方法的产物，或者是从一个原核或真核宿主(例如通过细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞培养)经重组技术制备的。根据在重组生产方法中所使用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化或者可以是非糖基化的。该多肽也可以包含一个起始的甲硫氨酸残基。
本发明的CGF基因可以被标记并被用作含有核酸内切酶消化的DNA制备物的Southern印迹分析中的探针，以确定正常组织和肿瘤组织中的criptin基因是否存在扩增、重排、缺失或限制性片段长度多态性。
标记的criptin基因可以用于分析含RNA的Northern印迹以确定在各种正常和病理组织中样品mRNA表达的相对水平。
CGF可以用于产生适合于原位RNARNA杂交的探针，以在表达CGF mRNA的正常或病理细胞中进行组织学定位。
CGF寡核苷酸(有义链)可以用于检测各种组织中的CGF mRNA水平。
CGF多肽由某些类型的癌细胞如胰腺癌过量表达和分泌，因此，检测CGF基因转录或CGF蛋白的过量使得能诊断胰腺癌。因此，抗CGF抗体可以用于诊断与肿瘤形成相关的新生血管化，因为这一多肽的改变的水平可以是这种疾病的指示指标。
可以采用一种竞争测定，其中将特异于CGF的抗体结合到固相支持物上，并将标记的CGF和从宿主得到的样品通过该固相支持物，然后所检测的吸附于该固相支持物上的标记量可以与该样品中CGF量相互关联。
“夹心”测定类似于酶联免疫吸附测定。在“夹心”测定中，将CGF多肽通过固相支持物并结合到已附着在该固相支持物上的抗体上，然后将第二抗体结合到CGF多肽上。随后将已标记并且特异于第二抗体的第三抗体引入固相支持物并结合到第二抗体上，之后可以定量测定其量。
本发明的多肽可以用于伤口愈合及与组织再生长有关的相关治疗方法，所述的组织如结缔组织、皮肤、骨骼、软骨、肌肉、肺或肾。
本发明的多肽还可以用于刺激血管生成，例如促进血管平滑肌细胞和内皮细胞的生长。血管生成的增加对局部缺血组织有利，并对冠状动脉狭窄后的旁路冠状动脉发育有利。
本发明的多肽还可以在移植固定中采用以刺激移植物周围的细胞生长并因此促进移植物与其目的部位的附着。
根据本发明更进一步的方面，本发明提供了一种利用这种多肽或者编码这种多肽的多核苷酸的方法，它们可作为与科学研究、DNA的合成、DNA载体的生产有关的体外目的中的研究试剂，以用于开发治疗人类疾病的治疗学和诊断学方法。
本发明提供了一种鉴定本发明多肽的受体的方法。编码受体的基因可以通过许多为本领域普通技术人员已知的方法进行鉴定，例如配体淘选与FACS分选(Coligan，等，免疫学通用方案，1(2)，第五章，(1991))。优选采用表达克隆法，其中从一个对CGF多肽有反应的细胞中制备聚腺苷酸化的RNA，并且把从该RNA产生的cDNA文库分割成多个集合体并且将其用于转染COS细胞或其它对CGF无反应的细胞。将生长于玻璃载玻片上的转染细胞与标记的CGF接触，CGF可通过许多方法，包括碘化作用或引入一个位点特异性蛋白激酶的识别位点来标记。固定与温育后，对玻片进行放射自显影分析。鉴定阳性集合体并且采用一种重复亚合并与再筛选方法来制备和再转染亚集合体，最终得到一种编码推定的受体的单一克隆。
作为一种用于受体鉴定的替代方法，标记的CGF可以和细胞膜或表达该受体分子的提取物的制剂光亲和连接。交联物质通过PAGE分析进行分辨并且在X-光胶片上曝光。可以切下含有CGF受体的标记复合物，分解成肽片段并且使之进行蛋白微量测序。从微量测序得到的氨基酸序列可以用来设计一套简并的用于筛选cDNA文库的寡核苷酸探针，从而鉴定编码该推定受体的基因。
本发明还设计一种筛选化合物的方法，以便于鉴定那些与CGF受体结合并活化之的物质。这种测定的一个实例包括在comitogen Con A存在下刺激内皮细胞的增殖。取人脐静脉内皮细胞在96孔平底培养板(Costar，Cambridge，MA)上培养并补加适于刺激细胞增殖的反应混合物，该混合物含有Con-A(Calbiochem，La Jolla，CA)。加入Con-A和待筛选的化合物，在37℃温育后用3[H]胸苷脉冲培养物并收获至玻璃纤维滤膜(PhD；Cambridge Technology，Watertown，MA)上。用液闪计数仪(Beckman Instruments，Irvine，CA)确定三份重复培养物的平均3[H]胸苷掺入(cpm)。显著的3[H]胸苷掺入指示对内皮细胞增殖的刺激。
为测定拮抗剂化合物，可以进行上述分析测定，然而在这一测定中CGF与待筛选化合物一起加入，在CGF存在下该化合物抑制3[H]胸苷掺入的能力指示该化合物是CGF的一种拮抗剂。
或者，可以在适合竞争抑制分析的条件下将标记的CGF和一潜在的拮抗剂化合物与膜结合CGF受体或重组受体合并来检测CGF拮抗剂。CGF可以用放射性标记，从而与受体结合的CGF分子数可以用来确定潜在的拮抗剂的效果。
或者，可以在潜在的拮抗剂化合物与受体相互作用后测定已知的第二信使系统的反应。这种第二信使系统包括但不限于cAMP鸟苷酸环化酶、离子通道或磷酸肌醇水解。可以标记化合物以检测结合，一种发生结合但却不刺激第二信使反应的化合物是有效的拮抗剂化合物。
