Aur－1和/或aur-2相关疾病的诊断与治疗的制作方法

专利名称：Aur－1和/或aur-2相关疾病的诊断与治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及被称为AURORA1和AURORA2(AUR-1和AUR-2)的新的蛋白质、编码AUR-1和／或AUR-2的核苷酸序列、以及用于诊断和治疗与AUR-1和／或AUR-2相关的疾病的各种产品和方法。
下文对本发明背景的描述是为了有助于理解本发明，并不是承认它们为已有技术。
细胞的信号传递是一种基本的机制，通过该机制，调节各种细胞过程的外界刺激被传递到细胞内部。信号传递中重要的生物化学机制之一涉及蛋白质的可逆磷酸化，它通过改变其结构和功能来调节成熟的蛋白质的活性。
真核细胞中被明确表征的蛋白质激酶在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的醇部分使蛋白质磷酸化。这些激酸大体上可分为两类，一类特异于丝氨酸和苏氨酸的磷酸化，一类特异于酪氨酸的磷酸化。一些激酸，被称为“双重特异性激酶”，能够对酪氨酸也能够对丝氨酸／苏氨酸残基磷酸化。
蛋白质激酶也可以其在细胞中的定位进行表征。一些激酸为跨膜受体型蛋白质，它们在应答例如配体的结合的外界环境时直接改变其催化活性。其它为非受体型蛋白质，它们缺乏跨膜区域。它们可存在于从细胞膜的内表面到细胞核的各种细胞空间中。
许多激酶参与了调节的梯级反应，它们的底物可包括其它激酶，其活性由其磷酸化状态进行调节。最后，一些下游效应子的活性通过磷酸化而被调节，导致这一反应通道的激活。
丝氨酸／苏氨酸激酶家族包括发现于各种信导梯级反应所有步骤中的成员，包括参与了控制细胞生长、迁移、分化和激素分泌、导致基因表达改变、肌肉收缩、葡萄糖代谢的转录子的磷酸化、细胞蛋白质合成的控制、和细胞周期的控制的那些成员。
本发明涉及AUR-1和／或AUR-2多肽、编码这些多肽的核苷酸、含有这种核苷酸的细胞，针对这些多肽的抗体，使用这种多肽的检测方法，以及与上述各项相关的方法。本发明基于我们称做AUR-1和／或AUR-2的新的蛋白质的分离和表征。当得知本文提供的序列后，该多肽和核苷酸可通过公知的和标准的合成方法来制备。AUR-1和／或AUR-2与具有短的N-末端链的丝氨酸／苏氨酸激酶同类。其果蝇和酵母中的同系物好象参与了有丝分裂的调节。人类中的这一蛋白质好象与癌症和／或其它信号传递紊乱相关。AUR-1 RNA在来源于正常和肿瘤细胞的迅速分裂中被大量表达。但AUR-2 RNA的表达仅限于有限的细胞类型，在大多数正常组织中很低或没有，仅在来自肿瘤细胞系的一个亚群中，特别是来自结肠直肠的那些细胞中，被大量表达。AUR-1和AUR-2两者在胎儿肝脏、成人精巢、和胸腺中有中等程度的表达，提示这些蛋白质在有丝分裂中具有正常作用。AUR-1和AUR-2好象均可调节细胞核分裂。阻断其信导则产生多倍体细胞。这一表型的产生可能是由于染色体错误分离造成的，如从其酵母同系物IPL1所观察到的那样。由于多倍性是肿瘤细胞以及缺失p53肿瘤抑制物细胞中的标志，我们正在测试AUR-1和AUR-2在细胞转化中的作用。
初步的人类基因序列分析表明，它们包含一个高度保守的C末端蛋白质激酶区域和74至130个氨基酸的低度保守N-末端区域，该区域可能作为底物结合基序具有调节作用或功能。该人类基因在激酶区域的活化环中含有一个cAMP／PKA磷酸化位点R／KR／KXS／T，这提示存在一个类似于细胞周期调节的CDC2／CDK相关的蛋白质的调节途径。
使用来自于AUR-1和／或AUR-2独特的N-末段区段的探针进行Southern分析的结果表明，它们以单拷贝基因存在于人类细胞中。但在低度严谨条件下，我们可检测到与AUR1探针轻度杂交的1．3kb和3．2kb的SacⅠ片段。克隆和序列分析的结果表明，该区段编码一个无内含子的AUR1相关的假基因(被称作AUR3)，具有多重移框。而且，紧接在AUR3假基因的上游是一个复杂的反转重复区段，推测可形成非常稳定的发夹环。AUR3DNA序列与起始于AUR-1 cDNA的第一个核苷酸的AUR1具有同源性。紧接在这一位点的上游是推测的AUR3的发夹环。我们目前正在测定AUR1基因组克隆，以确定这个与AUR3的同源性是否延伸至该核苷酸的上游，以及该AUR1 cDNA是否包括或在其前端存在一个类似的发夹环。
本发明的功用包括检测细胞生长抑制物的能力以及开发治疗癌症的小分子药物。
一方面，本发明的特征在于分离、富集成纯化了的编码AUR-1和／或AUR-2多肽的核酸。
“AUR-1和／或AUR-2多肽”意指基本上类似于SEQ ID NO3或SEQ IDNO4所示序列或其片段的氨基酸序列。基本上类似的序列最好与SEQ IDNO3或SEQ ID NO4具有至少90％的等同性(更佳为不少于95％，最佳为99-100％)。
“等同性”意指序列的一种性质，用以度量序列间的相似性或关系。等同性是将相同残基的数目除以残基总数，再将所得结果乘以100来计算的。这样，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％的等同性，但具有缺失、增加、或替换的具有较低保守性的序列却可能具有较低程度的等同性。本领域普通技术人员已知可用以计算序列等同性的几种计算机程序。
关于核酸的“分离”是指一种相互共价连接的6个(优选21个，更优选39个，最优选75个)或更多个核苷酸的聚合体，包括DNA或RNA被从其自然状态下或合成后的状态下分离出来。在本发明的一些实施方案中，优选使用较长的核酸，例如具有300，600，900或更多个核苷酸和／或与SEQID NO1或SEQ ID NO2所示的全长序列具有至少50％、60％、75％、90％、95％或99％等同性的那些核酸。本发明的分离的核酸在自然界中不是以纯净的或分离的状态存在，从这个意义上说它是独特的。术语“分离的”表明一个自然存在的序列被从其正常的细胞(即染色体)环境中分离出来。因而，该序列可以存在于无细胞溶液中或被置于不同的细胞环境中。这一术语并不意味着该序列是唯一存在的核苷酸链，但意味着它基本上不含有自然状态下与它相关的物质(至少约90-95％的纯度)，并因而意味着它不同于被分离的染色体。
有关核酸的术语“富集”意指特定的DNA或RNA序列在细胞中或溶液中比在正常或疾病细胞中或比在该序列被提取的细胞中占有显著较高的比例(2-5倍)。这可通过人们优先减少其它DNA或RNA的存在量，或通过优先增加该特定的DNA或RNA序列的存在量，或通过该两个过程的结合来达到。但请注意，富集并不意味着没有其它DNA或RNA序列存在，而只是所关心的序列的相对量显著增大。这里所说的显著是表明增长的水平相对于做到这一增长的人来说是有用的，并通常意味着相对于其它核酸来说这一增长为约至少2倍，最好是至少5至10倍或更多。该术语也不意指不存在其它来源的DNA或RNA。其它来源的DNA可以，例如，包括酵母或细菌基因组的DNA，或者如pUC19的克隆载体。这一术语将自然发生的现象区别开来，这些自然发生的现象有例如病毒感染，或肿瘤型生长，其中一种mRNA的水平相对于其它种类的mRNA可能会自然增加。即，这一术语仅指其中由于人为的干预发生了目的核酸的比例增高的情况。
对于某些目的来说，一种核苷酸序列为纯化形式时是有利的。有关核酸的术语“纯化的”并不需要绝对的纯净(例如同源制备)；只是表示该序列比自然环境中相对较纯(与自然水平相比，这一水平应至少高出2-5倍，如以mg／ml计)。从cDNA文库分离出的单个克隆可以被纯化至电泳时的单一物质。从这些克隆中得到的要求保护的DNA分子可直接从总DNA或总RNA获得。该cDNA克隆不是自然存在的，但却相反最好通过部分纯化的天然存在的物质(mRNA)的遗传学操作来获得。从mRNA构建cDNA文库涉及创建一种合成的物质(cDNA)，并且纯化的单个cDNA克隆可通过对携带该cDNA文库的克隆筛选从该合成文库中分离出来。因而，包括从mRNA的cRNA文库构建和单个的cRNA克隆分离的过程导致了该天然信息物质的约106倍的纯化。这样，预想有至少一个数量级的纯化，最好4或5个数量级的纯化。
“一种AUR-1和／或AUR-2多肽”是指SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的全长氨基酸序列中的25个(优选30个，更优选35个，最优选40个)或更多个相邻接的氨基酸，或本文所述的它们的功能衍生物。在某些方面优选100、200、300或更多个氨基酸的多肽。该AUR-1和／或AUR-2多肽可由全长核酸序列或全长核酸序列的任一部分编码，只要能够保留该肽的功能活性。
在优选的实施方案中，该分离的核酸包含一种核酸序列、基本上由该核酸序列组成或由该核酸序列组成，该核酸序列为SEQ ID NO3或SEQID NO4全长的氨基酸序列所示的核酸序列，其功能衍生物，或编码它们中25、30、35、40、50、100、200或300个相邻接的氨基酸的核酸序列；该AUR-1和／或AUR-2多肽包含下述物质，基本上由下述物质组成，或由下述物质组成，该物质为AUR-1和／或AUR-2多肽的至少25、30、35或40个相邻接的氨基酸。该核酸可通过cDNA克隆或减去杂交(substractivehybridization)从天然原料中被分离出来；该天然原料可以是哺乳动物(人类)血液，精液，或组织，并且该核酸可通过三酯方法(triestermethod)或通过使用自动化DNA合成仪被合成出来。在另一个优选实施方案中，该核酸是一个保守的或独特的区段，例如，用来设计杂交引物以便于另外的多肽的鉴别和克隆的那些区段，用来设计PCR引物以便于另外的多肽的克隆，并获得针对该多肽区段抗体的那些区段。本发明的氨基酸序列的例子包括下列氨基酸序列(编码它们的分离的、纯化的或富集的核酸也包括在本发明的范围内)ENSYPWPYGRQ(SEQ ID NO5)CISGP(SEQ ID NO6)QFPO(SEQ ID NO7)VNSGQ(SEQ ID NO8)RKEPVTPSA-LV(SEQ ID NO9)LMSRSNVQPTAAP(SEQ ID NO10)VQNQKQKQLQATSVPH(SEQ ID NO11)PVSRPLNNTQK(SEQ ID NO12)VMENSSGTPD(SEQ ID NO13)ILTRHFTID(SEQ ID NO14)SKQPLPSAPENNPEEQLASKQK(SEQ ID NO15)“保守的核酸区段”是指存在于两个或更多个编码AUR-1和／或AUR-2多肽的核酸上的区段，在低度严谨条件下，一个特定的核酸序列可与之杂交。适用于筛选编码AUR-1和／或AUR-2多肽的核酸的适度严谨条件的例子请参阅Abe，et al．，J．Biol，Chem．，1913361(1992)(全文引入本文，包括附图
)。优选保守区段之间20个核苷酸中不同的核苷酸不超过5个。
“独特的核酸区段”是指存在于编码AUR-1和／或AUR-2多肽而不存在于编码任一种天然存在的多肽的序列。这一区段在编码AUR-1和／或AUR-2多肽的全长核酸中最好包括30个或45个相邻接的核苷酸。尤其是独特的核苷酸区段最好来源于浦乳动物。
本发明的特征也在于检测一个样品中AUR-1和／或AUR-2多肽或编码AUR-1和／或AUR-2多肽的核酸的核酸探针。该核酸探针含有与SEQ IDNO1或SEQ ID NO2所示的序列或其功能衍生物杂交的核酸。
在优选实施方案中，该核酸探针与编码SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示全长序列或其功能衍生物中至少12，75，90，105，120，150，200，250，300或350相邻接的氨基酸的核酸杂交。根据所需的特异性和选择性，可以使用各种低度的或高度的严谨杂交条件。在严谨条件下，只有高度互补的核酸序列杂交。优选这种条件阻止在20个相邻接的核苷酸中具有1或2个错配的核酸的杂交。
使用该探针的方法包括在一个样品中检测AUR-1和／或AUR-2 RNA的存在和存在量，这是通过在发生杂交的条件下将核酸探针与该样品接触并检测结合到AUR-1和／或AUR-2上的探针的存在或存在量来进行的。在探针和编码AUR-1和／或AUR-2多肽的核酸序列之间形成的核酸双螺旋可被用来鉴别被检测的核酸序列(例如参见，Nelson et al．，非放射性DNA探针技术，第275页，学术出版社(Academic Press)，San Diego(Kricka，ed．，1992)全部引入本文作为参考，包括附图)。可以构建进行这一方法的试剂盒，该试剂盒包括一个容器，其中装有一种核酸探针。
本发明的特征也在于重组核酸，优选该核酸存在于细胞或机体中。该重组核酸可含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的序列或其功能衍生物以及能够在宿主细胞中起始转录的载体或启动子。该重组核酸或者可含有在细胞中具有功能的转录起始区段，一个与编码AUR-1和／或AUR-2多肽的RNA序列互补的序列和一个在细胞中具有功能的转录终止区段。
另一方面，本发明的特征在于一种分离的、富集的、或纯化的AUR-1和／或AUR-2多肽。
有关多肽的“分离的”是指一种2个(优选7个，更优选13个，最优选25个)或更多个相互邻接的氨基酸的聚合体，包括从天然原料分离出来的或合成的多肽。在某些方面，优选较长的多肽，如SEQ ID NO3或SEQ IND NO4所示的具有402，407，413，或425个相邻接的氨基酸的那些多肽。本发明的分离的多肽从它们不以纯化的或分离的形态存在于自然界中这个意义上来说，它们是独特的。术语“分离的”表明一种天然存在的序列已被从其正常的细胞环境中分离出来。因而，该序列可以是存在于一个无细胞溶液中或被置于一个不同的细胞环境中。该术语并不代表该序列是唯一存在的氨基酸链，但它基本上不含有自然状态下与其相联的非氨基酸物质(至少约90-95％的纯度)。
有关多肽的术语“富集的”是指特定的氨基酸序列在细胞或感兴趣的溶液中的总氨基酸中存在的量与正常或疾病细胞或该序列被提取的细胞中的总氨基酸中存在的量相比较构成了一个显著高的级分(2-5倍)。这可通过人们优先减少其它氨基酸的存在量或通过优先增加该感兴趣的特定氨基酸序列的存在量或通过二者的结合来实现。但应当指出，富集并不意味着不存在其它的氨基酸序列，只是感兴趣的序列的相对量已经显著增加。这里的术语显著的是用以表明对于实现这一增加的人来说该增长的水平是有用的，并且通常情况下意味着相对于其它氨基酸增加了约至少2倍，最好增加至少5至10倍甚至更多。该术语也不意味着不存在其它来源的氨基酸。其它来源的氨基酸可以包括，例如，由酵母或细菌基因组，或如pUC19那样的克隆载体编码的氨基酸。该术语仅适用于通过为干预提高所需的核酸组分增长的情况。
