酶及其制备和它们在生产丙烯酸铵中的应用的制作方法

专利名称：酶及其制备和它们在生产丙烯酸铵中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产丙烯酸铵的酶促方法以及适用于这些方法中的新微生物和酶。
丙烯酸(或其盐)通常是通过一步化学转化法从氧化丙烯制备或者通过两步转化法从丙烯腈经由丙烯酰胺硫酸盐中间体制备。该化学转化法得出的产物会含来自副反应的不需要的杂质，它包括某些二聚丙烯酸的形成，当在生产条件下产物丙烯酸处于高浓度时就会形成二聚丙烯酸。
利用酰胺酶将丙烯酰胺转化为丙烯酸(作为铵盐)在文献中常有描述。起先有报道将丙烯酰胺聚合物中残余的单体杂质转化为丙烯酸铵但它还提出希望将酰胺酶用于工业上从丙烯酰胺生产丙烯酸铵。
从丙烯腈通过腈水合酶制备丙烯酰胺的方法是已知的，例如描述于EP-A-307,926和Appl.Microbiol.Biotechnol.1993，40，pp.189-195中的方法。后一篇文献指示腈水合酶特别可得自紫红红球菌(R.rhodochrous)J1。EP-A-188316描述了利用腈水合酶将丙烯腈转化成丙烯酰胺。一种腈水合酶得自红球菌属(Rhodococcus)菌株S-6。WO 95/04828描述了腈水合酶，其中之一得自丛毛单胞菌属(Comamonas)NI1，它被描述为可将丙烯腈转化成丙烯酰胺。这些方法如果用于生产丙烯酸铵，就会包括两步，即生产丙烯酰胺的第一步和将它水解成丙烯酸的第二步。利用两步法通常引入两种杂质。它们是来自第一步的未反应起始原料和第一步的未反应产物(它是第二步的起始原料)。
将腈转化为其相应的酸的另一种方法描述于GB1,475,540中。该转化法是通过特定的细菌株对包括丙烯腈的各种腈而进行的。这些菌株是芽孢杆菌属(Bacillus)、炭疽芽孢杆菌(Bacteridium)、微球菌属(Micrococcus)或短杆菌属(Brevibacterium)的菌株。被转化物的实例有乳腈、甘氨腈(glycinonitrile)、氨基丙腈盐酸化物、氨基-3-丙腈和α-氨基-γ-甲基硫代丁腈。我们认为，微生物进行的水解是通过产生一种腈水合酶而将腈转化为酰胺和一种酰胺酶接着将该酰胺转化为酸。
希望能应用丙烯腈水解酶通过工业上便利的酶促方法一步从丙烯腈生产丙烯酸铵。
应用腈水解酶将丙烯腈转化为丙烯酸铵的方法在文献中已有报道，例如EP-A-187,680、JP-B-63-2596和Appl Microbiol.Biotechnol.1990，34，pp.322-324，它们应用得自紫红红球菌J1(与描述于上述EP-A-307,926中相同的微生物)的腈水解酶，以及EP-A-444,640，它也描述了得自紫红红球菌J1的腈水解酶是优选的。
在J.Bacteriol.172，9，pp.4807-4815中描述了将紫红红球菌K22用于将丙烯腈转化成丙烯酸铵的方法中。
在Biotech.Appl.Biochem.，1989，11，pp.581-601中阐述了得自尖镰孢(Fusarium oxysporum)f.sp.melonis的腈水解酶作用于高达60mM丙烯腈而生产丙烯酸。
Stevenson等在Biotech.and Appl.Biochem.15，283-302(1992)中描述了对由红球菌属ATCC 39484生产的腈水解酶的研究。该酶对芳族腈的水解最有效，但对很多脂族腈如丙烯腈显示小的或不显示活性。据说该酶的最佳pH为7.5，在pH5.0～9.0范围之外完全被灭活，且在40℃以上预保温被不可逆地灭活。在底物、特别是苄腈存在下还可使该酶活化。该文的作者认为这是亚单位聚集的缘故。
遗憾的是应用腈水解酶的已知方法都不是工业上令人满意的。例如，在Appl.Microbiol.Biotechnol.34，1990，pp.322-324中描述的方法表明，紫红红球菌J1显示最佳活性所需的pH为7.8，在30～50℃之间被轻度灭活，而在60℃下几乎被完全灭活，被高于200mM浓度的丙烯腈抑制活性，且被形成的产物(丙烯酸铵)抑制活性。此文中没有适当数据指示由该微生物生产的腈水解酶对丙烯腈的Km值或它对丙烯酸铵的Ki值，但在上述J.Bacteriol文献中报道了紫红红球菌K22的Km值为1.14mM。在Biotech.Appl.Biochem.，1989，11，pp.581-601中报道了对丙烯腈水解酶的该值为17mM，且据报道该反应期间已形成大约4～6％的丙烯酰胺。
希望在经济的方法中能获得高浓度下良好产率的丙烯酸铵。希望提供实现该目的的微生物和酶。
已鉴定出具有不寻常的和特别希望的活性的腈水解酶。因而该腈水解酶可用于催化从丙烯腈生产丙烯酸铵的反应，该酶或者呈整个细胞形式或者作为提取的酶。它还可用于催化其它腈如己二腈的类似反应。
