专利名称：在种子中增加必需氨基酸积累的方法
技术领域：
本发明的领域本发明涉及动物营养领域。尤其，本发明涉及在作为饲料的种子中增加营养含量的方法。
背景饲料配方要为生长提供动物关键的必需营养物。然而，一般地农作物提供营养质量低的食物资源因为农作物含有低比例的一些单胃动物不能自我合成的必需氨基酸。
多年来研究人员试图通过育种方案来提高必需氨基酸在一些重要作物种子蛋白中的比例。随着对种子贮藏蛋白以及编码这些蛋白基因表达的更深了解，和更多种植物转化系统的建立，提高种子蛋白营养质量的分子手段能为较传统手段提供其它途径。因此，通过生物工程可增加某种作物特定的氨基酸水平。
其中一种方法是表达某种含有所需氨基酸成分的异源蛋白达到足以避免饲料的额外添加的水平。例如，一些富含硫氨基酸的种子蛋白已确定。这些蛋白正常表达的一个关键包括含有种子特异性启动子的有效表达盒。不但基因控制区域须指导合成高水平的mRNA，而且mRNA必须翻译成稳定的蛋白。
通常在这些动物营养需要的必需氨基酸中农作物缺乏的是甲硫氨酸，苏氨酸和赖氨酸。试图借助育种，突变选择和/或改变农作物积累贮藏蛋白组成来提高这些游离氨基酸水平只取得很小的成功。通常，表达转基因贮藏蛋白不会导致总的种子氨基酸足够的增加。由菜豆蛋白启动的巴西坚果2S表达盒是一种有效的嵌合种子特异基因的一个实例。然而，既使通过巴西坚果蛋白增加总甲硫氨酸和结合甲硫氨酸量，从而提高营养价值，但出现了一个在种子中积累甲硫氨酸总量的阈值限制。这些种子保留不足的甲硫氨酸作为甲硫氨酸源因此在用上述豆类作为食物时须有甲硫氨酸添加。
另一种通过改变目的氨基酸组成蛋白的水平来增加特定氨基酸水平的方法是氨基酸生物合成途径的修饰。重组DNA和基因转移技术已用于改变氨基酸生物合成途径中催化关键步骤酶的活性。Glassman，U.S.P.NO.5,258,300；Galili，et al.，European Pafent Application NO.485970；(1992)；在此全文引入。然而，修饰种子中氨基酸水平不总是联系着那些参入有这些氨基酸蛋白含量的变化。Burrow，et al.，Mol.Gen.Genet.；Vol.241；PP.431～439；(1993)；在此全文引入作为参考。在叶片和种子中增加游离赖氨酸水平已通过选择DHDPS突变体或在植物中表达大肠肝菌DHDPS而获得。然而，由于种子中游离氨基酸水平常常仅是总氨基酸含量的小部分，这些增加不足以有效提高种子的总氨基酸含量。
lysC基因是细菌天冬氨酸激酶的一个突变体，它对由赖氨酸和苏氨酸引起的反馈抑制不敏感。表达这一基因导致增加甲硫氨酸和苏氨酸生物合成的水平。然而，用种子特异的表达盒来表达这一基因导致在种子中仅有6～7％总苏氨酸或甲硫氨酸水平的增加。参阅Karchi，et al.，The Plant J.，Vol.3；PP.721～7；(1993)；在全文引入作为参考。因此，仅对种子营养价值有很小的影响，必需氨基酸的添加仍是需要的。
基于上述，仍存在对于一种增加植物种子必需氨基酸水平的方法的需求。从现有技术可知，前述方法不足以增加游离和结合氨基酸水平而有效地增加饲料营养含量。仍存在一种需求来100％，增加必需氨基酸水平，即双倍于现有水平。如果这个目标达到，添加将不再需求。
因此本发明的目标是提供方法从基因水平上修饰植物种子从而提高这种植物种子的必需氨基酸苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的水平。
本发明的进一步目标是作为食物和/或饲料提供比野生类型种同样种子含较高水平必需氨基酸，苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的种子。
本发明的进一步目标是作为食物和/或饲料提供加倍的必需氨基酸水平，从而能避免饲料添加需求的种子。
概述本发明提供从基因水平上修饰植物种子从而提高必需氨基酸苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的水平的方法。这些方法包括一种把提供增加了的目标游离氨基酸类群之来源和某种伴随产生的，补充蛋白质沉积，结合起来的方法，其结果是一个超出预料提高了的蛋白质结合的目标氨基酸的积累。
这些方法包括1)对种子内氨基酸代谢途径进行操作，以提供增加必需氨基酸如苏氨酸、甲硫氨酸和/或赖氨酸的水平和/或可能性；和2)过量表达已选定的基因，不管内源的或异源的，编码那些含有必需氨基酸如苏氨酸、甲硫氨酸和/或赖氨酸的种子蛋白。合成足够的游离目标氨基酸作为来源结合到相伴合成选定的蛋白内用作消除饲料中添加必需氨基酸需求的一种沉积。