对于某些目的来说，氨基酸序列以纯化形式存在是有利的。有关多肽的“纯化的”并不需要绝对的纯净(例如同源制备)，而是说它只是表示该序列比自然环境中的相对较为纯净(与自然状态下的水平相比较，这一水平应至少高2-5倍，如以mg／ml计)。预想至少一个数量级的纯化，优选两个或三个数量级，更优选四个或五个数量级的纯化。该物质最好没有在功能显著水平上的污染，例如纯度为90％，95％，或99％。
在优选的实施方案中，AUR-1和／或AUR-2多肽含有至少25，30，35，40，50，100，150，200，250，300，或350个SEQ ID NO3或SEQ IDNO4所示的全长序列中相邻接的氨基酸或其功能衍生物。
又一方面，本发明的特征在于对AUR-1和／或AUR-2多肽具有特异的结合亲和性的抗体(如，单克隆或多克隆抗体)。该抗体含有一种可特异地与AUR-1和／或AUR-2多肽特异地结合的氨基酸序列。“特异的结合亲和性”是指在特定条件下该抗体与AUR-1和／或AUR-2多肽的结合比它与其它多肽的结合具有更大的亲和性。
对AUR-1和／或AUR-2多肽具有特异的结合亲和性的抗体可用于检测样品中AUR-1和／或AUR-2多肽的存在和／或存在量的方法中，这是通过在免疫复合体形成的条件下将样品与该抗体接触并检测与AUR-1和／或AUR-2多肽偶联的抗体的存在和／或存在量来进行的。可构建实现这一方法的诊断试剂盒，它包括一个含有该抗体的第一容器和一个第二容器，该第二容器具有一个该抗体的结合对应物和一个标记物的偶联体。
另一方面，本发明的特征在于一种杂交瘤，该杂交瘤产生一种与AUR-1和／或AUR-2具有特异结合亲和性的抗体。“杂交瘤”是指一种能够分泌抗体，如AUR-1和／或AUR-2抗体的永生细胞系。在优选的实施方案中，该AUR-1和／或AUR-2抗体包含一种能够特异地结合AUR-1和／或AUR-2多肽的氨基酸序列。
另一方面，本发明描述了一种多肽，它包含一种重组的AUR-1和／或AUR-2多肽或其独特的片段。“独特的片段”是指一种存在于全长AUR-1和／或AUR-2多肽中而不存在于任何其它的来自天然原料的多肽中的氨基酸序列。优选这样一种序列包含存在于该全长序列中的6个相邻接的氨基酸。更优选这样一种序列包含存在于该全长序列中的12个相邻接的氨基酸。更进一步优选这样一种序列包含存在于该全长序列中的18个相邻接的氨基酸。
“重组AUR-1和／或AUR-2多肽”是指一种包括通过重组DNA技术生长的多肽，使它在其定位(如与自然状态相比，它存在于不同的细胞或组织中)，纯度或结构上明显不同于天然存在的多肽。通常，这样一种重组多肽将以不同于正常情况下在自然界中观察到的量存在于细胞中。
另一方面，本发明描述了一种重组细胞或组织，它含有一种编码AUR-1和／或AUR-2多肽的纯化的核酸。在这种细胞中，该核酸可以是在其基因组调节元件的控制之下，或可以是在包括一个外源启动子的外源调节元件的控制之下。“外源”是指一种启动子在正常情况下在体内不与AUR-1和／或AUR-2多肽的编码序列进行转录偶联。
另一方面，本发明描述了一种AUR-1和／或AUR-2多肽结合剂，它能够与AUR-1和／或AUR-2多肽结合。该结合剂优选为一种纯化的抗体，它识别存在于AUR-1和／或AUR-2多肽上的抗原决定部位。其它的结合剂包括与AUR-1和／或AUR-2多肽结合的分子和与AUR-1和／或AUR-2结合的类分子。这种结合剂可通过使用检测AUR-1和／或AUR-2结合对应物活性的检测方法来识别，如测定PDGFR活性的那些检测方法。
有关抗体的“纯化的”是指该抗体不同于自然存在的抗体，如以纯化的形式存在。更可取的是该抗体是通过标准技术以同源制剂提供的。针对该克隆的多肽的抗体的应用包括那些作为治疗，或作为诊断工具的应用。
本发明描述了一种用于筛选含有AUR-1和／或AUR-2多肽或等同序列的人类细胞的方法。该方法涉及使用现有技术中常规的和标准的技术在人类细胞中识别新的多肽，例如本文描述的用于鉴别AUR-1和／或AUR-2的那些技术(例如，无性繁殖，Southern或Northern印迹分析，PCR原位杂交，PCR扩增等)。
本发明也描述了在人类细胞中筛选AUR-1和／或AUR-2多肽的结合对应物和在其它机体中筛选AUR-1和／或AUR-2或相应的结合对应物的方法。本发明也描述了通过上述方法识别的这种多肽的纯化的，分离的或富集的形式。
另一方面，本发明提供了一种鉴别能够干扰AUR-1和／或AUR-2与AUR-1和／或AUR-2结合物之间相互作用的制剂的检测方法。这种检测方法可在体外或体内进行，并在本文中进行了详细描述，或可通过改变已有的检测方法来进行，例如NO．08／487，088，申请日1995年6月7日中描述的生长检测法，(引入本文作为参考，包括其中的附图)，或NO．60／005，167，申请日1995年10月13日描述的检测方法(引入本文作为参考，包括其中的附图)。另一种可被修改以使用本发明的基因的检测方法描述于国际申请NO．WO94／23039，公开于1994年10月13日。其它的可能性包括在自磷酸化检测中检测激酶的活性或对标准底物如组蛋白、髓鞘质碱性蛋白、伽马微管蛋白、或中心体蛋白质的检测激酶活性。结合对应物可通过将蛋白质的N-末端置于双-杂种筛选中或检测双重特异性激酶的磷酸酪氨酸来进行识别。Fields和Song的美国专利NO．5283173，1994年2月1日颁发，引入本文作为参考。
对Aurora活性的抑制物进行限定的一种方法是使用一种温度敏感型酵母突变体的筛选系统，如Chan和Botstein(遗传学)135677-691，1993)所述；也请参见Francisco et al．，分子细胞生物学。14(7)4731-4740，1994)，其全文引入本文作为参考，包括其中的附图。简言之，酵母品系CCY72-3D-1(ipl 1-2)，它编码一种温度敏感型的Aurora(ipl1)的酵母同系物，虽然在26℃可以存活，但在37℃时不能生长。将该品系用一种含有一个杂种Aurora基因的表达质粒进行转染，该杂种Aurora基因是由ipl1的N-末端部分，它含有推测的底物相互作用区域，和Aurora1或2的C-末端部分，它含有催化区域，所组成。这一转染克服了这种生长温度的敏感性。然后将该Aurora表达酵母品系在37℃和在检测物质存在的情况下生长。在抑制Aurora催化功能的物质存在下显然不会生长。潜在的抑制物包括小分子量的化学品和／或从各种有机体，如真菌、海洋生物、植物等分离的天然产物。
上述对本发明的概述不是限制性的，本发明的其它的特征和优点可从下文对优选实施方案和权利要求的描述将是显而易见的。
本发明涉及AUR-1和／或AUR-2多肽，编码这种多肽的核酸，含有这种核酸的细胞、组织和动物，针对这种多肽的抗体，使用这种多肽的检测方法，和与上述各项相关的方法。Ⅰ．编码AUR-1和／或AUR-2多肽的核酸本发明的范围包括本文描述的分离的核酸分子的功能等同物。遗传密码的简并性允许一些密码子被编码同一个氨基酸的密码子所替换，而产生同一种蛋白质。由于除甲硫氨酸和色氨酸之外所有已知的氨基酸可由一个以上的密码子编码，核酸序列可有大幅度的变化。这样，AUR-1和／或AUR-2基因的部分或全部可被合成出来，而其核酸序列明显不同于SEQID NO1或SEQ ID NO2所示的序列。但是其所编码的氨基酸序列完全相同。
此外，该核酸序列可以包含一个产生于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的序列或其功能衍生物的5’端和／或3’-端至少一个核苷酸的增加、缺失或替换的序列。在这方面可以使用任何一种核苷酸或多核苷酸，只要其增加，缺失或替换不改变该核苷酸序列编码的SEQ ID NO3或SEQ IDNO4所示的氨基酸序列。例如，本发明包括任一种产生于在本发明核酸序列或其功能衍生物的5’-端增加ATG作为起始密码子，或产生于在本发明的核酸序列或其功能衍生物的3’-端增加TTA，TAG或TGA作为终止密码子的核苷酸序列。此外，本发明的核酸分子如果需要在其5’-端和／或3’-端增加限制性核酸酶识别位点。
这种给定核酸序列的功能变换提供了一个机会，促进由与其融合的外源核酸序列编码的异源蛋白质的分泌和／或加工。因而，遗传密码所允许的AUR-1和／或AUR-2基因和其片段的所有核苷酸序列的变化均包括在本发明中。
而且，可以缺失密码子或由不是简并密码子的密码子替换一个或更多个密码子，以产生一个结构上被修饰的多肽，但该被修饰的多肽具有与没有修饰的核酸分子所产生的多肽基本上相同的作用或活性。现有技术中已知，这两种多肽是功能等效的，如同产生它们的两种核酸分子是等效的一样，虽然该两种核酸分子之间的差别与遗传密码的简并性无关。Ⅱ．用于检测AUR-1和／或AUR-2的核酸探针本发明的核酸探针可通过通常的杂交方法用于探测一个适当的染色体或cDNA文库，以获得本发明的另一种核酸分子。可根据现有技术中已知的方法从合适的细胞制备染色体DNA或cDNA文库(参见分子克隆实验室手册，第二版，Sambrook，Fritsch，＆ Maniatis编，Cold SpringHarbour Laboratory，1989)。
或者，为了获得具有相应于感兴趣多肽的氨基酸序列N-末端和C-末端部分的核苷酸序列的核酸探针，可进行化学合成。这样，该合成的核酸探针可被用作引物，用于按照已知的PCR技术，主要是按照“方法和应用指导”Michael等编，Academic Press，1990，中的PCR方法进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，使用适当的染色体或cDNA文库，以获得本发明的片段。
本领域的技术人员根据本文公开的序列，使用现有技术已知的计算机排列和序列分析方法(参见分子克隆实验室手册，第二版，Sambrook，Fritsch，& Maniatis编，Cold Spring Harbour Laboratory，1989)，可容易地设计这种探针。本发明的杂交探针可通过标准的标记技术进行标记，如使用放射性标记，酶标记，荧光标记，生物素-抗生物素蛋白标记，化学发光标记等。杂交以后，探针可通过已知方法看到。
本发明的核酸探针包括RNA，也包括DNA探针，这种探针是通过使用已知方法产生的。该核酸探针可被固定在固相支持物上。这种支持物的例子包括，但不限于，塑料例如聚碳酸酯，复合碳水化合物如琼酯糖及其凝胶和丙烯酸树脂，如聚丙烯酰胺和橡浆珠。将核酸探针与这种固相支持物相偶联的技术为本领域公知技术。
适用于本发明的核酸探测方法的待测样品包括，例如，细胞或从细胞中提取的核酸，或生物液。用于上述方法的样品根据检测程序，检测方法和待测组织、细胞或提取物的性质会有不同。制备细胞的核酸提取物的方法是已知技术，并可被容易地加以调整，以获得与所使用的方法相容的样品。Ⅲ．用于检测AUR-1和／或AUR-2的方法和试剂盒的探针一个检测样品中AUR-1和／或AUR-2存在的方法包括(a)在发生杂交的条件下将所说样品与上述核酸探针接触，和(b)检测与所说核酸分子结合的所说探针的存在。本领域普通技术人员将按照上述的已知技术选择核酸探针。待测样品包括但不限于人类组织的RNA样品。
一个检测样品中AUR-1和／或AUR-2存在的试剂盒包括至少一个其中放置有上述核酸探针的容器。该试剂盒可进一步包括其它容器，所述其它容器包括下述的一种或多种洗涤剂和可检测结合的核酸探针存在的试剂。检测试剂的例子包括，但不限于，放射标记探针，酶标记探针(辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶)，和亲和标记探针(生物素，抗生物素蛋白，或链菌素)。
更详细地说，一个分隔化的试剂盒包括任何其中试剂被存放于分开的容器中的试剂盒。这种容器包括小的玻璃容器，塑料容器或塑料条或纸条。这种容器允许试剂从一个分隔间到另一个分隔间的高效率的转送，并使样品和试剂不发生交叉感染，并且每个容器中的试剂或溶液可以定量的方式从一个分隔间到另一个分隔间的加入。这种容器将包括一个接收测试样品的容器，一个盛装用于检测的探针或引物的容器，盛装洗涤剂(如磷酸缓冲液，Tris-缓冲液等)的容器，和盛装用于检测杂交探针，结合的抗体，扩增产物等试剂的容器。本领域普通技术人员将很容易地看到本发明描述的核酸探针可容易地与现有技术中已知的已建立的试剂盒程式相结合。Ⅳ．含有AUR-1和／或AUR-2核酸分子的DNA构建体和含有这些构建体的细胞。
本发明也涉及一种重组DNA分子，它从5’至3’包括能够在宿主细胞中起始转录的启动子和上述核酸分子。此外，本发明涉及一种含有一种载体和上述核酸分子的重组DNA分子。本发明也涉及一种核酸分子，它含有一种在细胞中具有功能的转录区段，一种与编码相应于上述多肽的氨基酸序列的RNA序列相互补的序列，和一种在细胞中具有功能的转录终止区段。上述分子可以是分离的和／或纯化的DNA分子。
本发明也涉及一种含有上述核酸分子并从而能够表达一种肽的细胞或生物体。该多肽可以从被进行了改造以表达该多肽的细胞中纯化出来。一种细胞当它通过遗传操作进行改造以产生它在正常情况下不产生的蛋白质或在正常情况下以低水平产生该蛋白质时被称作“被改造以表达所需的蛋白质”。本领域普通技术人员可容易地调整程序，以在真核或原核细胞中引入并表达基因组、cDNA或合成序列。
一种核酸分子，例如DNA，如果它含有的核苷酸序列含有转录和转译调节信息并且这种序列为“可操纵地连接”于编码一种多肽的核苷酸序列上，即被称作是“能够表达”一种多肽。可操纵连接是一种连接，其中调节DNA序列和寻求表达的DNA序列的连接方式允许基因序列的表达。基因序列表达所需的调节区段的准确性质在不同的生物之间不相同，但一般包括一启动子区段，该启动子区段在原核细胞中含有启动子(它的作用是起始RNA转录)以及当转录成RNA后即起始合成的DNA序列。这些区段通常包括那些参与转录和转译起始的5’-非编码序列，如TATA盒，加帽序列(capping sequence)，CAAT序列等。
如果需要，编码AUR-1和／或AUR-2基因序列3’侧的非编码区段可通过上述方法获得。该区段可以保留其转录终止调节序列，如终止和聚腺苷酸化。这样，通过保留自然状态下与编码AUR-1和／或AUR-2基因的DNA序列相邻接的3’-区段，可以提供转录终止信号。当在宿主细胞中该转录终止信号功能不佳时，可用在宿主细胞中具有功能的3’区段替换。
两个DNA序列(如启动子区段序列和AUR-1和／或AUR-2序列)被称为可操纵连接的条件是，如果该两个DNA序列之间连接的性质不会(1)引致移框突变的引入，(2)干扰启动子区段序列引导AUR-1和／或AUR-2基因序列转录的能力，或者(3)干扰AUR-1和／或AUR-2被启动子区段序列转录的能力。这样，如果一个启动子能够使一个DNA序列转录，则该启动子区段与该DNA序列为可操纵连接。因而，为了表达AUR-1和／或AUR-2基因，需要有由适当的宿主识别的转录和转译信号。
