专利名称：北冬虫夏草菌丝体发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及人工分离培养冬虫夏草菌丝技术，具体地说是一种采用生物发酵培养北冬虫夏草菌丝粉体的方法。
北冬虫夏草，也称蛹虫草，与冬虫夏草同属麦角菌科，蛹虫草是冬虫夏草的模式种。成分、药用价值同冬虫夏草，是我国传统的药用食用佳品。1757年始载于《本草从新》，《药性考》，均记载＂入肺，肾二经＂。古医书更有许多记载，味甘、性温、止血化痰、秘精益气、专保命门、阴阳双补、壮水生金等等。到近代人们对虫早夏草有了更多的认识，《现代实现中药》记载适于肺结核、老人衰弱、贫血虚弱等症。近年通过大量药理试验证明，具有降压降脂作用，临床用于心律失常，尤其北冬虫夏草含有核苷类抗菌素(3′-脱氧腺苷)，能抗癌、抑菌，增强免疫功能。
天然虫草生长环境特殊，生长周期长，加之人工过量采集，自然环境破环，产量逐年下降。为满足市场需要，扩大药源，除人工种殖外，采用大规模培养冬虫草菌丝体是解决药源的有效途径，一直是有关部门极为关注和急待解决的问题。
本发明的目的是提供一种采用液体深层发酵大规模培养北冬虫夏草菌丝的方法，以解决药源紧缺的局面，满足需求。
北冬虫夏草生长环境及形态特征采自长白山延山山脉地区向阳坡，针阔叶混交林地带，海拔200～400m，棕色森林上，土壤肥沃，疏松，土表层为黑褐色腐殖土，土壤温度15～20％，土壤pH6.0左右，蛹体大部距土表5～10cm土层中，子实体多发生在6～8月，8月下旬柘死。头孢菌寄生在虫、蛹或茧上，其子座大部从寄主的头部或近腹部长出1～3个，长短不一，3～7cm，扁平，金黄色，头部长椭园型1-1.5×0.3-0.5cm，在解剖镜下能观察到有许多为乳头状的子囊壳外突。本新鲜北冬虫夏草子实体能育部位分离得到纯菌，经回接感染试验培育出与自然形态特征一致的子座，鉴定为头孢霉属(cephalosporium)，蛹草头孢(Cephlosporium militaris，Kobaysi)。
本发明的工艺方法是将取自新鲜北冬虫夏草子实体并获得的蛹草头孢菌种，在PDA斜眷面培养基上恒温培养7天制成斜面菌种；菌种接入含培养基的摇瓶内振荡3～4天；经纯度检查6～10％，并种含培养基的种子罐内，于罐温25～27℃、风量1∶0.4、搅速180～200rpm、罐压0.05MPa条件下，培养38～45小时；以接种量为6～10％进入发酵罐，罐温25～27℃、风量1∶0.1，罐压0.05MPa，搅拌速130～140rpm培养55～65小时；然后脱水、干燥制成干菌体。其工艺流程为保存菌种→斜面菌种→种子瓶→种子罐→发酸罐→脱水→干燥→粉碎→分析→储存。
菌株特征在PDA培养基上，三天可见白色绒毛状菌称，七天后可长满斜面，两周后可长出厚菌膜，见光可产生黄色素，有时在斜面上长出4～5cm的子座。菌丝有隔，在固体斜面上7天产生分生孢子，在液体培养基上，40小时开始产生分生孢子，孢子椭圆型或长椭圆型。
本发明给出的方法所制备菌丝体其营养和药用价值均同于天然北冬早夏虫，缓解了该药源紧缺的局面，可满足部分需求。本工艺设计合理，产品纯度高，无杂质影响。
本发明的详细叙述斜面菌种培养由保存的菌种移至马铃薯(PDA)斜面培养基，置于25℃恒温处培养7天，低温保存，备用。PDA斜面培养基配方20％马铃薯汁100ml，加入白糖2g，蛋白胨1g，MgSO40.05g，KH2PO40.1g，VB110mg，琼脂2g，pH7.0。
摇瓶种子培养300ml三角瓶装100ml培养基，120℃，灭菌20分钟。一只斜面菌种接三瓶25-27℃，振荡(100-120rpm)培养，时间3-4天。摇瓶培养基配方a.葡萄糖2％，白糖1％，蛋白胨1％，酵母膏1％，MgSO400.05％，NH4Cl0.2％，pH7.0。b.白糖3％，蛋白胨2％，MgSO40.06％，KH2PO40.1％，VB10.01％。
种子罐种子培养将摇瓶培养4天左右的种子经检查纯度后，于无菌条件下并种，接种量为6-10％于罐内，罐温为25-27℃，风量1∶0.4，搅拌速度180-200rpm，罐压0.05MPa，培养438～45小时。种子罐培养基配方白糖3％，蛋白胨1.5～2.0％，MgSO40.06％，KH2PO40.1％，VB10.01％，pH7.0。
发酵培养接种量8-10％，罐温25-27℃，风量1∶0.1左右，罐压0.05MPa，搅拌速度130-140rpm，培养时间60小时左右。发酵罐培养基与种子罐同。
菌丝体的收集与干燥发酵培养后，用SS型三足式离心机离心脱水(SS600，1400rpm，沈阳化工学院机械厂出品，依菌体性质应用板框过滤效果较佳，本单位无此设备，以离心脱水代替板框过滤)，离心30分钟，于60～70℃干燥，菌体含水量控制在8-9％左右。
