专利名称：：从大豆废糖蜜中回收异黄酮的制作方法
技术领域：
：本发明涉及从大豆废糖蜜中回收异黄酮的方法。此外，本发明涉及含有异黄酮的所得产品。异黄酮出现在各种豆科植物，包括如大豆的植物蛋白原料中。这些化合物包括黄豆苷、黄豆苷6”-乙酸酯、黄豆苷6”-丙二酸酯、黄豆苷原、染料木苷、染料木苷6”-乙酸酯、染料木苷6”-丙二酸酯、染料木黄酮、大豆异黄酮(glycitin)、大豆异黄酮6”-乙酸酯、大豆异黄酮6”-丙二酸酯、黄豆黄素(glycitein)、鹰嘴豆芽素A，7-羟基-4’-甲氧异黄酮，以及拟雌内酯。一般来说，这些化合物与大豆固有的苦味有关。大豆原料中的异黄酮包括异黄酮糖苷、异黄酮共轭物和配基异黄酮。异黄酮糖苷具有与异黄酮部分连接的葡萄糖分子。异黄酮共轭物具有与异黄酮糖苷的葡萄糖分子连接的附加部分，例如染料木苷6”-乙酸酯含有在染料木苷的葡萄糖分子的6位置上连接的乙酸酯基。配基异黄酮单独由异黄酮部分组成。大豆包含具有对应糖苷、共轭物和配基成员的三个“族”的异黄酮化合物染料木黄酮族、黄豆苷原族和黄豆黄素族。染料木黄酮族包括糖苷染料木苷、共轭物染料木苷6”-丙二酸酯(染料木苷的6”-丙二酸酯)和染料木苷6”-乙酸酯(染料木苷的6”-乙酸酯)、以及配基染料木黄酮。黄豆苷原族包括糖苷黄豆苷、共轭物黄豆苷6”-丙二酸酯和黄豆苷6”-乙酸酯；以及配基黄豆苷原。黄豆黄素族包括糖苷大豆异黄酮，共轭物大豆异黄酮6”-丙二酸酯，以及配基黄豆黄素。在生产市售产品如植物蛋白浓缩物时，关键在于除去这些物质。例如，常规生产大豆浓缩蛋白的方法中，用含水酸或含水乙醇提取大豆薄片，以便从大豆薄片中除去水溶性物质，许多异黄酮溶解在提取物中。包含异黄酮的水溶性物质提取物就是大豆废糖蜜。大豆废糖蜜是一般被丢弃的生产大豆浓缩蛋白的副产品物质。因此，大豆废糖蜜价格便宜，而且是异黄酮理想的来源，只要能从大豆废糖蜜中分离出异黄酮即可。近来人们认识到含在植物蛋白原料如大豆中的异黄酮具有药用价值。配基异黄酮特别有益。染料木黄酮和黄豆苷原可以明显降低心血管危险因子。参见“PlantandMammalianEstrogenEffectsonPlastmaLipidsofFemaleMonkeys”，Circulation，Vol.90，P.1259(1994年10月)。染料木黄酮和黄豆苷原还被认为可以减少由于妇女内生雌激素含量降低或改变而引起的症状，如绝经或经前综合症。此外，正如以下文章描述的，近来人们认识到配基异黄酮可以抑制人体癌细胞的生长，如乳腺癌细胞和前列腺癌细胞，Peterson和Barnes的“GenisteinInhibitionoftheGrowthofHumanBreastCancerCells，IndependencefromEstrogenReceptorsandtheMulti-DrugResistanceGenne”，BiochemicalandBiophysicalResearch，Communications，Vol.179，No.1pp.661-667，1991年8月30日；Peterson和Barnes的“GenisteinandBiochaninAInhibittheGrowthofHumanProstrateCancerCellsbutnotEpidermalGrowthFactorReceptorTyrosineAutophosphorylation”，TheProstate，Vol.22，pp.335-345(1993)；以及Barnes等人的“SoybeansInhibitMammaryTumorsinModelsofBreastCancer”，MutagensandCarcinogensintheDiet，pp.239-253(1990)。配基异黄酮具有以下通式其中R1、R2、R3和R4可以选自H、OH和OCH3。染料木黄酮具有其中R1＝OH、R2＝H、R3＝OH而R4＝OH的上式，黄豆苷原具有其中R1＝OH、R2＝H、R3＝H而R4＝OH的上式，黄豆黄素具有其中R1＝OH、R2＝OCH3、R3＝H而R4＝OH的上式。因此，本发明涉及异黄酮，和从大豆废糖蜜中回收富含异黄酮的物质。本发明还涉及异黄酮糖苷和配基异黄酮——涉及将大豆废糖蜜的异黄酮转化成异黄酮糖苷和配基异基酮，以及从大豆废糖蜜中回收富含异黄酮糖苷的物质和富含配基异黄酮的物质。将植物蛋白异黄酮共轭物转变成配基异黄酮的一般方法是已知的，由本申请受让人拥有的、于1995.6.7递交的现在仍未决的申请US08/477,102中提供了这种方法。本领域其它已知将异黄酮糖苷转变成配基异黄酮的方法在如Obata等人的JP申请258,669中有所描述。这些方法没有提供从大豆废糖蜜中回收富含异黄酮物质的方法。这种方法也没有提供将异黄酮共轭物转变成异黄酮糖苷或转变成配基异黄酮的方法。而且，这些方法仅仅达到中等程度地转化异黄酮糖苷成为配基异黄酮，而且需要基本上一段时间去完成这个中等程度的转变。因此，本发明的目的是提供富含异黄酮的物质以及从大豆废糖蜜中生产这种物质的方法。本发明的另一个目的是提供富含异黄酮糖苷的物质以及从大豆废糖蜜中生产这种物质的方法。本发明进一步的目的是提供富含配基异黄酮的物质以及从大豆废糖蜜中生产这种物质的方法。本发明涉及一种富含异黄酮的物质，以及从含异黄酮的大豆废糖蜜中回收这种物质的方法。该方法包括提供含有异黄酮的大豆废糖蜜原料，并且从大豆废糖蜜原料中在足以使多数异黄酮含在豆粕中的pH和温度下分离豆粕。分离过程中优选pH为约3.0-约6.5，温度为约0℃-约35℃。豆粕就是富含异黄酮的物质。