专利名称：Rna病毒的感染性克隆及其衍生的疫苗及诊断分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及RNA病毒及得自RNA病毒的感染性克隆领域，本发明进一步涉及经利用及修饰该RNA病毒感染性克隆所得的疫苗及诊断分析。
重组DNA技术包括非常多样的并非常有效的分子生物学技术，其目的在于在DNA水平修饰核酸并使得能在分子水平分析及修饰基因组。在这一方面，由于病毒的基因组小，所以特别适于如此操作。但由于非逆转录病毒DNA病毒在其复制中不包括DNA中间步骤，因而重组DNA技术不能立即应用于这些病毒，这些病毒的感染性克隆(如DNA拷贝或体外转录的RNA拷贝或其衍生物)需在重组DNA技术可被应用于其基因组以产生修饰的病毒之前进行开发。感染性克隆的衍生可通过构建所研究的病毒的全长(基因组长度)cDNA(在本文中这一术语是指广义的RNA的DNA拷贝而不仅仅是狭义的mRNA的DNA拷贝)，然后在由全长cDNA转染的细胞体内合成感染性转录物而进行，但感染性转录物也可从组成完整病毒基因组的体外连接的部分长度cDNA片段的体外转录而获得。在所有情况下，转录的RNA携带所有已引入cDNA的修饰，并可用于进一步传代如此修饰的病毒。
许多含有12kb或稍大基因组的正链RNA病毒均已产生了感染性cDNA克隆及感染性体外转录物(综述参见Boyer及Haenni，病毒学198，415-426)。瘟病毒属的病毒基因组长度到目前为止似乎是最长的正链RNA病毒基因组，从中已制备出感染性克隆(Moormannet al.，病毒学杂志70763-770)。与基因组长度相关的问题不仅在于难以在细菌中得到和保持长的且稳定的cDNA克隆，也在于初始RNA转录物的感染性，该初始RNA转录物在宿主细胞中的复制需在没有与病毒复制相连的正常相关的病毒蛋白的帮助下进行。为获得成功的感染，病毒转录物必须与病毒编码的蛋白质相互作用，特别是与病毒复制酶及宿主细胞组分如翻译机制相互作用；因而病毒转录物的结构应尽可能地接近病毒颗粒RNA的结构。另一些问题发生在那些经转录自基因组3’侧的次基因组信使RNA机制复制的正链RNA病毒及在复制期间产生包括一些结构蛋白但仅是基因组的一部分的缺陷干扰颗粒如裸衣壳或空壳颗粒的正链RNA病毒。不完全RNA病毒片段或例如与待转录的病毒RNA或复制中间体RNA相互作用或干扰并或破坏其结构的基质或核衣壳蛋白的存在将破坏全长RNA链的合成，由此产生包含基因组长度RNA的感染性病毒。
莱利斯塔德(Lelystad)病毒(LV)也称猪生殖呼吸综合征病毒(PRRSV，基因组长15.2kb)，是动脉炎病毒科(Arteriviridae)家族的一个成员，该家族也包括马动脉炎病毒(EAV，基因组长12.7kb)，乳酸脱氢酶升高病毒(LDV，基因组长至少14.2kb)，及猿出血热病毒(SHFV，基因组长近15kb)，(Meulenberg et al.，1993a，Plagemann and Moenning，1993)。
近来病毒分类国际委员会已决定将这个家族与冠形病毒科(基因组长28-30kb)及Toroviridae(基因组长26-28kb)一起归入一种新的病毒纲，即Nidovirales。Nidovirales纲代表含有正链RNA基因组并在复制期间合成3’嵌套的次基因组RNA的有包膜RNA病毒。冠形病毒及动脉炎病毒的次基因组RNAs含有一衍生自病毒基因组5’末端的引导序列(Spaan et al.，1988.Plagemann and Moening，1993)。Toroviruses的次基因组RNAs缺少引导序列(Snijder andHorzinek，1993)。尽管编码RNA依赖性RNA聚合酶的ORF1a及1b从基因组RNA中表达，但编码结构蛋白的在Nidovirales基因组3’末端的较小ORFs表达自次基因组mRNA。
PRRSV(莱利斯塔德病毒)在1991年由Wensvoort等首次分离出，并示出是一种目前已知为猪生殖呼吸综合征(PRRS)这种新疾病的病因。该疾病的主要症状是猪呼吸困难及母猪流产。尽管该病大规模爆发如1987首次在美国及1991年在欧洲所观察到的爆发已减少，但该病毒仍可导致美国，欧洲，亚洲猪群的经济损失。PRRSV优选地生长于肺泡巨噬细胞中(Wensvoort et al.，1991)，一些细胞系如CL2621及其它克隆自猴肾细胞系MA-104的细胞系(Benfield etal.，1992；Collins et al.，1992；Kim et al.，1993)也是该病毒易感性的。