专利名称：碱性蛋白酶、其制造方法、使用方法和产生此蛋白酶的微生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的碱性蛋白酶。更具体地说，本发明涉及一种在表面活性剂中稳定和抗热的碱性蛋白酶、它的生产方法、其在去污剂中的使用和产生碱性蛋白酶的微生物。
背景技术：
近几年，环境污染已成为一个社会问题。为了调节磷酸盐作为去污剂成分的使用，将酶与去污剂混合以提高去垢性。目前市场上已经有含有酶(例如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶)的去污剂。特别是，蛋白酶能够降解衣服上的有机污点，10-40％的有机污点是由蛋白质造成的，并且这种污点不能由常规去污剂洗掉。蛋白酶已经成为一种改进去垢性的必要成分。
作为去污剂中使用的蛋白酶，有很多来源于在碱性pH范围内具有活性的微生物，并且已经使用了蛋白酶，如Kazusase(Showa Denko K.K.)、Savinase(Novo)，Maxacal(Gist)、Alcalase(Novo)和Biosam(ShowaDenko K.K.)。随着自动洗碗机的广泛应用，现在需求能够用于自动洗碗机的酶。蛋白酶对盘子上的蛋黄、奶制品等蛋白质污点有效。然而，一般来说高温时在水溶液中酶的失活加快。因此，需要在稳定性方面具有优势的酶。尽管目前Esperase(Novo)等已用于此目的，但是这些酶没有令人完全满意的活性和稳定性。目前知道的在表面活性剂中最稳定的蛋白酶是通过芽孢杆菌属菌株SD 521(1991年的专利申请号191781)产生的。然而，需要一种更稳定的蛋白酶。
因此，本发明的目的是提供一种在表面活性剂中更稳定的碱性蛋白酶、生产这种碱性蛋白酶的方法、这种蛋白酶在去污剂组合物中的应用和产生这种蛋白酶的微生物。
发明描述我们努力研究的结果是发现了由芽孢杆菌属未知种SD 114(一种芽孢杆菌属的菌株)产生的蛋白酶API-26具有极好的稳定性，并且适合于在去污剂中使用，并且完成了本发明。
因此，本发明提供了下列新的碱性蛋白酶、它的生产方法、用途和产生这种蛋白酶的微生物。
1)满足下列(a)-(c)所规定的至少一个条件的碱性蛋白酶(a)40℃下在表面活性剂溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置30分钟后剩余活性超过60％(b)55℃下在缓冲剂溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA)中放置15分钟后剩余活性超过40％(c)55℃下在表面活性剂溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置15分钟后剩余活性超过20％2)在以上第1)项中规定的具有下列特性的碱性蛋白酶(1)作用此蛋白酶能水解蛋白质和肽。
(2)最适pH当此蛋白酶在30℃下，以酪蛋白为底物反应10分钟时的最佳pH大约为12。
(3)稳定pH范围30℃下将此蛋白酶温育24小时时，其在5-11的pH范围内稳定。
(4)最佳温度当此蛋白酶在pH10时，以酪蛋白为底物反应10分钟时的最佳温度大约为60℃。
(5)分子量通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的分子量为29,000±2,000。
(6)等电点通过等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的等电点为10.1±0.5。
3)在以上第1)项或第2)项中规定的由属于芽孢杆菌属的微生物产生的碱性蛋白酶。
4)在以上第3)项中规定的由属于芽孢杆菌属的微生物产生的碱性蛋白酶，其中所说的微生物是芽孢杆菌属未知种SD114(保藏号FERM BP-5736)。
5)与以上第4)项中规定的蛋白酶具有免疫交叉反应性的碱性蛋白酶，并且能够满足下列(a)-(c)所规定的至少一个条件(a)40℃下在表面活性剂溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置30分钟后剩余活性超过60％。