在一个实施方案中，从富含异黄酮原料豆粕中形成富含糖苷的异黄酮原料。由富含异黄酮原料形成水浆液。在约2℃-约120℃温度且约6-约13.5pH值下处理浆液，处理的时间要足以将富含异黄酮原料中的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。然后可以从浆液中分离富含异黄酮糖苷物质的豆粕。在另一实施方案中，从富含异黄酮原料豆粕中形成富含配基异黄酮的原料。由富含异黄酮的原料形成水浆液。在约2℃-约120℃温度且约6-约13.5pH下以足以将富含异黄酮原料中的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷的时间处理浆液。将能够裂解1，4-糖苷键的酶与浆液中的异黄酮糖苷在约5℃-约75℃温度且约3-约9pH值下接触，接触的时间要足以将异黄酮糖苷转化成配基异黄酮。可以从浆液中分离富含配基异黄酮物质的豆粕。另一方面，本发明涉及富含异黄酮糖苷的物质，以及从大豆废糖蜜中回收这种物质的方法。在约2℃-约120℃温度下且pH值为约6-约13.5之间以足以将含在大豆废糖蜜中的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷的时间处理大豆废糖蜜。从大豆废糖蜜原料中在足以使多数异黄酮糖苷含在豆粕的pH和温度下分离富含异黄酮糖苷物质的豆粕。再一方面，本发明涉及富含配基异黄酮的物质，以及从大豆废糖蜜中回收这种物质的方法。在约2℃-约120℃温度下且pH值为约6-约13.5之间，以足以将含在大豆废糖蜜中的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷的时间处理大豆废糖蜜。用能够裂解1，4-糖苷键的酶在约5℃-约75℃温度且约3-约9pH下与大豆废糖蜜原料中的异黄酮糖苷以足以将异黄酮糖苷转化成配基异黄酮的时间接触。从大豆废糖蜜原料中在足以使多数配基异黄酮含在豆粕的pH和温度下分离富含配基异黄酮物质的豆粕。这里用于所描述方法的起始原料是大豆废糖蜜。大豆废糖蜜是许多涉及大豆或大豆衍生物的商业方法的副产品，例如生产提取蛋白、蛋白乳清和浓缩蛋白产品的方法的副产物。因此，得到大豆废糖蜜的量大到可以使大豆废糖蜜成为相对便宜的商品的程度。一般认为大豆废糖蜜是通过醇或酸的洗涤从大豆不溶物中除去的大豆可溶物。大豆废糖蜜一般是含有约50％或更多固形物的含水混合物，其中固形物包含约6％(基于大豆废糖蜜的总重量)的蛋白、约3％灰分、约5％脂肪和约36％的碳水化合物。本领域还已知大豆废糖蜜是大豆的可溶物质。这里使用的术语“大豆废糖蜜原料”是指含有大豆废糖蜜和/或大豆废糖蜜衍生物的组分，如富含异黄酮糖苷的大豆废糖蜜原料和富含配基异黄酮的大豆废糖蜜原料。因此，这些术语可以在这里互换使用。在一优选实施方案中，大豆废糖蜜起始原料从已经按常规方式由溶剂提取除去油的脱脂大豆薄片中得到。用加入一种或多种合适酸如醋酸、硫酸、磷酸、盐酸或任何其它合适试剂调节成酸性pH、优选约pH4-约pH5的水提取脱脂大豆薄片。酸性提取剂与大豆薄片的重量比优选为约16∶1-约20∶1。为提高提取的效果，可将提取剂的温度升高于室温之上，优选约32℃和约55℃之间。提取之后，从大豆不溶物中除去大豆废糖蜜提取液。在另一实施方案中，用含水的醇提取脱脂大豆薄片得到大豆废糖蜜起始原料。优选用约80％的含水乙醇以提取剂与大豆薄片的重量比为约16∶1-约20∶1，提取薄片。可将醇提取剂的温度升高于室温之上，优选约32℃-约55℃，以便提高提取的效果。从大豆不溶物中除去大豆废糖蜜提取液，得到大豆废糖蜜起始原料。从大豆废糖蜜起始原料中可以回收到富含异黄酮的物质。可以用水将大豆废糖蜜原料稀释至固形物含量达约6％-约13％，首选13％。本方法并不要求稀释大豆废糖蜜原料，但是稀释相对稠的大豆废糖蜜原料便于加工原料。在多数异黄酮于实行分离过程时会从大豆废糖蜜中分离的pH和温度下处理大豆废糖蜜原料，优选稀释的原料。在一个优选实施方案中，在约3.0-约6.5的pH及约0℃-约35℃温度下处理大豆废糖蜜原料，使大豆废糖蜜中异黄酮的不溶性最大化。在优选范围之外的pH值及35℃以上的温度下可以从大豆废糖蜜中分离出异黄酮，但很少选择这些条件，这是因为在分离过程中从大豆废糖蜜中分离的异黄酮很少。如果需要，可用适宜的常规酸性或碱性试剂调整大豆废糖蜜的pH。大豆废糖蜜最优选的pH应调整至约4.5。还优选将大豆废糖蜜冷凝或冷却至约0℃-约10℃的温度，首选约4℃-约7℃。然后对大豆废糖蜜原料实行分离过程，从大豆废糖蜜原料中分离富含异黄酮物质的豆粕。进行分离的同时保持大豆废糖蜜在前述的pH和温度条件。在一个实施方案中，通过离心大豆废糖蜜并从豆粕中滗析上清液，分离富含异黄酮物质的豆粕。优选在约0℃-约10℃下进行大约30分钟的约3,000-约10,000rpm的离心。另一实施方案中，通过过滤从大豆废糖蜜中分离富含异黄酮的豆粕。优选在前述pH和温度条件下完成过滤过程，首选在约4.5的pH及约0℃-约10℃温度下进行。本发明的另一个方面，从大豆废糖蜜中回收富含异黄酮糖苷物质的豆粕。如上述得到大豆废糖蜜起始原料。为便于原料加工，尽管并不需要，但还是优选将大豆废糖蜜原料稀释至约6％-约13％的固形物含量，首选约13％。然后对大豆废糖蜜实行转化操作，使大豆废糖蜜中的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。大豆废糖蜜中异黄酮的基本部分是异黄酮共轭物，因此转化过程实际上是增加大豆废糖蜜原料中异黄酮糖苷的量。