潜在的CGF拮抗剂化合物的例子包括抗体，或者在某些情况下为寡核苷酸，其与多肽本身结合或与多肽受体结合。或者，一种潜在的拮抗剂可以是一种紧密相关的蛋白质，例如CGF的一种突变体形式，它识别CGF受体上但却没有效果，因而竞争性地抑制CGF的作用。
另一种潜在的CGF拮抗剂为一种采用反义技术制备的反义构建体。通过三股螺旋形成或反义DNA或RNA，反义技术可以用于控制基因的表达，上述两种方法均是建立在一种多核苷酸结合到DNA或RNA的基础上的。例如，编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码部分可以用于设计一种反义RNA寡核苷酸，其长度从大约10至40个碱基对。将一种DNA寡核苷酸设计成互补于涉及转录的基因区域(三股螺旋-参见Lee等，核酸研究，63073(1979)；Cooney等，科学，241456(1988)；与Dervan等，科学，2511360(1991))，从而阻止转录以及CGF的生产。反义RNA寡核苷酸在体内杂交到mRNA上并且阻止mRNA分子翻译成CGF(反义-Okano，神经化学杂志，56560(1991)；作为基因表达的反义抑制剂的寡脱氧核苷酸，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988))。还可以把上述寡核苷酸传递至细胞，从而该反义RNA或DNA可以在体内表达以抑制CGF的生产。
潜在的CGF拮抗剂包括一些小分子，这些小分子可以结合多肽的活性位点、受体结合位点或多肽的其它生长因子结合位点从而阻止CGF的正常生物学活性。小分子的实例包括但不限于小肽或类肽分子。
拮抗剂可以直接或间接用于抑制肿瘤生长，例如通过拮抗CGF活性和/或拮抗气囊血管成形术之后动脉粥样硬化和再狭窄中常见的新生血管化和平滑肌细胞新生内膜增殖而达到所述抑制作用。
拮抗剂可以与一种如下所述的药物学可接受的载体一起用于一种组合物中。
本发明的CGF多肽和拮抗剂可以结合一种合适的药物载体而使用，这种组合物包括一种治疗上有效量的多肽或拮抗剂化合物以及一种药用可接受的载体或赋形剂。这样的一种载体包括但不限于盐水，缓冲盐水。葡萄糖，水，甘油，乙醇及其混合物。该配方应当适合于给药的方式。
本发明也提供了一种药物包装或试剂盒，它们包括一个或多个容器，该容器中装有一种或多种本发明的药物组合物的成分。与该容器相伴的可以是一则以管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府机构规定的形式存在的通知，该通知反映出生产、使用或销售机构对人体给药的批准。此外，该药物组合物可以与其它的治疗化合物结合使用。
该药物组合物可以按照常规的方式给药，如通过口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或者真皮内的途径。该药物组合物以对治疗和/或预防具体症状有效的量进行给药。一般而言，该组合物以至少约10μg/kg体重的量进行给药，并且在大多数情况下该组合物的给药量将不超过约8mg/kg体重/天。在大多数情况下考虑到给药的途径、症状等，该剂量从每天约10μg/kg体重至约1mg/kg体重。
CGF与其它生长因子结合可以加速如在伤口愈合中见到的生理学应答，所述的其它生长因子包括但不限于PDGF、IGF、FGF、EGF或TGF-β。
根据本发明，CGF多肽以及同为多肽的兴奋剂(agonist)和拮抗剂也可以通过在体内表达所述多肽而使用，这通常称作“基因治疗”，因此，例如可以采用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)在体外工程化来自患者细胞，随后将工程化的细胞提供给待采用该多肽治疗的患者。上述方法是本领域所熟知的。例如，可以通过本领域已知的方法、采用一种含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒来工程化细胞。
类似地，为了在体内表达多肽，例如可以通过本领域已知的方法在体内工程化细胞。正如在本领域已知的，为了在体内工程化细胞并且在体内表达多肽，可以给予患者一种生产含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒颗粒的生产细胞。从本发明的教导出发，通过上述方法给予本发明的一种多肽的这些或者其它的方法对本领域的普通技术人员是显而易见的。例如，除了逆转录病毒颗粒以外，用于工程化的细胞的表达载体还可以是如一种腺病毒，它可以在与一种合适的输送载体结合后用于在体内工程化细胞。
可以得到上述逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于Moloney小鼠白血病病毒，脾坏死病毒，逆转录病毒诸如Rous肉瘤病毒，Harvey肉瘤病毒，禽白血病病毒，长臂猿白血病病毒，人免疫缺陷病毒，腺病毒，骨髓增生性肉瘤病毒与乳房肿瘤病毒。在一个具体的实施方案中，逆转录病毒质粒载体是从Moloney小鼠白血病病毒得到的。