(b)55℃下在缓冲液溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA)中放置15分钟后剩余活性超过40％。
(c)55℃下在表面活性剂溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置15分钟后剩余活性超过20％。
6)一种生产碱性蛋白酶的方法，其特征在于从产生以上第1)-5)项所规定的蛋白酶的属于芽孢杆菌属的微生物或其变种的培养物中获得所说的蛋白酶。
7)一种生产以上第6)项所规定的碱性蛋白酶的方法，所说的蛋白酶由属于芽孢杆菌属的微生物产生，这种微生物是芽孢杆菌属未知种SD114(FERM BP-5736)。
8)芽孢杆菌属未知种SD 114(FERM BP-5736)和它的突变体。
9)所说的去污剂的成分，其中包括以上第1)-5)项所规定的蛋白酶。
10)包含以上第1)-5)项所规定的蛋白酶的去污剂。
11)用于自动洗碗机的去污剂，其中包含以上第1)-5)项所规定的蛋白酶。
12)生产肽或氨基酸的方法，其特征在于使以上第1)-5)项之任一所规定的蛋白酶与蛋白质或者肽反应。
附图的简更描述[
图1]为描述本发明酶的最适pH范围的图。
为描述本发明酶的稳定pH范围的图。
为描述本发明酶的最佳温度范围的图。
为描述本发明酶和已知酶在55℃下的稳定性的图。
为描述本发明酶和市售去污剂(Ultra Ariel)中的已知酶在55℃下的稳定性的图。
为描述本发明酶和市售去污剂(Super Cheer)中的已知酶在55℃下的稳定性的图。
为描述本发明酶和市售去污剂(Tide Grease Releasing)中的已知酶在40℃下的稳定性的图。
发明的详细公开产生酶的微生物产生本发明酶的微生物之一的芽孢杆菌属未知种菌株SD 114是一种与强固芽孢杆菌(Bacillus firmus)在菌学上密切相关的菌株。然而，这种菌株在一些特性方面明显地不同于其它的已知菌株，其被认为是一个新的菌株。细菌学特性与本发明相关的芽孢杆菌属未知种菌株SD 114具有下列的细菌学特性(a)形式芽孢杆菌(b)革兰氏染色阳性(c)孢子的产生阳性(d)孢子的形状椭圆(e)移动性阳性(f)对氧的反应需氧菌(g)过氧化氢酶的产生阳性(h)在厌氧条件下的生长阴性(i)伏-普二氏反应(VP)反应阴性(i)VP肉汤培养物的pH6.2(k)酸的产生葡萄糖阴性阿拉伯糖阴性木糖阴性甘露糖醇阴性(i)由葡萄糖产气阴性(m)明胶的液化作用阳性(n)淀粉的降解阳性(o)柠檬酸盐的利用阴性(p)丙酸盐的利用阴性
(q)苯丙氨酸脱氨基作用阴性(r)蛋黄反应阴性(s)硝酸盐的还原阴性(t)在pH6.8下的生长阳性(u)在pH5.7下的生长阳性(v)在5％氯化钠中的生长阳性(w)在7％氯化钠中的生长阳性(x)在10℃下的生长阳性(y)在30℃下的生长阳性(z)在55℃下的生长阳性(aa)微生物DNA的GC含量(摩尔％)45％参考Bergey的系统细菌学手册(Vol.2，William和Wilkins，1986)，将所说的具有上述细菌学特征的细菌的系统特征与其它的菌株比较如下本发明涉及到的芽孢杆菌属未知种菌株SD 114在由糖产生酸和50℃生长方面没有表现出与强固芽孢杆菌相同的特征。然而，已知菌株SD 521由葡萄糖产生酸、使硝酸盐脱氧，不能在pH6.8时生长，也不能在50℃生长。NCIB 10309由葡萄糖、阿拉伯糖和甘露糖醇产生酸。PB 92由葡萄糖和木糖产生酸，并且能够利用丙酸盐。从以上细菌学特征可以明显地看出菌株SD 114是一种嗜温细菌，是与强固芽孢杆菌密切相关的芽孢杆菌属未知种，但是这种菌株与其它的已知菌株不同。因此这种菌株被认为是一种新的菌株。此菌株在1995年10月2日以FERM P-15214保藏在生物科学和人类技术国家研究院(工业科学和技术机构(地址1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本))，并在1996年10月30日按照布达佩斯条约以菌株SD 114(FERM BP-5736)转变成国际保藏物。