一种新腈水解酶的特征在于它对丙烯腈的Km低于500μM。在本说明书中Km表示在pH7.0时测定的Km。Km的测定条件为该酶表现出Michaelis-Menten动力学时的条件。特别是我们应用下文实施例6的条件。我们进行初始实验时呈整个细胞形式的优选腈水解酶对丙烯腈的Km为30.6μM，我们预计可应用标准的技术和选择方法，例如Silman等在(1989)J.Gen.Microbiol.，135，3153-3164中描述的对酰胺酶的那些以及由Wagner(1990)Tibtech.，8，263-270描述的对乳酸脱氢酶的那些，将得到Km值高达60或100，或许300μM，以及Km值降至9.4和甚至3.8μM的腈水解酶。
Km值低于500μM的该新腈水解酶主要优点在于它因此而对很低含量的腈底物有效。通常酶催化反应中应用底物的浓度约为Km的10倍。因此，应用本发明的新腈水解酶有可能在丙烯腈浓度为500μM或更低，甚至低到300μM，常常为40～100μM时进行从丙烯腈至丙烯酸铵的转化。这很有益，因为它可通过一种方法连续生产丙烯酸铵而使反应器中、因而丙烯酸铵产物中的丙烯腈含量为300ppm或更小。本发明的新腈水解酶还可用于丙烯腈底物浓度大于300ppm的方法中，以及可用于间歇法或补料分批法。
本发明的酶低Km的另一个优点在于该酶良好的清除能力。因为腈水解酶在丙烯腈浓度很低时具有活性，所以它能从例如含残余丙烯腈的丙烯酸铵产物中清除很低浓度的残余丙烯腈。
能在很低腈浓度下工作还是有益的，因为丙烯腈和其它腈在高浓度下具有使腈水解酶灭活的倾向。具有更高Km的已知酶迄今应用有限，因为它们需要一定的最小腈含量才能实现有效的反应活性，但该含量高到足以导致灭活。本发明的腈水解酶能有效地作用于浓度低到足以避免使该酶明显灭活的丙烯腈或其它腈而生产丙烯酸铵或其它盐。
本发明的新腈水解酶特征在于它对丙烯酸铵的Ki至少为100mM，优选至少为150或200，更优选至少为250mM。本说明书中，Ki表示在pH7.0下测定的Ki。该酶在测定条件下表现出Michaelis-Menten动力学。优选的测定条件是下文实施例7中给出的条件。我们进行初始实验时优选的腈水解酶对丙烯酸铵的Ki据我们估测为309mM。预计标准技术和选择方法，例如诱变，将产生对丙烯酸铵的Ki高达300mM或甚至800mM或更大的腈水解酶。
本发明的腈水解酶高Ki值的优点在于它使该酶催化丙烯腈的反应而生成高浓度的丙烯酸铵(10％ w/v或更大，例如高达30或40％)。在这类反应中，产物对该酶的作用的抑制程度较低。
本发明的新腈水解酶特征在于比值(对丙烯酸铵的Ki)/(对丙烯腈的Km)至少为200。该比值优选至少为300，更优选至少为500，特别是至少为1000。本发明的腈水解酶的Ki/Km比值至少为5000，甚至9000或更大，且我们进行初始实验的腈水解酶的该比值大于10000。
所述比值的高值优势在于该腈水解酶能催化很低含量腈如丙烯腈的水解，条件可以是当存在高浓度的相应盐如丙烯酸铵时。
新腈水解酶的特征在于，在pH6.8时，丙烯腈水解酶的比活性是它的最佳pH时活性的至少80％、优选至少95％。最佳pH指腈水解酶具有最大丙烯腈水解酶比活性时的pH。它的最佳pH通常在6.5～7范围内，一般约为6.8，所以该腈水解酶具有这个优点，即它的最佳活性是在丙烯酸铵的自然pH时。因此，不需缓冲或恒定监控和调节。
本发明的新腈水解酶的特征在于，具有如下的改进的温度稳定性它在50℃下保持其25℃时丙烯腈水解酶活性的至少80％。活性的测定是这样进行的，即在所需温度下将细胞于水中保温5分钟，然后添加浓度为50mM的丙烯腈，监测至丙烯酸铵的转化达15分钟。优选地，该腈水解酶还在55℃和60℃下保持其25℃时丙烯腈水解酶活性的至少80％。在50℃、55℃和60℃下的活性可能甚至高于25℃下的活性，例如至少是25℃时活性的100％，或甚至200％或300％。
按下述方法固定于交联的聚丙烯酰胺珠粒中之后，本发明的新腈水解酶保持其原来的丙烯腈水解酶比活性的至少80％将含腈水解酶的细胞浆悬浮于冷冻的缓冲液中，再加至丙烯酰胺单体和亚甲基双丙烯酰胺交联剂混合物的冷冻的缓冲液中。立即添加氧化还原引发剂体系的水溶性组分。再将该混合物转入搅拌下含冷冻的矿物油和表面活性剂的树脂罐中，接着添加可溶于这两个液相的第二种氧化还原引发剂组分以引发聚合。聚合时，细胞被裹入交联的聚合物珠粒中。优选地，当腈水解酶在这些条件下固定于交联聚丙烯酰胺珠粒中时，在60℃下干燥至12％湿度和/或在0.1mbar时冷冻干燥24小时后，保持其固定化丙烯腈水解酶比活性的至少90％、优选至少95％、更优选基本上全部保持。“固定化比活性”表示当该酶被固定于交联的聚丙烯酰胺珠粒之后显示的比活性。优选地还有，固定于交联的聚丙烯酰胺珠粒中和任选干燥过并在20℃下贮存了17天的腈水解酶，它的丙烯腈水解酶比活性是固定化比活性的至少90％、优选至少95％、更优选基本上全部。