图的简述
图1描绘了一幅天冬氨酸类生物合成途径的简图。
本发明的详细描述在此使用的“沉积”指一种稳定积累的蛋白质并含有大量目标氨基酸。
在此使用的“来源”指可用于蛋白质生物合成的游离氨基酸。他们是经生物合成途径从头合成的。
在此使用的“游离氨基酸”指那些未经修饰的或直接合成的氨基酸。
在此使用的“结合氨基酸”指那些修饰后的，例如结合到肽和蛋白质上的氨基酸。
在此使用的“目标氨基酸”指一种将被大量产生的氨基酸。
在此使用的“选定的蛋白质”指某种蛋白质，或其基因等价物，它含有提高后水平的目标氨基酸。
在此使用的“基因水平上修饰的”指一种植物细胞稳定地参入一种由转化方法导致的核酸构建物。术语“野生型”指一种未转化的植物细胞。
“内源的”蛋白质指植物中在天然部位正常具有的天然蛋白质。
此外，本发明含有本发明各种DNA构建物的制备和使用方法。用描述的核酸序列转化的植物种子和微生物也是本发明的实施例。
优选的其种子中蛋白质含量通过本方法得到提高的植物包括，但不局限于大豆、canola，玉米，向日葵，小麦，大麦，燕麦，小米，水稻。高粱和黑麦。种子可直接用作饲料或食物，或进一步加工。在本发明的实践中最好的植物种子是大豆。
按照本发明，可提供简单，快速，和可靠的方法同于产生在结出的种子中增加了必需氨基酸积累的转基因大豆植株。本方法是基因型独立的，表明了比以前使用系统一个巨大的出乎意料的改进。
氨基酸代谢途径的操作近来在重组DNA和基因转移技术方面的进展使得有可能分离、测序、操作和再导入基因到生物体中，参阅如植物生物工程学商业化前景和困难，(1993)，eds Prakash et al.，Oxford&IBH PwblishingCO.，新德里，印度；酵母分子生物学和基因工程，(1992)，Heslot，et al.，CRC Press，Inc.，USA；和分子克隆实验手册，(1989)，Sambrook，et al.，Cola Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约；都在此全文引入作为参考。使用这些技术允许基因调控代谢途径，最终导致某种代谢物浓度的改变。参阅Bailey，et al.，“面对一个代谢工程科学”Science；Vol.252；PP.1668～1675；(1991)；Muller-Rober，et al.，“在转基因马铃薯中抑制ADP-葡萄糖焦磷酸化酶导致糖-贮存块茎和影响块基形成和块基贮藏蛋白质基因的表达”TheEMBO Journal；Vol.11(4)；PP.1229～1238；(1992)；Sonnenwald，et.al.，“转基因烟草植株表达酵母来源的转化酶于胞浆、液泡或非元质体一种有效工具来研究蔗糖代谢和沉积/源关系”The PlantJournal；Vol.1(1)，PP.95～106；(1991)；和Tarczynski，et al.，“细菌mtlD基因在转基因烟草中表达导致甘露糖醇的产生和积累”Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.89，PP.2600～2604；(1992)；都在此全文引入作为参考。下面描述了标准的分子生物学方法，借助它植物种子中代谢苏氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的代谢途径能被改变。这些非限制性方法的目的是增加这些不必需氨基酸的供给。
过量表达一种编码目标酶的基因这一方法增加某种期望目标酶的浓度，这种酶是一种限速酶，常被调控位于代谢分支点上。参阅如Van Schaewen，A.，et al.，EMBOJ.，Vol.9；PP.3033～3044；(1990)；和Dickinson，C.D.，et al.，PlantPhysiol..Vol.95；PP.420～425；(1991).两篇在此全文引入作为参考。目标酶编码基因的增加的表达能，例如，通过提高所用的驱动转录该基因启动子的强度和/或提高该基因和它的调控元件的拷贝数达到。强的基因表达和基因高拷贝导致增加mRNA和目标酶的水平。目标酶浓度的增加提高了通过限速步骤的代谢流。
例如，增加胱硫γ-合酶(“CS”)的量相对应提高了甲硫氨酸的生物合成。参阅如Thompron，et al.，“浮萍中的甲硫氨酸生物合成”Plant Physiol.；Vol.69；PP.1077～1083；(1992)；在此引入作为参考。