本发明包括AUR-1和／或AUR-2(或其功能衍生物)在原核或真核细胞中的表达。原核宿主细胞在一般情况下对于产生重组蛋白质来说非常有效和方便，因而为优选的AUR-1和／或AUR-2基因表达系统的一个类型。原核生物常常由各种品系的大肠杆菌作为代表，但也可使用其它的微生物品系，包括其它的细菌品系。
在原核系统中，可以使用一种质粒载体，该质粒载体含有来自与宿主相容的品种的复制位点和控制序列。适当的质粒载体的例子可以包括pBR322，pUC118，pUC119等；适当的噬菌体或噬菌体载体可以包括γgt10，γgt11等，适当的病毒载体可以包括pMAM-neo，pKRC等；更可取的是本发明选择的载体在选择的宿主细胞中具有复制的能力。
公知的原核宿主包括细菌，如大肠杆菌，杆菌，链霉菌，假单孢菌，沙门氏菌，沙雷氏菌等。但是在这些条件下，该多肽不被糖基化。该原核宿主必须与该表达质粒中的复制子和控制序列相容。
为了在原核细胞中表达AUR-1和／或AUR-2(或其功能衍生物)，必须将该AUR-1和／或AUR-2序列与具有功能的原核启动子进行可操纵连接。这一启动子可以是组成型的，或者最好为可调节型的(即可诱导或可抑制)。组成型启动子的例子包括噬菌体λ的int启动子，pBR322的β-内酰胺酶(β-lactamase)基因序列的bla启动子，和pPR325的氯霉素酰基转移酶基因序列的CAT启动子，等等。可诱导型原核启动子的例子包括噬菌体λ的主要的右和左启动子(PL和PR)，大肠杆菌的trp recA、λacZ、λacI，和gal启动子，枯草杆菌(Gilman等，基因序列3211-20(1984))的α-淀粉酶(Ulmanen等，微生物学杂志，162176-182(1985))和ζ-28-特异性启动子，杆菌的噬菌体启动子(Gryczan，杆菌的分子生物学Academic Press，Inc．，NY(1982))，和链霉菌启动子(Ward等，分子基因遗传学，203468-478(1986))。原核启动子已由GLICR(工业微生物技术杂志．，1277-282(1987))；Cenatiempo(生物化学68505-516(1986))；和Gottesman(遗传学年度评论，18415-442(1984))进行综述。
原核细胞中的正常表达也需要在基因序列-编码序列上游存在核糖体结合位点。这种核糖体结合位点由，例如，Gold等，(微生物学年度评论35365-404(1981))公开。控制序列、表达载体、转化方法等的选择有赖于用于表达该基因的宿主细胞类型的选择。本文所用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交换使用，并且所有这些称谓包括其子代。这样，术语“转化物”或“转化细胞”包括原代受试细胞和由此衍生的培养物，与传代的次数无关。应当认识到，由于有意或无意的突变，所有的子代在DNA内含物上可能不完全相同。但是，正如限定的那样，突变的子代具有与原始转化的细胞相同的功能。
可用于本发明的表达系统的宿主细胞没有严格限制，只要它们适用于本发明的感兴趣的AUR-1和／或AUR-2肽的表达。适用的宿主可通常包括真核细胞。优选的真核宿主包括，例如，酵母、真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞，它们或是在体内，或是在组织培养物中。可以用作宿主的哺乳动物细胞包括HeLa细胞，来源于成纤维细胞的细胞，例如VERO或CHO-K1，或淋巴来源的细胞和它们的衍生物。优选的哺乳动物宿主细胞包括SP2／0和J558L，以及成神经细胞瘤细胞系如IMR332，它具有更强的正确转译后加工能力。
此外也可使用植物细胞作为宿主，与植物细胞相容的控制序列已可得到，例如花椰菜花叶病毒35S和19S，以及胭脂碱合成酶启动子和聚腺苷酸化信号序列。另一种优选的宿主为昆虫细胞，例如果蝇幼虫。用昆虫细胞作为宿主，可使用果蝇乙醇脱氢酶启动子。Rubin，科学2401453-1459(1988)。或者，可将杆状病毒(baculovirus)载体进行遗传改造以在昆虫细胞中表达大量的AUR-1和／或AUR-2(Jasny，科学2381653(1987))；Miller等，遗传工程(1986)，SetloW，J．K．，等编，Plenum，第8卷，第277-297页。
可使用一系列的酵母基因序列表达系统中的任何一种，它整合了来自活跃表达的编码糖酵解酶的基因序列的启动和终止元件，当酵母在富含葡萄糖的培养基中生长时该糖酵解酶会大量产生。已知的糖酵解基因序列也可提供非常有效的转录控制信号。酵母也可进行转译后肽修饰，这提供了相当有利的条件。存在一些重组DNA策略，它们使用强的启动子序列和高拷贝数的质粒，这些质粒可在酵母中用于产生所需的蛋白质。酵母识别克隆的哺乳动物基因序列产物上的引导序列并分泌携带引导序列的肽(即前肽)。对于哺乳动物宿主，已存在几种可能的载体系统以用于AUR-1和／或AUR-2的表达。
根据宿主的性质，可以使用品种繁多的转录和转译调节序列。该转录和转译调节信号可来源于病毒，如腺病毒，小牛乳头瘤病毒，细胞肥大病毒，猿猴病毒等，其中该调节信号与具有高水平表达的特定基因序列相联。或者，可以使用来自哺乳动物表达产物，如肌动蛋白、胶原蛋白、肌球蛋白等的启动子。可选用可允许抑制或激活的转录起始调节信号，以便可对该基因序列的表达进行调控。重要的是调节信号为温度敏感型，从而通过变换温度，表达可被抑制或被启动，或经受化学品(如代谢物)的调节。
AUR-1和／或AUR-2在真核宿主中的表达需要使用真核调节区段。这种区段一般来说包括一个启动子区段，该区段应足以引导RNA合成的启动。优选的真核启动子包括，例如，小鼠金属硫因Ⅰ基因序列的启动子(Hamer等，分子应用遗传学杂志1273-288(1982))；疮疹病毒的TK启动子(Mcknight，细胞31355-365(1982))；SV40早期启动子(Benoist等，自然(London)290304-310(1981))；酶母gal4基因启动子(Johnston等，美国科学院院刊796791-6975(1982)；Silver等，美国科学院院刊815951-5955(1984))。
真核mRNA的转译是在编码第一个甲硫氨酸的密码子开始的。由于这一原因，最好确保真核启动子和编码AUR-1和／或AUR-2(或其功能衍生物)的DNA序列之间的连接没有插入能够编码甲硫氨酸的密码子(即AUG)。这种密码子的存在或者导致融合蛋白的形成(如果AUG密码子与编码AUR-1和／或AUR-2的序列处于同一个阅读框中)或导致移框突变(如果AUG密码子与编码AUR-1和／或AUR-2的序列不处于同一阅读框)。
AUR-1和／或AUR-2核酸分子和可操纵连接的启动子导入受体原核或真核细胞的形式可以是非复制DNA(或RNA)分子，它可以是或者线性分子，或者最好是封闭共价环状分子。由于这种分子不能自动复制，基因的表达可以通过被导入序列的瞬间表达来进行。或者，通过被导入DNA序列与宿主染色体的整合可以进行永久表达。
可以使用能够将所需基因序列整合进宿主细胞染色体中的载体。在其染色体中已被稳定地整合进被导入DNA的细胞可通过也导入一个或多个标记基因来选择，该标记基因可对含有表达载体的宿主细胞进行选择。该标记基因可对营养缺陷型宿主提供原养，杀生物素抗性，如抗生素，或重金属，如铜等。该可选择标记基因序列可直接地与待表达的DNA基因序列相连，或者通过共转染被导入同一个细胞。对于单链结合蛋白质mRNA的最理想的合成来说也可能需要另外的元件。这些元件可以包括剪切信号，以及转录启动子，增强子和终止信号。整合了这些元件的cDNA表达载体包括由Okayama，在Molec．Cell Biol．，3280(1983)中描述的那些表达载体。
该被导入的核酸分子可被整合进能够在受体宿主中自动复制的质粒或病毒载体中。种类繁多的载体中的任一种均可用于这一目的。选择特定的质粒或病毒载体的重要因素包括应可容易地将含有该载体的受体细胞从不含有该载体的受体细胞中识别和分离出来；在特定的宿主中所需的载体的拷贝数；是否需要该载体能够在不同种类的宿主细胞之间“穿梭”。
优选的原核载体包括质粒，例如能够在大肠杆菌中复制的那些质粒(如，pBR322，ColEl，pSC101，pACYC184，πVX)。这种质粒公开于，例如，Sambrook分子克隆实验室手册，第二版，Sambrook，Fritsch，＆Maniatis编，Cold Spring Harbour Laboratory，(1989))。杆菌质粒包括pC194，pC221，pT127等。这种质粒公开于Gryczan(杆菌的分子生物学，Academic Press，NY(1982)，pp．307-329)。合适的链霉菌质粒包括pIJ101(Kendall等，微生物学杂志1694177-4183(1987))，和链霉菌噬菌体，如φC31(Chater等，第六届放线菌国际研讨会Akademiai Kaido，Budapest，Hungary(1986)，第45-54页)。假单孢菌质粒已由John等，(传染病评论8693-704(1986))和Izaki(日本微生物学杂志33729-742(1978)进行综述。
优选的真核质粒包括，例如，BPV，牛痘疫苗(Vaccinia)，SV40，2-微米环等，及它们的衍生物。这种质粒为公知的(Botstein等，迈阿密冬季研讨会19265-274(1982)；Broach，酵母菌的分子生物学生活周期和遗传，Cold Spring Harbour laboratory，Cold Spring Harbor，NY，第445-470页(1981)；Broach，细胞，28203-204(1982)；Bollon等，监床血液癌证学杂志1039-48(1980)；Maniatis，细胞生物学综合论文，第3卷，基因表达，Academic Press，NY，第563-608页(1980)。
制备出用于表达的载体或含有该构建体的核酸分子之后，可将该DNA构建体通过任一种适当方式导入合适的宿主细胞，即通过转化，转染，接合，原生质体融合，电穿孔，粒子枪技术，磷酸钙沉淀，直接显微注射等。载体导入之后，将受体细胞在选择培养基上生长，选择培养基选择出含有载体的细胞。该克隆的基因分子的表达导致AUR-1和／或AUR-2或其片段的产生。这可在这样转化的细胞中进行，或在这些细胞被诱导分化之后进行(如对神经母细胞瘤细胞等施用5-溴脱氧尿苷)。可使用多种温育条件来形成本发明的肽。最优选的条件为模拟生理环境的那些条件。Ⅴ．纯化的AUR-1和／或AUR-2多肽多种已知的方法均可用于获得本发明的肽。该肽可从自然状态下产生它细胞或组织中分离出来。或者，上述分离的核酸片段可被用来在任一种生物体中表达AUR-1和／或AUR-2蛋白质。本发明的样品包括细胞，细胞的蛋白质提取物或膜提取物，或生物液。根据检测程式，检测方法以及用作样品的组织，细胞或提取物性质的不同，该样品可有不同。
任一种真核生物体可被用作本发明肽的来源，只要这种原料生物体在天然状态下含有这种肽。本文所用的术语“原料生物体”是指产生该亚单位的氨基酸序列的原始生物体，与该亚单位在其中表达并最终从其中分离的生物体无关。
普通技术人员能很容易地按照已知的蛋白质分离方法来获得不含天然污染物的这种肽。这些包括，但不限于排除尺寸色谱法(Size-exclusion chromatography)，高压液相色谱法(HPLC)，离子交换色谱法，以及免疫亲和色谱法。Ⅵ．对AUR-1和／或AUR-2多肽具有结合亲和性的抗体和含有这种抗体的杂交瘤。
本发明涉及一种对AUR-1和／或AUR-2多肽具有结合亲和性的抗体。该多肽可具有如SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，或其功能衍生物，或其中至少9个相邻接的氨基酸(优选其中的至少20，30，35或40个相邻接的氨基酸)。
本发明也涉及一种对AUR-1和／或AUR-2多肽具有特异的结合亲和性的抗体。这种抗体可通过将其与AUR-1和／或AUR-2多肽的结合亲和性与其与另一种多肽的结合亲和性相比较来分离。那些对AUR-1和／或AUR-2有选择性的结合的抗体将被用于需要在AUR-1和／或AUR-2和其它多肽之间进行区分的方法之中。这种方法可包括，但不限于，分析在含有其它多肽的组织中AUR-1和／或AUR-2的表达发生变化的方法。
本发明的AUR-1和／或AUR-2蛋白质可被用于多种方法中，如用于产生抗体，以用于鉴别药物组合物，和用于研究DNA／蛋白质相互作用。
本发明的AUR-1和／或AUR-2肽可被用于产生抗体或杂交瘤。本专业普通技术人员将认识到，如需要一种抗体，将如本文所述生产出的肽用作免疫原。本发明的抗体包括单克隆和多克隆抗体，和这些抗体的片段，及其人源化形式。本发明抗体的人源化形式可通过使用已知方法之一产生，如嵌合成CDR移植。本发明也涉及产生上述单克隆抗体或其结合片段的杂交瘤。杂交瘤是一种能够分泌特定单克隆抗体的瘤化细胞系。
总之，制备单克隆抗体和杂交瘤的技术是公知的(Campbell，单克隆抗体技术生物化学和分子生物学实验室技术；Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands(1984)；St．Groth等，免疫学方法杂志351-21(1980))。任何一种已知可产生抗体的动物(小鼠，兔等)可用选择的多肽进行免疫。免疫方法是公知的。这种方法包括皮下和腹膜内注射该多肽。普通技术人员会意识到用于免疫的多肽的量将依受免疫动物、该多肽的免疫原性及注射部位的不同而不同。
为提高肽的免疫原性，可对其进行修饰或与辅药一起施用。提高多肽免疫原性的方法是公知的。这种方法包括将抗原与一种异源蛋白质(如球蛋白或半乳糖苷酶)相偶联或与辅药一起进行免疫。
对于单克隆抗体来说，切除被免疫动物的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞，如SP2／O-Ag／4骨髓瘤细胞相融合，使其成为产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。可使用多种公知方法中的任意一种来识别产生具有所需特征的抗体的杂交瘤细胞。这些方法包括用ELISA检测、Western印迹、或放射免疫检测来筛选杂交瘤(Lutz等人．，细胞研究实验，175109-124(1988))。将分泌所需抗体的杂交瘤进行克隆，抗体的类和亚类是用已知方法进行确定的(Campbell，单克隆抗体技术生物化学和分子生物学实验室技术，同上文献(1994))。