一些熟知的PRRSV毒株的登录号为CNCM I-1102，I-1140，I-1387，I-1388，ECACC V93070108或ATCC VR 2332，VR2385，VR2386，VR2429，VR2474及VR2402。PRRSV基因组已完全或部分测序(Conzelmann et al.，1993；Meulenberg et al.，1993a，Murthaugh etal，1995)并且除了编码RNA依赖性RNA聚合酶(ORFs 1a及1b)外，还编码6种结构蛋白，其中四种包膜糖蛋白命名为GP2(ORF2)，GP3，(ORF3)，GP4(ORF4)及GP5(ORF5)，一种非糖基化膜蛋白M(ORF6)及核衣壳蛋白N(ORF7)(Meulenberg et al.，1995，1996；van Nieuwstadt et al。1996)。PRRSV的EP及US毒株的免疫学鉴定及核酸序列测定已鉴别出PRRSV毒株间位于病毒结构蛋白中的微小抗原差异(Nelson et al.，1993；Wensvoort et al.，1992；Murtaugh et al.，1995)。
猪可经口鼻途径被PRRSV感染，肺内的病毒可被肺泡巨噬细胞吞噬且在这些细胞中PRRSV的复制在9小时内完成。PRRSV在12小时内从肺行至肺淋巴管，并在3天内到达周围淋巴管、骨髓及脾。在这些部位只有少数细胞对病毒抗原染色阳性。该病毒在血液中存在至少21天，通常更长的时间。7天之后在血液中发现PRRSV的抗体。在PRRSV感染的猪体内病毒与抗体同时出现显示病毒感染不管抗体出现与否均可持续较长时间，尽管其在低水平持续。在至少7周期间，肺内肺泡细胞群体不同于正常SPF肺。
PRRSV需要其包膜经口鼻途径去感染猪，由此猪的正常免疫应答尤其需要产生针对一种或多种包膜蛋白的中和抗体。这种抗体能使病毒丧失感染力。但一旦在肺泡巨噬细胞内，该病毒也产生由M和/或N蛋白衣壳化的RNA构成的裸衣壳，有时多少含有糖蛋白的某一种。这些不完全病毒颗粒或(部分)裸衣壳在细胞内及细胞外的存在可经电子显微镜检术表明。有时可发现没有核酸成分的裸衣壳。这些裸衣壳经血流分布至全身并被脾，淋巴管及骨髓中的巨噬细胞从血液中吸收。这些裸露的但感染性的病毒衣壳不能被猪产生的抗体中和，这样就解释了在抗体存在下病毒感染的持续状态。以这种方式，来自被感染骨髓细胞的巨噬细胞子代将病毒感染传播至身体的新部位。由于不是所有的骨髓巨噬细胞谱系细胞都被感染，所以只是在外周部位的少量巨噬细胞被感染并产生病毒。只由ORF7蛋白组成的PRRSV衣壳在缺乏其它病毒蛋白的条件下，可通过例如用嵌合假狂犬-ORF7载体病毒感染巨噬细胞形成。PRV病毒可被操作成含有PRRSV的ORF7遗传信息。在感染后18小时之后，感染细胞的胞质含有大量小的，空球状的具有PRRS病毒核衣壳大小的结构。
本发明现提供一种衍生自基因组长度远远超过到目前为止已从中获得感染性克隆的正链RNA病毒最长基因组的一种病毒的感染性克隆。本申请的实验部分描述了基于并衍生自具有15.2kb基因组长度的PRRSV的感染性克隆的产生，但这种克隆现在也可得自也具有大约15kb基因组长度的LDV和SHFV，及得自基因组略短的EAV，和得自更长基因组长度的病毒如冠形病毒科或Toroviridae。
本发明还提供了一种产生感染性克隆的方法，该方法解决了病毒RNA链合成中所遇到的问题，从而产生感染病毒，所遇到的问题是不完全病毒RNA片段或例如基质或核衣壳蛋白的存在，它们干扰或与转录的RNA转录物或复制中间体RNA相互作用并破坏其结构，从而破坏全长RNA链合成。本发明提供了一种产生感染性克隆的方法，该方法是用基于野生型病毒基因组的重组核酸转染基本上不易被该病毒感染的宿主细胞，随后经传代至易于感染该病毒的细胞或与易于感染该病毒的细胞共培养从所述宿主细胞中得到感染性子代病毒。本质上不易感的细胞与通常用于病毒复制的细胞相比较只稍易感于或完全不易感于所研究的病毒，但也许地易感于其它病毒菌株。本发明提供了一种经转染不易感于野生型病毒的感染的宿主细胞而产生感染性克隆的方法，因而避免了含有干扰病毒RNA链合成的RNA片段和基质或核衣壳蛋白的裸衣壳或不完全病毒颗粒的产生。经传代至对病毒易感的细胞从如此转染的宿主细胞中获得感染性病毒。在实验部分描述了怎样以如此方法得到PRRSV的感染性克隆，但该方法也适用于其它正链RNA病毒。
本发明现还提供经重组DNA技术的进一步应用而产生修饰的感染性克隆的可能性。该修饰可以是经本领域已知的任何重组DNA技术方法所得到的单突变或多突变、取代、缺失或插入或其组合。因此本发明提供了修饰的RNA病毒以用于研究RNA病毒并制备疫苗。