早已发现转化依赖于大豆废糖蜜的pH和温度。转化大豆废糖蜜中异黄酮共轭物成异黄酮糖苷的pH范围为约6-约13.5。如果需要，应当将大豆废糖蜜的pH调至所需pH，若pH需要增加，可用适宜的碱、苛性剂或碱试剂，或者，若pH需要降低，可用适宜的酸或酸试剂。早已发现将异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷需要碱催化，所以最优选使用高pH以达到快速转化。异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷的首选pH是pH为约9-约11。转化大豆废糖蜜中异黄酮共轭物成异黄酮糖苷的温度范围为约2℃-约120℃。容易发生转化的温度范围取决于大豆废糖蜜原料的pH。发明人发现当pH相对高时较低温度下易发生转化。例如，pH约11时快速且有效发生转化的温度范围为约5℃-约50℃。pH约9时，有效发生转化的温度位于约45℃-约75℃范围内。当大豆废糖蜜的pH相对低时，转化发生在较高温度下。例如，pH约6时，转化发生在约80℃-约120℃的温度范围内。在一个优选的实施方案中，转化是在约35℃及pH约11下完成的。另一个优选的实施方案中，转化是在约73℃温度及pH约9下完成的。将异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷所要求的时间主要取决于大豆废糖蜜所运用的pH和温度。一般这个转化时间从15分钟至最长达几个小时或更长。高pH和高温下转化发生得较迅速。pH为约9时，转化基本上在73℃下在约4小时至约6小时下完成。在首选的实施方案中，异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷的pH为约11，温度约35℃，时间为约30分钟-约1小时，优选约45分钟。转化异黄酮共轭物成异黄酮糖苷是非常有效的，将至少多数的、且优选基本上全部存在的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。术语“多数”指至少约50％的转化程度。术语“基本上全部”指至少约80％首选至少约90％的转化程度。将异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷之后，可以从大豆废糖蜜原料中分离富含异黄酮糖苷物质的豆粕。在多数异黄酮糖苷于分离过程中会从大豆废糖蜜原料中分离的pH和温度下处理大豆废糖蜜原料。在一优选的实施方案中，在分离过程中将大豆废糖蜜原料保持在约3-约6.5、首选约4.5的pH以及约0℃-约35℃、优选约0℃-约10℃、首选约4℃-约7℃的温度下。如果需要，可以用合适的常规酸性或碱性试剂调节大豆废糖蜜的pH。分离可以通过常规用于从液体中分离固体的方式来完成。优选通过如上述相应于从大豆废糖蜜原料中分离富含异黄酮豆粕的离心或过滤方式分离富含异黄酮糖苷豆粕。本发明还有的另一个方面，从大豆废糖蜜中回收富含配异基黄酮物质的豆粕。如上述得到大豆废糖蜜起始原料，优选用水稀释至固形物含量为约6％-约13％。如上所述处理大豆废糖蜜起始原料，将异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。然后在适合转化异黄酮糖苷成配基异黄酮的pH和温度下，通过合适的酶和大豆废糖蜜原料中的异黄酮糖苷接触，对富含异黄酮糖苷的大豆废糖蜜原料进行酶的转化操作。两步转化过程有效地将大豆废糖蜜原料中基本上全部的异黄酮共轭物和异黄酮糖苷转化成配基异黄酮，即实际上增加大豆废糖蜜原料中配异基黄酮的量。已经发现异黄酮糖苷转化成配基异黄酮取决于各种因素，包括存在于大豆废糖蜜原料的酶的类型、酶浓度分布、酶活性以及转化过程中大豆废糖蜜原料的pH和温度。完成转化所需要的酶是能够裂解异黄酮糖苷中异黄酮部分和葡萄糖分子间糖苷连接键的酶。在优选的实施方案中，酶是能够裂解1，4-糖苷键的糖酶或葡糖淀粉酶。酶可以是大豆废糖蜜原料中固有存在的，也可以是加到大豆废糖蜜原料的可商购的酶。固有存在的酶在这里称作“残余的”酶，而加到大豆废糖蜜的酶这里称作“补充的”酶。大豆废糖蜜原料中应当存在足够的酶，将至少多数、优选基本上全部的异黄酮糖苷转化成配基异黄酮。普遍认为，如果大豆废糖蜜原料中的残余酶不足以完成转化，则应当向大豆废糖蜜原料加入补充酶。在优选的实施方案中，不管是否大豆废糖蜜原料中存在足够的残余酶，大豆废糖蜜原料中都加入补充酶，这是因为加入补充酶大大减少了实现基本上完全转化糖苷至配基所必需的时间。如果加补充酶，则应当加补充酶使得大豆废糖蜜原料中所存在的酶的总浓度以干基计为固体重量的约0.1％-约10％。在所选pH和温度下基于其最佳活性选择补充酶，选择的依据还有经济效率。补充酶是能够裂解异黄酮糖苷中异黄酮部分和葡糖分子间键的酶，如能够裂解1，4-糖苷键的糖酶和葡糖淀粉酶。优选的补充酶是可商购得到的α-和β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶和果胶酶。特别优选的酶有Biopectinase100L(优选在约3-约6的pH范围下使用)、Biopectinase300L(最佳pH范围约3-约6)、BiopectinaseOK70L(最佳pH范围约3-约6)、Biolactase30,000(最佳pH范围约3-约6)、NeutralLactase(最佳pH范围约6-约8)，所有这些可从QuestInternational，183357thStreet，邮政信箱3917，Sarasota，佛罗里达34243中得到。