分析检验与储存干燥菌体粉碎过筛后测定D-甘露醇、总氮、腺苷、麦角甾醇、多糖、虫草素、维生素、微量元素等项，干菌体置于通风干燥处保存发酵过程控制正常发酵情况下，发酵过程中，培养基灭菌后pH为6.8，接菌后随菌体的生长pH下降至5.0-5.5；糖浓度下降至1％左右，菌体生长对数期耗糖最快；发酵到55小时左右菌量最高。同时考查了发酵过程中菌丝体的D-甘露醇及粗多糖含量的变化，如下表所示，D-甘露醇含量随发酵时间延长缓慢下降，在43-67小时的范围内几乎不变；而菌体多糖随发酵时间延长呈上升的趋势。
发酵过程中菌体收率及部分指标的变化发酵时间菌粉收率 D-甘露醇含量粗多糖含量(hr) (g/L) (％) (％)碘量法019 8.042 6.350 6.031 9.550 6.190 8.843 13.378 5.856 9.655 14.624 5.799 11.267 15.026 5.777 12.1工艺稳定性试验结果根据1200立升连续试验5批次的结果，确定工艺条件如下采用三级发酵流程，摇瓶投料量为100ml/300ml三角瓶，接种量为一只斜面接三瓶100-120rpm振荡培养4-5天；种子罐投料量为70L/100L，接种量6～10％左右，温度25-27℃，风量1∶0.38-0.4，罐压0.05MPa，搅拌速度180-200rpm，种龄40-50小时；发酵罐投料800L/1200L，接种量6～10％左右，罐温25-27℃，风量1∶0.1，搅拌速度130-140rpm，罐压0.05MPa，发酵时间60小时左右。在上述条件下，菌体收率1.1-1.65％，D-甘露醇5.0％以上，粗蛋白24.08-26.07％，多糖11.0-14.0％，麦角甾醇平均6.0mg/g以上，腺苷0.68～1.1mg/g，氨基酸20％以上，VB10.43mg/100g，VB20.446mg/100g，VB120.92ppm，微量元素(ppm)Cu9.1，Zn63，Fe85，Mn14，Mg1104，Ca3106，Cd＜0.001，Pb＜0.01，脂肪酸含硬脂酸、软脂酸，其中油酸、亚油酸、亚麻酸等含量占脂肪酸总量的65％以上，SOD46.1U/g。
权利要求
1.一种北冬虫夏草菌丝体发酵工艺，其特征是将取自新鲜北冬虫夏草子实体并获得的蛹草头孢菌种，在PDA斜面培养基上恒温培养7天制成斜面菌种；菌种接入含培养基的摇瓶内振荡3～4天；经纯度检查并种含培养基的种子罐内，于罐温25～27℃、风量1∶0.4、搅速180～200rpm、罐压0.05MPa条件下培养38～45小时；送接种量为6～10％，罐温25～27℃、风量1∶0.1，罐压0.05MPa，搅速130～140rpm发酵罐内培养55～65小时；然后脱水、干燥制成干菌体。
2.按照权利要求1所述的北冬虫夏草菌丝体发酵工艺，其特征是其工艺流程为保存菌种→斜面菌种→种子瓶→种子罐→发酸罐→脱水→干燥→粉碎→分析→储存。
3.按照权利要求1所述的北冬虫夏草菌丝体发酵工艺，其特征是斜面培养基配方20％马铃薯汁100ml，加入白糖2g，蛋白胨1g，MgSO40.05g，KH2PO40.1g，VB110mg，琼脂2g，pH7.0。
4.按照权利要求1所述的北冬虫夏草菌丝体发酵工艺，其特征是摇瓶种子培养基配方300ml三角瓶装100ml培养基，120℃，灭菌20分钟。一只斜面菌种接三瓶，25-27℃，振荡(100-120rpm)培养，时间3-4天。摇瓶培养基配方a.葡萄糖2％，白糖1％，蛋白胨1％，酵母膏1％，MgSO40.05％，NH4Cl0.2％，PH7.0。b.白糖3％，蛋白胨2％，MgSO40.06％，KH2PO40.1％，VB10.01％。
5.按照权利要求1所述的北冬虫夏草菌丝体发酵工艺，其特征是种子罐培养基配方白糖3％，蛋白胨1.5～2.0％，MgSO40.06％，KH2PO40.1％，VB10.01％，pH7.0。
全文摘要
本发明是一种采用生物发酵培养北冬虫夏草菌丝粉体的方法。将取自新鲜北冬虫夏草子实体并获得的蛹草头孢菌种，在FDA斜面培养基上恒温培养7天制成斜面菌种；菌种接入含培养基的摇瓶内振荡；经纯度检查并种含培养基的种子罐内培养38～45小时；送发酵罐内培养55～65小时；然后脱水、干燥制成干菌体。本发明给出的方法所制备菌丝体其营养和药用价值均同于天然北冬早夏虫，缓解了该药源紧缺的局面，可满足部分需求。
文档编号C12N1/14GK1148623SQ9611945
公开日1997年4月30日 申请日期1996年10月4日 优先权日1996年10月4日
发明者苏凤岩, 黄荣年, 李维光 申请人:海南兆隆实业有限公司