本发明现还提供了感染性克隆，如衍生自动脉炎病毒科如PRRSV的感染性克隆，其可被用作抗由感染性克隆所基于的病毒所致疾病的单向疫苗。例如，基于PRRSV的感染性克隆现可用于研究PRRSV的毒力标志或血清学标志。已知的PRRSV的血清学标志是在由ORF2-7编码的PRRSV的某些结构蛋白上，但也发现位于由ORF1a和1b编码的蛋白质内。毒力标志在ORF1a和1b编码的PRRSV非结构蛋白内，但也发现在某些ORF2-7编码的蛋白质上。针对这些标志，通过对感染性克隆基因组的修饰，可得到无毒或比其亲代菌株减毒的PRRSV，和/或经血清学标志的缺失或插入而被修饰的PRRSV以使免疫接种的猪和野生型病毒感染的猪之间有血清学差异。这种修饰的例子是这样的PRRSV感染性克隆，其中编码ORF7N蛋白的核酸序列由ATCC VR2332或LDV的ORF7蛋白所置换。
本发明还提供了可用作许多抗原的输送系统或病毒载体疫苗的感染性克隆，如衍生自动脉炎病毒科如PRRSV的感染性克隆。在这种克隆中，插入了与所研究的病毒的序列不相应的异源核酸序列。该异源核酸序列例如可衍生自编码任何所选抗原的序列。这种抗原是一种可诱导抗病原体的免疫性的蛋白质或肽。由于病毒感染骨髓中的巨噬细胞及巨噬细胞系细胞，并将含抗原的病毒通过其子代细胞分布，这种病毒载体疫苗感染免疫系统关键的细胞并可呈递抗原以进一步加工。该载体疫苗病毒感染抗原呈递细胞如树突状巨噬细胞或肝巨噬细胞或其它免疫系统细胞，并能以(不完全的)包膜病毒颗粒或裸衣壳颗粒而感染。由于裸衣壳或不完全病毒颗粒可引起持续感染，免疫学加强效应将引起抗抗原筛选自其中的病原体的终生免疫(由于在低水平持续刺激)。通过加入其它病原生物体或物质的表位信息，我们可以用该病毒作为抗原携带者。一些携带外源表位信息的这种载体疫苗病毒可以混合在一起并在同一个时间内给药。这使主动免疫可以抗一种病原体的不同抗原或使主动免疫可以抗不同的病原体。
本发明现还提供了可被用作双向疫苗的感染性克隆，如衍生自动脉炎病毒科如PRRSV的感染性克隆。例如基于PRRSV的感染性克隆可被用于构建抗PRRSV及另一种病原体的保护性疫苗，通过将载体疫苗的研制与只抗PRRS的单向疫苗的研制组合起来而成。在PRRS疫苗中插入衍生自己知可感染猪的任何其它呼吸病原体的抗原可开发出一种特异的双向疫苗，以抗猪的呼吸疾病。
本发明还提供了疫苗，无论其是单向，双向或载体疫苗均不会释放到环境中，因此是安全的。疫苗的安全性(非释放)可通过将产生有包膜的感染性病毒所需的那些病毒蛋白的信息缺失来保证。该病毒需在组成型表达蛋白质的细胞系中增殖，在该互补细胞系中复制的病毒有完整的包膜并能感染猪巨噬细胞。在一个复制周期之后，丢失了包膜蛋白质信息的子代病毒，不能作为有包膜病毒感染其它细胞。作为裸衣壳或不完全病毒颗粒感染体内巨噬细胞始终是可能的。
本发明也提供了可从根据本发明修饰的RNA病毒感染的细胞培养物中获得的病毒抗原及蛋白质。如此的抗原可用于如ELISA诊断分析或本领域技术人员已知的其它类型的诊断分析。这种分析可用作初步诊断的唯一标准，或作为已用基于本发明修饰的RNA病毒的判别或标志疫苗接种过的动物群体的对比标准。
实验部分从中可体外转录感染性RNA的cDNA克隆的产生已成为正链RNA病毒的分子遗传学分析的基本工具。该技术可用于正链RNA病毒，在导入合适宿主细胞时其RNA基因组可作为mRNA并引发一轮完整的感染。已描述了许多病毒感染性克隆，从而促进了对遗传表达、复制，病毒蛋白的功能及RNA病毒重组的研究(综述参见Boyer及Haenni，1994)。另外这些克隆可以用于新病毒载体和疫苗的研制。目前动脉炎病毒的感染性cDNA克隆未被阐述过，我们在此报告PRRSV的感染性克隆的产生及其首次在嵌合PRRSV病毒产生中的应用。
材料及方法细胞和病毒PRRSV(或LV)的Ter Huume株(保藏在CNCM，巴黎，保藏号I-1102)在1991年被分离出(Wensvoort et al.，1991)并培养于原始肺泡巨噬细胞或CL2621细胞中。本研究应用的是Ter Huure株(TH)的第6代及其衍生物，LV4.2.1，其通过连续传代在CL2621细胞上生长适应。肺泡巨噬细胞保持在RPMI1640培养基(Flow)中，而CL2621细胞保持在Hank’s最小基本培养基(Gibco-BRL/LifeTechnologies)中。BHK-21细胞保持在Dulbecao’s最小基本培养基中。为进行转染试验，如Liljestron及Garoff(1993)方法，BHK-21细胞培养于Glasgow最小基本培养基(GIBCO-BRL/LifeTechnologies Ltd)中。