因此，本发明该方面的腈水解酶是高度化学稳定和物理稳定的。这使它很适合掺入聚合物材料珠粒中。已知以完整的细胞形式将酶固定于交联聚合物材料、特别是聚丙烯酰胺珠粒中，以便使它们处于可方便应用的形式。本发明的腈水解酶掺合成该形式时未变性(即它的比活性未明显减小)。此外，当该腈水解酶被掺入交联聚丙烯酰胺珠粒后，在干燥或贮存这些珠粒时，该酶在这些珠粒中的活性优选地未明显减小。
本发明的新腈水解酶的特征在于，在含125～175mM丙烯腈和2,475～2,525mM丙烯酸铵的水溶液中测定时它的半寿命至少为5天，优选至少为7天，更优选至少为7.5天。测试期间丙烯腈和丙烯酸铵的准确含量可以变化但总是保持在该规定的浓度限度内。丙烯腈将被腈水解酶转化为丙烯酸铵，所以丙烯腈浓度将逐渐减小。当该浓度达到125mM的下限时，另外添加丙烯腈而将浓度提高至175mM的上限。类似地，允许丙烯酸铵的含量在规定范围内变化，调节丙烯酸铵的浓度以免浓度高于上述2525mM的规定最大值。我们进行初步实验时特定的微生物产生的腈水解酶在这些条件下的半寿命为7.6天，我们预测可产生具有至少10～15天的半寿命的酶。
有利的半寿命表明本发明的腈水解酶具有对底物和产物(丙烯腈和丙烯酸铵)、特别是高浓度的产物引起变性的高稳定性。
本发明该方面的丙烯腈水解酶的长半寿命特别有利于长期商用。可将一批酶加入反应器并保留在其中达数天，例如10天或更久或者甚至达20或30天，不必另加酶至反庆器中以置换变性的酶。
本发明的腈水解酶与丙烯腈和/或丙烯酸铵接触时具有增大其比活性的性能。在4～175mM丙烯腈水溶液和/或1.2～2.5M丙烯酸铵水溶液的存在下保温1～3小时之后，优选地它们表现出比活性的增大至少为1.7倍，优选至少为2或3倍，且通常不大于10倍。实验期间丙烯腈和丙烯酸铵的准确含量可以变化但总是保持在规定的浓度限度内。丙烯腈将通过腈水解酶转化为丙烯酸铵，于是丙烯腈浓度将逐渐减小。当浓度达到125mM的下限时，另加丙烯腈以提高浓度至175mM的上限。类似地，允许丙烯酸铵的含量在规定范围内变化，调节丙烯酸铵的浓度以免浓度高于上述2525mM的规定最大值。
因此这种改进的腈水解酶具有重要优势，即当它们暴露于应用它们的反应环境时，它们的活性会增大。
虽然本发明提供的新腈水解酶具有上述性能中的任一项，优选地本发明的腈水解酶具有规定性能中的一项以上。尤其优选的是，本发明的腈水解酶对丙烯腈的Km小于500μM，且更优选地，它还对丙烯酸铵的Ki至少为100mM。
特别优选地，该腈水解酶还具有(对丙烯酸胺的Ki)/(对丙烯腈的Km)比值至少为200。
更优选地，本发明的丙烯腈水解酶除了具有这些Km、Ki和Ki/Km性能外，还具有至少两项上文规定的性能，更优选具有所有上述规定的性能。
我们已分离出一种新的微生物，即一个紫红红球菌菌株，它能生产具有所有上述性能的腈水解酶。该微生物已于1995年8月8日按布达佩斯条约的规定保藏于NCIMB，登记号为NCIMB 40757。我们还于1996年12月11日新保藏了紫红红球菌菌株NCIMB 40833。它也具有所有上述性能并在下文称为“新保藏的菌株”。
因此，本发明的又一方面提供了微生物紫红红球菌NCIMB 40757或新保藏的NCIMB 40833，或者能产生腈水解酶的任一种的突变体。
本发明还提供了新的腈水解酶，它可通过培养紫红红球菌NCIMB40757或新保藏的菌株NCIMB 40833而获得。
经分析，在NCIMB 40757下保藏的菌株显示下列结果细胞壁二氨基酸是内消旋DAP。脂肪酸分布图示出标明百分含量的下列酸十四烷酸 2.1％十五烷酸 2.8％十六碳烯酸 24.7％十六烷酸 25.9％十七碳烯酸 6.2％十七烷酸 3.1％十八碳烯酸 25.0％十八烷酸 1.9％结核硬脂酸 7.0％生化试验给出下列结果下列物质的分解腺嘌呤 -酪氨酸 +脲 -存在下列物质时的生长情况5％NaCl +右旋糖叠氮化物 (+)在单一碳源上的生长情况肌醇 (+)麦芽糖 +甘露糖醇 +鼠李糖 -
山梨糖醇 +间羟基苯甲酸 +己二酸钠 +苯甲酸钠 +柠檬酸钠 +乳酸钠+谷氨酸钠 -L-酪氨酸 +甘油 +海藻糖+对羟基苯甲酸 +D-甘露糖 +乙酰胺+D-半乳糖 (+)(+)弱阳性酶试验Rosco discs.4小时，37℃α-葡糖苷酶 -半胱氨酸芳基酰胺酶-缬氨酸芳基酰胺酶 -得自紫红红球菌NCIMB 40757和NCIMB 40833的腈水解酶以及所有本发明的腈水解酶可用于把腈转化为相应的铵盐的方法中。因此按本发明的又一方面，我们提供了一种方法，即在作为水解催化剂的本发明的腈水解酶存在下，于水溶液中将腈转化为相应的铵盐，优选的腈水解酶可通过培养紫红红球菌NCIMB 40757或NCIMB 40833而得到。