CS催化甲硫氨酸生物合成的第1步(见图1)。明显的生理底物是O-磷酸高丝氨酸，因此CS与苏氨酸合酶竞争这一底物，苏氨酸合酶是苏氨酸生物合成中的一个酶。CS水平与甲硫氨酸水平呈反相关，表明了甲硫氨酸或有关化合物的调节作用。过量表达CS须导致增加流过CS的流量，引起增加的甲硫氨酸生物合成。
为增加苏氨酸合成，甲硫氨酸腺苷转移酶(“MAT”)能过量表达。MAT的直接产生物，S-腺苷甲硫氨酸(“SAM”)已在体外被证明强烈地激活苏氨酸合酶(“TS”)。提高MAT表达导致增加SAM的合成，从而引起将处于激活状态的高浓度的TS。增加的TS活性导致苏氨酸生物合成的提高。由于沉积蛋白质的共同表达，如同本发明期望的，在目标蛋白质合成中游离苏氨酸水平将不会足够高而反面地影响天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶的活性或启动分解代谢的活性。
为增加赖氨酸的合成，过量表达二氢吡啶二羧酸合酶(“DHPS”)是有效的。DHPS的一种底物，天冬氨酸半醛，是一种分支点中间物，是高丝氨酸生物合成和DHP生物合成的一种前体。提高DHPS活性使之更多转向DHP生物合成，从而，提高赖氨酸的生物合成。共同表达一种沉积蛋白质必然引起在目标蛋白生物合成过程中游离赖氨酸的水平足够低以致于DHPS或AK-HSD活性不受反面地影响。
编码目标酶基因的低水平表达降低一种目标酶的浓度是能达到的，例如使用一种反义构建物。参阅如Temple，S.T.et al.，“调节谷氨酰胺合酶基因在烟草内表达借助插入一个苜蓿谷氨酰胺合酶基因在有义和反义方向分子和生化分析”Molecwlar and General Genetics，Vol.238(2～3)；PP.315～325；(1993)；在此引入作为参考。表达一种反义基因构建物导致用于酶合成的可转录mRNA降低，使得目标酶浓度和在目标酶位点的代谢流降低。
例如，苏氨酸合酶(“TS”)催化苏氨酸生物合成的第一个关键步骤。TS的生理底物是O-磷酸高丝氨酸因此TS与CS竞争此底物。TS的低水平表达减少通过TS的流，而为CS提供额外的底物(O-磷酸高丝氨酸)，从而增加了朝向甲硫氨酸生物合成的代谢流。而且，低水平的TS引起苏氨酸生物合成和浓度的下降，因而降低了这种代谢物对AK-HSD反馈抑制的水平，再次导致甲硫氨酸生物合成的增加。因此，碳骨架和代谢能被从苏氨酸生物合成转向甲硫氨酸生物合成。
对于苏氨酸，DHPS和CS的低水平表达，与如上所述同样的原因是有效的。例如，降低水平的CS为TS提供增加了的O-磷酸高丝氨酸，从而提高了苏氨酸的生物合成。
而且，降低的TS水平减少了苏氨酸生物合成和由苏氨酸对AK-HSD活性的抑制，这是由于游离苏氨酸水平是相对低的。这些作用增加了赖氨酸(和甲硫氨酸)的生物合成。由于MAT具有一种对TS活性强烈的正影向，对它生物合成的抑制降低了活化TS的水平，这种效应是相同于TS的低水平表达。
产生另一个代谢分支点，有时期望重新引导代谢流远离主要的分支点，在此点一种代谢物是多条竞争途径的底物，转移到一条更直接的途径或到产生一种新代谢物途径上。这是能通过表达编码目标酶的单个基因或包括编码多个酶的多个基因做到的。参阅如Tarczynski，M.C.，et al.，“在转基因烟草中表达细菌mtlD基因导致产生和积累甘露糖醇”Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol.89；PP。2600～2604；(1992)；在此引入作为参考。
例如，在高等植物中O-磷酸高丝氨酸如不是唯一的也是主要的CS生理底物。第1个关键酶在甲硫氨酸生物合成(CS)和苏氨酸生物合成(TS)都竞争O-磷酸高丝氨酸。为提高甲硫氨酸生物合成，高丝氨酸可通过表达编码高丝氨酸丙二酰转移酶的基因部分地转变为丙二酰高丝氨酸。丙二酰高丝氨酸，是除O-磷酸高丝氨酸外的CS但不是TS的一种底物，这样能获得CS的较高水平底物，使得甲硫氨酸生物合成提高。