特别优选的还有从AmanoInternationalEnzymeCo.Inc。邮政信箱1000，Troy，弗吉尼亚22974中得到的两种酶LactaseF(优选在约4-约6的pH范围下使用)和Lactase50,000(最佳pH范围约4-约6)。其它特别优选的补充酶包括从EnzymeDevelopmentCorporation，2PennPlaza，Suite2439，NeWYork，纽约10121得到的G-ZymeG990(最佳pH约4-约6)以及EnzecoFungalLactaseConcentrate(最佳pH约4-约6)；从NovoNordiskBioindustrials，Inc.，33TurnerRoad，Danbury，康涅狄格06813得到的Lactozyme3000L(优选在约6-约8的pH范围下使用)和α-Gal600L(优选在约4-约6.5的pH范围下使用)；从GistBrocadesFoodIngredients，Inc.，KingofPrussia，宾夕法尼亚，19406得到的MaxilactL2000(优选在约4-约6的pH范围下使用)；以及从PfizerFoodScienceGroup，205East42ndStreet，NewYork，纽约10017得到的NeutralLactase(优选在约6-约8的pH范围下使用)。转化异黄酮糖苷成配基异黄酮的pH范围为约3-约9。所用的pH主要取决于所使酶的类型，并且应当以此作为选择。虽然据信大豆废糖蜜原料在转化过程期间pH降低，但残余酶在约7-约9的pH范围内具有活性。补充酶在酶制造商说明的最佳pH范围内具有活性，这一点如上所示的几种具体酶。一般，在中性pH范围约6-约8，或在酸性pH范围约3-约6内补充酶都具活性。大豆废糖蜜原料的pH可以调整至实施转化异黄酮糖苷至配基异黄酮所需的值。在大部分实例中，通过添加一种或几种合适的酸如醋酸、硫酸、磷酸、盐酸或任何其它合适的试剂，将相对高的pH或转化异黄酮共轭物成异黄酮糖苷所需的碱性pH降低下来。转化糖苷成配基的大豆废糖蜜原料的温度范围为约5℃-约75℃。温度非常影响酶的活性，以及由此的转化率。补充酶可在70℃以上有活性，例如α-Gal600L在75℃时具活性，但优选在较低温下实施转化，以避免酶失活。在一优选实施方案中，转化在约35℃-约45℃之间完成。将糖苷转化成配基所需的时间取决于与酶相关的因素，特别是浓度，以及系统的温度和pH。在大部分的实例中，在24小时之内便可以达到基本上完全的转化，但是，为大大加快反应速率，优选添加补充酶。所选择的补充酶、酶浓度、pH和温度应当优选造成在约2小时内基本上完成转化，首选在1小时内。异黄酮糖苷到配基异黄酮的转化非常有效，将存在的至少多数、优选基本上全部的糖苷转化成配基。术语“多数”指至少约50％的转化程度。术语“基本上全部”指至少约80％的转化程度，最优选至少约90％。将异黄酮糖苷转化成配基异黄酮之后，可从大豆废糖蜜原料中分离富含配基异黄酮物质的豆粕。在多数配基异黄酮于分离过程中会从大豆废糖蜜原料中分离的pH和温度下处理大豆度糖蜜原料。分离过程中优选将大豆废糖蜜原料保持在约3-约6.5、首选约4.5的pH及约0℃-约35℃、优选约0℃-约10℃、首选约4℃-约7℃的温度下。如果需要，可用合适的常规酸性或碱性试剂调整大豆废糖蜜原料的pH。可以通过从液体中分离固体的常规方式实现分离过程。优选通过如上述相应于从大豆废糖蜜原料中分离富含异黄酮豆粕的离心或过滤方式分离富含配基异黄酮的豆粕。富含配基异黄酮物质还可以从由大豆废糖蜜中回收的富含异黄酮物质中得到，其中从大豆废糖蜜中回收富含异黄酮物质的方法描述如上。把水加到富含异黄酮物质的回收豆粕中，形成富含异黄酮物质的浆液。优选将浆液稀释至约6％-约13％固形物，但较高固形物含量的也可以使用。然后在上述相应于转化大豆废糖蜜中异黄酮共轭物成异黄酮糖苷的同等条件下处理浆液，使浆液中异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。具体说，在约6-约13.5、优选约pH9-约pH11的pH以及约2℃-约120℃的温度下处理浆液约15分钟至几个小时的时间。首选在pH约11和温度约5℃-约50℃、优选约35℃下处理浆液约30分钟-约1小时；或者在pH约9和温度约45℃-75℃、优选约73℃下处理约4小时-约6小时。如果需要，可以按上述从大豆废糖蜜中分离富含异黄酮物质的相似方式将富含异黄酮糖苷的物质从浆液中分离出来。然后在上述相应于转化大豆废糖蜜原料中的异黄酮糖苷成配基异黄酮的等同条件下将浆液中的异黄酮糖苷转化成配基异黄酮。具体说，在合适的pH和温度下在一段时间内将浆液中异黄酮糖苷与能够裂解异黄酮糖苷的异黄酮部分和葡糖分子间糖苷连接键的酶接触，接触时间足以将异黄酮糖苷转化成配基异黄酮。优选的酶、pH条件、温度和时间描述如上。按上述从大豆废糖蜜中分离富含异黄酮物质的相似方式从浆液中分离富含配基异黄酮的物质。还可以从由大豆废糖蜜原料回收的富含异黄酮糖苷物质中生产富含配基异黄酮的物质，其中从大豆废糖蜜原料中回收富含异黄酮糖苷物质的方法描述如上。把水加到富含异黄酮糖苷物质的回收豆粕中，形成富含异黄酮糖苷物质的浆液。优选稀释浆液至约6％-约13％固形物，但较高固形物含量的也可以使用。按上述相应于从富含异黄酮浆液中形成富含异黄酮糖苷浆液的同样方式将浆液中的异黄酮糖苷转化成配基异黄酮。转化后按上述从大豆废糖蜜中分离富含异黄酮物质的相似方式从浆液中分离富含配基异黄酮物质。