此外，属于所说的菌株SD 114的蛋白酶生产力改进的突变体(通过自发或者诱导突变而得到)可以作为产生本发明蛋白酶的细菌。为了制备这些突变体，可以使用常规的方法，例如由紫外辐射或者诱变剂(如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG))对原始菌株诱导人工突变后，将培养物接种到含有脱脂乳等的琼脂培养基中。从在菌落周围形成较大清晰环带的菌落中选择具有极好生产力的突变体。而且可以通过在合适的宿主细胞中利用基因扩增现象改进生产力，用与合适的自我复制DNA偶联的本发明蛋白酶的基因转化所说的宿主细胞。产生蛋白酶的方法任何能够使产生本发明蛋白酶的微生物生长并产生所说的蛋白酶的培养基都可以用于生产本发明的蛋白酶。
例如，可以使用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉等作为碳源，使用有机的氮化合物(如大豆饼，糠饼和玉米浸液)作为氮源。此外还要加入矿物质，如磷酸盐、钾盐和镁盐。在本发明中，将培养物在需氧的条件下培养，例如可以使用通气培养或摇动培养。尽管在20-40℃的温度下此菌株是稳定的，但要求使用的培养温度是30-37℃。理想的初始pH为9-10，在培养期间的pH是8.5-10。培养时间为16-60小时，当获得最大的蛋白酶活性时结束培养是理想的。可以按照常规的分离和纯化方法对通过以上过程获得的培养物进行纯化。通过盐析沉淀蛋白质、溶剂分级分离方法、喷雾干燥方法、冻干法等等，将可溶性盐或者亲水的有机溶剂加入到所得的上清液或滤液(所说的上清液和滤液是通过离心或者过滤除去体细胞或培养基的固体剩余物而得到的)中，获得了本发明的蛋白酶。而且可以结合使用其它的纯化方法(如离子交换层析和凝胶过滤层析)来进一步纯化所说的蛋白酶。我们把通过上述方式所获得的本发明的蛋白酶命名为API-26。通过下列方法测定API-26的活性。酶活性的测定将50μl适当稀释的酶溶液加入到500μl 50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)中，并且在30℃下预温育3-5分钟。将500μl 的2％汉马斯坦氏酪蛋白溶液(pH10)加入到此溶液中，10分钟后，加入2ml的三氯乙酸(TCA)溶液(用乙酸盐缓冲液调节至pH4的0.032M TCA溶液)使反应终止。在30℃下放置10分钟以上，然后用2号滤纸(Toyo Roshi)过滤。将5ml的0.4M碳酸钠和1ml用水稀释6倍的酚试剂加入到1ml滤液中。在30℃下着色20分钟，然后测定在660nm下的吸光度。katal是描述蛋白酶活性的单位。1 katal定义为pH10和30℃下以酪蛋白为底物产生的降解产物在660nm下与1摩尔酪氨酸的吸光度相同的蛋白酶活性。蛋白酶的特性本发明所获得的蛋白酶的物理和化学特性如下(1)作用和底物特异性此蛋白酶降解蛋白质或肽(如酪蛋白、血红蛋白、白蛋白、肉蛋白质、鱼蛋白质和大豆蛋白质)。
(2)最适pHpH值的确定以Britton-Robinson宽范围缓冲液作为缓冲溶液。为了确定最适pH值，将大约20nkatal/ml的酶加入到每一种含有1％酪蛋白的pH缓冲液中。在30℃下温育10分钟后测定酶活性。酶活性如表1和图1所示，其中在pH11.7下的活性被认为是100。从这些结果看出此酶的最适pH值大约为12。
(3)稳定pH范围稳定pH范围的确定将此酶以大约20nkatal/ml的浓度加入到每一种pH缓冲溶液中。在30℃下温育10分钟后测定酶活性。表2和图2描述了剩余活性，其中在温育前的活性被认为是100。从这些结果中可以看出在30℃下此酶的稳定pH值范围大约为5-11。
表1<
>(4)最适温度最适温度的确定在每个温度下将25mM含有2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)进行预温育后，加入所说的酶并在每个温度下反应10分钟。30℃下将此溶液温育24小时后测定酶活性。表2和图2描述了相对活性，其中在60℃下的活性被认为是100。从这些结果中可以看出此酶的最适温度大约为60℃。