载体包含一个或者多个启动子。可以采用的合适的启动子包括但不限于逆转录病毒LTR；SV40启动子；以及在Miller，等，生物技术，第7卷，第9期，第980-990页(1989)中所描述的人巨细胞病毒(CMV)启动子，或者任何一种其它的启动子(例如细胞启动子，如真核细胞启动子，包括但不限于组蛋白、pol III和β-肌动蛋白启动子)。其它可以采用的病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子，胸苷激酶(TK)启动子及B19细小病毒启动子。根据本文中的教导，选择合适的启动子对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。
编码本发明多肽的核酸序列受到一个合适的启动子的控制。可以采用的合适的启动子包括但不限于腺病毒启动子，如腺病毒主要晚期启动子；或者异源启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启动子；诱导型启动子，如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热体克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人珠蛋白启动子；病毒的胸苷激酶启动子，如单纯疱疹胸苷激酶启动子；逆转录病毒LTRs(包括上述修饰的逆转录病毒LTRs)；β-肌动蛋白启动子；以及人生长激素启动子。该启动子也可以是控制编码该多肽的基因的天然启动子。
采用逆转录病毒质粒载体来转导包装细胞系从而形成生产细胞系。可以被转导的包装细胞的实例包括但不限于PE501，PA3 17，φ-2，φ-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，φCRE，φCRIP，GP+E-86，GP+envAm12以及在Miller，人类基因治疗，第1卷，第5-14页(1990)中所描述的DAN细胞系，其中该文献以其全文引入本文以供参考。载体可以通过本领域已知的任何一种方法来转导包装细胞，这些方法包括但不限于电穿孔，采用脂质体以及CaPO4沉淀。在另一种方法中，逆转录病毒质粒载体可以包埋在脂质体中，或者被偶联到脂类上，然后再将该载体引入宿主中。
生产细胞系产生含有编码该多肽的核酸序列的侵染性逆转录病毒载体颗粒，然后可以使用这些逆转录病毒载体颗粒或在体外或在体内转导真核细胞。被转导的真核细胞将表达编码该多肽的核酸序列。可以被转导的真核细胞包括但不限于胚干细胞，胚胎癌性细胞，以及造血干细胞，肝细胞，成纤维细胞，成肌细胞，角质形成细胞，内皮细胞和支气管上皮细胞。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列特异地靶向位于单个的人染色体上的特定位置并能与之杂交。此外，现在需要鉴定染色体上的特定位点。目前，仅有少数几种以实际的序列数据(重复多态性)为基础的染色体标记试剂可以用于标记染色体的位置。本发明的DNA染色体作图是将这些序列和疾病相关基因相关联的重要的第一步。
简而言之，通过从cDNA制备PCR引物(优选10-25bp)便可以把序列定位到染色体上。采用3’未翻译区域的计算机分析可以快速地选择引物，其中引物不应跨越超过基因组DNA上的一个外显子，否则使得扩增方法复杂化。然后采用这些引物用于PCR筛选含有单个的人染色体的体细胞杂交体。只有那些含有与该引物对应的人基因的杂交体才会生产扩增片段。
体细胞杂交体的PCR作图是将一个特定的DNA定位于特定的染色体上的快速程序。根据本发明采用同样的寡核苷酸引物，用来自于特定染色体或者大基因组克隆集合体的一组片段、按照类似方式可以实现亚定位(sublocalization)。可以类似地用于对染色体作图的其它的作图策略包括原位杂交，用标记的经流式分选的染色体进行预筛选以及通过杂交进行预选，从而构建出染色体特异性的cDNA文库。
cDNA克隆与一个中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来实现一步法准确染色体定位。该技术可以采用50或60个碱基长短的cDNA。关于该技术的综述参阅Verma等，人类染色体基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。
一旦一个序列已定位到一个准确的染色体位置，则染色体上该序列的物理位置可与遗传图谱数据相关联。这些数据例如可在V.McKusick，人类的孟德尔遗传中找到(可以通过Johns Hopkins大学Welch医学文库联机得到)。然后通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)来鉴定基因与已定位到相同染色体区域上的疾病之间的关系。
接下来需要测定在受影响的和未受影响的个体之间cDNA或基因组序列中的差异。如果突变是在一些或所有的受影响个体中观察到的、但是又没有在任何一个正常个体中被观察到的话，那么该突变可能是疾病的病原体。
根据物理作图和遗传作图技术目前的分辨率，一个被准确定位到与疾病有关的染色体区域的cDNA可以是50-500个潜在的病原(causative)基因中的一种(其中假定有1兆碱基的作图分辨率且每20kb为一个基因)。
多肽、其片段或该多肽的其它衍生物或类似物、或者表达上述物质的细胞可以用作生产其抗体的免疫原。这些抗体可以是例如多克隆抗体或者单克隆抗体。本发明也包括嵌合，单链和人源化的抗体，以及Fab片段或Fab表达文库的产物。本领域已知的多种方法可以用于生产这些抗体和片段。