本发明通过以下的实施例作更详细地说明。实施例旨在举例说明，而无论如何不应当认为是限制或者说限定本发明的范围。如上提及的，包括大豆废糖蜜的大豆原料包括具有对应糖苷、共轭物和配基成员的染料木黄酮、黄豆苷原和黄豆黄素“族”异黄酮，其中染料木黄酮族含有共轭物染料木苷6”-丙二酸酯(6”-OMal染料木苷)、染料木苷6”-乙酸酯(6”-OAc染料木苷)、糖苷染料木苷和配基染料木苷；黄豆苷原族含有共轭物黄豆苷6”-丙二酸酯(6”-OMal黄豆苷)、黄豆苷6”-乙酸酯(6”-OAc黄豆苷)、糖苷黄豆苷和配基黄豆苷；而黄豆黄素族含有共轭物大豆异黄酮6”-丙二酸酯(6”-OMal大豆异黄酮)、大豆异黄酮6”-乙酸酯(6”-OAc大豆异黄酮)、糖苷大豆异黄酮和配基大豆异黄酮。在以下实施例中，异黄酮的相对浓度或者以异黄酮族的总浓度计，或者以一个异黄酮族中每种异黄酮的单独的百分数计。例如，异黄酮的染料木黄酮族的总浓度是6”-OMal染料木苷、6”-OAc染料木苷、染料木苷和染料木黄酮浓度的总和；且染料木黄酮族中每个异黄酮的百分数是相对于其它染料木黄酮族异黄酮作的测定％染料木苷+％6”OMal染料木苷+％6”OAc染料木苷+％染料木黄酮＝100％。实施例1第一个实验，在各种大豆废糖蜜浓度下检验从大豆废糖蜜中富含异黄酮物质的回收率。在具有选择浓度的大豆废糖蜜样品中、在根据本发明方法由大豆废糖蜜样品分离的豆粕中、以及在经分离过程除去豆粕的液体乳清中测定每个异黄酮族的总浓度。分析大豆废糖蜜中所存在的所有形式异黄酮的总浓度。用水将大豆废糖蜜的样品稀释至固形物含量为28％(1∶2稀释)、13.7％(1∶4稀释)和6.6％(1∶8稀释)。所有样品调至pH4.5，然后以3000rpm之间的速率离心经处理的样品30分钟，从样品中分离并产生液体乳清和豆粕部分。一组样品在0.6℃温度下离心。在60℃温度下离心具有28％和13.7％大豆废糖蜜固形物的样品，用以和具有相同大豆废糖蜜固形物浓度而在0.6℃下分离的样品作比较。将样品所得的液体和豆粕部分用于分析所存在各种形式异黄酮的总浓度。表1显示从前述试验中获得的各种豆粕和液体部份中异黄酮的浓度。所示的全部是所有形式具体异黄酮(包括共轭物、糖苷和配基形式)的全部，用每克豆粕或液体部份固体中mg异黄酮表达。</tables>在所有分离后的样品中，豆粕中的异黄酮浓度明显高于大豆废糖蜜起始原料中的，并且大大高于液体乳清部份固体中的异黄酮浓度。0.6℃下分离的样品在豆粕中比60℃下分离的相应样品含有更高的异黄酮浓度，而60℃下分离的样品在乳清部份固体中具有较高的异黄酮浓度。实施例2另一个实验，检验从大豆废糖蜜中富含异黄酮糖苷物质的回收率。将大豆废糖蜜中的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷，并从大豆废糖蜜原料中分离富含异黄酮糖苷豆粕。异黄酮族丙二酸酯和乙酸酯的百分比和浓度定量减少，同时同一异黄酮族的糖苷的百分比相应地定量增加，据此测定转化的程度。分析大豆废糖蜜起始原料中各个异黄酮化合物的浓度。通过用水按下列比例稀释大豆废糖蜜制作大豆废糖蜜的两个样品1∶4(100g废糖蜜+300g水)以及1∶8(50g废糖蜜+350g水)。样品调至pH11，样品温度在35℃下持续30分钟。然后将样品调至pH4.5及温度4℃。4℃下以10,000rpm离心样品，将废糖蜜样品分成豆粕和液体乳清。分析乳清和豆粕中各个异黄酮化合物的浓度。表2表示与大豆废糖蜜起始原料相比，由异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷所得各种形式异黄酮之间的比例变化。异黄酮浓度表示为样品中的每百万份中的份数(ppm)，并且表示为液体或豆粕部分中具体异黄酮总量(共轭物、糖苷和配基形式的总和)的百分比。表2<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="870">样品染料木苷6”-OMAL-染料木苷6”-OAC-染料木苷染料木黄酮黄豆苷6”-OMAL-黄豆苷6”-OAC-黄豆苷黄豆苷原大豆异黄酮6”-OMAL-大豆异黄酮黄豆黄素大豆废糖蜜ppm％异黄酮1∶4稀释乳清ppm％异黄酮1∶4稀释豆粕ppm％异黄酮1∶8稀释乳清ppm％异黄酮1∶8稀释豆粕ppm％异黄酮46787722219828621992852982751799132922171680241101000000000008813012611361272135337426529216133973356941261797928201796192118751381210429100000084221123212712452500523419214429640694114610010511288002860036037006640000</table></tables>在所有受到调节使异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷的样品中，豆粕和液体部分二者中的异黄酮糖苷百分比明显高于相应未转化的大豆废糖蜜样品，且这些样品中对应的异黄酮共轭物的百分比明显地较低，这证明大部分异黄酮共轭物被转化成它们的糖苷形式。另外，正如从大豆废糖蜜起始原料与每个样品中乳清和豆粕部分的相关浓度中可以看出，当分离过程时，大部分糖苷异黄酮被分离在豆粕中，形成了富含异黄酮糖苷的物质。实施例3再一个实验，检验大豆废糖蜜中异黄酮成为配基异黄酮的转化率。将大豆废糖蜜中的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷，再将异黄酮糖苷转化成配基异黄酮。