对于多克隆抗体来说，将含有抗体的抗血清从被免疫动物中分离出来，然后使用上述方法之一筛选具有所需特异性的抗体。对上述抗体可进行可检测标记。抗体可通过下述方式进行可检测标记放射性同位素，亲和标记(如生物素、抗生物素蛋白等)，酶标记(如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等)，荧光标记(如FITC或罗丹明等)，顺磁性原子等。进行这种标记的方法是公知的，如，参见(Stemberger等，组织化学和细胞化学杂志18315(1970)；Bayer等．，酶学方法，62308(1979)；Engval等，免疫学，109129(1972)；Goding，免疫学方法杂志13215(1976))。本发明的被标记的抗体可被用于体外，体内和原位检测，以识别表达特定肽的细胞或组织。
上述抗体也可被固定于一种固相支持物上。这种固相支持物的例子包括聚碳酸脂，复合碳水化合物，如琼脂糖和琼脂糖凝胶，丙烯酸树脂，如聚丙烯酰胺和胶乳珠。将抗体与这种固相支持物相偶联的技术是公知的(Weir等，实验免疫学手册，第4版，Blackwell ScientificPublications，Oxford，England，第19章(1986)；Jacoby等，酶学方法34，Academic Press，N．Y．(1974))。本发明的固化的抗体可被用于体外、体内及原位检测以及免疫层析。
而且，本专业普通技术人员可容易调整现有的方法，以及上文所述的有关抗体的技术，方法和试剂盒，目的在于产生设计合理的抗肽的肽类来生产能够与特定的肽序列相结合的肽，其例子请参阅Hurby等，合成肽的应用反义肽，合成肽，使用手册，W．H．Freeman，NY，第289-307页(1992)，和Kaspczak等，生物化学289230-8(1989)。
抗肽的肽类可通过将AUR-1和／或AUR-2肽序列中存在的碱性氨基酸残基用酸性残基替换，同时保留疏水性的和不带电荷的极性基团来制备。例如，赖氨酸、精氨酸、和／或组氨酸残基被无冬氨酸替换，或谷氨酸和谷氨酸被赖氨酸、精氨酸或组氨酸替换。Ⅶ．基于检测AUR-1和／或AUR-2的方法和试剂盒的抗体本发明包括检测样品中AUR-1和／或AUR-2多肽的方法，包括(a)在使免疫复合体形成的条件下将样品与上述抗体接触，和(b)检测与该多肽结合的所说抗体的存在。详细地说，该方法包括将测试样品与本发明的一种或多种抗体一起温育，并检测该抗体是否与测试样品结合。样品中AUR-1和／或AUR-2的水平与正常水平相比较发生了变化可能表明疾病的发生。
用于抗体和测试样品温育的条件各不相同。温育条件依赖于所使用的测试的程式、所使用的检测方法和测试中使用的抗体的类型和性质。普通技术人员会认识到通常可使用的免疫程式中的任一种(如放射免疫测试，酶联免疫吸附测试，diffusion based ouchterlony，或火箭免疫荧光检测)能很容易地使其适用于本发明的抗体。这种检测方法的例子请参阅Chard，放射免疫和相关技术简单，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands(1986)；Bullock等，免疫细胞化学技术，Academic press，Orlando，FL Vol．(1982)，Vol．2(1983)，Vol．3(1985)；Tijssen，酶免疫检测的实践和理论，生物化学和分子生物学技术，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，TheNetherlands(1985)。
本发明的免疫检测样品包括细胞，细胞的蛋白质或膜提取物，或生物液如血液，血清，血浆或尿。用于上述方法的测试样品按照检测程式，检测方法以及用作待测样品的组织，细胞或提取物的不同而不同。制备细胞的蛋白质提取物或膜提取物的方法为公知的，并且可容易地进行调整以获得可用于本系统的样品。
试剂盒含有所有为进行前述检测方法的试剂。该试剂盒可以包括(ⅰ)含有上述抗体的第一容器，和(ⅱ)第二容器，它含有包括该抗体的结合对应物和标记物的结合物。在另一个优选实施方案中，该试剂盒还含有一个或多个其它容器，它们包括一个或多个下述产品洗涤剂和能够检测结合抗体存在的试剂。
检测试剂的例子包括，但不限于标记的第二抗体，或者，如果第一抗体是标记的，能够与该标记抗体反应的发色的、酶的、或抗体结合的试剂。该分隔式试剂盒可以如同上述核酸探针试剂盒。普通技术人员可容易认识到本发明所述的抗体很容易同已知的试剂盒程式结合在一起。Ⅷ．与AUR-1和／或AUR-2相互作用的化合物的分离本发明也涉及一种检测能够与AUR-1和／或AUR-2多肽相互作用的化合物的方法，包括将该化合物与AUR-1和／或AUR-2一起温育，并检测与AUR-1和／或AUR-2相结合的化合物的存在。该化合物可能存在于一个复杂混合物中，如血清、体液、或细胞提取物。
本发明涉及一种检测AUR-1和／或AUR-2活性或AUR-1和／或AUR-2结合对应物活性的兴奋剂或颉颃剂的方法，包括在一种化合物的存在下温育产生AUR-1和／或AUR-2的细胞并检测AUR-1和／或AUR-2活性或AUR-1和／或AUR-2结合对应物活性水平的变化。经这种方式鉴定的化合物将产生一个表明该化合物存在的活性变化。该化合物可能存在于一个复杂混合物中，例如，血清、体液、或细胞提取物中。一旦该化合物被鉴别，即可用公知的技术将其分离出来。
本发明也包括一种兴奋(刺激)或颉颃哺乳动物中与AUR-1和／或AUR-2相关活性的方法，包括给所说哺乳动物施用一种对AUR-1和／或AUR-2的兴奋剂或颉颃剂，施用量应足以产生兴奋效应或颉颃效应。一种用AUR-1和／或AUR-2相关活性的颉颃剂或兴奋剂治疗哺乳动物疾病的方法，包括对哺乳动物施用该兴奋剂或颉颃剂，其施用量足以兴奋或颉颃AUR-1和／或AUR-2相关的功能。该方法也包括在本发明的范围内。Ⅸ．转基因动物生产与本发明相关的转基因动物的方法已有多种可以使用。在雄性和雌性细胞核融合前将DNA注射进受精卵的前核中，或者在细胞分裂起始之后注射进胚胎细胞核中(例如，两细胞胚胎的核中)(Brinster etal．，美国科学院院刊82，4438-4442(1985))。可用修饰的病毒，特别是反转录病毒转染胚胎，该修饰的病毒携带有本发明的无机离子受体核苷酸序列。
来自胚胎内细胞群并在培养中稳定化的多能干细胞可在培养中进行遗传操作，以整合进本发明的核苷酸序列。转基因动物可通过将这种细胞植入一个移植进养母的胚胞并使其完成孕期来生产。适用于转基因动物实验的动物可通过标准商业途径获得，如Charles River(Wilmington，MA)，Taconic(Germantown，NY)，Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)等。
对啮齿类动物胚胎进行遗传操作的方法和将DNA显微注射进合子的前核的方法是公知的(Hogan et al．，文献同上)。对鱼类，两栖类卵和鸟类进行显微注射的方法在文献(Houdebine和Chourrout，实验47897-905(1991))中有详细描述。将DNA导入动物组织的其他方法描述于美国专利NO．4945050(Sandford等，1990年7月30日)。
顺便举一例，为生产转基因鼠，诱导雌性小鼠，使其排卵过度。将雌性和雄性放在一起，将交配的雌性用CO2窒息或断颈法将其杀死，从切开的输卵管中取出胚胎。除去周围的丘细胞(Cumulus cell)。将前核胚胎洗净并贮存起来，直至进行显微注射。将随机循环的成年雌性小鼠与输精管切除的雄性交配。受体雌性与供体雌性被同时交配。然后将胚胎进行手术转移。生产转基因大鼠的方法与生产转基因小鼠的方法相似。参见Hammer等，细胞631099-1112(1990)。
培养胚胎干细胞(ES)的方法以及随后的使用电穿孔法，磷酸钙／DNA沉淀法和直接注射法将DNA导入ES细胞来生产转基因动物的方法均为公知技术。参见，例如，畸形癌和胚胎干细胞，一种实用方法，E．J．Robertson，ed．，IRL Press(1987)。
在涉及随机基因整合的情况下，将含有本发明序列的克隆与编码抗性的基因进行共传染。或者，将编码新霉素抗性的基因与本发明的基因物理地连接在一起。所需克隆的传染和分离可通过公知的几种方法之一来进行(E．J．Robertson，文献同上)。
导入ES细胞的DNA分子也可通过同源重组被整合进染色体。参见文献(Capecchi，科学2441288-1292(1989)。对重组发生(即neo抗生)的正选择的方法和双重正负选择(即neo抗性和gancyclovir抗性)的方法以及随后的通过PCR对所需克隆的识别的方法已描述于Capcchi，文献同上，和Joyner等，自然338153-156(1989)，其内容引入本文作为参考。该方法的最后阶段是将靶ES细胞注射进胚胞内并将该胚胞转移进假怀孕雌性体内。培育所产生的嵌合动物，将其子代通过Southern印迹进行分析，来鉴别携带该转基因的个体。生产非啮齿动物和其它动物的方法已由他人描述。见Houdebine和Chourrout，文献同上；Pursel等，科学，2441281-1288(1989)；和Simms等，生物技术6179-183(1988)。
这样，本发明提供了转基因的非人类的哺乳动物，它含有编码AUR-1和／或AUR-2多肽的转基因或使AUR-1和／或AUR-2表达的基因。这种转基因非人类转基因哺乳动物可被用作体内测试系统，来研究AUR-1和／或AUR-2多肽导入的效果，AUR-1和／或AUR-2多肽表达调节的效果(即通过导入额外基因、反义核酸、或核酶)。
“转基因动物”是一种具有一种细胞的动物，该细胞含有人工插入细胞的DNA，所说的DNA成为由这种细胞发展而来的动物的基因组的一部分。优选的转基因动物为灵长类、小鼠、大鼠、牛、猪、马、山羊、绵羊、狗和猫。该转基因DNA可以编码人的AUR-1和／或AUR-2多肽。在一种动物中的天然表达可以通过提供一种对降低该受体的表达有效量的反义RNA或DNA来降低。Ⅹ．基因治疗AUR-1和／或AUR-2或其遗传序列也可被用于基因治疗(见综述Miller，自然357455-460，(1992))。Miller称，在对人类基因治疗的实用方面已取得进展，已显出积极的初步结果。基因治疗的基本原理描述于Mulligan，科学260926-931，(1993)。
在一优选实施方案中，一种含有AUR-1和／或AUR-2编码序列的载体被插入细胞，该细胞被培养在体外，然后大量注入病人体内。在另一个优选实施方案中，将一个含有精选的启动子(如一种强启动子)的DNA片段转入含有一种外源AUR-1和／或AUR-2的细胞中，其转入方式使该启动子片段增强该外源AUR-1和／或AUR-2基因的表达(例如，该启动子片段被转入细胞中并使它直接与该外源AUR-1和／或AUR-2基因相连)。
基因治疗可以涉及一种靶击肿瘤的腺病毒的使用，该腺病毒含有AUR-1和／或AUR-2 DNA，通过向适当组织中植入工程细胞、注射AUR-1和／或AUR-2病毒、或注射裸露的AUR-1和／或AUR-2 DNA提高全身的AUR-1和／或AUR-2。
靶细胞群体可通过导入该蛋白质复合体中一个或多个成分的变型而被修饰，以求调节这种复合体的活性。例如，通过降低或抑制靶细胞内一种复合成分的活性，一个导致疾病的反常信号转导事件就可能会被降低、受抑制、或逆转。一个成分的缺失或错义突变，该突变保留了它与该蛋白质复合体中其它成份相互作用的能力，但不能发挥信号传导功能，可被用来抑制一个反常的、有害的信号传导事件。
来自病毒的表达载体，如逆转录病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、疮疹病毒、几种RNA病毒，或小牛乳头瘤病毒，可被用来将编码重组AUR-1和／或AUR-2蛋白质的核酸序列运送至靶细胞群中(如肿瘤细胞)。可用公知的方法构建含有编码序列的重组病毒载体。参见例如，Maniatis等，分子克隆实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，NY(1989)和Ausube1等，现代生物学方法，Greene PublishingAssociates and wiley Interscience，N．Y．(1989)。或者，编码蛋白质序列的重组核酸分子可被用作裸露DNA或用于重新构成系统，如用于转送至靶细胞的脂质体或其它脂系统(参见，例如，Felgner等，自然337387-8，1989)。已存在有几种其它方法将质粒DNA直接输入细胞内，以用于人类基因治疗，并涉及通过将该质粒DNA与蛋白质进行复合，用该DNA靶击细胞上的受体。参见Miller，文献同上。
在最简单的方式中，基因转移可通过显微注射方法简单地将微量的DNA注射进细胞核中来进行。Capecchi MR，细胞，22479-88(1980)。一旦重组基因被导入细胞，定们可被细胞的正常机制识别，进行转录和转译，并表达基因产物。其它方法也曾试图将DNA导入大量的细胞内。这些方法包括转染，其中DNA与CaPO4一起被沉淀并通过胞饮作用被导入细胞(见文献Chen C．and Okayama H，分子细胞生物学72745-52(1987))；电穿孔，其中细胞被暴露于高压脉冲并在膜上形成小洞(见文献Chu G．等，核酸研究，151311-26(1987))；脂质体转染／脂质体融合，其中DNA被包装进亲脂载体中并与靶细胞融合(见文献Felgner PL．等，美国科学院院刊847413-7(1987))；和使用结合在小枪弹上的DNA微粒轰击法(见文献Yang NS．等，美国科学院院刊，879568-72(1990)。另一种将DNA导入细胞的方法是将DNA与化学修饰的蛋白质相偶联。
腺病毒蛋白质已显示能够使核内体不稳定，并增强细胞对DNA的摄取。将腺病毒与含有DNA复合体的溶液混合，或者将DNA与使用蛋白质交联剂与腺病毒共价连接的聚赖氨酸相结合大大改善了重组基因的摄取和表达。参见文献Curiel DT等，美国呼吸细胞分子生物学杂志6247-52(1992)。
本文所用“基因转移”是指将外源核酸分子导入的细胞内的过程。为使由基因编码的特定产物能够表达，常常进行基因转移。该产物可包括蛋白质，多肽，反义DNA或RNA，或酶活性RNA。基因转移可在培养细胞中进行或直接施用给动物。通常基因转移涉及的过程包括核酸通过非特异性或受体介导的相互作用与靶细胞相接触，通过膜或通过胞吞作用摄取核酸进入细胞，核酸从质膜或核内体被释放进胞质中。此外，表达可能需要核酸转移至细胞核中并与适当的核因子结合进行转录。
本文所说的“基因治疗”是基因转移的一种形式，并包括在本文所用的基因转移的概念中，以处尤其指从体内细胞或体外细胞中表达一种治疗性产品的基因转移。基因转移可在体外的细胞上进行，然后将其移植到病人体内，或者可以通过将核酸或核酸蛋白质复合体直接施用给病人。
在另一个优选实施方案中，所提供的载体具有编码AUR-1和／或AUR-2的核酸序列，其中该核酸序列仅在特定的组织中表达。获得组织特异性基因表达的方法描述于国际申请NO．WO 93／09236，申请日1992年11月3日，
公开日1993年5月13日。