病毒RNA的分离细胞内RNA分离自如前所述用PRRSV以感染复数为1感染24小时后的肺泡巨噬细胞或CL2621细胞(Meulenberh et al.，1993a)。为分离病毒基因组RNA，如Nieuwstaolt et al.，(1996)所述将病毒颗粒在蔗糖梯度上纯化，并重悬浮于TNE(0.01M Tris-HCl，pH7.2，0.1MNaCl，1mM EDTA)中。将1ml的蛋白酶K缓冲液(100mM Tris-HCl，pH7.2，25mM EDTA，300mM NaCl，2％(w/v)SDS)和0.4mg蛋白酶K(Boehringer Mannheim)加入到1ml纯化的PRRSV病毒颗粒(108TCID50)中。将此反应混合物在37℃保温30分钟，RNA用苯酚/氯仿(1∶1)抽提一次，并用乙醇沉淀。将RNA贮存在-20℃乙醇中。该RNA制备物的十分之一用于逆转录(RT)反应。
PRRSV基因组的5’和3’末端的克隆用修改的单链连接单链cDNA方法(SLIC；Edwards et al.，1991)克隆PRRSV病毒基因组的5’末端。将如上制备的病毒RNA的十分之一与引物11U113(5’TACAGGTGCCTGATCCAAGA3’)用于RT反应，该引物与基因组的1232-1251位核苷酸互补。此RT反应如前所述在终体积为20μl中进行(Meulenberg et al.，1993b)。随后将2μl 6M的NaOH加入RT反应中并在37℃将RNA水解30分钟。用Boehringer Mannheim的高纯度PCR产物纯化试剂盒纯化单链cDNA。将纯化的cDNA用乙醇沉淀，重悬浮于TE中，并与锚定引物ALG3(5’CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC3’)连接。该引物含有EcoRI，ClaI及BamHI位点，且其3’末端用防止自连接的氨基封闭基团修饰。将此单链cDNA产物与4pmol ALG3在50mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgCl2，10μg/mlBSA，25％PEG，1.0mM己胺氯化钴，40μM ATP及0.5μl(10U)T4 RNA连接酶(New England Biolabs)中在室温下连接过夜。将该连接反应物的三分之一用作引物为LV69(5’AGGTCGTCGACGGGCCCCGTGATCGGGTACC3’)和ALG4 (5’GAAGGATCCAGAATCGATAG 3’)的PCR中的模板。引物LV69互补于LV基因组的594-615位核苷酸，而ALG4互补于锚定引物ALG3。PCR条件如Meulenberg et al.，(1993b)所述，将获得的产物用EcoRI及SalI消化并克隆在pGEM-4Z中。用相似的策略克隆来自细胞内LV RNA的LV基因组5’末端。为进行这些实验，使用10μg分离自用LV感染的CL2621细胞的总细胞RNA。对5’cDNA克隆进行测序，并将含有比发表的PRRSV序列(Meulenbery et al.，1993a)长10个核苷酸的克隆pABV387用作进一步实验。
用含EcoRI，XbaI及PvuI位点的引物LV76(5’TCTAGGAATTCTAGACGATCG(T)403’)进行LV RNA的逆转录，以构建含长的聚(A)尾部的3’末端cDNA克隆。此逆转录反应之后用引物LV75(5’TCTAGGAATTCTAGACGATCGT3’)(该引物与LV76除了聚(T)一段序列之外是相同的)及39U70R(5’GGAGTGGTTAACCTCGTCAA3’)(相应于LV基因组14566-14585位核苷酸并含有一HpaI位点的有义引物)进行PCR。用HpaI及EcoRI消化所得PCR产物，克隆进用相同酶消化的cDNA克隆pAV39中(图1)。将含有45个A和109个A的聚(A)序列及由寡核苷酸测序确定的正确基因组cDNA序列的两个cDNA克隆(pABV382和pABV392)用于构建全长基因组cDNA克隆。
序列分析用PRISMTMReady Reaction Dye DeoxyTMTerminator Cycle测序试剂盒及Applied Biosystems的自动测序仪确定寡核苷酸序列。
