专利名称：一种新的细菌菌种保存方法
技术领域：
本发明属微生物工程技术领域。具体涉及一种新的细菌菌种保存方法。
经典的保存菌种方法常用冷冻真空干燥保存法。此法为1.制备菌液。将待保存的新鲜纯培养物，以无菌手段研磨于脱脂牛奶中，制成浓厚菌悬液，分装于菌种管内，一般不超过菌种管球部的1/2，并做好标记。2.冷冻。将装好的菌种管放入冷冻干燥仪内，立即降温至-40℃以下，冷冻1h或过夜。3.干燥。然后将干燥仪转至抽真空状态连续3-6h，至球部菌液干燥成蜂窝状为止。4.真空封口。将干燥好的菌种管抽真空，达到所需真空度后，边抽真空边封口。5.检查，鉴定。干燥好的菌种管，用真空测定应达到所需真空度(10-1以上)。菌种外观呈蜂窝状，加入溶剂后可立即溶解。同时，还应进行细菌培养，检查存活情况，必要时再进行详细鉴定。6.保存。4℃保存，保存时间一年或数年。7.启用。将要用的菌种管取出，折断，用毛细管吸取少量盐水或肉汤，加入菌种管内待溶解后，即可转种使用。已有技术出处1.菌种保藏手册科学出版社1980，2.卫生防疫微生物检验操作规程北京出版社1991。3.微生物学通报1989(4)220-224，王美芝等著L-干燥法和冷冻真空干燥法保藏放线菌效果比较。但经典的冷冻真空干燥法，在干燥过程中，需两次抽真空，使固化水分直接升华，细菌易受到损伤。其次，需要特殊仪器设备，一般实验室难于开展此工作。第三操作过程较为复杂。
本发明的技术方案如下1.使用菌种为35种细菌，259菌株，具体品种见表1。
2.使用培养基为常规培养基，它们是SS琼脂，泰康铠琼脂，普通营养琼脂，血琼脂，BCYE琼脂，营养肉汤。配方见表2。
3.将预定要保存的菌种，接种于相应培养基上，生长良好。
4.用特殊棉拭子滚动沾取菌苔，放入带螺盖的玻璃管中，拧紧管盖，迅速放入-20℃至-30℃冰柜中保存。菌种保存期为2年。
5.启用。从冰柜保存处取出，待温度升至室温后，直接接种于相应培养基上。
6.特殊棉拭子的制备。
将少许脱脂棉，缠绕在棉签上，然后浸泡于浸泡溶液中，浸透后取出棉拭子，50℃-60℃烘干，放入带螺盖的小玻璃管中，盖紧，灭菌备用。
浸泡溶液配方按重量百分比，每一百份水溶液中，含结晶氯化钙0.005-0.015，硫乙醇酸钠0.05-0.015，丙酮酸钠0.005-0.015。其中水为去离子水。最佳配方为结晶氯化钙0.01，硫乙醇酸钠0.1，丙酮酸钠0.01，去离子水为99.88。
本发明有如下优点1.适用于大量菌种保存。2.保存的细菌，直接吸附于灭菌和特殊处理的棉拭子上，无需真空干燥，立即进入干燥环境，保持细菌体内固有水分，能更好地保持细菌原有特性。3.化学药品能使保存的微小环境，呈缺氧状态，使细菌免于氧化作用。4.不需特殊保护剂。5.适于科研机关使用，更便于基层单位使用，有推广使用价值。6.减少污染。7.成本低，不需特殊设备。
本方法效果良好在正式试验中，使用菌种35个种，菌株259菌株，经过3年观察试验，本发明以直接分离，接种相应平板上，全部试验用菌株生长良好，存活率为100％，冷冻真空干燥保存法，用直接分离，转种相应平板上，有13株菌未见生长，即使用复苏修补培养法进行增殖，仍未见生长，存活率为94.98％。两种方法保存菌种比较见表1。
本发明有附图
图1中1.棉拭子，2.玻璃管，3.螺纹管盖。
实施例1.使用肺炎链球菌，培养内汤按常规接种、培养。
2.将少许脱脂棉，缠绕在棉签上，浸泡在浸泡液中，浸透后取出棉拭子。浸泡液配方为结晶氯化钙0.01％，硫乙醇酸钠0.1％，丙酮酸钠0.01％，去离子水为99.88％(配至100ml)。将浸透棉拭子50℃烘干，放入带螺盖小瓶中，紧盖，灭菌。
3.用棉拭子滚动沾取菌苔，放入小管，拧紧盖，迅速放入-20℃冰柜中保存，可保存2年。
表1 两种方法保存菌种比较(正式试验)
表2.
培养基处方1.SS琼脂g牛肉浸膏5，蛋白胨5，乳糖10，3号胆盐8.5，柠檬酸钠8.5，硫代硫酸钠8.5，柠檬酸铁1，琼脂13.5，煌绿0.00033，中性红0.025，蒸馏水1000ml。
2.麦康铠琼脂g蛋白胨17，多价胨3，乳糖10，胆盐1.5，氯化钠5，中性红0.03结晶紫0.001，蒸馏水1000ml。pH 7.1。
3.普通营养琼脂gpH7.6牛肉膏汤1000ml，琼脂2。
4.血琼脂gpH7.6普通营养琼脂1000ml，加脱纤维羊血5-10ml。
5.BCYE琼脂gN-2-乙酰氨基-2-氨基乙烷磺酸(ACES)10，酵母浸膏10，活性炭2，琼脂17，L-半胱氨酸盐酸盐0.4，可溶性焦磷酸铁0.25，蒸馏水1000ml。
6.营养肉汤g牛肉浸液1000ml，蛋白胨10，氯化钠5，磷酸氢二钾2。
权利要求
1.一种新的细菌菌种保存方法，其特征在于本方法按如下步骤进行(1)将预定要保存的菌种，接种于相应培养基上，生长良好。(2)用特殊棉拭子滚动沾取菌苔，放入带螺盖的玻璃管中，拧紧管盖。(3)迅速放入-20℃至-30℃冰柜中保存。(4)启用时，从冰柜取出，待温度升至室温后，直接接种于相应培养基上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于特殊棉拭子的制法为将少许脱脂棉，缠绕在棉签上，然后浸泡在浸泡溶液中，浸透后取出棉拭子，于50-60℃烘干，放入带螺盖的玻璃管中，拧紧盖，灭菌备用。
3.根据权利要求2所述的浸泡溶液，其特征在于浸泡溶液配方为按重量百分比，每一百份浸泡溶液中含结晶氯化钙0.005-0.015份，硫乙醇酸钠0.05-0.015份，丙酮酸钠0.005-0.015份，水为去离子水。
4.根据权利要求2所述的浸泡溶液，其特征在于，其最佳配方为按重量百分比，每一百份浸泡溶液中含结晶氯化钙0.01份，含硫乙醇酸钠0.1份，含丙酮酸钠0.01份。
全文摘要
本发明涉及一种新的细菌菌种保存方法。它使用一种特殊的棉拭子滚动沾取已培养的菌种菌苔，迅速放入已处理好的小管中，并拧紧管盖，立即放入-20℃至-30℃冰柜中保存，菌种可保存2年。
文档编号C12M1/26GK1142535SQ9610522
公开日1997年2月12日 申请日期1996年5月21日 优先权日1996年5月21日
发明者路文彬, 彭晓旻, 吴家丽, 严寒秋 申请人:北京市卫生防疫站