表3<
>(5)抑制物的影响按照下列条件和方法研究了各种抑制物对所说的酶的影响制备含有大约20nkatal/ml酶的50mM硼酸盐缓冲液(pH10)溶液。将EDTA、对汞苯甲酸(PCMV)或甲苯磺酰氟(PMSF)以表4所示的浓度加入到此溶液中。30℃下温育30分钟后测定酶活性。结果如表4所示，其中没有抑制物时酶的相对活性被认为是100。如表4所示，PMSF十分强烈地抑制此酶，因此所说的酶是丝氨酸蛋白酶。
表4<
6)分子量通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的此酶的分子量为29,000±2,000。
(7)等电点通过等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的等电点为10.1±0.5。
(8)稳定性所说的酶能够满足至少下列条件之一(a)40℃下在表面活性剂溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm线型烷基苯磺酸钠(LAS))中放置30分钟后剩余活性超过60％。
(b)55℃下在缓冲溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA)中放置15分钟后剩余活性超过40％。
(c)55℃下在表面活性剂溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置15分钟后剩余活性超过20％。与抗API-26体的交叉反应性在下列的测定条件下本发明的蛋白酶优选地表现出与抗API-26体的交叉反应。
交叉反应的测定条件制备2mg/ml的API-26抗原，并将其和等量的弗氏完全佐剂混合以形成完全的油包水乳剂。将1ml的这种乳剂在0天、21天、42天和63天施用到2只雌兔上。在70天时采用驱血法收集所有的血液，并且制备含有抗体的血清样品。
使用Ouchterlony技术(Acta.Med.Scan.13376-79，1950)评估交叉反应，即用10μl的API-26或其它蛋白酶以1mg/ml的浓度填充中央孔，并且用10μl抗血清(以2n(n＝1、2、3、4、5、6、7)比例稀释)填充周围孔。将平板放置在湿度培养室中，并在37℃下温育过夜，直到能够看到沉淀素线。如果沉淀素线是以形成API-26的沉淀素线的最小浓度的4倍或更高浓度形成时，就可以得出所说的酶和抗API-26体具有交叉反应性。蛋白酶的应用通过使用本发明的蛋白酶处理蛋白质或者肽可以产生肽或者氨基酸。通过使用蛋白酶处理包含蛋白质或者肽的目标物质可以用此蛋白酶加工目标物质。在常规的使用方法中，本发明的蛋白酶可以与常规的蛋白酶合用。甚至在常规酶失活的苛刻条件下，本发明的蛋白酶还可以使用直到此蛋白酶被激活。例如，不仅可以在50ppm-500ppm LAS存在时使用所说的蛋白酶，而且在超过500ppm的LAS存在下也可以使用。然而，在小于3,000ppm下使用此蛋白酶是优选的，在小于300ppm使用此蛋白酶是更优选的。可以在超过48℃的高温下使用所说的蛋白酶。然而在小于75℃下使用此蛋白酶是优选的，在小于70℃下使用此蛋白酶是更优选的。用途在各种市售的去污剂溶液或者表面活性剂中，本发明的碱性蛋白酶比常规碱性蛋白酶更稳定。由于此酶也具有热稳定性，所以在用温水洗涤衣服或盘子时，其能有效地降解蛋白质污点，所以通过在去污剂中加入这种蛋白酶能够增加去垢性。
此外，这种蛋白酶可以用于饲料加工、食品加工(鱼油加工、肉加工等)、纤维加工、羊毛加工、皮革加工、接触透镜的洗涤、管道的洗涤。此外，这种蛋白酶可以与浴液和脱毛剂混合使用。去污剂组合物本发明提供了与具有上述指定特性的碱性蛋白酶混合的去污剂组合物。虽然没有限定与本发明的去污剂组合物混合的碱性蛋白酶的数量，但是将相当于10-1,000nkatal/l的去污剂溶液量的酶混合是合适的。如果加入的量太小，就不能令人满意地提高去垢性。相反，如果加入的量太多，也不能象所期望的那样提高去垢性，而且从经济方面考虑也是不可取的。