针对相应于本发明的序列的多肽而产生的抗体可以通过将该多肽直接注射人动物体内或者通过将该多肽向动物给药来得到，其中的动物优选非人类。然后，如此得到的抗体会结合到该多肽上。通过这种方式，即使是仅仅编码该多肽的一个片段的序列也可用于产生能结合整个天然多肽的抗体。然后，该抗体可以用于从表达该多肽的组织中分离这种多肽。
为了制备单克隆抗体，可以采用任何一种通过连续的细胞系培养生产抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler与Milstein，1975，自然，256495-497)，三体杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，今日免疫学，472)以及生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole，等，1985，单克隆抗体与癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
可以将用于生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)进行修改从而生产出针对本发明免疫原性多肽制品的单链抗体。也可以使用转基因小鼠来表达针对本发明免疫原性多肽制品的人源化抗体。
本发明将参照下面的实施例进一步加以说明；但是，应当了解本发明并不局限于这些实施例。除非另作声明的以外，所有的份或量均为重量。
为了利于理解以下的实施例，现叙述一些经常出现的方法和/或术语。
“质粒”通过一个在前的小写p和/或跟随几个大写字母和/或数字加以命名。本文中的起始质粒或者可以通过商业途径得到或在不受限制的基础上公众可得到，或者可以根据已公开的方法从可得到的质粒中构建出来。此外，对于与那些所述等价的质粒是本领域已知的并且对本领域普通技术人员是显而易见的。
DNA的“消化”是指用一种仅对DNA上的某些序列起作用的限制性酶催化裂解DNA。本文所采用的多种限制性酶可以通过商业途径得到，并且其反应条件、辅因子和其它使用要求对本领域普通技术人员是已知的。为了分析目的，通常把1μg的质粒或DNA片段与溶于约20μl缓冲溶液的约2单位的酶一起使用。为了分离用于质粒构建的DNA片段，通常在一个更大的体积内用20至250单位的酶消化5至50μg的DNA。针对具体的限制性酶而言，合适的缓冲溶液和底物的量是由生产者规定的。通常采用在37℃下约1小时的温育时间，但是该时间可以根据产品供应者的指示而变化。在消化后，反应混合物直接在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳以分离出所需的片段。
采用由Goeddel，D.等，核酸研究，84057(1980)所述的8％聚丙烯酰胺凝胶进行裂解片段的大小分离。
“寡核苷酸”或指一种单链多脱氧核苷酸，或指可以通过化学合成的两条互补的多脱氧核苷酸链。这些合成的寡核苷酸不具有5’磷酸，因此如果不在一种激酶存在下以ATP添加一个磷酸时，该寡核苷酸将不会连接到另一个寡核苷酸上。合成的寡核苷酸将连接到未被去磷酸化的片段上。
“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，等，出处同上，p.146)。除非另行提供的以外，采用已知的缓冲液和条件、每0.5μg约等摩尔量的待连接DNA片段10单位T4DNA连接酶(“连接酶”)来实现连接。
除非另有说明，按Graham，F.和Van der Eb，A.，病毒学，52456-457(1973)所述的方法进行转化。
实施例1CGF的细菌表达与纯化编码CGF的DNA序列，ATCC#97142采用与加工后的CGF蛋白(减去信号肽序列)的5’序列和CGF基因3’的载体序列相对应的PCR寡核苷酸引物进行起始扩增。与CGF基因相对应的附加的核苷酸分别加入到5’和3’序列中。5’寡核苷酸引物具有序列5’ACTCTTGGATCCAATTTGGGAAACAGCTATCAAGA 3’(SEQ ID NO3)，并且含有一个BamHI限制性酶位点(粗体字)，后接起自加工蛋白的假定末端氨基酸密码子的CGF编码序列。3’寡核苷酸引物序列为5’TACAACTCTAGACTATTATTTACAACATAGAAAATTAAAGGC3’(SEQ ID NO4)，它含有XbaI限制性位点(粗体字)并且后跟对应于羧基端5’氨基酸和翻译终止密码子的核苷酸反向互补序列。限制性酶切位点与在细菌表达载体pQE(Qiagen，Inc.Chatsworth，CA 91311)上的限制性酶切位点对应。pQE-9编码抗生素抗性(Ampr)，一个细菌的复制起点(ori)，一个IPTG调节的启动子操纵子(P/O)，一个核糖体结合位点(RBS)，一个6-组氨酸标记物和限制性酶位点。然后用HindIII和XbaI消化pQE-9，将扩增序列连接到pQE-9上，并且将其插入含有编码组氨酸标记物和核糖体结合位点(RBS)的序列的框架中。然后，通过在Sambrook,J.等，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社，(1989)中所述的方法，用连接昆合物转化大肠杆菌菌株M15/rep 4(Qiagen，Inc.)