专利名称：无蚕蛹提取液冬虫夏草深层培养的方法
技术领域：
本发明属于无蚕蛹提取液冬虫夏草深层培养的方法，具体地说，本发明是涉及微生物的繁殖及其培养基的配方和制备方法。
在我国清代乾隆年间出版的《本草从新》一书中有这样的记载“冬在土中，身活如老蚕，有毛能动，至夏则毛出土上，连身俱化为草”，这是我国著名的冬虫夏草的早期描述。冬虫夏草是表面科虫草，属于真菌。寄生于蝙蝠蛾内形成的复合体(简称虫草)，为我国特有名贵药用真菌。天然冬虫夏草产于四川、贵州、云南、青海等地高山上，由于生长环境和寄生条件特殊，天然资源紧张，价格昂贵。
近十年来，我国药物研究人员分别分离出多株的虫草真菌菌株，最著名的是中国医学科学院药物研究所分离的Cs-4菌株，已生产出金水宝菌药，杭州第二制药厂也生产出宁心宝胶囊。人工深层培养工艺成为大规模生产虫草菌的高新技术。人工培养的虫草菌丝体在药理、毒理及成分等方面与天然虫草相似。
由于虫草菌的寄生习性，许多研究者和生产单位都采用蚕蛹蛋白提取液作为虫草深层培养的培养基的重要成分。由于蚕在生长过程中吞食了大量桑叶，体内累积了大量重金属，因而用蚕蛹提取液培养虫草菌也使所生产的干菌丝体中重金属含量超过国家规定标准，严重地影响产品的质量。
经过检索可知高俊德等发表在《中药通报》1981年第1期第3页，题目为“冬虫夏草菌丝分离培养基及其与生药冬虫夏草化学成份的对比”一文中公开了一种含蚕蛹的培养基。作为蚕蛹提取液的替代品水解蛋白、牛肉膏、湟鱼、牛肝等被应用于不同的研究者的培养基配方中。这些物品在实验室规模的研究中广泛被应用，但在大规模培养中，将使产品的成本显著增加。其冬虫夏草培养方法包括了扩培阶段、生产阶段两个步骤。
本发明的目的是发明一种成本低、工艺简单、不存在重金属污染、菌体生长速度快的无蚕蛹提取液冬虫夏草深层培养的方法。
本发明是这样实现的无蚕蛹提取液的冬虫夏草深层培养方法在包括了扩培阶段、生产阶段两个步骤中，(1)先将培养基中的黄豆粉水溶液，经蛋白酶预先水解；
(2)然后添加蔗糖、特制糖蜜和适量无机盐制成生产阶段的培养基，其特制糖蜜可以是糖蜜和玉米浆混合物，也可以是糖蜜与枸杞提取液的混合物；(3)最后将扩培的虫草菌培养物接种于上述培养基，进行液体的深层培养。
本发明具有以下的特点①成本低、②工艺简单③不存在金属污染，④菌体生长速度快⑤菌体得率高。
以下将结合实施例对无蚕蛹提取液的冬虫夏草深层培养技术，包括培养基组成、1升摇瓶培养及3立方米发酵罐培养工艺作进一步的描述1斜面培养基马铃薯汁(马铃薯100克，去皮切块煮沸留汁)蔗糖 50克蛋白胨 0.5克琼脂 10克自来水 500毫升2种子液体培养基马铃薯汁(马铃薯100克，去皮切块煮沸留汁)蔗糖 50克蛋白胨 0.5克自来水 500毫升3生产培养基蔗糖 4％黄豆粉 2.5％(100目)特制糖蜜 0.3％K2HPO43H2O0.1％MgSO47H2O 0.05％特制糖蜜为甘蔗糖蜜和玉米浆以4∶1比例配制而成，特制糖蜜也可为甘蔗糖蜜与枸杞提取液的混合物。
培养基制备方法首先配制2.5％的黄豆饼粉水溶液，搅拌均匀，升温至上40--45℃，每升培养基加入中性蛋白酶0.2--1.0克，(活力单位5000IU/克)，恒温搅拌1小时。然后加入规定数量的蔗糖、特制糖蜜和无机盐，升温至121℃，灭菌20分钟，降温待接种。