测定异黄酮糖苷至配基异黄酮的转化程度根据的是异黄酮族糖苷浓度的定量减少，同时同一异黄酮族配基百分比相应地定量增加。用水将大豆废糖蜜起始原料稀释成1∶4，并且分析各个异黄酮化合物的浓度。然后将废糖蜜的pH调至11。大豆废糖蜜置于室温下持续1小时，以便产生富含糖苷的大豆废糖蜜原料。分析富含糖苷的大豆废糖蜜原料中各个异黄酮化合物的浓度。原料的pH调至4.5之后从富含糖苷的大豆废糖蜜原料中准备四份样品。在每份样品中分别按废糖蜜固体的重量添加10％的以下酶G-Zyme990，Biopectinase100L，Lactase50,000和α-Gal600L。然后在50℃将样品处理6小时，形成富含配基异黄酮的大豆废糖蜜原料。分析富含配基异黄酮大豆废糖蜜的异黄酮含量。表3表示从前述试验中所得各种形式异黄酮之间的分布。异黄酮浓度表示为样品中的每百万份中的份数(ppm)，还表示为具体异黄酮总量(共轭物、糖苷和配基形式的总和)的百分比。表3酶处理样品的配基异黄酮含量明显高于大豆废糖蜜和富含糖苷的大豆废糖蜜原料，这说明酶处理将基本数量上的糖苷异黄酮转化成了配基异黄酮。通过Lactase50,000和α-Gal600L样品中的异黄酮分布，证明了选择合适的酶、酶浓度、转化pH和温度能允许将基本上全部的的异黄酮糖苷转化成配基异黄酮。实施例4最后一个实验，检验富含异黄酮物质、富含异黄酮糖苷物质和富含配基异黄酮物质的异黄酮含量，并比较这些物质中异黄酮的分布。用水按1∶4比稀释大豆废糖蜜。将稀大豆废糖蜜的一份样品调至pH4.5，在冰浴中冷凝30分钟至0.6℃温度，并以3000rpm的速率离心30分钟分离富含异黄酮物质的豆粕。然后将剩余的稀大豆废糖蜜用氢氧化钠调至pH11，并在50℃下处理1小时，使废糖蜜中异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。将富含糖苷废糖蜜的一份样品调至pH4.5，冰浴中冷凝30分钟至0.6℃温度，并以3000rpm的速率离心30分钟分离富含异黄酮糖苷物质的豆粕。将剩余的富含异黄酮糖苷大豆废糖蜜原料调至pH4.5，并以2.6g酶/100g废糖蜜原料的浓度加入酶G-Zyme990。然后在50℃下处理酶和富含异黄酮糖苷大豆废糖蜜原料18-20小时，将异黄酮糖苷转化成配基异黄酮。将富含配基异黄酮的大豆废糖蜜原料于冰浴中冷凝30分钟至0.6℃温度，并以3000rpm的速率离心30分钟分离富含配基异黄酮物质的豆粕。然后分析富含异黄酮物质、富含异黄酮糖苷物质和富含配基异黄酮物质的豆粕中的异黄酮含量。表4表示富含异黄酮物质、富含异黄酮糖苷物质和富含配基异黄酮物质的豆粕中异黄酮的分布。异黄酮分布表示为具体异黄酮总量(共轭物、糖苷和配基形式的总和)的百分比。</tables>从物质的异黄酮分布中可以看到转化步骤的效率。富含异黄酮糖苷物质含有异黄酮糖苷的量明显高于富含异黄酮物质和富含配基异黄酮物质，它具有的异黄酮含量几乎完全由异黄酮糖苷组成。富含配基异黄酮物质含有配基异黄酮的量明显高于富含异黄酮物质和富含异黄酮糖苷物质，它具有的异黄酮含量几乎全部由配基异黄酮组成。在以上实施例中，所有表示的6”-OMal-染料木苷、6”-OAc-染料木苷、6”-OMal-黄豆苷、6”-OAc-黄豆苷、大豆异黄酮、6”-OMal-大豆异黄酮和黄豆黄素的百分比皆是计算值。下面描述确定大豆产品中异黄酮数量的方法。将0.75g样品(喷雾干燥或精磨的粉)和50ml80/20甲醇/水溶剂混合，从大豆产品中提取异黄酮。用轨道摇动器在室温下摇动混合物2小时。2小时后，通过WhatmanNo.42滤纸过滤除去剩余的未溶物质。用4ml水和1ml甲醇稀释5ml的滤液。使用HewlettPackardC18Hypersil反相柱，通过HPLC(高效液相色谱)分离提取异黄酮。将异黄酮注到柱上并用溶剂梯度洗脱，梯度开始时为88％甲醇、10％水和2％冰醋酸，结束时为98％甲醇和2％冰醋酸。在0.4ml/min的流速下，所有异黄酮-染料木苷、6”-0-乙酰染料木苷、6”-0-丙二酰染料木苷、染料木黄酮、黄豆苷、6”-0-乙酰黄豆苷、6”-0-丙二酰黄豆苷、黄豆苷、大豆异黄酮及其衍生物和黄豆黄素-被清晰地解析了。测定260mm下UV吸收的峰。用HPLC-质谱仪进行峰鉴定。使用由IndofineChemicalCompany，Sommerville，NJ得到的纯标准样(染料木苷、染料木黄酮、黄豆苷和黄豆苷原)作定量。计算上述每个化合物的响应系数(积分面积/浓度)并且用它测定未知样品的数量。对没有纯标准样可得到的共轭形式来说，假定响应系数是母体分子的响应系数，但母体分子对分子量差异作了校正。假定大豆异黄酮的响应系数是对分子量差异作过校正的染料木苷的响应系数。该方法提供了对各种异黄酮的定量。为方便起见，可以计算所有的染料木黄酮、所有的黄豆苷原和所有的黄豆黄素，并且如果所有的共轭形式都转化成它们分别的非共轭形式，则表示为这些化合物的聚集重量。还可以使用酸水解转化共轭形式的方法直接测定这些所有的异黄酮。前述的内容仅是本发明优选的实施方案。在不超出后面权利要求书要求的实质和更宽方面的范围可以作出各种变化和改换，根据专利法包括DoctrineofEquivalents的基本原则可以解释这一点。权利要求1.一种从大豆废糖蜜中获得富含异黄酮物质的方法，包括提供含有异黄酮的大豆废糖蜜原料；在有效造成多数异黄酮将含在富含异黄酮物质的pH和温度下，从所说的大豆废糖蜜原料中分离所说的富含异黄酮物质。2.