PRRSV的全长基因组cDNA克隆的构建将用于确定LV基因组核苷酸序列的以前产生的cDNA克隆(Meulenberg et al.，1993a)在如图1所示方便的限制位点连接在一起。从pABV克隆25，11，12及100中构建质粒pABV254，并用于先前的实验(den Boon et al.，1996)。根据Sambrook et al.，(1989)所述进行标准克隆步骤。这产生在高拷贝数质粒pGEM-42中含LV的重叠cDNA序列的三个质粒。质粒pABV331及pABV369由LV基因组的5-6015位核苷酸组成。在对第3462位测序时发现在6个独立cDNA克隆中以1∶1的比率出现核苷酸差异，该核苷酸差异导致ORF1A中第1084位氨基酸的取代(Leu代替Pro)。由于我们不能预言该氨基酸对感染性的影响，因而我们也通过在EcoRV(核苷酸3403)和SacII(核苷酸3605)位点的交换克隆了pABV331中编码Leu的cDNA片段，得到pABV369。质粒pABV384由LV基因组的5168-9825位核苷酸组成。由于没有适当的cDNA克隆可与质粒pABV20及pABV5重叠并最终与pABV331和pABV369质粒的cDNA序列融合，因此通过RT-PCR产生了两个新cDNA片段。相应于5169-5186位核苷酸的有义引物LV59(5’TCGGAATCTAGATCTCACGTGGTGCAGCTGCTG3’)和互补于6076-6097位核苷酸的反义引物61U303(5’CATCAACACCTGTGCAGACC3’)应用于一个PCR中。位于5936-5955位核苷酸的有义引物61U526R(5’TTCCTTCTCTGGCGCATGAT 3’)及互补于6727-6745位核苷酸的LV60(5’GTACTGGTACCGGATCCGTGAGGATGTTGC3’)用于另一PCR中。将这两个PCR片段用掺入LV59中的XbaI位点，内ApoI位点(6006位核苷酸)及也被掺入到引物LV60中的在6740位核苷酸的BamHI位点一起连接到pABV20中。将该新cDNA片段完全测序，其不含任何导致与发表序列(Meulenberg et al.，1993a)有氨基酸差异的突变。质粒pABV368包含PRRSV基因组的8247-13720位核苷酸。由于cDNA片段在pGEM-4Z中的进一步连接导致不稳定克隆，因而pABV331/369，pABV384及pABV368的插入物连接到pOK12的5’和3’cDNA片段(Viera and Messing，1991)上。预期质粒载体pOK12更适于大的外源cDNA序列的克隆，因为其比pGEM-4Z具有较低拷贝数。用质粒转化大肠杆菌菌株DH5a，在32℃有15μg/ml卡那霉素存在下生长以尽可能低地保持其拷贝数。首先，将pABV382((A)45)和pABV392((A)109)的cDNA片段用EcoRI消化并用Klenow聚合酶(Pharmacia)将该位点修饰成平端，随后用BamHI消化。这些片段克隆进用BamHI和FspI消化的pOK12中(FspI位点也被修饰成平端)，产生pPBV394和pABV395。以这种方式pOK12中的T7 RNA聚合酶启动子被除去。接着将pABV368和pABV384的cDNA片段用BclI位点(13394位核苷酸)，ScaI位点(8657位核苷酸)和在侧翼或载体序列中的BamHI及BgiII位点连接到3’末端cDNA克隆，这导致产生质粒pABV401和pABV402(图1)。
含有直接融合到LV基团组5’末端的T7 RNA聚合酶启动子的-5’cDNA克隆用引物LV83(5’GAATTCACTAGTTAATACGACTCACTATAGATGATGTGTAGGGTATTCC3’)和LV69经PCR从pABV387中扩增。LV83从5’至3’次序由-EcoRI和SpeI位点，-T7 RNA聚合酶启动子序列，起始转录的单G及LV基因组的1-19位核苷酸组成。PCR片段克隆进在pOK12的EcoRI和SaII位点导致产生pABV396。pABV396的正确序列用寡核苷酸测序来评价。接着用ApaI和BamHI切下pABV331和pABV369的LV cDNA片段，并连接至用ApaI和BamHI消化的pABV396中。最后将所得5’cDNA片段用T7 RNA聚合酶启动子上游的SpeI位点和在病毒基因组5168位的单一PmlI位点克隆入pABV401及pABV402中。以此方式中得到相应于类似亲代株的病毒及含外源开放读框的嵌合病毒的基因组长度cDNA克隆。