在前述的所有载体中，本发明的另一方面所提供的含在该载体中的核酸序列在该核酸的某些或全部核酸序列中可以包括增加、缺失或修饰，如上文定义的。
在另一个优选实施方案中，提供了一种基因替换的方法。本文所说的“基因替换”是指提供一种能够在动物体内表达的核酸序列，从而提供或增强一种在动物体内或缺陷的内源基因的功能。
实施例下述的实施例是非限定性的，仅是本发明各种特征的代表。下文的实施例描述了新的蛋白质AUR-1和／或AUR-2的分离和表征。
蛋白质激酶是真核蛋白质中最大的家族之一，具有几百个成员。这些蛋白质共同享有一个250-300个氨基酸的区域，该区域可被细分成12个含有共同催化核心结构的截然不同的亚区域。这些保守的蛋白质基序最近使用导致该已知的激酶大量扩增的PCR克隆策略而被开发出来。蛋白质激酶催化区域的序列校准排列的多重性及随后的系统分析使它们之间相互分离成一个系统树。以这种方式，相关的激酶被聚集在不同的分枝或亚群中，它们包括酪氨酸激酶、环核苷酸依赖的激酶、钙／钙调素激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶和MAP-激酶，以及几种其它较少表征的亚群。
我们是从鉴定CCK4的同系物开始的。它是一种代表酪氨酸激酶的一个独特的家族的受体。多重校准排列提示CCK4与受体酪氨酸激酶的ROS和TRK家族最为相关。我们设计了针对这些受体的激酶亚区域Ⅰ和Ⅸ中保守序列的简并引物。亚区Ⅰ位激酶区域的N-末端，并含有共有基序GXGXXGXV，它参与了ATP对所有种类激酶的催化单元的锚着，亚区域Ⅸ含有一个近乎常量的ASP，它通过与亚区域VIB中残基的结合起着稳定催化环的作用。该常量ASP和侧接氨基酸常被用于PCR克隆策略中，因为它将酪氨酸激酶(DWSY／FGI／V)与丝氨酸／苏氨酸激酶(DXWA／SXGI／V)区分开来。基于对所有已知的蛋白质激酶的比较，我们设计了针对亚区域Ⅰ和Ⅸ的简并寡核苷酸引物，它们通过PCR仅扩增CCK4及其鸡同系物KLG。
基于CCK4激酶区域内保守的残基，我们设计了简并引物A和DVW，以用于使用聚合酶链式反应(PCR)鉴别新的激酶。当使用HEPM细胞的sscDNA作为模板时，分离出了多拷贝的CCK4以及一个与其它激酶具有同源性的567bp的新的DNA片段(43-43)。该新的序列最接近于果蝇aurora激酶(基因库查阅号#X83465)并将该克隆称作人的Aurora1。将这一片段用作探针，我们筛查了来自一些结肠癌细胞系的RNA和人的多组织Northern印迹，发现Aurora1在肿瘤细胞中的表达明显具有选择性。
也将该Aurora1探针用于筛选一个从人胰癌细胞系mRNA构建的cDNA文库，以分离覆盖Aurora1完全开放阅读框的交迭克隆。在分离的多个克隆中，7个相应于人的Aurora1。两个额外的微弱杂交的克隆在这一筛选过程中也被分离出来，序列分析表明它们相应于一个相关的但完全不同的激酶，我们称之为人的Aurora2。
在COS细胞中表达的重组AURORA1和AURORA2以39000和46000的表观分子量泳动，这与基于其一级结构推测的分子量39264和46730相一致。这一分析证实了该重组蛋白质可以在哺乳动物细胞中被稳定产生。对这一推测的激酶确定靶特异性磷酸化测试正在进行中。
已在兔中产生了针对来自AUR1和AUR2的N-末端区域的肽序列具有特异性的免疫反应剂，并将这些反应剂用于在细胞内定位内源的和重组的Aurora的表达。而且，这些试剂可被用于鉴别该Auroro的底物，以更好地理解它们正常的生物学功能。
AUR-1和／或AUR-2的显性阴性和组成型活动形式可用于描述这些推测的丝氨酸／苏氨激酶的提供和过量表达的生物学后果。用改变的DNA构建体的初始研究表明，用AUR-1和／或AUR-2逆转录病毒原种感染NIH3T3或BALB／373细胞后仅2个小时内，这些细胞就变成了多核的。这一表型持续下来，以致于感染2天后，发现一些细胞具有多达20个核。这些多粒细胞一般具有增多的细胞质和散开的细胞界限。用肌动蛋白和DAPI二者进行免疫染色，证实了这些细胞核全部被包含于一个单个细胞中，并且肌动蛋白细胞骨架明显处于正常状态。正在进行的实验将试图阐明细胞核内染色体的含量的完整性，中心体的数量和位置，以及微管网络的总体组织形式。
对AUR-1和／或AUR-2正常的组成型活性和显性阴性表达的长期效应的特性正在研究之中，尤其是它们是否诱导或逆转细胞转化。表达这些重组蛋白质的稳定克隆正在分离之中。它们将用生长速率、DNA合成、细胞接触抑制(焦点形成)、锚着不依赖性生长(软琼脂测试)、和裸鼠中肿瘤引发性来表征。
在哺乳动物中心体复制和分离中Aurora起什么作用呢 已知这一功能的阻断和下调在酵母、果蝇和两栖类中，会导致染色体分离错误，单极纺锤体和核的不均衡分裂。在人Aurora和酵母IPL1和果蝇aurora之间的同源性令人震惊。因此我们急需评估人aurora是否酵母IPL1的功能等同物。酵母IPL1对于在发面酵母(Saccharomyces cerevisiae)中高忠实性染色体分离是必需的(见义献Francisco，L．et al，Mol，CellBiol．，144731-4740，1994)，并分离到一个温度敏感性突变体。我们计划确定是否各种全长嵌合型的人Aurora可与酵母中的这一温度敏感性互补。含有IPL1的N-末端和人Aurora的激酶区域的嵌合构建体将使我们能够确定该激酶是否功能等同，同时避开了由较低保守性的N-末端区域介导的潜在的调节或胞内定位作用。如果该人类基因弥补了IPL1所缺乏的功能，然后我们可以使用这一细胞系来筛选人aurora激酶的小分子抑制物。实施例1分子克隆使用Chomczynski和Sacchi和胍盐／酚抽提方法(见文献P．Chomczynski和N．Sacchi，生物化学年报，162，156(1987))，从正常人前列腺、十二指肠、卵巢、肝、垂体、脑、胸腺、和唾液腺，从人HEPM细胞(腭间质)，从人原发肾胚胎瘤和卵巢癌，和从来自结肠／直肠(HT29，SW480，SW1463，SW1417，SW837，SW948，SW620，SW403，SW1116，T84，HTC15，LS123和Caco-2)，肾脏(CaKi-1，CaKi-2)，肝脏(SK-HEP-1)，胰脏(HS766T，ASPC，Capan-1)，和乳房(MCF7)人肿瘤细胞系中分离总RNA。
将这些RNA用作模板，使用单链合成的指数扩增系统试剂盒(购自GibcoBRL，生命技术，U．S．A Gerard，GF等，(1989)，焦点11，66)，在制造商建议的条件下制备单链cDNA。一个典型的反应在60μl的反应体积中使用了10μg总RNA或2μg poly(A)+RNA和1．5μg寡(dT)12-18。将产物用RNase H处理并用H2O稀释至100μl。对于随后的PCR扩增来说，每一反应中使用了1-4μl的sscDNA。
寡核苷酸是在一个Applied Biosystems 394 DNA合成仪上合成的，使用的是已建立的氨基磷酸脂化学方法，并在用乙醇沉淀后以其非纯化形式使用。简并寡核苷酸引物为A=5’-GARTTYGGNGARGTNTTYYTNGC-3’(SEQ ID NO16)(有义链)和DVW=5’-AGNACNCCRAANGCCCACACRTC-3’(SEQ ID NO17)(反义链)。
这些引物分别来自肽序列EFGEVFLA(SEQ ID NO18)(有义链来自激酶亚区域Ⅰ)和DVW(A／S)FGVL(反义链来自激酶亚区域Ⅸ)。简并核苷酸残基的名称为N=A，C，G或T；R=A或G，和Y=C或T。使用CCK4作为模板，这些引物产生了一个567bP的产物。
使用引物A和DVW及上列的单链原料进行PCR反应。加入的每一种引物的终浓度为5μm，混合物中含有10μm，Tris HCl(pH8．3)，50μm KCl，1．5μmMgCl2，200μm的每种脱氧核苷三磷酸，0．001％明胶，和1．5单位的AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer／Cetus)，和1-4μl cDNA。在95℃变性3分钟后，循环条件前3个循环为94℃30秒，37℃1分钟，2分钟提升至72℃，和72℃1分钟，然后94℃30秒，50℃1分钟和72℃1分钟45秒进行35个循环。将2％琼脂糖电泳胶上500-600bp之间的PCR片段分离，使用的是GeneClean(BiO101)，并按照制造商的说明T-A克隆至PCRⅡ载体(Invitrogen Corp．USA)中。
使用Qiagen核对选择的菌落进行微质粒DNA制备，并使用循环测序染料一终止物试剂盒和AmpliTaq DNA聚合酶，FS(ABI，Foster City，CA)对该质粒DNA进行测序。将测序反应产物在ABI Prism 377DNA测序仪上电泳，并用BLAST校准排列规则系统进行分析(见文献Altschul，S，F，et等，分子生物学杂志，215403-10)。通过使用引物A和DVW以及来自人胚胎腭间质(HEPM或CRL1486)的单链cDNA作为模板分离到一个新的克隆(#43-43)。该克隆随后被称为人的Aurora1一个片段。
使用一种mRNA作为模板进行第一链cDNA合成构建了一个λZapⅡ(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)cDNA文库，该mRNA来自一个胰癌细胞系的集合物。将噬菌作用随机引发的32P标记的插入物在硝酸纤维素膜上进行筛选，该插入物来自编码人的λAurora1的p43-43，杂交缓冲液的计数为2×1O6cpm／ml，该杂交缓冲液含有6×SSC，1×Denhardt’s试剂，0．1％SDS，以及0．1mg／ml片段化的鲑精DNA。65℃杂交过夜之后，将滤膜在0．1×SSC，0．1％SDS，65℃下洗涤。在两条链上对全长cDNA克隆进行测序，使用的是T7聚合酶和寡核苷酸引物的手工测序(见文献Tabor和Richardson，美国科学院院刊844767-71)。实施例2Northern印迹分析Northern印迹含有来自16个不同的成人组织(脾、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、结肠粘膜、心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、胰脏、和外周血白细胞)，血种不同的胎儿组织(脑、肺、肝和肾)，和8种人癌细胞系(HL60，HeLa，K-562，MOLT-4，Raji，SW480，和G361)和每泳道2μg poly A+RNA。它是在电荷改性的尼龙膜上，得Clontech(PaloAlto，CA)。另外的Northern印迹的制备是通过将l0μg分离自人肿瘤细胞系的总RNA在变性甲醛1．2％琼脂糖凝胶上电泳并转移至尼龙膜上来进行的。
将滤膜用随机引发的[32p]dCTP-标记的探针进行杂交，该探针是从来自人的Aurora1克隆43-43的527bp插入物和来自pSG20的1162bp的EcoRI片段中二者之一，和从人的Aurora2克隆11-1A的1kb EcoRI片段和来自pS621的1257bp BamHI-Notl片段中二者之一合成的。杂交是在60℃在6×SSC，0．1％SDS，1×Denhardt’s溶液，100mg／ml变性的鲱鱼精DNA以及1-2×106cpm／ml的32P-标记的DNA探针中过夜进行的。将该滤膜在0．1×SSC／0．1％SDS中，65℃下洗涤，并在Kodak XAR-2胶片上曝光。
鉴别到一个约1．4kb的单一的AUR1 mRNA转录物，并发现它在胸腺和小肠中大量存在，而在精巢、卵巢、结肠、胎盘和脾中信号很弱。前列腺和外周血淋巴细胞为阴性。人胎儿肝和肾也为阴性，在胎儿肺中信号很弱，在胎儿脑中没有表达(见表)。
对人AUR2表达进行类似分析的结果显示其表达的范围更窄。一个单一的2．4kb AUR2转录物在成人精巢和胸腺中被强烈地检测到，在心、胎和骨骼中以及胎儿肝和肾很弱，而其它来源的正常组织为阴性(见表)。
在人正常组织和癌细胞中对AUR-1和AUR-2的Northern分析
ND没有检测在几种原发肿瘤和多种肿瘤来源的多细胞系中对AUR1 mRNA表达图谱通过Northern分析和通过使用来自AUR1激酶区域中序列的引物的半定量PCR检测进行确定。结果示于表中。在每一种检测的肿瘤细胞系中在下述细胞系中检测到AUR1转录物具有最高的表达值几种人结肠癌细胞系(SW480，Colo320，SW620，SW1417，Caco2，SW12417)和肺癌(Calu3)，乳腺癌(T47D，MCF7)，黑素瘤(A375)，肾癌(Caki-1，CaKi-2)，肝癌(SK-HEP-1)，和中性肿瘤(SF767，T98G)。在其它结肠癌中观察到较低的AUR1表达(HTC15，T84，SW948，SW1116，HT29)，中性肿瘤(Daoy)，卵巢癌(Ovcar3，原发癌)，胰癌(HS766T)，和原发肾癌。
在肿瘤细胞系中AUR2表达的图谱比AUR1窄得多。仅在结肠癌细胞系(Caco2，SW480，SW1417，SW620)中观察到AUR2的强表达，而在其它结肠(HTC15，Colo320)，乳腺(T47D，MCF7)和肺(Calu3)肿瘤细胞系中观察到弱的信号。几种其它种瘤细胞系中检测不到AUR2转录物。实施例3AURORA1的半定量PCR检测从许多人的细胞系、新鲜冷冻组织和原发肿瘤中分离出RNA。从10mg上述每种RNA，使用Superscript Preamplification System(GibcoBRL)合成单链cDNA。然后将这些单链模板用于35循环的PCR反应，使用两种AUTORA Ⅰ特异性寡核苷酸(34765’TTTGGCTCGGGAGAAGAAAAGCCAT-3’(SEQID NO19)，和35065-CAATACTCTGGGGGCAGGTAGT-3’)(SEQ ID NO20)。将反应产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，用溴乙锭染色并在UV光盒中光摄影。对每一样品的约475bp AURORA1特异性带的相对强度进行评估。实施例4Southern印迹分析用标准方法(Maniatis et al．，)，从各种转化的人细胞系(Caco2，HTC15，LS147，SKCO4，SW480，SW403，SW620，SW948，SW1417，SW1116，MCF7，BT474)分离基因组DNA。将细胞用胰蛋白酶处理，用PBS洗涤，并以约108细胞／ml的浓度重新悬浮于消化缓冲液(100mM NaCl，10Mm TrispH8，25mM EDTA，pH8，0．5％SDS，0．1mg／ml蛋白酶K)。将细胞在50℃温育12小时进行裂解，然后用酚／氯仿提取并用等体积的7．5M乙酸氨和100％EtOH进行沉淀。将DNAs重新悬浮于TE缓冲液。用HindⅢ或XhoⅡ在37℃将约20微克基因组DNA消化至少4小时，然后在1％琼脂糖凝胶上分离。将DNA片段通过毛细转移方法转移至硝酸纤维素膜上(见文献Southern，EM，J．Mol．Bio．98503，1975)，并用人的Aurora1和Aurora2特异性探针按照上述的Northern印迹分析进行杂交。