。M15/rep 4含有质粒pREP4的多个拷贝，其表达lacI阻抑物并且赋予卡那霉素抗性(Kanr)。转化体通过其在LB平板上生长的能力而加以鉴定，并且筛选出氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA并且通过限制酶切分析加以证实。将含有所需构建体的克隆在补充有Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB培养基上培养过夜(O/N)。按照1∶100至1∶250的比例将O/N培养物用于接种大的培养物。将细胞培养至光密度600(O.D.600)介于0.4与0.6之间，然后加入IPTG(“异丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”)至终浓度为1mM。IPTG通过失活lacI阻抑物、启动P/O进行诱导从而导致基因表达的提高。将细胞再培养2.5小时以便产生一呈指数生长的培养物，然后通过离心收集细胞。将含CGF/6-组氨酸的M15[pREP4]细胞在6摩尔盐酸胍、50mM NaPO4pH8.0中裂解。将裂解物上样至镍螯合柱并收集流通物。用pH8.0、6.0和5.0的6摩尔盐酸胍、50mMNaPO4洗柱。在pH2.0洗脱CGF融合蛋白(纯度＞90％)。为了复性，将pH2.0的洗脱液调节到3摩尔盐酸胍、100mM磷酸钠、10毫摩尔谷胱甘肽(还原型)及2毫摩尔谷胱甘肽(氧化型)。在此溶液中温育12小时之后将蛋白对10毫摩尔磷酸钠透析。为进行凝胶电泳，将沉淀物重悬于SDS/NaOH和2×SDS-PAGE上样缓冲液中，热变性，然后在4-20％SDS-PAGE凝胶中电泳。经考马斯亮蓝R-250染色可见蛋白质。
实施例2采用杆状病毒表达系统克隆和表达CGF采用含有5’BamHI和3’XbaI的PCR寡核苷酸引物来扩增编码全长CGF蛋白的DNA序列，ATCC#97142。引物序列为5’ACTCTTGGATCCGCCATCATGACCTGGAGGCACCT 3’(SEQ ID NO5)和5’TACAACTCTAGACTATTATTTACAACATAGAAAATTAAAGGC 3’(SEQID NO6)。BamHI-XbaI片段含有包括用于分泌的信号序列的完整的CGF编码区。这一片段命名为F2，是采用一种可以通过商业途径得到的试剂盒(“Geneclean”，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)从1％的琼脂糖凝胶中分离。
通过杆状病毒表达系统，利用载体pA2来表达CGF蛋白(综述参阅Summers，M.D.与Smith，G.E.1987，杆状病毒载体与昆虫细胞培养步骤的方法手册，得克萨斯农业实验站会刊No.1555)。这一表达载体含有苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(AcMNPV)的强的多角体蛋白启动子，后跟限制性内切核酸酶BamHI和XbaI的识别位点。猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化作用。为了容易地选择出重组病毒，将来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因以与多角体蛋白启动子同样的取向插入，其后面是多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。多角体蛋白序列两侧为用于共转染的野生型病毒DNA的细胞介导的同源重组的病毒序列。许多其它的杆状病毒载体，如pRGl，pAc373，pVL941和pAcIM1可以用于代替pA2(Luckow，V.A.与Summers，M.D.，病毒学，17031-39)。
质粒pA2以限制性酶BamHI和XbaI消化并且通过本领域已知的方法采用牛肠磷酸酶使其去磷酸化，然后采用可以通过商业途径得到的试剂盒(“Geneclean”，BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)从1％的琼脂糖凝胶中分离出DNA，该载体DNA命名为V2。
BamHI-XbaI裂解片段F2和去磷酸化质粒V2通过T4DNA连接酶进行连接。然后转化大肠杆菌XL1 Blue(Stratagene Cloning Systems，11011 North TorreyPines Road La Jolla，Ca.92037)并且采用酶BamHI和XbaI来鉴定含有带CGFcDNA的质粒(pBacCGF)的细菌。克隆片段的序列通过DNA测序加以证实。
采用脂转染法(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，847413-7417(1987))将5μg质粒pBacCGF和1.0μg可以通过商业途径得到的线性化杆状病毒(“BaculoGoldTM杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)进行共转染。