优选的腈是丙烯腈，于是相应的铵盐是丙烯酸铵，所以下文将讨论的方法是对丙烯腈和丙烯酸铵。其它腈也可用本方法转化，例如己二腈、甲基丙烯腈、α-氨基腈、乙腈、正丁腈、异丁腈、正戊腈、苄腈、氰基吡啶、丙二腈、丁二腈、富马腈(fumaronitrile)、氯乙腈和β-羟基丙腈。
本发明的腈水解酶的各种独特的性能可使得在这种情况下实施本方法，即将连续地低浓度的丙烯腈转化为连续地高浓度的丙烯酸铵。
因此在本发明中，有可能将3.0mM或更低、通常2.0mM或更低、且甚至1.5mM或更低的丙烯腈水溶液转化为浓度至少为5％、通常至少为8％或10％的丙烯酸铵水溶液。还可能将浓度为3.0～6.0mM、通常为4.0～5.0mM的丙烯腈水溶液转化成浓度至少为20％、通常至少为25％或30％且甚至高达40％或更高的丙烯酸铵水溶液。丙烯酸铵浓度最大值通常约为48～50％(w/v)。
本发明的方法通常在5～70℃、优选为20～60℃的温度下实施。pH条件一般是3～9.5、优选是5～9、更优选是6～8。
当发生上述转化时，本发明的方法可作为连续法实施。即，将丙烯腈给反应器连续进料以保持稳定的丙烯腈浓度，并连续地排出含稳定浓度的丙烯酸铵的反应液。
还需要水作反应物。反应开始时水可呈所需总量存在。也可在反应期间往反应器中加水。例如，丙烯腈进料时可呈溶液、通常是饱和溶液的形式，即约为7％wt/wt。也可单独加入水，而进料的丙烯腈呈纯形式或作为溶液进料。
这类连续反应例如可在下列反应器中进行连续搅拌釜式反应器、流化床反应器、填充床反应器、抽注式反应器(draw-fill type reactor)或活塞流反应器。
上述条件下的本方法也可作为补料分批法操作。在补料分批法中，允许丙烯腈浓度随着转化为丙烯酸铵而减小直至达到一预定的最小值。此时往反应混合物中另加丙烯腈以将浓度提高到预定的最大值。然后允许丙烯腈浓度再次减小到预定的最小值。当丙烯酸铵含量达到预定的最大值时，收集反应混合物，再往反应器中重新加入一批丙烯腈和酶。连续操作时，如果需要的话可在反应期间往反应器中加入水。
另外，本发明的腈水解酶可用于在间歇法中催化丙烯腈至丙烯酸铵的转化。即，应用较高浓度的丙烯腈作为起始原料。让丙烯腈水解酶将该丙烯腈转化为丙烯酸铵而不再添加起始原料。当丙烯腈的转化完成之后，收集并应用该反应混合物，提供新的反应混合物。
不过，本发明的方法优选是连续法或补料分批法。特别优选的方法描述于我们今天提交的共同未决国际申请No…(参照PRL03626WO)，要求的优先权是GB9525374.6和GB9525372.0。
这类方法包括制备含至少30wt％(甲基)丙烯酸或其盐以及低于0.2％(甲基)丙烯腈的水溶液，它包括提供水和(甲基)丙烯腈，它的用量足以使水解后生成的(甲基)丙烯酸或其盐的浓度至少为30wt％，并在操作期间提供酶与(甲基)丙烯腈接触而使(甲基)丙烯腈转化为(甲基)丙烯酸铵，该酶对(甲基)丙烯腈的Km低于500μM且对(甲基)丙烯酸铵的Ki大于100,000μM，使(甲基)丙烯腈发生水解直至反应液中(甲基)丙烯腈的浓度低于0.2％而(甲基)丙烯酸铵的浓度高于30％；再回收含高于30％(甲基)丙烯酸铵和低于0.2％丙烯腈的溶液。在这类方法中，(甲基)丙烯腈经历化学水解而得含(甲基)丙烯酸铵和丙烯腈的溶液，再使所得溶液与所述酶接触而使(甲基)丙烯腈发生水解直至反应液中(甲基)丙烯腈的浓度低于0.2％。备择地，基本上(甲基)丙烯腈的整个水解过程可用所述酶进行酶促水解。
这类方法可作为一步法或两步法操作。一步法包括通过如下方法制备含至少30wt％(甲基)丙烯酸铵和低于0.1％(甲基)丙烯腈的溶液，即在操作期间往反应器中装入酶以及水和(甲基)丙烯腈，该酶可将(甲基)丙烯腈转化为(甲基)丙烯酸铵，它对(甲基)丙烯腈的Km低于500μM且对(甲基)丙烯酸铵的Ki高于100mM，水和(甲基)丙烯腈的量足以使水解后生成的(甲基)丙烯酸铵浓度至少为30wt％，然后使反应器中发生水解直至反应器的溶液中(甲基)丙烯腈的浓度低于0.2％而(甲基)丙烯酸铵的浓度高于30％，最后从反应器中排出该溶液。
在该优选的方法中，(甲基)丙烯腈的最终浓度可能低于0.1％，更优选地低于0.05％。优选地该浓度低于0.03％，更优选地低于0.02％或0.01％。
(甲基)丙烯酸铵的最终浓度至少为30wt％，通常至少为35wt％，优选至少为40wt％或45wt％。(甲基)丙烯酸铵的最大浓度通常为48～50wt％，因为高于这些含量则(甲基)丙烯酸铵就会从溶液中沉淀析出。
