专利名称：含三个启动子的杆状病毒转移载体的制作方法
技术领域：
本发明含三个启动子的杆状病毒转移载体，分别是hsp70早期基因启动子，cor晚期基因启动子，polh极晚期基因启动子，属生物学基因工程领域。现有杆状病毒转移载体具有表达量多，能容纳较大的外源基因，重组蛋白可以修饰加工，如糖基化，磷酸化等优点。自80年代中期，第一个杆状病毒载体问世以来，已表达出数百种外源基因蛋白，与此同时，杆状病毒载体亦不断修正，研制出很多种表达载体，但大多数载体只含有一个极晚期启动子(polh或P10)一次只能表达一个外源基因，例如最近由荷兰Invitrogen公司提供的杆状病毒载体PBlueBac4，本发明的目的在一个载体中同时引入三个启动子，可表达三个外源基因，同时利用杆状病毒复制周期的特点分别使用早期、晚期、极晚期基因启动子，在病毒复制的不同时期表达外源基因，充分挖掘杆状病毒表达载体潜能，可应用于医学和农业中生产干扰素、白细胞介素，各种疫苗，各种杀虫剂等。
具体实施方案用杆状病毒转移载体pAcMP1(含有杆状病毒晚期基因启动子cor)为基础质粒，分离另一大肠杆菌转移载体pSQ4上的hsp70(早期基因启动子)和SV40末端，用连接酶把这一片段插入pAcMP1载体中，该载体就成为含有hsp70-cor双重启动子的载体质粒，经质粒转化，大量扩增后用内切酶把hsp70-cor片段分离出来，再把该片段用连接酶移入质粒pAcYM1中(含有一个极晚期启动子polh)按背靠背方式连接，成为含有polh-hsp70-cor三重启动子的杆状病毒转移质粒pAcBL1如
图1(1.启动子Cor；2.SV40；3.启动子hsp70；4.启动子polh)。
该杆状病毒转移载体含三个不同启动子，可分别控制三个外源基因，在病毒复制周期的不同时期进行表达，例如，外源基因1在晚期启动子cor控制下，在细胞感染12小时后表达，外源基因2在早期启动子hsp70控制下于细胞感染后1小时表达；外源基因3在极晚期启动子polh控制下，于细胞感染18小时后表达。在hsp70和cor之间有SV40增强子，一方面提供信号polyA，另一方面可以隔开两个不同的外源基因，pAcBL1的重组过程与其它的杆状病毒载体重组过程一样，宿主细胞仍为SF-21(昆虫细胞)，重组病毒无多角体蛋白存在。
pACBL1转移质粒可望在真核基因表达的许多方面得到应用，例如，利用三个启动子在病毒复制的不同时期表达的特点，分别插入三个不同的报道基因，可研究病毒侵染幼虫中肠的过程，又如，人绒毛膜性腺激素有两个亚基，分别由2个基因编码，利用该载体可接入2个外源基因和一个标记基因(便于重组病毒筛选)表达出有活性的人绒毛膜性腺激素。在同一载体上表达几个病毒或细菌的重组抗原蛋白，可以明显地提高抗体效价，成为高效的多价重组疫苗。在同一载体上表达几个杀虫毒素基因，可明显提高多价重组病毒杀虫剂的杀虫效果。
质粒说明1、质粒pAcBL12、质粒大小6.3kb3、质粒筛选Ampr4、启动子cor(晚期启动子)，hsp70(早期启动子)，polh(极晚期启动子)5、克隆位点；cor启动子控制下的外源基因位点为BamH1hsp70启动子控制下的外源基因位点为EcoR1polh启动子控制下的外源基因位点为多克隆位点(MCS)
权利要求
1.含三个启动的杆状病毒转移载体pAcBL1的特点是该载体同时结合早期(hsp70)、晚期(cor)、极晚期(polh)的启动子，在病毒复制的不同时期表达外源基因。
2.含三个启动子的杆状病毒转移载体pAcBL1能在同一表达系统中表达三个不同的外源基因。
全文摘要
本发明是研制含有三个启动子的杆状病毒转移载体,分别是hsp70早期基因启动子,cor晚期基因启动子,polh极晚期基因启动子。属生物学基因工程领域,其主要技术特征是在重组病毒复制的不同时期,分别控制三个外源基因的表达。在研制重组多价疫苗,研制多个重组抗原作为诊断试剂,重组多价病毒杀虫剂等方面,将起到重要作用。
文档编号C12N15/86GK1186856SQ9611972
公开日1998年7月8日 申请日期1996年12月31日 优先权日1996年12月31日
发明者梁布锋 申请人:中国科学院武汉病毒研究所