本发明的生产培养基是蔗糖、黄豆粉、特制糖蜜，硫酸镁，磷酸氢二钾。
实施例一
步骤1取冬虫夏草菌种，接入试管斜面培养基，温度为26℃，培养48小时；步骤2将新鲜斜面培养物接种至种子液体培养基内(150毫升/500毫升三角瓶)，温度为26℃，每分钟130转，旋转式摇床上培养72小时；步骤3将上述培养物接种于生产培养基中(250毫升/1000毫升三角瓶)，接种量3-5％，温度为28℃，每分钟140转，培养72小时；步骤4离心分离上述培养基，用蒸馏水洗涤2次，80℃烘干，干菌丝体得率为2.8克/100毫升培养基。
成品水份含量小于5.0％，总氨基酸含量12.86％，甘露醇含量0.185％，麦角甾醇定性分析显色。菌丝体酸水解物氨基酸分析见如下附表。
人工培养菌丝体全氨基酸含量分析天门冬氨酸1.3922％苏 氨 酸0.6296％丝 氨 酸0.6255％谷 氨 酸1.8301％脯 氨 酸0.2984％甘 氨 酸0.6646％丙 氨 酸0.9163％胱 氨 酸0.1548％缬草氨酸 0.7490％甲硫(蛋)氨酸 0.7510％异亮氨酸 0.7547％亮 氨 酸1.0092％酪 氨 酸0.5063％苯丙氨酸 0.5734％赖 氨 酸0.8381％组 氨 酸0.3502％精 氨 酸0.8085％总 量12.85％实施例二菌种经过2级扩培，得到7升菌种，接种到3立方米的工业生产罐中，接种量约5％。培养温度为28℃，通气量为0.2VVM(标准状态通气量体积/分·反应器有效体积)，搅拌转速每分钟200转，在36小时后，加大通气量0.5VVM(标准状态通气量体积/分·反应呈有效体积)，搅拌转速每分钟250转，总共培养50小时。离心分离菌丝体，用水洗涤二次。温度为80℃条件下，真空烘干，可得干菌丝体每100毫升培养基2.5克。
在以上实施例中，生产阶段的培养基的配方中特制糖蜜可以是糖蜜和玉米浆混合物，也可以是糖蜜与枸杞提取液的混合物。
权利要求
1.一种无蚕蛹提取液冬虫夏草深层培养的方法，其特征在于该方法包括了扩培阶段、生产阶段两个步骤(1)先将培养基中的黄豆粉水溶液，经蛋白酶预先水解；(2)然后添加蔗糖、特制糖蜜和适量无机盐制成生产阶段的培养基，其特制糖蜜可以是糖蜜和玉米浆混合物，也可以是糖蜜与枸杞提取液的混合物；(3)最后将扩培的虫草菌培养物接种于上述培养基，进行液体的深层培养。
全文摘要
本发明公开了一种无蚕蛹提取液冬虫夏草深层培养的方法，本发明包括了扩培阶段、生产阶段两个步骤，它是首先配制黄豆粉水溶液，用蛋白酶预先水解，其次添加蔗糖、特制糖蜜和适量无机盐制成生产阶段的培养基，最后将扩培的虫草菌培养物接种于上述培养基接种于上述培养基进行液体的深层培养。它具有成本低、工艺简单、不存在重金属污染，菌体生长速度快，菌体得率高的特点。
文档编号C12N1/14GK1158893SQ96117240
公开日1997年9月10日 申请日期1996年12月27日 优先权日1996年12月27日
发明者郭养浩, 石贤爱, 孟春, 陈剑峰 申请人:福州大学