在优选的方法中该酶被包括于反应混合物中以便在反应器中提供所需的活性。通常，加入反应器的催化剂形式具有的活性为每克50～100,000个腈水解酶单位，一般为每克500～5,000个腈水解酶单位，其中一个腈水解酶单位定义为在30℃、pH7.0和50mM丙烯腈于50mM磷酸盐缓冲液中以1μmol/min的速率将丙烯腈转化为丙烯酸铵。该催化剂可呈细菌细胞的形式，或更常用固定于聚合物凝胶基质中的形式。具有规定活性的该催化剂包括于反应器中的量占反应混合物的1～50wt％。
特别地，加入反应混合物的酶的活性最好是每升反应混合物3,000～50,000个腈水解酶单位。
在优选的方法中，通常在反应开始时向反应器中装入所需酶的全部量，也就是说，在加入(甲基)丙烯腈反应物之前装入酶。不过，也可这样操作该优选的方法，即在反应期间连续地或定期地加入附加的酶。
类似地，也是反应物以及溶剂的水可在开始反应时以全部量包括于反应器中。备择地，可在反应期间以可能与(甲基)丙烯腈反应物相同的方式连续地往反应器中加入水。
反应在水溶液中进行。通常地，水溶液的组分只有水、酶(包括细菌细胞、聚合物基质等)、(甲基)丙烯腈和(甲基)丙烯酸铵。
本发明的方法也可以是聚合物的纯化方法，该聚合物是由包括丙烯腈单体的单体掺合物形成的且含有未反应的丙烯腈单体，通过在本发明的丙烯腈水解酶催化剂存在下将未反应的丙烯腈单体转化为丙烯酸铵而进行纯化。可在一定的条件下实施该方法，使得丙烯腈单体含量被减少至基于聚合物重量的1,000ppm以下、通常低于500ppm、优选低于300或甚至100ppm。
本发明的方法可以是含残余丙烯腈的单体的纯化方法，该单体已通过任意方法而获得，例如通过丙烯腈的化学水解。在这类方法中，丙烯酰胺的起始含量可能高达5％，但通常低于2％，例如为0.5～1％。
在本发明的方法中和用到它的任何其它方法中，腈水解酶可呈任意方便的形式应用，例如呈纯形式，在用作催化剂之前已从培养的微生物中被提取出来。应用的提取方法应保证该酶的活性和稳定性未损失。
它也可呈半纯化形式应用，例如作为液体培养物或细菌的细胞部分如完整的细胞或破碎的细胞。它也可呈粗制的、不纯的酶溶液形式应用。它可被支持或固定在载体上，例如交联的聚合物基质如交联的聚乙烯醇或交联的聚丙烯酰胺。它可呈具有表面结合酶的未溶胀颗粒形式应用。优选地，它的应用形式是完整的细菌细胞或支持于交联聚合物基质中。
我们发现对于补料分批型的反应，最好应用呈纯形式或作为游离细胞的半纯化形式的酶。以这种形式应用就无需将细胞固定于载体上，但我们发现它不会导致贮存时或者在反应混合物中降低稳定性至过度的程度。
至于连续法，我们优选应用呈固定化形式的酶，因为这样可在应用的反应器赋予它更大的长期稳定性。尤其，我们发现在某些场合中，呈固定化形式的酶在反应混合物中与它在贮存时一样稳定。从终产物中分离催化剂也更为容易。
当酶被固定时，特别是呈聚合物珠粒的形式时，我们发现，生产更大尺寸的聚合物珠粒可改善聚合期间酶的稳定性。特别是尺寸大于850μm、优选大于1mm的珠粒是优选的。
聚合物基质可以任意方法生产，例如通过珠状聚合或悬浮聚合。在单体混合物中加入增粘剂也很有用。
我们发现生产期间在低细胞载荷下(即基于聚合物基质的干细胞的重量百分数)酶的稳定性最大，尤其是低于5％，优选低于1％，例如约为0.5wt％。然而，也可通过应用低聚合温度而实现稳定性，例如低于30或20℃，通常低于15℃。这可与更高的细胞载荷组合应用，例如至少4wt％，优选至少5wt％，如6.5wt％或6.8wt％左右。
本发明的腈水解酶、尤其是通过紫红红球菌NCIMB 40757和新保藏菌株NCIMB 40833生产的腈水解酶的一个优点在于，它们将低浓度的丙烯腈如低于18.86mM(1,000ppm)转化为高浓度的丙烯酸铵如30％、40％或更大的能力。这就意味着可实施连续法或补料分批法以生产这种产物，即它含有高浓度的丙烯酸铵而丙烯腈的浓度远低于上述值(1,000ppm)，该值标志着需要考虑毒性问题。因此可直接生产无毒的丙烯酸铵产品而无需进一步处理。类似地，可生产含丙烯腈的聚合物再转化成无毒的产品。
然而，在本发明中可以应用腈水解酶将丙烯腈转化成丙烯酸铵而生产丙烯腈浓度大于1,000ppm的产品再进一步处理以减小丙烯腈含量。
我们发现，通过本发明的方法生产的丙烯酸铵单体(生物-丙烯酸铵)显示优良的性能，等于或优于化学法生产的单体的性能，化学法例如用得自氧化丙烯的丙烯酸生产。应用由本发明方法制备的单体生产的聚合物也显示优良的性能。按本发明制备的生物-丙烯酸铵可被转化成其它化学形式，例如丙烯酸或其钠盐或其它碱金属盐或其它相关的丙烯酸类单体并用作起始单体供生产丙烯酸聚合物。它也可不转化而作为丙烯酸铵应用。它可用于形成均聚物或与其它单体结合而生产共聚物。