某种目标酶生化性质的改变按照本方法来修饰某种目标酶编码基因，改变这种酶的生化性质。参阅如U.S.P.NO.5,367,110，1994年11月22日公布，Galili，et al.，在此引入作为参考。有一些已知的方法可改变酶的生化性质。这些方法包括定点突变。参阅如Deng，et al.，“通过消除一个单一位点实质上可对任何质粒定点突变”Anal.Biochem.，Vol.200，PP.81～88；(1992)在此引入作为参考。基于改变的结果，代谢物质流可以经过目标酶提高或降低。参阅如Shaul，et al.，“在表达一个大肠杆菌天冬氨酸激酶反义突变子的转基因烟草植株中苏氨酸过量产生”PlantPhys.；Vol.100；PP.1157～1163；(1992)；和Brzovic，et al.，“用天冬氨酸替代109位谷氨酸改变了鼠伤寒杆菌来源的色氨酸合酶双酶复合体中β-亚基底物特异性和催化活性”Biochemistry；Vol.31；PP.1180～90；(1992)；都在此引入作为参考。
AK-HSD催化天冬氨酸类氨基酸生物合成的第1步。这个酶通常由赖氨酸和苏氨酸反馈调控。AK-HSD的突变体已在大肠杆菌和植物中选择到，这些细菌和植物已表明过量产生游离的苏氨酸和甲硫氨酸，赖氨酸和异亮氨酸。在结合苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸或异亮氨酸含量方面仅微弱或无改变。参阅如Galili et al.，在此同上引用。
过量表达一个预先选择的基因本发明进一步包括遗传地修饰一种植物种子优选地表达一种预先选择的蛋白质。实例包括，但不局限于，一种富含甲硫氨酸的蛋白质，一种富含半胱氨酸的蛋白质，一种富含赖氨酸的蛋白质，一种富含甘氨酸的蛋白质，一种富含色氨酸的蛋白质，和一种富含酪氨酸的蛋白质。
在此使用的“富含…的”指比正常蛋白质含较高百分率的氨基酸。
在此使用的“启动子”是指在某个基因中的一段DNA序列，通常位于基因编码序列的上游(5′)，并且通过为RNA聚合酶和其它启动转录必须的因子提供识别结合区控制该编码序列的表达。首选的启动子是那些能在种子中特异表达预先选择的蛋白质以避免在非一种子组织中任何潜在的有害影响。这些启动子对本领域的技术人员将是很熟悉的。
种子特异性启动子的实例包括，但不局限于，那些以高度调控方式在种子中表达种子贮藏蛋白质的启动子。Thompson，et al.，BioEssays；Vol.10；PP.108～113；(1989)；在此全文引入作为参考。那些将会特别有用的，在双子叶植物种子中表达蛋白质的种子特异性启动子包括豆类β-菜豆蛋白，napin，β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)，和大豆 凝集素。对于单子叶植物，玉米15KD玉米醇溶蛋白，22KD玉米醇溶蛋白，γ-玉米醇溶蛋白，蜡质的，皱缩的1，球蛋白1，和皱缩的2启动子将特别地用于多肽类的表达。那些本领域的技术人员将承认另一些启动子可提供结构以在选作转化的植物中提高预先选择的蛋白质的水平。
在一个首选的实施例中，预先选择的蛋白质是一个富含甲硫氨酸的2S种子贮藏蛋白质如巴西坚果蛋白质(BNP)。Altenbach，et al.，Plant Mol.Biol.Vol.8；PP.239～250；(l987)；在此全文引入作为参考。一种编码这一蛋白质的天然的或构建的DNA或RNA序列通过任何稳定地整合基因到植物基因组的转化方法被引入到植物细胞内。这能包括许多载体，如病毒载体，游离型载体，穿梭载体，Ti质粒载体及其类似物，都按照熟知的步骤。Sun，et al.，Eur.Patent Appl.EP NO.295,959；(1991)；在此全文引入作为参考。
“载体”是一种复制子，如质粒，粘粒，或噬菌体，其他DNA区段可连接其上以便产生连接区段的复制，或使得区段引入到一个细胞宿主中。
就某种蛋白质而言在此使用的术语“异源的”指编码这种蛋白质的基因或基因片段是从一种或多种该基因最终在此表达的植物基因组之外的其它来源基因组中获得。这来源可是天然的，如，基因可从另一种来源的生命体中获得，例如细菌，酵母，真菌等，或一种不同种的植物。这来源也能是合成的，如，基因或基因片段能在体外通过化学合成制备。
就某种预先选择的蛋白质而言在此使用的术语“表达”指编码这一蛋白质的基因被稳定地整合进细胞的基因组内，以便由这一基因编码的蛋白质，如，某种富含甲硫氨酸的蛋白质例如巴西坚果蛋白质(BNP)，在此细胞中产生。实例如，表达了BNP的新植物，含有可提取的种子BNP水平0.5％，最好的达至少2％。
编码预先选择的蛋白质的核酸序列的特性可以是不相同的，优选的实例描述了许多性质这些可以是有利的但本领域的技术人员将承认这些不是绝对必需的。这些特性包括选择某个具体的构建物和载体以将该序列导入细胞和产生该蛋白质的表达。一名熟练的技术人员能够建一个适合于在选定的细胞系统中表达这预先选择的蛋白质的表达盒而无需过度的实验。该发明的核心是这预先选择蛋白质的水平；因此，一般地这核酸序列额外的拷贝将产生对内源蛋白质合成增加抑制。