本发明的碱性蛋白酶可以与已知的去污剂组合物混合而在组成上无任何改变。本发明的去污剂组合物不需要特殊的成分。这种去污剂组合物典型的例子是具有一种或多种由下列物质构成的组成的去污剂组合物10-50％(重量比)的表面活性剂、0-50％(重量比)的助剂、1-50％(重量比)的碱性试剂或者矿物质、0.1-5％(重量比)的抗沉淀剂、酶、漂白剂、荧光染色剂、抗结块剂和抗氧化剂(依去污剂组合物的重量而定)。
可以使用去垢剂组合物中通常含有的下列表面活性剂肥皂；线型或者分支烷基或者链烯基硫酸酯；氨基硫酸酯；脂肪族硫酸化合物，如具有线性或分支烷基或者链烯基基团(其中加入了一个或多个环氧乙烷、环氧丙烷和环氧丁烷)的烷基或链烯基醚硫酸酯、烷基磺酸酯、氨基磺酸酯、二烷基磺基琥珀酸酯、脂肪族磺酸酯(如α-烯烃、亚乙烯基烯烃和内烯烃的磺酸酯)；芳香族磺酸酯，如线型或者分支的烷基苯磺酸酯、带有线型或者分支烷基或链烯基基团(其中加入了一个或多个环氧乙烷、环氧丙烷和环氧丁烷)的烷基或链烯基醚羧酸酯；α-磺基脂肪酸或者酯；氨基酸型的表面活性剂；烷基或者链烯基酸性磷酸酯；磷酸酯表面活性剂(如烷基或者链烯基磷酸酯)；磺酸型的两性表面活性剂；甜菜碱型两性表面活性剂；带有线型或分支烷基基团(其中加入了一个或多个环氧乙烷、环氧丙烷和环氧丁烷)的烷基或者烯基醚或者醇；带有线型或分支烷基基团(其中加入了一个或多个环氧乙烷、环氧丙烷和环氧丁烷)的聚氧化乙烯烷基苯醚；高级脂肪酸链烷醇酰胺或者它们的烯化氧加成化合物；蔗糖脂肪酸酯；甘油脂肪酸一酯；烷基或者链烯基胺氧化物；四烷基铵盐型阳离子表面活性剂；等等。阴离子表面活性剂的抗衡离子优选的是钠离子或者是钾离子。所说的去污剂可以含有一种或多种这些表面活性剂的混合物。
下列的无机化合物可以用作助洗剂和碱化剂或者无机电解质。可以作为碱性金属盐的有磷酸盐(如正磷酸盐、焦磷酸盐、三聚磷酸盐、偏磷酸盐、六偏磷酸盐、植酸盐等等)；膦酸盐(如乙烷-1，1-二膦酸、乙烷-1，1，2-三膦酸、乙烷-1-羟基-1，1-二膦酸和它们的衍生物、乙烷羟基-1，1，2-三膦酸、乙烷-1，2-二羧基-1，2-二膦酸、甲烷羟基膦酸等等)；膦酰基羧酸盐(如2-膦酰基丁烷-1，2-二羧酸、1-膦酰基丁烷-2，3，4-三二羧酸、α-甲膦酰基琥珀酸等等)；氨基酸盐(如天冬氨酸、谷氨酸等等)；氨基多乙酸盐(如次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸盐、二亚乙基三胺五乙酸盐等等)；高分子电解质(如聚丙烯酸、聚亚甲基丁二酸盐、聚顺丁烯二酸、无水顺丁烯二酸的共聚物、羧甲基纤维素盐等等)；未离解的聚合物(如聚乙二醇、聚乙烯醇等等)；羧甲基化合物(如二乙醇酸、羟二乙醇酸、羧甲基羟丁二酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、蔗糖、乳糖等等)；有机酸盐(如季戊四醇的羧甲基化合物、葡糖酸的羧甲基化合物、苯多羧酸、草酸、苹果酸、羟二丁二酸、葡糖酸等等)；硅铝酸盐(如沸石等等)；作为碱性金属盐的无机盐(如碳酸盐、倍半碳酸盐、硫酸盐、二硅酸盐等等)；作为有机化合物的淀粉，尿素等等；作为无机化合物的氯化钠，皂土等等；和作为有机碱化剂的三乙醇胺，二乙醇胺，一乙醇胺，三异丙醇胺等等。
如上所述，本发明的去污剂组合物含有一种或多种表面活性剂、本发明的碱性蛋白酶和碱化剂或者无机电解质作为主要成分。此外，如果需要，其可以含有两性表面活性剂、漂白剂(如过碳酸钠、过硼酸钠等)、漂白激活剂、染色剂、助洗剂、抗再沉淀剂(如聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等)、抗结块剂、抗氧化剂、防腐剂、荧光增亮剂、起泡沫剂和其它的酶(如脂酶等)。