含PacI和/或SwaI位点的突变病毒的产生为将单一PacI位点导入基因组长度cDNA克隆ORF7基因的下游，在14987和14988位核苷酸的T和A用有义引物LV108(5’GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC3’)与反义引物LV112(5’CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCTGA3’)及有义引物LV111(5’TCAGGGTGCAAGTTAATTAAACAGTCAGGTGAATGG3’)与LV75经PCR用A加以置换。相似地可通过将14980位的G置换为T及在14985位的T用A置换来产生单一SwaI位点，该置换是用引物LV108和LV110(5’CCTGACTGTCAATTTAAATTGCACCCTGAC3’) 及引物LV109(5’GTCAGGGTGCAATTTAAATTGACAGTCAGG3’)和LV111进行PCR而成。将PCR片段用所产生的PacI和SwaI位点及侧翼HpaI和XbaI位点连接入pABV395中，分别导致pABV427和pABV426的产生。然后将此片段用相同的HpaI和XbaI位点插入pABV414中，导致pABV437和pABV442的产生(见图4)。为检测回收自pABV437和pABV422转录物的病毒中的标志突变，将RNA从感染的猪肺泡巨噬细胞的上清液中分离出。将该RNA用于逆转录-PCR中以用引物LV76，LV75及39U70R扩增一个约0.6kb的片段(跨越核苷酸14576-不同长度的聚A尾部)。基因组标志的存在可用PacI或SwaI消化PCR片段加以检测。
RNA的体外转录及转染将含LV全长基因组cDNA片段的质粒pABV414，pABV416用位于聚(A)序列下游的PvuI线性化。由Semliki Forest病毒(SFV)表达载体pSFV1(Meulenberg et al.，1997)的ORF4组成的质粒pABV296用SpeI线性化，并作为体外转录和转染试验的对照。线性化质粒用乙醇沉淀，根据Liljestrom和Garoff(1991和1993)所述应用于SFV的方法将1.5μg这些质粒用T7 RNA聚合酶(质粒pABV414，pABV416)或Sp6 RNA聚合酶(pABV296)进行体外转录。将体外转录的RNA用异丙醇沉淀，用70％乙醇洗涤并在-20℃贮存直至使用。将BHK-21细胞播种于M6孔中(大约106细胞/孔)并用2.5μg与10μl最适宜的脂染剂混合的RNA转染，如Liljestrom及Garoff(1993)所述。或者将RNA经电穿孔导入BHK-21细胞中，在此情况下，利用Liljestrom和Garoff(16)的电穿孔条件，将10μg体外转录的RNA或10μg细胞内LV RNA转染至大约107BHK-21细胞中。转染24小时后收集培养基，并转移至CL2621细胞以拯救感染性病毒。基本上根据Wensvoort et al.，(1986)所述的免疫过氧化物酶单层分析(IPMA)测试转染的及感染的细胞对LV特异性蛋白的表达。用抗GP3，GP4，M及N蛋白的单克隆抗体(MAbs)122.13，122.59，122.9及122.17(Van Nieuwstadt et al.，1996)在IPMA中染色。
结果LV基因组RNA的5’末端序列的再构建尽管已报导了具有截短的5’末端的体外转录的RNA的感染性(Davis et al.，1989，Klump et al.，1990)，通常认为获得感染性克隆需要包括5’和3’最末端的全部病毒序列。为克隆LV基因组的5’末端，使用修改的单链连接单链cDNA(SLIC；Edwards et al.，1991)方法。分离自用LV感染的CL2621细胞的细胞内RNA及来自纯化病毒颗粒的LV RNA，利用互补于ORF1A 5’末端的引物LV69进行逆转录。将第一链cDNA产物连接至锚定引物ALG3，该引物3’末端的自连接反应被封闭。经PCR扩增该连接产物并克隆。将衍生自LV细胞内RNA及得自两个独立PCR的12个克隆，和衍生自病毒颗粒RNA及得自两种独立PCR的14个克隆测序。在这26个cDNA克隆中，22个克隆包括比以前公布的cDNA序列(Meulenberg etal，1993a)多10个核苷酸(5’ATGATGTGTA3’)的序列，而其它4个克隆在此附加序列的5’末端缺失1～3个核苷酸(表1)。这使我们认为这10个核苷酸代表LV基因组的5’最末端，并因而包括在基因组长度cDNA克隆中。