通过但不局限于实例的途径，那些本领域的技术人员将容易地懂得另外的蛋白质，如10KDa玉米醇溶蛋白来源于苜蓿的和2S白蛋白可替代BNP蛋白质作为预先选择的种子蛋白。分别参阅如Mol.Gen.Gtenet.(1988)Vol.211，PP.477～484；和J.Exp.Bot。Vol.41，233 PP.1541～7，1990，在此都被全文引入作为参考。熟练的技术人员将承认这种预先选择的蛋白质的选定将取决于这种蛋白质的氨基酸组成和它在种子积聚的能力。这包括所有类型的种子贮藏蛋白质；经过或未经过修饰以便在这种蛋白质中提高指定氨基酸的含量的2S，7S和11S蛋白质。这氨基酸因它的营养价值而被选定从而对于植物产生一种附加值的特性以及作为一种陷井来限制指明内源性蛋白质可得性。可使用蛋白质序列的适合来源的实例，按照本发明是植物，特别是高等植物。氨基酸适合于附加值特性以及作为一种限制合成内源性蛋白质的来源包括有，但不局限于甲硫氨酸，半胱氨酸，甘氨酸，赖氨酸，色氨酸，和酪氨酸。
在此使用的“植物”指一个整植物，一个植物的部分，一个植物的细胞，或一群植物细胞。能在本发明的方法中使用的植物类群通常范围宽达所有适合于转化技术的具种子的高等植物，包括单子叶和双子叶植物。按照本发明植物的转化可以进行基本上依照所有不同的对那些植物分子在生物学领域技术人员熟知的方法。这些包括但不局限于粒子轰击，微注射，电穿孔，和农杆菌介导的DNA转移。
如下的转化，再生将正常地包括从转化过程获得一个整植株。从组织培养再生植株的技术，如被转化的原生质体或愈伤组织细胞系，在本领域是熟知的。参阅如，Phillips，et al.，Plant Cell Tissue OrganCulture；Vol.1；P.123；(1981)；Patterson，KE and N.P.Everett，Plant Sci，；Vol.42；PP.125～132；(1985)；Wright，et al.，Plant Cell；Reports.Vol.6；PP.83～89；(1987)；Barwale，et al.，Planta；Vol.167；P.473；(1986)；在此都全文引入作为参考。选择一种合适方法是本领域技术的范畴。
在此详细描述的本发明实施的范例特别涉及大豆植物和在双子叶植物中操作的表达载体。在这些范例中大豆被选作一种模式系统主要是因为该从转化了的单个大豆细胞再生大豆植株的技术是以本领域熟知的某种方式进行的。在此使用的表达载体是可论证地能够在许多双子叶植物中或在组织培养或整个植株中操作。因此在此公开的本发明是能在双子叶植物种中转化单个植物细胞并能在双子叶植物种中获得整个完整的植株，这些植株可从转化了的植物愈伤组织再生得到并表达了预先选择的种子蛋白质。那些目前不能再生的种，当再生技术成熟时本发明是完全可用的。
此外，涉及种子蛋白质的嵌合表达载体也是熟知的并在文献中描述并已证明在单子叶植物细胞，至少在组织培养中是可操作的。有理由的希望，当再生这些植物的技术完善时，这些载体也将在整个单子叶植物中适用，以便所有预先选择的种子蛋白质能在任何单子叶植物种子中表达。因此本发明适用于单子叶和双子叶植物。
所以，本发明的实施能仅通过少量修饰用来改善农作物象水稻，玉米，小麦，和大麦。这种实施方案的一个α-hordothionin高赖氨酸衍生物到一个大麦或小麦细胞以减少种子中purothionin的含量增加且种子中赖氨酸的含量。
Thionins是一些存在于大麦，小麦，和其它植物种类胚乳中的小型抗菌蛋白质。Florack，et al.，Plant Mol Bicl.；Vol.24；PP.83～96；(1994)；在此全文引入作为参考。天然的α-hordothionin富含精氨酸和赖氨酸残基，每种含5个残基(10％)。这蛋白质的一些衍生物已制备出，在其中赖氨酸用来代替其它氨基酸产生对真菌毒性较低的复合物的并极大地更富含赖氨酸(29％赖氨酸)。
Purothionins也是存在于小麦和禾本科其它种胚乳中的小型富赖氨酸蛋白质。Wada，K.Plant&Cell Physiol.23(8)，1357～1361；(1982)；在此全文引入作为参考。Purothionins对酿酒酵母是有毒的，其结果，含有高水平这种蛋白质的大麦或小麦不能用来制作高质量啤酒。