我们发现本发明的新腈水解酶的又一个用途，即用于生物传感器以检测腈、特别是丙烯腈。
因此按本发明的方法我们这样检测腈(a)将腈与本发明的腈水解酶接触，该接触是在含水环境中进行的(b)使腈转化成其相应的铵盐，以及(c)检测有关腈转化的变化。
该变化例如可以是含水环境中导电率的变化。腈是非离子型物质，因而应用导电率测量不能检测它们。如果它们被转化成离子型物质即铵盐，则产生的导电率变化能被测量。也可检测铵离子浓度的变化或者可应用连接的酶系统来检测变化。
生物传感器可按这类传感器的任意常规方法制作，例如作为电极传感器。例如可将腈水解酶涂到电极上。
酶可存在于传感器内的含水环境中，例如，液态含水环境或含水凝胶。腈也可在含水环境中检测。当腈与腈水解酶接触时只需存在水以便使之发生水解。呈气态形式的腈可应用本发明的方法检测。
本发明的腈水解酶尤其适用于腈水解酶生物传感器，这特别是由于它对极低浓度腈显示基本上呈线性的响应。
一般地，应用的酶呈纯化的提取物形式。不过，可应用呈整个细胞形式或作为细菌细胞部分的酶。
本方法可用于检测任何环境中的腈，例如可能含有未反应的丙烯腈单体的聚合物，被腈污染的洗涤器排出液以及甚至与含丙烯腈蒸汽接触时。本发明的腈水解酶也可用于纯化这些排出物。
本发明的腈水解酶还可用于从蒸汽中除去腈，例如洗涤器蒸汽，其中存在的腈可能含量很低。它存在的量可能达0.3kg/m3，通常低于0.2kg/m3，例如0.05～0.1kg/m3。在该方法中，含腈蒸汽与腈水解酶接触而被转化成它相应的铵盐，于是腈被减少到低于5mg/m3或者甚至低于2mg/m3(2ppm)。通常是在含水环境中进行接触的，例如液态含水环境或含水凝胶，或者只是润湿酶。
本发明的该方法特别适用于在线检测其它方法不能检测的很低含量的腈。在本发明的方法中，该腈水解酶可以是本发明的任意腈水解酶，但优选该腈水解酶对被检测的腈的Km为500μM或更低，优选为100μM或更低，更优选为50μM或更低。最好该腈水解酶是通过培养紫红红球菌NCIMB 40757或新保藏的菌株NCIMB 40833而得到的。
下面是本发明的一些实施例。实施例1含腈水解酶或可从其中诱导出腈水解酶的、以培养物收集号NCIMB 40757保藏于the National Collection of Industrial and MarineBacteria的紫红红球菌菌株的原始分离物，被转入含下表所示液体培养基的锥形瓶中。<
>搅拌下将该锥形瓶保温24小时。然后从母液分离细胞，重悬浮于50mM pH7磷酸钠缓冲液，再从缓冲液分离。将一部分细胞在-20℃下冷冻贮存，余下的则重悬浮于含50mM丙烯腈的50mM pH7磷酸钠缓冲液。测得这些细胞的腈水解酶比活性为1060μmol/min/g细胞干重。
应用新保藏的菌株NCIMB 40833得到相似的结果。实施例2将如实施例1中所述生长的紫红红球菌菌株的细胞按下列方法固定于交联聚丙烯酰胺珠粒中将含有分离自培养基的细胞的浆状物悬浮于冷冻的缓冲液后再将它加到也处于冷冻缓冲液中的丙烯酰胺单体与甲基双丙烯酰胺(MBA)交联剂的混合物中。随后立即添加氧化还原引发剂体系的水溶性组分。然后将此细胞/单体/引发剂混合物转至搅拌下含冷冻的矿物油和表面活性剂的树脂罐中，再添加能溶于这两个液相的第二种氧化还原引发剂组分以引发聚合。聚合时，细胞被裹入交联的聚合物珠粒中。
将被包裹的细胞转入含50mM丙烯腈的50mM pH7磷酸钠缓冲液。测得这些细胞的腈水解酶比活性为845μmol/min/g细胞干重。实施例3将如实施例2中所述包裹于交联聚合物珠粒中的紫红红球菌细胞置于实验用流化床干燥器中于60℃下干燥至12％湿度。然后将一半干燥的珠粒在室温下贮存于气密性容器中。将包裹的细胞转入含50mM丙烯腈的50mM pH7磷酸钠缓冲液。测得这些细胞的腈水解酶比活性为1038μmol/min/g细胞干重。实施例4将如实施例2中所述包裹于交联聚合物珠粒中并且如实施例3中所述在实验用流化床干燥器中干燥过的紫红红球菌细胞转至冷冻干燥仪在0.1mbar下保持24小时。在室温下将这些珠粒贮存于气密性容器中。实施例5将如实施例1中所述生长的紫红红球菌菌株的细胞悬浮于30℃的纯水中。定期往该细胞悬浮液中加入丙烯腈而将丙烯腈浓度提高到190mM。每次加入前取样以测定细胞悬浮液中的丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸铵浓度。下表显示腈水解酶比活性的初始值、最大值和最终值，最终丙烯酸铵浓度和达到那个浓度的时间。