根据前述权利要求1的方法，其中所说的富含异黄酮物质是在pH约3-约6.5且温度约0℃-约35℃下从所说大豆废糖蜜原料中分离的。3.根据前述权利要求2的方法，其中所说的富含异黄酮物质是在pH约4.5时从所说大豆废糖蜜原料中分离的。4.根据前述权利要求2的方法，其中所说的富含异黄酮物质是在约0℃-约10℃温度下从所说大豆废糖蜜原料中分离的。5.权利要求1的方法，还包括在从所说大豆废糖蜜原料中分离所说富含异黄酮物质之前，形成具有固形物含量约3％-约28％的大豆废糖蜜原料的含水混合物。6.根据前述权利要求1的方法，其中所说的富含异黄酮物质是通过离心从所说大豆废糖蜜原料中分离的。7.根据前述权利要求6的方法，其中所说的离心是当所说大豆废糖蜜原料在温度约0℃-约10℃且pH约3-约6.5时进行的。8.根据前述权利要求1的方法，其中所说的富含异黄酮物质是通过过滤从所说大豆废糖蜜原料中分离的。9.根据前述权利要求8的方法，其中所说的过滤是当所说大豆废糖蜜原料在温度约0℃-约10℃且pH约3-约6.5时进行的。10.权利要求1的方法，还包括形成所说的分离后的富含异黄酮物质的含水浆液，所说的富含异黄酮物质含有异黄酮共轭物；并且在一定温度和一定pH下以足够的时间处理所说的浆液，以便将所说浆液中的所说异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷，形成富含异黄酮糖苷的浆液。11.根据前述权利要求10的方法，其中所说的富含异黄酮物质的含水浆液具有约6％-约13％固形物含量。12.根据前述权利要求10的方法，其中将所说的浆液在pH约6-约13.5且温度约2℃-约120℃下处理约15分钟-约6小时的时间，以便将所说的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。13.根据前述权利要求12的方法，其中将所说的浆液在pH约9-约11且温度约5℃-约75℃下处理约15分钟-约6小时的时间，以便将所说的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。14.权利要求10的方法，还包括从所说的浆液中分离富含异黄酮糖苷的物质。15.根据前述权利要求14的方法，其中所说富含异黄酮糖苷的物质是在pH约3-约6.5且温度约0℃-约35℃下从所说浆液中分离的。16.根据前述权利要求15的方法，其中所说富含异黄酮糖苷的物质是在温度约0℃-约10℃下从所说浆液中分离的。17.权利要求10的方法，还包括将所说异黄酮共轭物转化成所说异黄酮糖苷之后，在一定温度和一定pH下将酶和所说浆液中的异黄酮糖苷接触足够的时间，使异黄酮糖苷转化成配基异黄酮，形成富含配基异黄酮的浆液。18.根据前述权利要求17的方法，其中所说的酶与所说浆液中的所说异黄酮糖苷在pH约3-约9且温度约5℃-约75℃下接触至少约1小时。19.根据前述权利要求17的方法，其中酶与所说浆液中所说异黄酮糖苷的接触包括向所说浆液添加有效量的补充酶。20.根据前述权利要求19的方法，其中所说的补充酶包括能够裂解1，4-糖苷键的糖酶。21.权利要求17的方法，还包括从所说的浆液中分离富含配基异黄酮的物质。22.根据前述权利要求21的方法，其中所说富含配基异黄酮的物质是在pH约3-约6.5且温度约0℃-约35℃下从所说浆液中分离的。23.根据前述权利要求22的方法，其中所说富含配基异黄酮的物质是在温度约0℃-约10℃下从所说浆液中分离的。24.一种从含有异黄酮共轭物的大豆废糖蜜中获得富含异黄酮糖苷物质的方法，包括在有效使异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷的pH及温度下以足够的时间处理所说的大豆废糖蜜，将所说异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷；并且从所说的大豆废糖蜜中分离富含异黄酮糖苷的物质。25.根据前述权利要求24的方法，其中将所说的浆液在pH约6-约13.5且温度约2℃-约120℃下处理，以便将所说的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。26.根据前述权利要求25的方法，其中将所说的大豆废糖蜜在pH约9-约11且温度约5℃-约75℃下处理至少约15分钟的时间，以便将所说的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。27.根据前述权利要求26的方法，其中将所说的大豆废糖蜜在pH约11且温度约5℃-约50℃下处理约15分钟-约1小时的时间，以便将所说的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。28.根据前述权利要求27的方法，其中将所说的大豆废糖蜜在pH约11且温度约35℃下处理约30分钟-约1小时，以便将所说的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。29.根据前述权利要求26的方法，其中将所说的大豆废糖蜜在pH约9且温度约45℃-约75℃下处理约4小时-约6小时，以便将所说的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。30.根据前述权利要求24的方法，其中所说富含异黄酮糖苷的物质是在pH约3-约6.5且温度约0℃-约35℃下从所说大豆废糖蜜中分离的。31.