然而，按照本发明，一种高赖氨酸的α-hordothionin或另一种基因工程的为提高赖氨酸含量设计和减少对微生物毒性的thionin能被用来降低Purothionins的水平和提高大麦，小麦，或其它禾本科植物的赖氨酸含量。在酿造过程后这些富赖氨酸残余物能出售用作饲料。
前述的是本发明范围的说明，一个本领域技术人员将认识到许多改善植物的其它实例能够应用于本发明。
本发明借助如下更加详细描述本发明各种用途的实例能更好地理解但无意限制本发明的范围。
实验部分氨基酸途径的改变为了获得AK基因的种子特异性表达和定位该酶到质体上，使用步骤的描述如Karchi，et al.，“一种细菌脱敏的天冬氨酸激酶的种子特异性表达提高了转基因烟草种子苏氨酸和甲硫氨酸的产生”The PlantJournal；Vol.3(5)；PP.721～727；(1993)；在此全文引入作为参考。使用菜豆蛋白构建物。
一种富甲硫氨酸种子贮藏蛋白质对大豆的转化植物转化大豆(Glycine max)种子，原始变种9341，暴露于由钟形玻璃广口瓶产生的氯气下面消毒。氯气是由在100毫升次氯酸钠(5.25％w/w)中加入3.5毫升盐酸(34～37％w/w)产生的。暴露达16～20小时在一个体积约一立方英寸的容器内。表面消毒后的种子保存在培养皿内在室温下。种子的发芽是通过放置在1/10强度的琼脂固体培养基上，培养基依照Gamborg[B5基础培养基带有少量有机物，Sigma Chemical Co.，Cat.no.G5893，0.32gm/上；蔗糖，0.2％v/v和2-(N吗啉代)乙磺酸(MES)，3.0mM]无植物生长调节剂，培养在28℃和16小时日照长度大约20mEm 2S1照度的冷白荧光下培养。经过3天或4天后，种子可准备进行协同培养。去掉种子外皮并去掉子叶下3～4毫米处的伸长根。数个培养皿的每个培养皿中存有10粒处理过的种子。
构建质粒为构建含有单个拷贝嵌合富含甲硫氨酸的蛋白基因(BNP)的质粒p12GUSBN17，利用了质粒pARC12(Prosen D.E和R.B.Simpson，Biotechnology Vol.5，pp.966-971；(1987)；在此全文引入)。这是1个29.5kb的质粒，它是脓杆菌二分载体(binary vecfor)系统的部分并含有作为植物细胞选择性标志的嵌合基因胭脂氨酸合酶/新霉素磷酸转移酶II。从质粒PB1221获得的嵌合基因CaMV35S/β葡糖醛酸酶(Jefferson，R.A.，Plant.Mol.Bio.Reporter；Vol.5(4)，pp.387-405；(1987)；在此全文引入作为参考)被插入PARC12，构成质粒p12GUS-15。质粒pD3-8-12(Altenbach，et al.，Plant.Mol.Biol.；Vol.13；pp.513-522；(1989)；在此全文引入作为参考)含有载体pTZ19U中的BNP基因。质粒pD3-8-12经Hind III酶切后插入到质粒p12GUS-15的Hind III位点。形成的质粒p12GUSBN17大小约36kb，含有1个拷贝的BNP基因，并使细胞宿主能抗氨苄青霉素和四环素。
为构建一个含有4个拷贝富含甲硫氨酸的蛋白质基因的质粒，质粒pD3-8-12被用作起始质粒。BNP基因是从pD3-8-12经EcoR1，Hind III和Xmn1酶切而切出的。该片段的两端用DNA聚合酶I的克列诺片段填成平端，一个3kb含有嵌合基因的片段经凝胶纯化。该片段连接到事先经Smal酶切和用牛小肠磷酸酶处理后的质粒pD3-8-12上。形成的质粒称为pD3-8-12-2X，它含有双拷贝的嵌合串联排列的富甲硫氨酸BNP基因。
为构建含有4个拷贝嵌合的质粒，质粒pD3-8-12-2X经EcoR1和Hind III酶切后两端用DNA聚合酶的克列诺片段填成平端。1个含有双拷贝嵌合基因的6kb片段被分离出。该片段被连接到事先经Sma I酶切并经牛小肠磷酸酶处理后的质粒pD3-8-12-2X上。形成的质粒是pD3-8-12-4X。
这嵌合BNP基因被插入到Ti质粒载体pARC12中。一个从pD3-8-12-4X经EcoRI和Hind III酶切切出的12kb片段被连接到事先经EcoRI和Hind III酶切的pARC12上。形成的质粒，p12-4X，含有位于tDNA边界间4个拷贝的BNP基因，和1个作为植物细胞中选择标志的嵌合胭脂氨酸合酶新霉素磷酸转移酶II基因。随后，该质粒被从大肠杆菌转移到根癌脓杆菌菌系LBA4404中通过三亲株融合法。形成细菌的鉴定由Southern印迹分析确定。