LV的基因组长度cDNA克隆的构建为构建LV的基因组长度cDNA克隆，将预先分离及测序的cDNA(Meulenberg et al，1993a)根据图1所述的策略在共享的限制酶位点连接。另外产生新cDNA片段装配基因组长度cDNA克隆。经RT-PCR产生一个跨越5168～6740位核苷酸的cDNA片段以使来自克隆pABV5和pABV20的cDNA序列连接。用于体外转录的T7 RNA聚合酶启动子经PCR被直接连接至LV基因组的5’末端，且克隆在pABV396内的此新cDNA片段被插入基因组长度cDNA克隆。对在6种新的且独立的cDNA克隆中的3420-3725位核苷酸的再测序表明在ORFla中的第1084位氨基酸Leu与Pro以1∶1的比率出现。由于我们无法预测该氨基酸对转录自最终的基因组长度cDNA克隆的RNA的感染性的影响，而将这两种氨基酸用于构建克隆。使用的是两种在3’末端有差异的cDNA克隆，我们已先分离了含有最多20个A的聚(A)尾部的3’末端cDNA克隆(Meulenberg et al.，1993a)，但根据对相关病毒如LDV的聚(A)尾部的长度的研究(Chenet al，1994)，完整的聚(A)尾部预计更长一些。因而使用含40个T残基序列的引物LV76产生新的3’末端cDNA克隆。对这些cDNA克隆进行测序，其含有40-109个A残基的序列。将含有最长聚(A)序列的cDNA克隆(109个A残基；pABV392)用于基因组长DNA克隆，由于长的同聚序列会干扰质粒在E.coli中的复制(Deng andWu，1981)，我们选择了含45个A残基的第二种克隆pABV382用于随后的克隆步骤。首先，观察到在高拷贝数质粒中保持基因组长度cDNA克隆导致引起合成自这些克隆的转录物感染性丧失的突变或缺失的积累(Lai et al.，1991；Rice et al.，1987；Sumiyoshi et al.，1992)。当我们试图将pABV克隆331/369，384和368的较长cDNA片段连接至pGEM-4Z中的5’和3’末端时，还观察到质粒的不稳定性，从而最终将这些克隆在低拷贝数载体pOK12中互相融合(Viera andMessing，1991)。这导致产生基因组长度cDNA克隆pABV414/415和416，其在所用的生长条件之下在Ecoli中可稳定繁殖。同时观察到含45个或109个A残基的基因组长度cDNA克隆的稳定性没有差异。
LVRNA的感染性LV优选在猪肺泡巨噬细胞中生长。到目前为止，CL2621细胞系或其它衍生自猴肾细胞系MA104的克隆均显示为可繁殖LV的细胞系(Benfield et al.，1992；Collins et al.，1992；Kim et al.，1993)。因而CL2621细胞被用于确定LV RNA转染的最佳条件。分离自经LV感染的CL2621细胞的RNA使用不同的方法如脂转染、脂转染胺、DEAE-葡聚糖及电穿孔法以不同用量转染至CL2621细胞，直至转染后7天，筛选有细胞病变效应及噬斑的细胞，但这些感染性病毒的信号未检测到。另外在IPMA中使用LV特异性MAbs未检测到非LV特异性抗原。将体外转录自pABV296的RNA在这些试验中用做对照。质粒pABV296由插入表达载体pSFV1中的编码GP4的ORF4基因组成(Meulenberg et al.，1997)。通过在IPMA中用GP4特异性MAbs染色转染的细胞来测试pABV296 RNA的转染效率。导致0.01％阳性CL2621细胞的最高转染效率经电穿孔而得，而用BHK-21细胞使用相似条件可得80-90％阳性细胞。这些结果表明，CL2621细胞不适于转染试验而BHK-21细胞(不易感于野生型病毒的感染)明显示出非常适于转染。因而将BHK-21细胞用于测试LVRNA的感染性。分离自经LV感染的CL2621细胞的2μgRNA，根据所述的用于SFV条件(Liljestrom and Garoff，1993)用脂转染转至大约106BHK-21细胞中，转染24小时后，用抗LV-N蛋白的LV特异性Mab 122.17将细胞染色。大约3-10个细胞染色阳性，但没有观察到提示细胞与细胞之间扩散的感染性中心或噬斑。使用这些条件，转录自pABV296的对照RNA的转染导致60-70％阳性BHK-21细胞。将用细胞内LV RNA和pABV296 RNA转染的BHK-21细胞的上清液转移至CL2621细胞。3-4天后，，在与来自经细胞内LV RNA转染的BHK-21细胞的上清液温育的细胞内可观察到噬斑，而与来自经pABV 296 RNA转染的BHK-21细胞的上清液温育的细胞内未观察到噬斑。在IPMA中该噬斑被LV特异性MAbs阳性染色。当使用分离自LV纯化病毒颗粒的RNA时得到相似结果。进一步地，当细胞经电穿孔转染时染色阳性的细胞数提高2-4倍。这些数据表明可能由于BHK-21细胞缺乏LV受体而使LV不能感染BHK-21细胞。但一旦基因组RNA导入BHK-21细胞，新的感染性病毒颗粒产生并分泌到培养基中。用这些颗粒，无论是裸衣壳还是完整包膜的或部分包膜的颗粒对已转染的BHK-21细胞再感染同样是不可能的。