可以使用任何方法将所说的酶和本发明的去污剂组合物混合。然而，出于对去污剂用户或去污剂工厂中的工人的安全和健康危害考虑(在去污剂的处理期间产生灰尘)，最好不将酶的细粉末混合。因此，优选地将酶配制成液体或者无尘形式。可以通过任何常规的方法(如滚动成粒状、挤压成粒状、经流化床成为粒状和经离心流化床成为粒状)将酶成型。用于与本发明的去污剂组合物混合的酶的形状并不限于按照上述方法产生的形状。由于本发明的碱性蛋白酶很稳定，可以在比常规制备方法更高的温度下(例如大于50℃)进行酶的配制。
本发明的去污剂组合物的具体形式包括含有本发明碱性蛋白酶的洗涤衣物的去污剂和用于自动洗碗机的去污剂等。实现本发明的最好条件下面是具体说明本发明的例子，但是本发明不只限于下列例子。
使用了在这些实施例中指定的市售去污剂。在使用它们之前，通过分选等方法提取包含在所说的去污剂中的酶颗粒来制备不含酶的去污剂。
实施例1芽孢杆菌属未知种菌株SD 114的培养35℃下将菌株SD 114在300毫升含有1％酪蛋白、1％肉汤和1％多胨的培养基中震荡培养66小时，用碳酸钠将培养基的pH调节到7.5，然后在培养物中产生并分泌所说的酶。4℃下以1000 G离心此培养物以便获得上清液。上清液中的酶活性大约为50nkatal/ml。
实施例2酶API-26的纯化将在实施例1中获得的培养物的上清液用除去细菌的膜过滤，然后用超滤膜浓缩。用30-60％饱和的硫酸铵将此浓缩的溶液盐析。将获得的沉淀溶解在25mM tris-HCl缓冲液(pH7.5，包含1mM CaCl2)中，并用此缓冲液进行透析。然后在pH7.5下将此溶液加入到CM-cellulofine C-500柱(Seikagaku公司)中，使用0-1M含有1mM CaCl2的KCl通过浓度梯度方法洗脱所说的酶。与离子交换层析之前相比酶组分的比活显示出大约8倍的增加。对此组分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明此酶为一条单一的带。
实施例3温度稳定性将本发明的酶API-26、枯草杆菌蛋白酶10309(由菌株NCIB 10309产生的酶)、PB 92(由芽孢杆菌属菌株PB 92产生的酶)和SD 521(由芽孢杆菌属菌株SD 521产生的酶)加入到50mM Atkin-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10，包含0.1mM EDTA)中，得到活性大约为20 nkatal/ml的溶液。在55℃下温育此溶液，定期收集样品，并在30℃下测定剩余活性。表5为每一时间点的剩余活性，其中在没有热处理的条件下测定的活性为100。分别根据1976年的8401号专利出版物、1976年的125407号临时出版物和1991年的191781号临时出版物所规定的方法制备枯草杆菌蛋白酶10309、PB 92和SD 521。如表5和图4所示，API-26具有极好的温度稳定性。
表5.温度稳定性(55℃)<
实施例4表面活性剂稳定性我们研究了此酶对表面活性剂的稳定性。测定方法将LAS溶解在50mM Atkin-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10，包含0.1mMEDTA)中，得到500ppm的LAS溶液。将酶(API-26、枯草杆菌蛋白酶10309、PB 92和SD 521)加入到此溶液中，得到酶活性大约为20nkatal/ml的溶液，在40℃和55℃下温育此溶液。在30℃下定期检测剩余活性。表6(40℃)和表7(55℃)为在每个时间点的剩余活性，其中开始时酶活性为100。如这两个表所示，与常规酶相比，API-26在表面活性剂中具有极好的稳定性。
表6.在表面活性剂中的稳定性(40℃)<