将1μg的BaculoGoldTM病毒DNA和5μg质粒pBacCGF在一个含有50μl无血清Grace培养基(生命技术公司，Gaithersburg，MD)的无菌微量滴定板的孔中进行混合。之后加入10μl Lipofectin和90μl Grace培养基，混合并在室温下温育15分钟。然后将该转染混合物逐滴加入种在35mm组织培养平板上的Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)，其中平板上含有1毫升无血清Grace培养基。来回摇动平板以混合新添加的溶液。然后该平板于27℃下温育5小时。5小时后，从平板中除去转染溶液并且加入1ml补充有10％胎牛血清的Grace昆虫培养基。将该平板放回温育箱中并且于27℃下持续培养4天。
4天后收集上清液，并且与Summers和Smith所述(出处同上)类似地进行噬斑测定。作为一种改进，采用一种含有“Blue Gal”(生命技术公司，Gaithersburg，MD)的琼脂糖凝胶，它可以使染上蓝色的噬斑易于分离。(“噬斑测定”的详细描述也可以在用于昆虫细胞培养和杆状病毒学的使用者指南的第9-10页中找到，该指南由生命技术公司，Gaithersburg分发)。
在连续稀释4天后将病毒加入细胞中，并且用一个Eppendorf移液管的尖端挑取染上蓝色的噬斑。然后将含有重组病毒的琼脂重新悬浮在一个含有200μlGrace培养基的Eppendorf管中。通过短时间的离心除去琼脂并且采用含有重组杆状病毒的上清液去感染种在35mm平皿上的Sf9细胞。4天后收集这些培养平皿中的上清液，然后于4℃下进行储存。
将Sf9细胞在补充有10％热灭活FBS的Grace培养基上进行培育。在感染复数(MOI)为2的条件下，采用重组杆状病毒V-CGF感染细胞。6小时后除去该培养基并且代之以不含甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900 II培养基(生命技术公司，Gaithersburg)。42小时后加入5μCi的35S-甲硫氨酸和5μCi的35S半胱氨酸(Amersham)。将细胞进一步温育16小时后离心收获细胞，并且通过SDS-PAGE和放射性自显影用肉眼观察被标记的蛋白。
实施例3在COS细胞中表达重组CGF使用载体pN346表达CGF蛋白，质粒pN346是质粒pSV2-dhfr(ATCC入藏号37146)的衍生物。两个质粒均含有在SV40早期启动子控制下的小鼠dhfr基因。用这些质粒转染的中国仓鼠卵巢细胞或其他缺少二氢叶酸活性的细胞可以通过在补加化疗剂氨甲喋呤的选择性培养基(alpha minus MEM，Life Technologies)中培养细胞而筛选。DHFR基因在氨甲喋呤(MTX)抗性细胞中的扩增已公知(见，例如Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.，and Schimke，R.T.，1978，生物化学杂志2531357-1370，Hamlin，J.L.and Ma，C.1990，生物化学生物物理年报1097107-143，Page，M.J.and Sydenham，M.A.1991，生物工程，9卷，64-68)。在增加浓度的MTX中培养的细胞具有对该药物的抗性，这是由于DHFR基因扩增所致的靶酶DHFR的过量产生带来的。如果第二种基因与dhfr基因连接，则它通常共扩增并过量表达。因此，当除去氨甲喋呤时，细胞系含有整合到染色体上的扩增基因。
质粒pN346含有Rouse肉瘤病毒(Cullen等，分子和细胞生物学，1985年3月，438-447)的长末端重复(LTR)的强启动子以及从人巨细胞病毒(CMV)(Boshart等，细胞41521-530，1985)的立即早期基因的增强子分离的片段，以用于表达感兴趣的基因。启动子的下游是使基因整合的下述单一限制性酶裂解位点BamHI、PvuII和Nrul。在这些克隆位点之后，质粒含有在所有3个阅读框内的翻译终止密码子，后接大鼠前胰岛素原基因的3’内含子和聚腺苷酸化位点。也可使用其他高效启动子用于表达，例如人β-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或来自其他逆转录病毒如HIV和HTLVI的长末端重复。对于mRNA的聚腺苷酸化，也可使用其他信号，例如来自人生长激素或珠蛋白基因的信号。
携带整合到染色体上的感兴趣的基因的稳定细胞系还可在用选择标记如gpt、G418或潮霉素共转染后筛选。有利的是使用在开始时使用一种以上的选择标记，例如G418加氨甲喋呤。
质粒pN346用限制酶BamHI消化，然后用牛肠磷酸酶根据公知技术去磷酸化，然后从1％琼脂糖凝胶上分离载体。
用对应于基因的5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物扩增编码全长CGF蛋白的DNA序列，ATCC#97142。