根癌农杆菌LBA 4404/p12GUSBN17和p12-4X的制备包含二分质粒p12GUSBN17(DP1816，单拷贝BNP序列)或p12-4X(DP1813，4个拷贝BNP序列)的根癌农杆菌菌系LBA4404在含有1.0mg/ml四环素的基本A培养基上生长至对数期的过夜培养物被收集合并在550nm处测定其光密度。在15ml锥形离心管中装入足够体积的培养物使得沉降后每个离心管收集到1.0和2.0×1010个细胞，此时O.D.550 1.0＝1.4×109细胞/ml。沉降经6000g离心10分钟获得。离心后倾注出上清液离心管室温保存作为种子接种物但不能超过1小时。
转化接种分批进行使得每个种子的平板都经新鲜悬浮的脓杆菌沉淀处理。每次一个，沉淀悬浮在20ml接种培养基中。接种培养基含有B5盐(G5893)3.2gm/l；蔗糖2.0％w/v；6-苯基氨基嘌呤(BAP)44mM；吲哚基乙酸(IBA)0.5mM；乙酰丁香酮(AS)100mM并用10mM pH5.5MES缓冲液配制。经涡旋振动再次悬浮。然后种子接种物被注入含有处理的种子其子叶节用外科刀片浸渍的培养皿内。这是这样完成的通过沿着种子的长轴经茎尖把种子分成两部分以保存2个整子叶。然后基尖的两部分与它们各自的子叶折断借助外科刀片将它们汾开。然后子叶节用外科刀片沿着对称轴反复划痕而被浸渍。小心不能从外植体到远轴面整个切开。二十个外植体经处理在大约5分钟内然后在室温下静止培养30分钟。额外的平板可在这段时间内处理。30分钟后外植体被转移到同样的含有0.2％w/v Gelrite(Merk在Co.Inc.)的固体培养基上。外植体以近轴面朝上水平种植在该培养基表面在22℃约20mEm2S1冷白荧光照射下培养3天。
培养和选择3天以后外植体被转移到液体反选择培养基上。反选择培养基含有B5盐(G5893)3.2gm/L；蔗糖2.0％w/v；BAP5.0mM；IBA0.5mM；万古霉素200mg/ml；cefotaxime 500mg/ml并用3.0mM pH5.7MES缓冲液配制。每个培养皿中十个外植体进行洗涤并在室温下恒定，缓慢地旋转摇动四天。反选择培养基须替换四次。
外植体然后被放入琼脂固化的选择培养基上。选择培养基含有B5盐(G5893)3.2gm/L；蔗糖2.0％w/v；BAP5.0mM；IBA0.5mM；硫酸苄那霉素50mg/ml；万古霉素100mg/ml；cefotaxime 30mg/ml；timentin 30mg/ml并用3.0mM pH5.7MES缓冲液配制。选择培养基因用0.3％w/v Seakem琼脂固化。外值体被种植在培养基上，近轴面朝下培养在28℃16小时日照长度和冷白荧光照度为60-80mEm2S1。
经过二星期后外植体再次在旋转摇床上用液体培养基洗涤、这一次洗涤进行过夜在含有50mg/ml硫酸苄那霉素的反选择培养基中。第二天外植体被放置在琼脂固化的选择培养基上。这些外植体再次被种植在培养基上，近轴面朝下，如同前面所述再培养另二个星期。
再生一个月后在选择培养基上转化后的组织肉眼可见，与发白健康状况不佳的背景组织相反呈再生组织的绿色部分。去除没有绿色区域的外植体，带绿色区域的外植体转移到延长培养基上。延长培养基含有B5盐(G5893)3.2gm/L；蔗糖2.0％w/v；IBA3.3mM；赤霉酸1.7mM；万古霉素100mg/ml；cefotaxine 30mg/ml；timentin30mg/ml用3.0mMpH5.7MES缓冲液配制。延长培养基用0.2％w/v gelrite固化。外植体被种植上近轴面朝上同前一样培养。在这种培养基上培养继续，每二个星期外植体被转移到新鲜平板上。当基长至长度为0.5cm时外植体从基部切断被放置在13×100mm的试管长根培养基上。长根培养基含有B5盐(G5893)3.2gm/l；蔗糖15gm/l；烟酸20mM；焦谷氨酸(PGA)900mg/l和IBA10mM。培养基用3.0mM pH5.7MES缓冲液配制用0.2w/v Gelrite固体。十天后这些基转移到不含IBA和PGA同样培养基上。基上长出根来并把这些试管按前述的保存在同样的环境条件下。
当根系统完全形成时小植株转移到无菌土壤混合的植包内(ICNBiomedicas，Inc.，cat.no.26-720在1-02)。温度、光照期和光强与前述一样。在这些条件下再生体变成茁壮的，大多数正常(虽小)的植株。当它们的根系再次完全形成时切去植包的一角。在气候室或温室内植株逐渐地耐寒。最终它们在温室中被栽种在土壤中生长成熟，结种子。