作为比较，见Appl.Microbiol.Biotechnol.，Nagasawa等(1990)，将238mg干重紫红红球菌J1细胞在20℃下培养于50mL50mM磷酸钾缓冲液(pH7.8)和200mM丙烯腈中。定期加入丙烯腈而将它们的丙烯腈浓度维持在大约200mM。有必要通过加入6M KOH溶液而将反应混合物的pH保持在pH7.8。下表显示初始丙烯腈水解酶比活性、最终丙烯酸铵浓度和达到该浓度用去的时间。
Nagasawa等(1990)声称“甚至加入不同浓度的…细胞时，〔丙烯酸随着紫红红球菌J1〕的积累也几乎一样。因此，对〔丙烯酸随着紫红红球菌J1〕的积累的限制可归于产物抑制而不是酶的灭活”。产物抑制的这种程度未被NCIMB 40757酶显示。实施例6将如实施例1中所述生长的紫红红球菌菌株的细胞悬浮于30℃时50mM pH7磷酸钠缓冲剂的溶液中，该溶液含有下表中所示浓度的丙烯腈。随时间取样以测定细胞悬浮液中丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸铵的浓度。
从上表数据测得该菌株的腈水解酶的Km为30.6μM丙烯腈。
作为比较，下表给出文献中测得的其它两种腈水解酶的Km
这表明紫红红球菌NCIMB 40757腈水解酶清除丙烯腈的能力远远高于以前描述的那些菌株。实施例7将如实施例1中生长的紫红红球菌菌株的细胞悬浮于30℃时1.2M丙烯酸铵的溶液中，该溶液含下表中所示浓度的丙烯腈。随时间取样以测定该细胞悬浮液中丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸铵的浓度。
从上表中的数据测得该菌株的腈水解酶在1.2M丙烯酸铵中的表观Km为145μM丙烯腈。从该表观Km值测得该菌株的Ki为309mM丙烯酸铵。这个相当高的值表明小量的产物抑制作用见于紫红红球菌NCIMB40757腈水解酶。
这可与前面实施例5中所述J1酶示出的产物抑制作用形成对比。实施例8将如实施例1中生长的紫红红球菌菌株的细胞悬浮于30℃时50mMpH7磷酸钠缓冲剂的溶液中，该溶液含下表所示浓度的丙烯腈。随时间取样以测定该细胞悬浮液中丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸铵的浓度。结果示出紫红红球菌NCIMB 40757腈水解酶引起较低量的底物降解
作为比较，引用Nagasawa等(1990)叙述的“研究了〔紫红红球菌J1细胞悬浮于50mM磷酸钾缓冲剂(pH7.8)的〕反应混合物中丙烯腈的浓度对丙烯酸生成速率的影响〔下表〕。生成速率在25-100mM丙烯腈时最高。然而，在高于200mM的浓度下，丙烯腈引起明显的抑制作用。因此，反应混合物中丙烯腈的浓度应保持在低于200mM的浓度”。Nagasawa等的结果示于下表
实施例9将如实施例1中生长的紫红红球菌菌株的细胞悬浮于30℃时50mM缓冲剂的溶液中，该溶液含下表所示的各pH值时50mM丙烯腈。随时间取样以测定该细胞悬浮液中丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸铵的浓度。
这表明紫红红球菌NCIMB 40757腈水解酶的最大活性在与形成丙烯酸铵而引起的相同pH范围(6-7)内，不需加入苛性碱，比较Nagasawa等(1990)，他们叙述道〔紫红红球菌J1细胞悬浮的缓冲液的〕最佳pH是7.8。实施例10将如实施例1中所述生长的紫红红球菌菌株的细胞悬浮于下表所示温度值时的50mM pH7磷酸钠缓冲剂的溶液中。在下表所示温度下将细胞温育5分钟，再添加丙烯腈至浓度为50mM。在15-30分钟内取样以测定该细胞悬浮液中丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸铵的浓度。
最佳活性似乎在55℃下达到的，而且甚至在60℃和65℃下过15～30分钟后还保持高活性。
作为比较，引用Nagasawa等(1990)叙述的“对〔悬浮于pH7.850mM磷酸钾缓冲液中的紫红红球菌J1细胞〕热稳定性的研究表明，直到30℃都能保持活性稳定，在30～50℃之间稍微失活，而在60℃下几乎完全灭活”。实施例11a)如实施例2中所述包裹于交联聚合物珠粒中的紫红红球菌细胞，b)如实施例2中所述包裹于交联聚合物珠粒中、且如实施例3中所述在实验用流化床干燥器中干燥后的紫红红球菌细胞以及c)如实施例2中所述包裹于交联聚合物珠粒中、并如实施例4中所述在实验用流化床干燥器中干燥后又在冷冻干燥仪中进一步干燥过的紫红红球菌细胞，在室温下被贮存于气密性容器中达17天。然后将珠粒转至含50mM丙烯腈的50mM pH7磷酸钠缓冲液。测得三种情况下细胞的腈水解酶比活性分别为a)1023μmol/min/g细胞干重，b)1165μmol/min/g细胞干重，以及c)1456μmol/min/g细胞干重。