实施例5酶API-26在去污剂溶液中的稳定性我们按照下列的条件和方法研究了本发明的酶在市售的去污剂UltraAriel(P&G)、Super Cheer(P&G)和Tide Grease Releasing(P&G)溶液中的稳定性。向50mM Atkin-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10，包含1,000ppm的Ca2+和1,000ppm的去污剂溶液)中加入酶API-26和其它的酶、枯草杆菌蛋白酶10309、PB 92和SD 521，得到酶活性为大约20nkatal/ml的溶液，然后在55℃或40℃下温育此溶液。30℃下定期检测剩余活性。表8-10和图5-7为每个时间点的剩余活性，其中开始时活性为100。如这些表和图所示，与其它酶相比，API-26在去污剂中具有十分显著的稳定性。
表8.Ultra Ariel(55℃)
表9.Super Cheer(55℃)
表10.Tide Grease Releasing(40℃)
实施例6包含酶API-26的去污剂的去垢性试验用除去细菌的膜处理以实施例1相同的方式获得的培养物的上清液，用超滤膜浓缩所得的上清液，然后通过喷雾干燥制备此酶的粗制剂。将所得的粗制品酶加入到Tide(P&G)(一种市售的液体去污剂)中，并测定去垢性。将所说的粗制品酶以100nkatal/ml的浓度加入到Tide中。40℃下将含有制备的酶的去污剂温育4周。将2克温育4周的含有酶的去污剂加入到1升含有40ppm钙离子(Ca2+)的水中，洗涤脏衣物，测定亮度，以便通过下列方程确定去垢性。10块大小为5cm×5cm的EMPA-116用作脏衣物。
去垢性(％)＝(洗涤后衣物的亮度-脏衣物的亮度)/(干净衣物的亮度-脏衣物的亮度)×100也以SD521作为对照检测去垢性。所得结果列于表11。从这些结果可以看出，API-26的加入增加了液体去污剂的有效性。
表
实施例7含有酶API-26用于自动洗碗机的去污剂的去垢性试验我们使用实施例6描述的酶粗制剂检验了其在自动洗碗机中的去垢性。
使用市售的去污剂(Hi-wash S(NCC))制备用于自动洗碗机的含有所说的酶的去污剂，所说的市售去污剂含有聚乙烯亚烷基醚、过碳酸钠、碳酸盐、硫酸盐和有机酸盐，并将其以20∶1的重量比与API-26酶的粗制剂混合。将所得的去污剂以0.21％的浓度用于洗涤，并测定去垢性。洗涤条件机器由Matsushita电力工业有限公司装配的自动洗碗机NP-600，其中将去污剂溶液从旋转的喷嘴中注入，洗涤放置在旋转的去污剂溶液中的盘子。
洗涤温度温度由5℃缓慢升至55℃水硬度为3.5°DH酶浓度0.01％用于洗涤的循环水的量2.5升脏盘子用1克蛋黄弄脏两个直径为25cm的陶瓷盘，并过夜风干。去垢性的评价洗涤后，通过照相测定使用amide-Schnitz溶液反应在盘子上产生的紫色区域的面积(PI)。按照下列方程由测定的脏区域的面积计算清洁率。
清洁率(％)＝{(P0-P1)/P0×100}，其中的P0是盘子的面积。
表12显示出计算的清洁率。此试验也以SD521作为对照。这些结果表明含有酶API-26的去污剂具有很强的去污活性，这是因为其甚至对于象此试验中所用的蛋黄那样的顽固污点的清洁率也为100％。应该考虑到此酶大大有助于提高用于自动洗碗机的去污剂的去垢性。
表12
工业使用的可能性本发明的碱性蛋白酶在市售的各种去污剂或者表面活性剂中是非常稳定的，与现存的碱性蛋白酶相比其对于热也是稳定的。由于此酶在衣物和碗的洗涤过程中能有效地降解蛋白质，所以与此酶混合可以增加去垢性。
用这种酶处理蛋白质或者肽，生产其它肽或者氨基酸的过程可能是经济的，因为此酶是稳定的。
本发明的芽孢杆菌属未知种菌株SD 114及其突变体是很容易处理的嗜温菌，其在本发明的碱性蛋白酶的生产上是有用的。
通过本发明的蛋白酶的生产方法可以有效地生产本发明的碱性蛋白酶，其中包括培养属于芽孢杆菌属的微生物或其突变体。
权利要求
1.满足下列(a)-(c)所规定的至少一个条件的碱性蛋白酶(a)40℃下在表面活性剂溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置30分钟后剩余活性超过60％；(b)55℃下在缓冲剂溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA)中放置15分钟后剩余活性超过40％；(c)55℃下在表面活性剂溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置15分钟后剩余活性超过20％。