根据前述权利要求30的方法，其中所说富含异黄酮糖苷的物质是在温度约0℃-约10℃下从所说大豆废糖蜜原料中分离的。32.根据前述权利要求30的方法，其中所说富含异黄酮糖苷的物质是在pH约4.5时从所说大豆废糖蜜原料中分离的。33.根据前述权利要求30的方法，其中所说富含异黄酮糖苷的物质是通过离心从所说大豆废糖蜜中分离的。34.根据前述权利要求30的方法，其中所说富含异黄酮糖苷的物质是通过过滤从所说大豆废糖蜜中分离的。35.权利要求24的方法，还包括形成所说的分离后的富含异黄酮糖苷物质的含水浆液；并且在一定温度和一定pH下以足够的时间将酶与所说浆液中的所说异黄酮糖苷接触以便将所说的异黄酮糖苷转化成配基异黄酮，形成富含配基异黄酮的浆液。36.根据前述权利要求35的方法，其中所说的酶与所说浆液中的所说异黄酮糖苷在pH约3-约9且温度约5℃-约75℃下接触至少约1小时。37.根据前述权利要求35的方法，其中酶与所说浆液中所说异黄酮糖苷的接触包括向所说浆液添加有效量的补充酶。38.根据前述权利要求37的方法，其中所说的补充酶包括能够裂解1，4-糖苷键的糖酶。39.权利要求35的方法，还包括在将所说异黄酮糖苷转化成配基异黄酮之后，从所说的浆液中分离富含配基异黄酮的物质。40.根据前述权利要求39的方法，其中所说富含配基异黄酮的物质是在pH约3-约6.5且温度约0℃-约35℃下从所说浆液中分离的。41.根据前述权利要求40的方法，其中所说富含配基异黄酮的物质是在温度约0℃-约10℃下从所说浆液中分离的。42.一种从含有异黄酮共轭物的大豆废糖蜜中获得配基异黄酮的方法，包括在一定pH和一定温度下以足够的时间处理所说的大豆废糖蜜，使所说异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷；在一定pH及一定温度下将酶和所说大豆废糖蜜中异黄酮糖苷接触足够的时间，使所说的异黄酮糖苷转化成配基异黄酮；并且从所说的大豆废糖蜜中分离富含配基的异黄酮物质。43.权利要求42的方法，还包括在转化所说异黄酮共轭物成异黄酮糖苷之前，形成具有固形物含量约3％-约28％的大豆废糖蜜的含水混合物。44.根据前述权利要求42的方法，其中将所说的大豆废糖蜜在pH约6-约13.5且温度约2℃-约120℃下处理至少约15分钟以便将所说的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。45.根据前述权利要求44的方法，其中将所说的大豆废糖蜜在pH约9-约11且温度约5℃-约75℃下处理约15分钟-约6小时的时间，以便将所说的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。46.根据前述权利要求45的方法，其中将所说的大豆废糖蜜在pH约11且温度约5℃-约50℃下处理约30分钟-约1小时的时间，以便将所说的异黄酮共轭物转化成异黄酮糖苷。47.根据前述权利要求42的方法，其中所说的酶与所说大豆废糖蜜中所说的异黄酮糖苷在pH约3-约9且温度约5℃-约75℃下接触至少约1小时。48.根据前述权利要求47的方法，其中所说的酶与所说大豆废糖蜜中所说异黄酮糖苷是在温度约35℃-约60℃下接触的。49.根据前述权利要求42的方法，其中所说的酶与所说大豆废糖蜜中所说异黄酮糖苷的接触包括向所说大豆废糖蜜中添加有效量的补充酶。50.根据前述权利要求49的方法，其中所说的补充酶包括能够裂解1，4-糖苷键的糖酶。51.根据权利要求49的方法，其中补充酶选自α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、萄糖淀粉酶、果胶酶，及其混合物。52.根据前述权利要求42的方法，其中所说富含配基异黄酮的物质是在pH约3-约6.5且温度约0℃-约35℃下从所说大豆废糖蜜中分离的。53.根据前述权利要求52的方法，其中所说富含配基异黄酮的物质是在温度约0℃-约10℃下从所说大豆废糖蜜中分离的。54.根据前述权利要求52的方法，其中所说富含配基异黄酮的物质是在pH约为4.5时从所说大豆废糖蜜中分离的。55.根据前述权利要求52的方法，其中所说富含配基异黄酮的物质是通过离心从所说大豆废糖蜜中分离的。56.根据前述权利要求52的方法，其中所说富含配基异黄酮的物质是通过过滤从所说大豆废糖蜜中分离的。57.由前述权利要求1所述方法生产的富含异黄酮的物质。58.由前述权利要求14所述方法生产的富含异黄酮糖苷的物质。59.由前述权利要求21所述方法生产的富含配基异黄酮的物质。60.由前述权利要求24所述方法生产的富含异黄酮糖苷的物质。61.由前述权利要求39所述方法生产的富含配基异黄酮的物质。62.由前述权利要求42所述方法生产的富含配基异黄酮的物质。63.从大豆废糖蜜中分离的富含异黄酮的物质。64.从大豆废糖蜜中分离的富含异黄酮糖苷的物质。65.从大豆废糖蜜中分离的富含配基异黄酮的物质。全文摘要本发明公开了从大豆废糖蜜中回收异黄酮及其衍生物的方法。第一个实施方案中,公开了一种没有任何明显将异黄酮共轭物转化成其它形式的回收异黄酮的方法。第二个实施方案中,公开了一种方法,其中于回收它们之前在大豆原料中将异黄酮共轭物转化成糖苷。第三个实施方案中,公开了一种方法,其中于回收它们之前在大豆原料中将异黄酮转化成配基形式。本发明还公开了从大豆废糖蜜中得到的富含各种异黄酮的产品。文档编号A23J3/16GK1174839SQ9711499公开日1998年3月4日申请日期1997年6月11日优先权日1996年6月11日发明者D·H·韦格尔,B·A·布赖恩申请人:蛋白质技术国际公司