5’引物序列为5’ACTCTTGGATCCGCCATCATGACCTGGAGGCACCAT3’(SEQ ID NO7)，其含有一BamHI限制酶位点(粗体字)，后接代表在真核细胞中起始翻译的有效信号的6个核苷酸(Kozak，M.，分子生物学196947-950，(1987))，其余的核苷酸对应于氨基端6个氨基酸(包括翻译起始密码子)。3’引物的序列为5’TACAACCAGCTGCTATTATTTACAACATAG 3’(SEQ IDNO8)，其含有一个PvuII限制位点和18个核苷酸，该18个核苷酸是起自翻译终止密码子的3’CGF DNA的反向互补物。用BamHI-PvuII消化PCR产物并用商购试剂盒(“Geneclean”，BIO 100 Inc.，LaJolla，Ca.)在1％琼脂糖凝胶上纯化。这一片段然后用T4DNA连接酶连接到BamHI-PvuII消化的磷酸酶化的pN346质粒上。转化大肠杆菌菌株XllBlue(Stratagene)并在50μg/ml氨苄青霉素LB平板上铺板，带有合适方向的所需重组体的菌落经PCR筛选，采用对应于Rous肉瘤病毒启动子的5’引物和对应于CGF密码子73-79的反向互补物的3’引物。克隆片段的序列用DNA测序证实。CHO-dhfr细胞的转染用缺少活性DHFR酶的中国仓鼠卵巢细胞进行转染，5μg表达质粒pN346CGF和0.5μg质粒pSVneo通过脂转染法(Felgner等，文献同上)共转染。质粒pSV2-neo含有一主要选择标记，即来自编码赋予一组抗生素包括G418抗性的酶的Tn5的neo基因。将细胞种于补加1mg/mlG418的alpha minus MEM中，2天后将细胞胰酶化并种在杂交瘤克隆平板(Greiner，Germany)上，培养10-14天。此期间过后，将单一克隆胰酶化，然后用不同浓度的氨甲喋呤(25nM，50nM，100nM，200nM，400nM)将其种在6孔培养皿中。然后将在最高浓度氨甲喋呤中生长的克隆转移到含有更高浓度氨甲喋呤(500nM，1μM，2μM，5μM)的新的6孔培养皿中。重复这一程序直至克隆在100μM浓度下生长。
所需基因产物的表达用Western印迹分析和SDS-PAGE分析。
实施例4通过基因治疗的表达成纤维细胞是通过皮肤活组织检查从一个研究对象中得到的。将得到的组织放置在组织培养基上并且分割成小块。将小的组织块放置在组织培养瓶的湿表面上，其中每个瓶中放置约10块组织。将瓶颠倒放置，盖紧并于室温下保留过夜。在室温下过24小时后反转瓶，组织块固定在瓶底部，加入新鲜培养基(例如含有10％FBS，青霉素和链霉素的Ham’s F12培养基)，然后于37℃下温育大约1周。这时加入新鲜培养基，随后每隔几天更换一次培养基。再培养2周后，出现了一单层成纤维细胞。该单层细胞经胰蛋白酶消化并放入更大的瓶中。
用EcoRI和Hind III消化旁侧有Moloney鼠肉瘤病毒长末端重复的pMV-7(Kirschmeier，P.T.等，DNA，7219-25(1988))，接下来用牛肠磷酸酶进行处理。线性载体在琼脂糖凝胶上分级分离并使用玻璃珠加以纯化。
采用分别与5’和3’末端序列对应的PCR引物扩增编码本发明多肽的cDNA。5’引物包含一个EcoRI位点，3’引物含有一个Hind III位点。在T4 DNA连接酶存在下，将等量的Moloney鼠肉瘤病毒的线性化骨架与扩增的EcoRI和Hind III片段加在一起，在适于两个片段连接的条件下保持所得到的混合物。将该连接混合物用于转化细菌HB101，然后为了证实该载体具有插入正确的感兴趣的基因而将细菌涂布在含有卡那霉素的琼脂上。
将兼嗜性(amphotropic)pA317或GP+am12包装细胞在含有10％小牛血清(CS)、青霉素和链霉素的Dulbecco’s改良Eagles培养基(DMEM)的组织培养板上进行培育，直至达到汇合密度。然后将含有基因的MSV载体加入培养基中并用该载体转导包装细胞。包装细胞随即生产含有该基因的具有感染性的病毒颗粒(现在包装细胞被称作生产细胞)。
向转导的生产细胞中加入新鲜的培养基，接下来从一个铺满生产细胞的10cm平板中收集培养基。含有感染性病毒颗粒的培养基经微孔过滤器过滤以除去脱附(detached)的生产细胞，然后利用该培养基去感染成纤维细胞。从成纤维细胞的亚铺满平板中除去培养基并迅速地代之以来自于生产细胞的培养基。除去该培养基并代之以新鲜的培养基。如果该病毒的滴度高的话，那么实质上所有的成纤维细胞均被感染并且无需选择。如果滴度非常低，那么就需要采用一个具有如neo或his这样的可选择性标记物的逆转录病毒。
然后将工程化的成纤维细胞注射入宿主，它或单独注射或在一个cytodex 3微载体珠上已培育至铺满之后再注射。
根据以上的教导，本发明的许多改进和变化都是可能的，因此在附加的权利要求的范围内可以另外的方式实施本发明。
序列表(1)一般信息(i)申请人Meissner等人(ii)发明名称人criptin生长因子(iii)序列数10(iv)联系地址(A)地址CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART&OLSTEIN(B)街道6BECKERFARMROAD(C)城市ROSELAND(D)州 新泽西(E)国家美国(F)邮政编码(ZIP)07068(v)计算机可读形式(A)存储媒体类型3.5英寸软磁盘(B)计算机IBM PS/2(C)操作系统MS-DOS(D)软件WORD PERFECT 5.1(vi)目前申请数据(A)申请号(B)申请日同时(C)分类(vii)在先申请数据(A)申请号无(B)申请日无(viii)律师/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORYD.