这表明紫红红球菌菌种1290腈水解酶对呈细胞形式的固定化作用和随后的干燥有相当高的耐力。实施例12将如实施例2中所述包裹于交联聚合物珠粒中的紫红红球菌细胞转入固定的工作容积的反应器并且以下表所示浓度悬浮于30℃的丙烯酸铵中。添加丙烯腈至下表中所示的浓度。固定化细胞中的腈水解酶催化丙烯腈的水解而产生丙烯酸铵。当反应器中丙烯腈浓度降至下表所示的下限浓度时，自动向反应器中添加足量的丙烯腈和水以将丙烯腈浓度提高到下表中所示的上限浓度。每次添加前取样以测定悬浮液中丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸铵的浓度。测定包裹细胞的腈水解酶的初始比活性以及该活性减小一半所需的时间，结果示于下表。
实施例13通过离心和过滤从实施例5中产生的丙烯酸铵溶液中除去细胞原料，测定丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸铵的浓度，结果示于下表。
这就证实NCIMB 40757腈水解酶对丙烯腈具有良好的清除能力，且可实现极低的丙烯酰胺杂质含量。实施例14将a)如上述实施例13中分析的丙烯酸铵样本和b)氨中和的丙烯酸样本用于配制20％的单体混合物，加入丙烯酰胺使总的单体浓度为30％。在两个不同的氧化还原引发剂用量下进行聚合，生成的聚合物的特性粘度(IV)值示于下表
实施例15将上述实施例14中生成的聚合物用于使陶土悬浮液絮凝。未检测到聚合物絮凝效果的差异。
权利要求
1.一种腈水解酶，其特征在于它在pH7.0时对丙烯腈的Km为500μM或更低。
2.权利要求1的腈水解酶，它在pH7.0时对丙烯腈的Km为100μM或更低，优选为50μM或更低。
3.一种腈水解酶，其特征在于它在pH7.0时对丙烯酸铵的Ki至少是100mM。
4.权利要求3的腈水解酶，它在pH7.0时对丙烯酸铵的Ki至少是250mM。
5.一种腈水解酶，其特征在于它的(pH7.0时对丙烯酸铵的Ki)/(pH7.0时对丙烯腈的Km)比值至少是200。
6.权利要求5的腈水解酶，它具有的比值至少是5000。
7.一种腈水解酶，其特征在于它在pH6.8时的丙烯腈水解酶活性至少是它在最佳pH时的丙烯腈水解酶活性的80％。
8.一种腈水解酶，其特征在于它在50℃时保持它在20℃时丙烯腈水解酶活性的至少80％。
9.一种腈水解酶，其特征在于在下列冷冻条件下被固定化于交联聚丙烯酰胺珠粒中之后它保持其初始丙烯腈水解酶比活性的至少80％将含腈水解酶的细胞浆悬浮于冷冻的缓冲液中，再添加至丙烯酰胺单体和亚甲基双丙烯酰胺交联剂在冷冻的缓冲液中的混合物中，然后立即添加氧化还原引发剂体系的水溶性组分，再将该混合物转入搅拌下含冷冻的矿物油和表面活性剂的树脂罐中，接着添加可溶于这两个液相的第二种氧化还原引发剂组分以引发聚合，聚合时细胞被裹入交联的聚合物珠粒中。
10.权利要求9的腈水解酶，当交联的聚丙烯酰胺珠粒在60℃下干燥至12％湿度和/或在0.1mbar时冷冻干燥24小时后，它保持其固定化丙烯腈水解酶比活性的至少90％。
11.权利要求9或10的腈水解酶，当交联的聚丙烯酰胺珠粒在20℃下贮存17天后，它保持其固定化丙烯腈水解酶比活性的至少90％。
12.一种腈水解酶，其特征在于在含125～175mM丙烯腈和2,475～2,525mM丙烯酸铵的水溶液中测得它的半寿命至少为5天。
13.通过培养紫红红球菌NCIMB 40757或NCIMB 40833而得到的腈水解酶。
14.一种微生物，它是能产生腈水解酶的紫红红球菌NCIMB 40757或NCIMB 40833或其突变体。
15.在作为催化剂的权利要求1～13中任一项的腈水解酶存在下和在水的存在下将丙烯腈转化为丙烯酸铵的方法。
16.在水的存在下检测腈的方法，它包括a)在水的存在下将权利要求1～16中任一项的腈水解酶与腈接触b)使腈转化成它相应的铵盐c)检测与腈的转化相关的变化。
全文摘要
提供了新的腈水解酶,它们在pH7.0时对丙烯腈的Km为500μM或更低。新酶还在pH7.0时对丙烯酸铵的Ki至少为100mM。特别是,新腈水解酶的所述Ki与所述Km的比值至少为200。特别优选的腈水解酶得自微生物紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)NCIMB40757或NCIMB40833。这些腈水解酶可用于如下方法中,即在含水态或气态中将丙烯腈转化为丙烯酸铵以及检测含水态或气态中低含量的腈。
文档编号C12R1/61GK1207770SQ96199639
公开日1999年2月10日 申请日期1996年12月12日 优先权日1995年12月12日
发明者Y·C·阿米塔吉, J·胡格斯, N·A·韦伯斯特 申请人:联合胶体有限公司