DNA被HindⅢ酶，因AUR1和AUR2 cDNA二者均含有该限制性酶的单一位点。所有来源的AUR1均显示一个单一的4．3kb强度相等的带，提示它在所检测的多种肿瘤类型中是单一拷贝的非重排基因。但是，在低严谨条件下，我们能够检测到与AUR1探针微弱杂交的1．3kb和3．2kb的SacⅠ片段。克隆和序列分析表明，这一区段编码一个无内含子的AUR1相关的假基因(称作AUR3)，并具有多重移框突变。而且，紧接AUR3假基因的上游是一个具有复杂的反转重复区段，推测会形成一个稳定的发夹环。AUR3 DNA序列与从AUR1 cDNA的第一个核苷酸开始的AUR1具有同源性。坚持在这一位点上游，是推测的AUR3的发夹环。我们目前正在研究AUR1基因组克隆，以确定这一对AUR3的同源性是否从该核苷酸的上游继续下来，以及AUR1 cDNA是否包括或在其前面有一个类似的发夹环。从所有的来源中AUR2显示了在7．Okb和4．3kb的带以及一个模糊的约10kb的较高分子量的带。这些结果提示AUR2也为一单拷贝基因。在用AUR2探测的印迹上看的多重带可能是由于使用了全长cDNA探针的缘故。实施例5对人的AURORA1和AURORA2编码cDNA克隆的序列分析人的AURORA1和AURORA2的全部序列是从它们的全长克隆和从HEPM细胞分离的部分人AURORA1克隆确定的，这些全长克隆分离自人胰癌、正常人十二指肠文库。
1244bp的人Aurora1(AUR1-h)的核苷酸序列示于SEQ ID NO1或SEQID NO2，并包含一个编码344个氨基酸的多肽的单一开放阅读框。该AUR1-h编码区段由一个54核苷酸的5人非转译区段和一个132核苷酸的3’-非转译区段侧接，终止于聚(A)尾。
2198bp的人Aurora2(AUR2-h)核苷酸序列示于SEQ ID NO1或SEQID NO2，并含有一个编码403氨基酸的多肽的单一开放阅读框。该AUR2-h编码区段由一个200核苷酸的51’-非转译区段和一个768核苷酸的3’-非转译区段侧接。
从人胰脏肿瘤和正常人十二指肠两者中均对AUR1和AUR2 cDNA编成序列，除了一些可能的多态性位点外没有序列差异。这种模板两可的情况包括cDNA 核苷酸 注释AUR1 1174一个克隆具有聚A插入873在所有十指肠克隆中为T，在胰癌中为C469一个克隆中为T，其它均为C848一个克隆中为G，其它均为A-氨基酸E变换成G1097一个克隆中为G，两个其它克隆中为T956一个克隆中为G，两个其它克隆中为A295个克隆中剪切至103，5个克隆中没有剪切AUR2394一个克隆中为T，多个其它克隆中为C(氨基酸P变成L)396这 3个克隆中为A，多个其它克隆中为G(氨基酸Ⅴ变成Ⅰ)AUR1和AUR2的C-末端部分保留了作为真核蛋白质激酶的所有12个亚区域。该AUR1和AUR2激酶前面的N-末端区域分别为74和130氨基酸。该AUR1和AUR2核苷酸和推测的氨基酸序列(SEQ IDNO3或SEQ ID NO4)与可得到的DNA和蛋白质序列数据库的比较结果表明，除了几个EST序列享有高的序列一致性外它们是独特的。但它们在N-末端和催化区域中与果蝇aurora和发面酵母(SaccharomycesCerevisiae)ILP1基因具有惊人的同源性。而且，两个没有发表的数据库条目可能是来自在Xenopus Laevis的相近的同系物(p46 APK-GBaccession #217206和p46 BPK-GB aceession #217207)。
来自人、蛙、果蝇和酵母的Auroras的N-末端区域共有很有限的序列一致性。要求AUR2要有大量的常成对存在并通过单一残基分隔开的谷氨盐。
这些蛋白质催化区域相比较的结果表明，AUR1和AUR2具有7％氨基酸的一致性，与果蝇Aurora具有61％，与酵母IPL1基因具有4％。AUR2与该果蝇蛋白质具有60％氨基酸一致性，与酵母IPL1具有45％一致性。AUR1和AUR2两者与所有其它已知的哺乳动物激酶具有45％以下的一致性(最接近的是cAMP-依赖性蛋白质激酶A)，提示它们为这些果蝇和酵母激酶的同系物。
AUR1和AUR2二者均含有一个cAMP-依赖性蛋白质激酶磷酸代位点(AUR1的THR232和AUR2的THR288)，它们在果蝇和酵母同系物中是保守的，并且是一个在细胞周期蛋白-依赖性激酶p34cdc2中已知的调节位点。AUR2在SER342处含有一个额外的PKA位点。该两个蛋白质也具有多个Casein激酶Ⅱ(AUR1和AUR2分别为5个和6个)和蛋白质激酶C(AUR1和AUR2分别为4个和10个)磷酶化位点。AUR2也具有在TYK334处的单一酪氨酸磷酸化共有位点，它在果蝇Aurora中也是保守的，但不存在于AUR1或酵母IPL1中。
令人惊奇的是果蝇aurora AUR-dm和酵母IPL1基的自然突变物导致核的不均衡分裂，导致染色体分离错误，及不正常的单极纺缍体。这一表型好象产生于中心体分离失败。相关的微管构造好象没受影响。在果蝇和酵母二者靶氨基酸残基中的自然突变被严格地保留在这两种人的AURORA之间，进一步支持了它们可能是功能同系物。在AUR-dm或IPL1的自然突变物中发现的AUR1中相应的残基为GLU125、THR232、PRO312、HIS324。所有这些突变均位于催化区域之内，并且值得注意的是，有一个是代表着保守的PKA-磷酸化位点。在AUR-dm中于ASP47的一个额外的突变是在N-末端区域中的一个非保守残基上。
这些研究结果使人想到，该催化活性在低等生物中确实可能在中心体复制和分离的生物学中起着一个重要的作用，并想到人的Aurora在哺乳动物细胞中可能起一个补充的作用。实施例6AURORA1和AURORA2的重组表达表达载体构建通过PCR-协助的诱变制备表达构建体，其中AURORA1和AURORA2的整个编码区域的C-末端被连接上流感嗜血杆菌凝血素(hemophilusinfluenza hemaglutin，HA)抗原决定基YPYDVPDYAS(SEQ IDNO21)(Pati，1992)。将这些构建体导入两个哺乳动物表达载体pLXSNC(见文献Miller，A，D，& Rosman，G，J，Biotechniques 7，980-988，1989)，以制备出产病毒细胞系的生成；和pRK5，以进行瞬间表达分析。插入物被设计成由独特的BamHⅠ和NotⅠ位点侧接并在5’-BamHⅠ和3’-NotⅠ位点被直接克隆进pLXSN或pRK5。
该BamHⅠ-NotⅠ全长AUR1和AUR2构建体也被连接进pRS316(Liu，H．etal．Genetics 132665-673，1992)。该载体含有一个在着丝粒穿梭载体中的半乳糖-可诱导型启动子，以在发面酵母中表达。这是用来评估人的基因是否能互补相关的温度敏感型酵母IPL1突变体，它与AUR1密切相关。此外，也制备了含有与AUR1和AUR2基因的C-末端区域相融合的酵母IPL1的N-末端区域的融合构建体。这些是通过半人工ClaⅠ位点插入该激酶的激酶区域的5’-端，在保守的Asp-Asp-Phe-GLu序列中而产生的。
在pLXSN和pRK5二者中通过使PCR诱变将常量Lys(在AUR1和AUR2的氨基酸位置分别为106和162)突变成Met也制备了AUR1和AUR2的显性阴性AUR1和AUR2构建体。这些构建体被称为AUR1KM和AUR2KM。AUR1和AUR2的组成型活性形式是通过引导编码磷酸化位点(232和288)的DNA突变成Asp而进行的，产生AUR1TD和AUR2TD。
在pLXSN和pRK5二者中也制备了表达构建体，它们仅含有AUR1和AUR2N-末端的非催化区域。它们是通过PCR从其亲代构建体产生的，并含有AUR1的N-末端的77个氨基酸和和AUR2的132个氨基酸。
该不含有起始甲硫氨酸的完整AUR1和AUR2开放阅读框(没有HA-标签)通过PCR而产生，并被连接进pGEX载体，以通过细菌产生GST-融合蛋白质，用于免疫兔子，产生抗体。实施例7制备产病毒的AURORA细胞系为制备高滴度的病毒原种，将含有AUR1和AUR2基因的pLXSN重组构建体用CaCl2介导的转染转染进双嗜性辅助细胞系PA317。在G418上选择之后，将细胞在没有G418的培养在上铺板(500μg／ml)。将来自抗性细胞的上清液用于感染亲嗜性辅助细胞系GP+E86，并将细胞再在G418上选择。将抗性细胞再次除去G418，将每8-12小时收获的上清液集中在一起作为病毒原种(见文献RedemannN．，Holzmann，B．，Wagner，E．F．，Schlessinger，J．，& Ullrich，A．，Mol．Cell，Biol．12，491-498(1992)。病毒原种的滴度一般为约106／ml。实施例8具有AURORA的NIH-3T3细胞的逆转录病毒感染将NIH-3T3和BALB／3T3细胞在含有10％小牛血清(FCS)的DMEM(Gibco)生长于100mm平板上。将细胞用AUR1和AUR2逆转录病毒进行超感染，这是通过向15ml培养基中加入约3ml病毒上清液。进行约24小时。然后将表达该逆转录构建体的细胞通过在添加了500μg／ml G418的DMEM／10％FCS中生长而进行选择。实施例9AURORA特异性免疫试剂的制备AURORA特异性免疫试剂是在兔中针对KLH-结合的合成肽产生的，这些肽对应于AUR2的N-末端区段(104SAPENNPEEQLASK117)(SEQ IDNO22)和(90RPLNNTQKSKQPL102)(SEQ ID NO23)或者人的AUR1的N-末端或N-末端区域(1MAQKENSYPWPYG13)(SEQ ID NO24)和(53PGQKVMENSSGTP65)(SEQ ID NO25)。另外的免疫试剂是用细菌表达的全长AUR1和AUR2 GST-融合蛋白质在兔中免疫而产生的。实施例10AURORA在哺乳动物细胞中的瞬间表达将含有HA-标记的AUR1和AUR2基因的pRK5表达质粒(10μgDNA／100mm平板)用脂转染胺试剂(Gibco BRL)导入COS和293细胞中。72小时之后，收获细胞至0．5ml溶解缓冲液中(20mM HEPESpH7．35，150mM NaCl，10％甘油，1％ Triton X-100，1．5mM MgCl2，1mM EGTA，2mM苯基甲基磺酰氟，1μg／ml抑蛋白酶肽)。将等份样品通过SDS聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)在15％丙烯酰胺／0．5％双丙烯酰胶凝胶上电泳并电泳转移至硝酸纤维素膜上。非特异性结合通过在Blotto(含有5％w／v脱脂奶粉和0．2％v／v乙基苯基聚乙二醇p-40(sigma)的磷酸盐缓冲液)中预温育印迹来进行封闭，使用鼠对HA+肽标记物的单克隆抗体检测重组蛋白质。或者，重组蛋白质可使用各种AUR1-或AUR2-特异性抗血清来检测。实施例11髓鞘质碱性蛋白质是一种AURORA1和AURORA2激酶的人工底物方法将人的染色腺癌(colorectal)SW480细胞培养在添加了10％小牛血清，L-谷氨酰胺，青霉素和链霉素的RPMI1640中。将SW480细胞的汇合培养物用冰冻磷酸缓冲液(PBS)洗三次，然后在1ml冰冻PBS中打碎。将细胞在4℃1000rpm离心，取出PBS，将所得细胞团贮存于-80℃。将来自3个15cm平板的细胞团在冰上解冻，再悬浮于总体积1ml的激酶裂解缓冲液中(50mM HEPES pH7．4，100mM KCl，25mMNaF，1mM NaVO3，0．5％NP40，1mM DTT，2μg／ml抑蛋白酶肽，和1μg／ml亮抑酶肽)，然后在4℃徐徐旋转20分钟。然后将样品在1000×g，4℃离心10分钟，再将所得上清液转移至一个洁净的1．5ml离心管中并在冰上保存。用Bradford分析确定蛋白质浓度。将1mg总蛋白质用10μl蛋白质A-琼脂糖(Boehringer)在4℃预清洁15分钟，然后加入2μl兔的免疫前血清，亲和纯化的aurora1肽抗血清，亲和纯化的auroral肽抗血清加上6μg竞争Aarora1肽，亲和纯化的aurora2肽抗血清，或者，亲和纯化的aurora2肽抗血清加上6μg的竞争aurora2肽并在4℃温育30分钟。随后加入10μl蛋白质A-琼脂糖，并继续在4℃另外温育45分钟。将该试管短暂离心，使抗体-蛋白质A-琼脂糖复合体集中，并将所产生的上清液吸去。将该抗体-蛋白质A-琼脂糖团块用0．5ml激酶裂解缓冲液洗两次，然后用0．5ml激酶缓冲液(20mM HEPESpH7．4，125mM KCl，10mM MgCl2，1mM NaF，1mM NaNO3，t 1mm DTT)洗一次。将该抗体-蛋白质A-琼脂糖团块再悬浮于20μl含有5μCi(γ-32P)ATP和0．5mg／ml髓鞘质碱性蛋白质(Sigma)的激酶缓冲液中，在37℃温育20分钟，之后加入10μl蛋白质样品缓冲液(200mMTris-HCl pH6．8，40％甘油，730mM B-巯基乙醇，0．4％SDS，和0．05％溴酚蓝)。将该试管充分混合，并在100℃温育5分钟。将样品在18％SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳，通过放射自影观察结果。结果AURORA1和AURORA2免疫复合体能够使髓鞘质碱性蛋白磷酸化。当在免疫沉淀中使用了竞争肽时，aurora1或aurora2抗血清二者均不能比免疫前的对照血清更能使髓鞘质碱性蛋白磷酸化。这提示观察到的激酶活性是由aurora1和aurora2产生的，而不是免疫复合体中存在的其它蛋白质。
这一现象使我们能够使用髓鞘质碱性蛋白作为底物按照激酶活性来纯化有活性的aurora1和aurora2激酶。它也使我们能够使用重组aurora1和2蛋白质开发出体外激酶检测方法。而且，aurora1和2的体外激酶检测方法可使人们能够筛选一个小的分子样品中的aurora1和2的抑制物，这是通过测定髓鞘质碱性蛋白质的磷酸化抑制来进行的。
本发明在此作适度举例说明，可能实践起来缺少在此未曾专门公开的任何一种要素或多种要素，任何一种限制因素或多种限制因素。所使用的术语和表达方式只是一种说明方式，不是一种限定，并不意味着这些术语和表达方式的使用排除了所示和所描述的技术特征或其部分的任何等同物。应认识到可以进行各种变换而不脱离本发明权利要求的范围。因而，虽然本发明通过优先实施方案和可选择方案进行了公开，本文中公开的概念的各种变换可能被本领域普通技术人员采用，而这种变换被认为是处于本发明的范围之内。