(B)登记号36,134
(C)案号/文档号325800-(ix)电讯信息(A)电话201-994-1700(B)传真201-994-1744(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)长度205个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)长度碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO3(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)长度碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO4(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)长度碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)长度碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO权利要求
1.一种分离的多核苷酸，它包括选自如下一组中的一个成员(a)一种编码包括如图1所示的第-26位至第207位氨基酸的多肽的多核苷酸；(b)一种编码包括如图1所示的第1位至第207位氨基酸的多肽的多核苷酸；(c)一种编码包括如图1所示的第1位至第150位氨基酸的多肽的多核苷酸；(d)一种编码包括如图1所示的第45位至第150位氨基酸的多肽的多核苷酸；(e)一种能够与(a)、(b)、(c)或(d)的多核苷酸杂交并且与(a)、(b)、(c)或(d)的多核苷酸之间至少有70％相同性的多核苷酸；以及(f)(a)，(b)，(c)，(d)或(e)的多核苷酸的一个多核苷酸片段。
2.权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是DNA。
3.一种分离的多核苷酸，它包括选自如下一组中的一个成员(a)一种编码由包含在ATCC保藏号97142中的DNA表达的成熟多肽的多核苷酸；(b)一种编码由包含在ATCC保藏号97142中的DNA表达的多肽的多核苷酸；(c)一种能够与(a)或(b)的多核苷酸杂交并且与(a)或(b)的多核苷酸之间至少有70％相同性的多核苷酸；以及(d)(a)，(b)或(c)的多核苷酸的一个多核苷酸片段。
4.权利要求2的多核苷酸，包括如图1所示的从核苷酸1至核苷酸771的序列。
5.权利要求2的多核苷酸，包括如图1所示的从核苷酸62至核苷酸771的序列。
6.权利要求2的多核苷酸，包括如图1所示的从核苷酸151至核苷酸771的序列。
7.权利要求2的多核苷酸，包括如图1所示的从核苷酸283至核苷酸600的序列。
8.一种含有权利要求2的DNA的载体。
9.一种用权利要求8的载体遗传工程化的宿主细胞。
10.一种生产多肽的方法，该方法包括从权利要求9的宿主细胞中表达由所说的DNA编码的多肽。
11.一种生产能够表达多肽的细胞的方法，该方法包括用权利要求8的载体遗传工程化细胞。
12.一种包括选自如下一组中的一个成员的多肽(i)一种具有图1的推导的氨基酸序列的多肽及其片段，类似物与衍生物；以及(ii)一种由ATCC保藏号97142的cDNA编码的多肽，以及所说多肽的片段，类似物和衍生物。
13.一种激活权利要求12的多肽的受体的化合物。一种抗权利要求10的多肽的抗体。
14.一种抑制权利要求12的多肽的化合物。
15.一种抗权利要求12的多肽的抗体。
16.一种鉴定抑制权利要求12的多肽的活化的化合物的方法，包括将在其表面表达CGF受体的细胞与标记的CGF以及待筛选的化合物在适合于配体与所述的受体结合的条件下接触；以及通过测定附着于受体的标记量确定标记的CGF与受体的结合程度。
17.一种鉴定抑制权利要求12的多肽的活化的化合物的方法，包括将在其表面表达CGF受体的细胞与待筛选的化合物在适合于配体与所述的受体结合的条件下接触；以及确定化合物与受体的结合程度以及由结合产生的信号的丧失。
18.一种鉴定激活权利要求12的多肽的受体的化合物的方法，包括将在其表面表达CGF受体的细胞与待筛选的化合物在适合于配体与所述的受体结合的条件下接触；以及确定化合物与受体的结合程度以及由结合产生的信号的存在。
19.一种诊断与权利要求1的多核苷酸中的突变有关的疾病和疾病易感性的方法，包括测定权利要求1的多核苷酸中的突变。
20.一种诊断方法，包括分析来自宿主的样品中是否存在权利要求12的多肽。
全文摘要
本发明公开了一种人Criptin生长因子多肽(CGF)和编码该多肽的DNA(RNA),以及一种通过重组技术生产该多肽的方法。本发明还公开了利用这种多肽促进伤口愈合或组织再生、刺激移植物固定和血管生成的方法。本发明也公开了抗这种多肽的拮抗剂及其用作一种治疗和/或防止瘤形成如肿瘤的治疗剂的用途。本发明还公开了用于检测CGF核酸序列中的突变以及CGF的浓度改变以检测癌症的诊断方法。
文档编号C12N15/63GK1182431SQ9519783
公开日1998年5月20日 申请日期1995年6月5日 优先权日1995年6月5日
发明者保罗·S·梅斯纳, 蒂莫西·A·科尔曼 申请人:人体基因组科学有限公司