2.权利要求1所规定的具有下列特性的碱性蛋白酶(1)作用此蛋白酶能水解蛋白质和肽；(2)最适pH当此蛋白酶在30℃下，以酪蛋白为底物反应10分钟时的最佳pH大约为12；(3)稳定pH范围30℃下将此蛋白酶温育24小时时，其在5-11的pH范围内稳定；(4)最适温度当此蛋白酶在pH10时，以酪蛋白为底物反应10分钟时的最佳温度大约为60℃；(5)分子量通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的分子量为29,000+2,000；(6)等电点通过等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的等电点为10.1±0.5。
3.权利要求1或权利要求2所规定的由属于芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物产生的碱性蛋白酶。
4.权利要求3所规定的由属于芽孢杆菌属的微生物产生的碱性蛋白酶，其中所说的微生物是芽孢杆菌属未知种SD114(保藏号FERM BP-5736)。
5.与权利要求4中规定的蛋白酶具有交叉反应性的碱性蛋白酶，并且能够满足下列(a)-(c)所规定的至少一个条件(a)40℃下在表面活性剂溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置30分钟后剩余活性超过60％；(b)55℃下在缓冲剂溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA)中放置15分钟后剩余活性超过40％；(c)55℃下在表面活性剂溶液(50mM Atkins-Pantin硼酸盐缓冲液(pH10)、0.1mM EDTA、500ppm LAS)中放置15分钟后剩余活性超过20％。
6.一种生产碱性蛋白酶的方法，其特征在于从产生权利要求1-5所规定的蛋白酶的属于芽孢杆菌属的微生物或其变种的培养物中获得所说的蛋白酶。
7.一种生产权利要求6所规定的碱性蛋白酶的方法，所说的蛋白酶由属于芽孢杆菌属的微生物产生，这种微生物是芽孢杆菌属未知种SD114(FERM BP-5736)。
8.芽孢杆菌属未知种SD 114(FERM BP-5736)和它的突变体。
9.去污剂的成分，其中包括权利要求1-5所规定的蛋白酶。
10.包含权利要求1-5所规定的蛋白酶的去污剂。
11.用于自动洗碗机的去污剂，其中包含权利要求1-5所规定的蛋白酶。
12.生产肽或氨基酸的方法，其特征在于使权利要求1-5任一项所规定的蛋白酶与蛋白质或者肽反应。
全文摘要
本发明涉及一种新的芽孢杆菌属未知种菌株(保藏号FERM BP－5736)、通过培养所说的菌株或其突变体所获得的,在表面活性剂中高度稳定的且具有下列特性的蛋白酶、此蛋白酶的产生方法和其用途。(1)能水解蛋白质或肽,(2)在30℃下,以酪蛋白为底物反应24小时的最佳pH大约为12,(3)30℃下以酪蛋白为底物反应24小时,其稳定pH范围为5—11,(4)在pH10下以酪蛋白为底物反应10分钟时的最佳温度大约为60℃,(5)通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的分子量为29,000±2,000,(6)通过等电聚焦聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的等电点为10.1±0.5,(7)40℃下与500ppmLAS溶液混合30分钟的剩余活性不少于60%,55℃下与500ppmLAS溶液混合15分钟的剩余活性不少于20%。
文档编号C12P21/06GK1201489SQ96198013
公开日1998年12月9日 申请日期1996年11月1日 优先权日1995年11月2日
发明者御代田喜昭, 福山志朗, 米田正 申请人:诺沃挪第克公司 被以下专利引用 (2),