上文中没有引入本文的参考文献，包括专利和非专利文献均引入本文作为参考。其它的实施方案描述于权利要求中。
序列表(1)总信息(ⅰ)申请人Mossie，Kevin G．Plowman，Gregory D．(ⅱ)发明名称AUR-1和或AUR-2相关疾病的诊断与治疗(ⅲ)序列数目6(ⅳ)通信地址(A)收信人Lyon & Lyon(B)街道633 West Fifth Street，Suite 4700(C)城市Los Angeles(D)州CA(E)国家USA(F)邮政编码90071-2066(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS／MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1．0，Version#1．30(ⅵ)目前申请状态(A)申请号(B)申请日(C)分类(ⅷ)代理人信息(A)姓名Warburg，Richard J．(B)登记号32327(ⅸ)通讯资料(A)电话(213)489-1600(B)传真(213)955-0440(C)电传67-3510(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1244碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假定否(ⅳ)反义否(ⅵ)原始来源(A)有机体人类(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID N01CGGGAGAGTA GCAGTGCCTT GGACCCCAGC TCTCCTCCCC CTTTCTCTCT AAGGATGGCC 60CAGAAGGAGA ACTCCTACCC CTGGCCCTAC GGCCGACAGA CGGCTCCATC TGGCCTGAGC120ACCCTGCCCC AGCGAGTCCT CCGGAAAGAG CCTGTCACCC CATCTGCACT TGTCCTCATG180AGCCGCTCCA ATGTCCAGCC CACAGCTGCC CCTGGCCAGA AGGTGATGGA GAATAGCAGT240GGGACACCCG ACATCTTAAC GCGGCACTTC ACAATTGATG ACTTTGAGAT TGGGCGTCCT300CTGGGCAAAG GCAAGTTTGG AAACGTGTAC TTGGCTCGGG AGAAGAAAAG CCATTTCATC360GTGGCGCTCA AGGTCCTCTT CAAGTCCCAG ATAGAGAAGG AGGGCGTGGA GCATCAGCTG420CGCAGAGAGA TCGAAATCCA GGCCCACCTG CACCATCCCA ACATCCTGCG TCTCTACAAC480TATTTTTATG ACCGGAGGAG GATCTACTTG ATTCTAGAGT ATGCCCCCCG CGGGGAGCTC540TACAAGGAGC TGCAGAAGAG CTGCACATTT GACGAGCAGC GAACAGCCAC GATCATGGAG600GAGTTGGCAG ATGCTCTAAT GTACTGCCAT GGGAAGAAGG TGATTCACAG AGACATAAAG660CCAGAAAATC TGCTCTTAGG GCTCAAGGGA GAGCTGAAGA TTGCTGACTT CGGCTGGTCT720GTGCATGCGC CCTCCCTGAG GAGGAAGACA ATGTGTGGCA CCCTGGACTA CCTGCCCCCA780GAGATGATTG AGGGGCGCAT GCACAATGAG AAGGTGGATC TGTGGTGCAT TGGAGTGCTT840TGCTATGAGC TGCTGGTGGG GAACCCACCC TTCGAGAGTG CATCACACAA CGAGACCTAT900CGCCGCATCG TCAAGGTGGA CCTAAAGTTC CCCGCTTCTG TGCCCACGGG AGCCCAGGAC960CTCATCTCCA AACTGCTCAG GCATAACCCC TCGGAACGGC TGCCCCTGGC CCAGGTCTCA020GCCCACCCTT GGGTCCGGGC CAACTCTCGG AGGGTGCTGC CTCCCTCTGC CCTTCAATCT080GTCGCCTGAT GGTCCCTGTC ATTCACTCGG GTGCGTGTGT TTGTATGTCT GTGTATGTAT140AGGGGAAAGA AGGGATCCCT AACTGTTCCC TTATCTGTTT TCTACCTCCT CCTTTGTTTA200ATAAAGGCTG AAGCTTTTTG TAAAAAAACA AAAAAAAAAA AAAA 1244(2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度2198碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅲ)假定否(ⅳ)反义否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2GGGATATCTC AGTGGCGGAC GAGGACGGCG GGGACAAGGG GCGGCTGGTC GGAGTGGCGG 60ACGTCAAGTC CCCTGTCGGT TCCTCCGTCC CTGAGTGTCC TTGGCGCTGC CTTGTGCCCG120CCCAGCGCCT TTGCATCCGC TCCTGGGCAC CGAGGCGCCC TGTAGGATAC TGCTTGTTAC180TTATTACAGC TAGAGGCATC ATGGACCGAT CTAAAGAAAA CTGCATTTCA GGACCTGTTA240AGGCTACAGC TCCAGTTGGA GGTCCAAAAC GTGTTCTCGT GACTCAGCAA TTTCCTTGTC300AGAATCCATT ACCTGTAAAT AGTGGCCAGG CTCAGCGGGT CTTGTGTCCT TCAAATTCTT360CCCAGCGCGT TCCTTTGCAA GCACAAAAGC TTGTCTCCAG TCACAAGCCG GTTCAGAATC420AGAAGCAGAA GCAATTGCAG GCAACCAGTG TACCTCATCC TGTCTCCAGG CCACTGAATA480ACACCCAAAA GAGCAAGCAG CCCCTGCCAT CGGCACCTGA AAATAATCCT GAGGAGGAAC540TGGCATCAAA ACAGAAAAAT GAAGAATCAA AAAAGAGGCA GTGGGCTTTG GAAGACTTTG600AAATTGGTCG CCCTCTGGGT AAAGGAAAGT TTGGTAATGT TTATTTGGCA AGAGAAAAGC660AAAGCAAGTT TATTCTGGCT CTTAAAGTGT TATTTAAAGC TCAGCTGGAG AAAGCCGGAG720TGGAGCATCA GCTCAGAAGA GAAGTAGAAA TACAGTCCCA CCTTCGGCAT CCTAATATTC780TTAGACTGTA TGGTTATTTC CATGATGCTA CCAGAGTCTA CCTAATTCTG GAATATGCAC840CACTTGGAAC AGTTTATAGA GAACTTCAGA AACTTTCAAA GTTTGATGAG CAGAGAACTG900CTACTTATAT AACAGAATTG GCAAATGCCC TGTCTTACTG TCATTCGAAG AGAGTTATTC960ATAGAGACAT TAAGCCAGAG AACTTACTTC TTGGATCAGC TGGAGAGCTT AAAATTGCAG020ATTTTGGGTG GTCAGTACAT GCTCCATCTT CCAGGAGGAC CACTCTCTGT GGCACCCTGG080ACTACCTGCC CCCTGAAATG ATTGAAGGTC GGATGCATGA TGAGAAGGTG GATCTCTGGA140GCCTTGGAGT TCTTTGCTAT GAATTTTTAG TTGGGAAGCC TCCTTTTGAG GCAAACACAT200ACCAAGAGAC CTACAAAAGA ATATCACGGG TTGAATTCAC ATTCCCTGAC TTTGTAACAG260AGGGAGCCAG GGACCTCATT TCAAGACTGT TGAAGCATAA TCCCAGCCAG AGGCCAATGC320TCAGAGAAGT ACTTGAACAC CCCTGGATCA CAGCAAATTC ATCAAAACCA TCAAATTGCC380AAAACAAAGA ATCAGCTAGC AAACAGTCTT AGGAATCGTG CAGGGGGAGA AATCCTTGAG440CCAGGGCTGC CATATAACCT GACAGGAACA TGCTACTGAA GTTTATTTTA CCATTGACTG500CTGCCCTCAA TCTAGAACGC TACACAAGAA ATATTTGTTT TACTCAGCAG GTGTGCCTTA560ACCTCCCTAT TCAGAAAGCT CCACATCAAT AAACATGACA CTCTGAAGTG AAAGTAGCCA620CGAGAATTGT GCTACTTATA CTGGTTCATA ATCTGGAGGC AAGGTTCGAC TGCAGCCGCC680CCGTCAGCCT GTGCTAGGCA TGGTGTCTTC ACAGGAGGCA AATCCAGAGC CTGGCTGTGG740GGAAAGTGAC CACTCTGCCC TGACCCCGAT CAGTTAAGGA GCTGTGCAAT AACCTTCCTA800GTACCTGAGT GAGTGTGTAA CTTATTGGGT TGGCGAAGCC TGGTAAAGCT GTTGGAATGA860GTATGTGATT CTTTTTAAGT ATGAAAATAA AGATATATGT ACAGACTTGT ATTTTTTCTC920TGGTGGCATT CCTTTAGGAA TGCTGTGTGT CTGTCCGGCA CCCCGGTAGG CCTGATTGGG980TTTCTAGTCC TCCTTAACCA CTTATCTCCC ATATGAGAGT GTGAAAAATA GGAACACGTG040CTCTACCTCC ATTTAGGGAT TTGCTTGGGA TACAGAAGAG GCCATGTGTC TCAGAGCTGZ100TAAGGGCTTA TTTTTTTAAA ACATTGGAGT CATAGCATGT GTGTAAACTT TAAATATGCA160AATAAATAAG TATCTATGTC AAAAAAAAAA AAAAAAAA 2198(2)SEQ ID NO3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度344氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅲ)假定否(ⅳ)反义否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3Met Ala Gln Lys Glu Asn Ser Tyr Pro Trp Pro Tyr Gly Arg Gln Thr1 5 10 15Ala Pro Ser Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gln Arg Val Leu Arg Lys Glu20 25 30Pro Val Thr Pro Ser Ala Leu Val Leu Met Ser Arg Ser Asn Val Gln35 40 45Pro Thr Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Met Glu Asn Ser Ser Gly Thr50 55 60Pro Asp Ile Leu Thr Arg His Phe Thr Ile Asp Asp Phe Glu Ile Gly65 70 75 80Arg Pro Leu Gly Lys Gly Lys Phe Gly Asn Val Tyr Leu Ala Arg Glu85 90 95Lys Lys Ser His Phe Ile Val Ala Leu Lys Val Leu Phe Lys Ser Gln100 105 110Ile Glu Lys Glu Gly Val Glu His Gln Leu Arg Arg Glu Ile Glu Ile115 120 125Gln Ala His Leu His His Pro Asn Ile Leu Arg Leu Tyr Asn Tyr Phe130 135 140Tyr Asp Arg Arg Arg Ile Tyr Leu Ile Leu Glu Tyr Ala Pro Arg Gly145 150 155 160Glu Leu Tyr Lys Glu Leu Gln Lys Ser Cys Thr Phe Asp Glu Gln Arg165 170 175Thr Ala Thr Ile Met Glu Glu Leu Ala Asp Ala Leu Met Tyr Cys His180 185 190Gly Lys Lys Val Ile His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu195 200 205Gly Leu Lys Gly Glu Leu Lys Ile Ala Asp Phe Gly Trp Ser Val His210 215 220Ala Pro Ser Leu Arg Arg Lys Thr Met Cys Gly Thr Leu Asp Tyr Leu225 230 235 240Pro Pro Glu Met Ile Glu Gly Arg Met His Asn Glu Lys Val Asp Leu245 250 255Trp Cys Ile Gly Val Leu Cys Tyr Glu Leu Leu Val Gly Asn Pro Pro260 265 270Phe Glu Ser Ala Ser His Asn Glu Thr Tyr Arg Arg Ile Val Lys Val275 280 285Asp Leu Lys Phe Pro Ala Ser Val Pro Thr Gly Ala Gln Asp Leu Ile290 295 300Ser Lys Leu Leu Arg His Asn Pro Ser Glu Arg Leu Pro Leu Ala Gln305 310 315 320Val Ser Ala His Pro Trp Val Arg Ala Asn Ser Arg Arg Val Leu Pro325 330 335Pro Ser Ala Leu Gln Ser Val Ala340(2)SEQ ID NO4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度403氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅲ)假定否(ⅳ)反义否(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4Met Asp Arg Ser Lys Glu Asn Cys Ile Ser Gly Pro Val Lys Ala Thr1 5 10 15Ala Pro Val Gly Gly Pro Lys Arg Val Leu Val Thr Gln Gln Phe Pro20 25 30Cys Gln Asn Pro Leu Pro Val Asn Ser Gly Gln Ala Gln Arg Val Leu35 40 45Cys Pro Ser Asn Ser Ser Gln Arg Val Pro Leu Gln Ala Gln Lys Leu50 55 60Val Ser Ser His Lys Pro Val Gln ASn Gln Lys Gln Lys Gln Leu Gln65 70 75 80Ala Thr Ser Val Pro His Pro Val Ser Arg Pro Leu Asn Asn Thr Gln