生长，增殖，和收获转基因大豆在衣阿华州，同一品种(9341)未转化和转化植株得到的种子在1992年春季种植于1992年秋季收获。每个单独品系保持隔离地生长在1个或多个10.5英尺的行列中以保证最大的生长。从转化过程得到的品系其中插入单拷贝BNP基因的称为BNP1X。那些插入四个拷贝基因的称为BNP4X。
在1992年秋季大部分收获的BNP4X种子在Puerto Rico中增殖。这种子按品系在1992年12月种植于1993年3月按品系收获。
部分增殖，收获的种子返回进行产量测试和进一步实验室测试。其余的按品系在1993年3月再次种植于Puerto Rico 1993年6月按品系收获。整个第二次种植的增殖量约是2英亩，或每个品系略多于0.1英亩。
在本说明书中提到的所有出版物和专利申请是本发明所属领域的那些本领域技术人员水平的体现。在此引入作为参考的所有出版物和专利申请是处于同等的程度，好象每一单独的出版物或专利申请被特别地和独立地指明引入作为参考。
上述实施例的变动是在本领域技术人员普通技术能力的限度内，这种变动不偏离如同下述权利要求描述的本发明的范围。
权利要求
1.一种提高某种植物种子内一种目标氨基酸水平的方法包括a)对这种氨基酸的代谢途径进行操作以提供这种目标游离氨基酸的一种额外来源；和b)通过过量表达某种编码含有目标氨基酸的蛋白的预先选择的基因而相伴地产生一种补充的沉积，使得有蛋白结合的目标氨基酸的积累。
2.权利要求1所述的方法其中目标氨基酸是从由赖氨酸，甲硫氨酸和苏氨酸组成的组中选择的。
3.权利要求2所述的方法其中代谢途径是通过过量表达关键酶，少量表达关键酶，重建代谢分支点或改变酶的生化特性来调节的。
4.权利要求3所述的方法其中种子是从由大豆，canola，玉米，向日葵，小麦，大麦，燕麦，小米，水稻，高粱和黑麦组成的组中选择的。
5.权利要求4所述的方法其中代谢途径是通过过量表达关键酶，少量表达关键酶或改变酶的生化特性来调节的。
6.权利要求5所述的方法其中种子是从由大豆，玉米，高粱，canola和向日葵组成的组中选择的。
7.权利要求6所述的方法其中种子是从由大豆，玉米和canola组成的组中选择的。
8.权利要求7所述的方法其中种子是从由大豆种子组成的组中选择的。
9.权利要求7所述的方法其中代谢途径是通过改变酶的生化特性来调节的。
10.权利要求6所述的方法其中种子中甲硫氨酸水平的提高是通过a)过量表达编码巴西坚果蛋白质基因；和b)过量表达关键酶，少量表达关键酶或改变酶的生化特性而完成。
11.权利要求10所述的方法其中种子中甲硫氨酸水平的提高是通过改变酶的生化特性完成。
12.某种植物种子被遗传地修饰能表达相对于同种野生型植物种子提高了水平的某种目标氨基酸，这种修饰包括a)调节这种氨基酸代谢途径以提供这种目标游离氨基酸的一个增加来源；和b)通过过量表达某种编码含有该氨基酸的蛋白质的预先选择的基因而相伴地产生一种补充的沉积蛋白质，使得有蛋白结合的目标氨基酸的积累。
13.权利要求12所述的种子其中目标氨基酸是从由甲硫氨酸，赖氨酸和苏氨酸组成的组中选择的。
14.权利要求13所述的种子其中代谢途径是通过过量表达关键酶，少量表达关键酶，重建代谢分支点或改变酶的生化特性来调节的。
15.权利要求14所述的种子其中该种子是从由大豆，canola，玉米，向日葵，小麦，大麦，燕麦，小米，水稻，高粱和黑麦组成的组中选择的。
16.权利要求15所述的种子其中该种子是从由大豆，玉米，高粱，canola和向日葵组成的组中选择的。
17.权利要求16所述的种子其中该种子是从由大豆，玉米和canola组成的组中选择的。
18.权利要求17所述的种子，该种子是大豆。
19.权利要求18所述的种子其中甲硫氨酸水平的提高是通过a)过量表达编码巴西坚果蛋白质的基因；和b)过量表达关键酶，少量表达关键酶或改变酶的生化特性而完成的。
20.权利要求19所述的种子其中代谢途径是通过改变酶的生化特性来调节的。
全文摘要
本发明提供一种提高植物种子中必需氨基酸水平的方法,从而增进种子的营养价值。该方法包括调节氨基酸的代谢途径以提供目标游离氨基酸的一个增加源,和伴随地过量表达某种编码含有目标氨基酸蛋白质的预先选择的基因,使得有蛋白结合的目标氨基酸的积累。产生一个补充的蛋白质沉积。本发明在提高种子中甲硫氨酸,赖氨酸和苏氨酸水平中是特别有效的。
文档编号C12N15/29GK1195377SQ96196076
公开日1998年10月7日 申请日期1996年5月30日 优先权日1995年5月31日
发明者L·R·比奇, M·C·塔尔茨斯基 申请人:先锋高级育种国际公司