85 90 95Lys Ser Lys Gln Pro Leu Pro Ser Ala Pro Glu Asn Asn Pro Glu Glu100 105 110Glu Leu Ala Ser Lys Gln Lys Asn Glu Glu Ser Lys Lys Arg Gln Trp115 120 125Ala Leu Glu Asp Phe Glu Ile Gly Arg Pro Leu Gly Lys Gly Lys Phe130 135 140Gly Asn Val Tyr Leu Ala Arg Glu Lys Gln Ser Lys Phe Ile Leu Ala145 150 155 160Leu Lys Val Leu Phe Lys Ala Gln Leu Glu Lys Ala Gly Val Glu His165 170 175Gln Leu Arg Arg Glu Val Glu Ile Gln Ser His Leu Arg His Pro Asn180 185 190Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Tyr Phe His Asp Ala Thr Arg Val Tyr Leu195 200 205Ile Leu Glu Tyr Ala Pro Leu Gly Thr Val Tyr Arg Glu Leu Gln Lys210 215 220Leu Ser Lys Phe Asp Glu Gln Arg Thr Ala Thr Tyr Ile Thr Glu Leu225 230 235 240Ala Asn Ala Leu Ser Tyr Cys His Ser Lys Arg Val Ile His Arg Asp245 250 255Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Gly Ser Ala Gly Glu Leu Lys Ile260 265 270Ala Asp Phe Gly Trp Ser Val His Ala Pro Ser Ser Arg Arg Thr Thr275 280 285Leu Cys Gly Thr Leu Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Met Ile Glu Gly Arg290 295 300Met His Asp Glu Lys Val Asp Leu Trp Ser Leu Gly Val Leu Cys Tyr305 310 315 320Glu Phe Leu Val Gly Lys Pro Pro Phe Glu Ala Asn Thr Tyr Gln Glu325 330 335Thr Tyr Lys Arg Ile Ser Arg Val Glu Phe Thr Phe Pro Asp Phe Val340 345 350Thr Glu Gly Ala Arg Asp Leu Ile Ser Arg Leu Leu Lys His Asn Pro355 360 365Ser Gln Arg Pro Met Leu Arg Glu Val Leu Glu His Pro Trp Ile Thr370 375 380Ala Asn Ser Ser Lys Pro Ser Asn Cys Gln Asn Lys Glu Ser Ala Ser385 390 395 400Lys Gln Ser
权利要求
1.一种分离的、富集的或纯化的编码AUR1和／或AUR2多肽的核酸分子。
2.按照权利要求1所述的核酸分子，其特征在于所述的核酸是人的核酸。
3.按照权利要求1所述的核酸分子，其特征在于所述的分子编码SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少25个相邻接的氨基酸。
4.按照权利要求1所述的核酸分子，其特征在于所述的分子编码SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少50个相邻接的氨基酸。
5.按照权利要求1所述的核酸分子，其特征在于所述的分子编码SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少100个相邻接的氨基酸。
6.按照权利要求1所述的核酸分子，其特征在于所述的分子编码SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少200个相邻接的氨基酸。
7.按照权利要求1所述的核酸分子，其特征在于所述的分子编码SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少300个相邻接的氨基酸。
8.一种用于检测样品中编码AUR1和／或AUR2多肽的核酸的探针。
9.按照权利要求8所述的探针，其特征在于所述的多肽包括SEQ IDNO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少25个相邻接的氨基酸。
10.按照权利要求8所述的探针，其特征在于所述的多肽包括SEQID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少50个相邻接的氨基酸。
11.按照权利要求8所述的探针，其特征在于所述的多肽包括SEQID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少100个相邻接的氨基酸。
12.按照权利要求8所述的探针，其特征在于所述的多肽包括SEQID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少200个相邻接的氨基酸。
13.按照权利要求8所述的探针，其特征在于所述的多肽包括SEQID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中至少300个相邻接的氨基酸。
14.一种重组核酸分子，其编码AUR1和／或AUR2多肽以及一个在宿主细胞中对起始转录有效的载体或启动子。
15.一种重组核酸分子，其特征在于它含有一种在细胞中具有功能的转录区段，一种与编码AUR-1或AUR-2多肽的RNA序列互补的序列和一种在细胞中具有功能的转录终止区段。
16.一种分离的、富集的或纯化的AUR-1或AUR-2多肽。
17.按照权利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽包含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的氨基酸序列中的至少25个相邻接的氨基酸。
18.按照权利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽包含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的氨基酸序列中的至少50个相邻接的氨基酸。
19.按照权利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽包含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的氨基酸序列中的至少100个相邻接的氨基酸。
20.按照权利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽包含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的氨基酸序列中的至少200个相邻接的氨基酸。
21.按照权利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽包含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4的氨基酸序列中的至少300个相邻接的氨基酸。
22.按照权利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽是从哺乳动物中分离的、纯化的、或富集的。
23.按照权利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽是从人中分离的、纯化的、或富集的。
24.按照权利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽是一种AUR-1多肽。
25.按照权利要求16所述的AUR-1或AUR-2多肽，其特征在于所述的多肽是一种AUR-2多肽。
26.一种对AUR-1或AUR-2多肽具有特异的结合亲和性的抗体。
27.按照权利要求26所述的抗体，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4氨基酸序列中的至少3个相邻接的氨基酸。
28.按照权利要求26所述的抗体，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4氨基酸序列中的至少4个相邻接的氨基酸。
29.按照权利要求26所述的抗体，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4氨基酸序列中的至少25个相邻接的氨基酸。
30.按照权利要求26所述的抗体，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4氨基酸序列中的至少50个相邻接的氨基酸。
31.按照权利要求26所述的抗体，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有示于SEQ ID NO3或SEQ ID NO4氨基酸序列中的至少100个相邻接的氨基酸。
32.按照权利要求26所述的抗体，其特征在于所述的多肽是从哺乳动物中分离的、纯化的、或富集的。
33.按照权利要求26所述的抗体，其特征在于所述的多肽是从人中分离的、纯化的、或富集的。
34.按照权利要求26所述的抗体，其特征在于所述的多肽是一种AUR-1多肽。
35.按照权利要求26所述的抗体，其特征在于所述的多肽是一种AUR-2多肽。
36.一种产生对AUR-1和／或AUR-2多肽具有特异的结合亲和性的抗体的杂交瘤。
37.按照权利要求36所述的杂交瘤，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中的至少25个相邻接的氨基酸。
38.按照权利要求36所述的杂交瘤，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中的至少50个相邻接的氨基酸。
39.按照权利要求36所述的杂交瘤，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中的至少100个相邻接的氨基酸。
40.按照权利要求36所述的杂交瘤，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中的至少200个相邻接的氨基酸。
41.按照权利要求36所述的杂交瘤，其特征在于所述的AUR-1或AUR-2多肽含有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中的至少300个相邻接的氨基酸。
42.按照权利要求36所述的杂交瘤，其特征在于所述的多肽是从一种哺乳动物中分离的、纯化的、或富集的。
43.按照权利要求36所述的杂交瘤，其特征在于所述的多肽是从人中分离的、纯化的、或富集的。
44.按照权利要求36所述的杂交瘤，其特征在于所述的多肽是一种AUR-1多肽。
45.按照权利要求36所述的杂交瘤，其特征在于所述的多肽是一种AUR-2多肽。
全文摘要
本发明涉及AUR－1和/或AUR－2多肽,编码这种多肽的核酸,含有这种核酸的细胞组织和动物,对这种多肽的抗体,使用这种多肽的检测方法,以及与上述各项相关的方法。本发明也提供了用于治疗,诊断和筛查与AUR－1和/或AUR－2相关的疾病的方法,这些疾病的特征为AUR－1和/或AUR－2与AUR－1和/或AUR－2结合对应物之间的作用异常。
文档编号C12N15/85GK1205740SQ96199101
公开日1999年1月20日 申请日期1996年11月25日 优先权日1996年11月25日
发明者格雷戈里·D·普洛曼, 凯文·G·莫西 申请人:苏根公司