感染RNA的体外合成由于实际上不易感于野生型PRRSV感染的BHK-21细胞特别适于从细胞内LV RNA中拯救病毒，而易感的CL2621细胞则不能，因而将BHK-21细胞用作测试转录自基因组长度cDNA克隆的RNA是否是感染性的。将质粒pABV414/416经PuvI线性化并使用T7 RNA聚合酶体外转录。PvuI位点位于聚(A)序列下游，因而转录的RNA在3’末端含有2个非病毒核苷酸(图2)。另外，转录物在5’末端应含有一非病毒G，其是T7 RNA聚合酶的转录起始位点。将大约2.5μg体外转录的RNA转染至BHK-21细胞，同时将2μg细胞内LV RNA作为随后在CL2621细胞中拯救病毒的阳性对照，将pABV296 RNA作为RNA转染至BHK-21细胞的阳性对照和随后在CL2621细胞拯救病毒的阴性对照。转染24小时后，收集细胞的上清液并将细胞固定及在IPMA中用N-特异性MAb 122.17染色。在用细胞内LV RNA转染的BHK-21细胞的孔中只观察到少量阳性细胞，而在用转录自pABV414/416的RNA转染的BHK-21细胞的孔中观察到800-2700个阳性细胞。为检测感染性病毒是否从细胞中释出，将上清液用于感染CL2621细胞。在经用细胞内LV RNA及pABV414/415的转录物转染的BHK-21细胞的上清液感染的CL2621培养物中产生噬斑。该噬斑在IPMA中用抗N，M，GP4，及GP3蛋白的MAbs染色阳性，提示这些蛋白质都能被合适地表达。在与用转录自pABV296的RNA转染的BHK-21细胞的上清液温育的CL2621培养物中未观察到噬斑和在IPMA中的染色。因而这些结果清晰地示出将转录自基因组长度cDNA克隆pABV414和pABV416的RNA转染至BHK-21细胞可导致感染性LV的产生和释放。此外当将pABV414和pABV416的转录物经电穿孔而非脂转染法转染至BHK-21细胞时，可观察到用LV特异性MAbs染色阳性的细胞增加2-4倍。在这些电穿孔的BHK-21细胞上清液中重组病毒的滴度大约为105TCID50/ml。
感染性拷贝病毒与Ter Huurne和LV 4.2.1的生长曲线的对比拯救的病毒的生长特性初始的转染及感染试验提示，与拯救自经细胞内LV RNA转染的BHK-21细胞的病毒相比，标为vABV414和vABV416的拯救重组病毒在猪肺泡巨噬细胞中感染和生长同样良好，但在CL2621细胞中生长稍慢。分离从用LV4.2.1感染的CL2621细胞分离此细胞内LV RNA，该LV4.2.1已经适于在CL2621上生长。为更深入地研究vABV414和vABV416的生长性能，测定在CL2621细胞中及猪肺泡巨噬细胞中的生长曲线，并与只在猪肺泡巨噬细胞上传代的野生型LV(TH)的生长曲线及在CL2621细胞上生长的LV4.2.1的生长曲线相比较。此两种重组病毒的生长速率没有差别，不论直接衍生自BHK-21或在猪肺泡巨噬细胞上进一步传代，其生长同样良好(图3)。在感染32小时后在猪肺泡巨噬细胞中的滴度出现峰值(7.1-7.9 TCID50/ml)，而在CL2621中滴度稍慢，甚至在感染96小时后还未出现峰值。TH病毒的生长特性与重组病毒相似。相反在CL2621中适应的病毒LV4.2.1在CL2621细胞上的生长比vABV414，vABV416及TH病毒的生长要快(图3)。概括地讲，这些结果表明重组病毒的生长性能与TH病毒相似。由于用于构建感染性克隆的cDNA序列是衍生亲代“未适应性”TH病毒，因而这一点是可预期的。
在LV感染性克隆中导入遗传标志为论证基因组长度cDNA克隆能用于产生LV病毒突变体，将一单一PacI和SwaI位点经PCR介导的诱变导入ORF7基因的下游(图4)。当转录自含PacI位点的基因组长cDNA克隆pABV437和含SwaI位点的pABV442的RNA被转染至BHK-21细胞，并将上清液在转染24小时后移至猪肺泡巨噬细胞及CL2621细胞中时，产生感染性病毒。拯救的病毒vABV437和vABV442与亲代病毒vABV414在猪肺泡巨噬细胞及CL2621细胞中生长性能相似(数据未示出)。对分离自用vABV414和vABV416感染的猪肺泡巨噬细胞上清液的病毒RNA进行逆转录和PCR扩增了一大约0.6kb的特异性区域(14576位核苷酸-聚(A)尾部)。经PacI的消化示出此限制位点在衍生自vABV437的片段中确实存在，但在衍生自vABV414的片段中不存在。相似地也确定了SwaI位点在vABV442中的存在(数据未示出)。这样我们可排除野生型病毒污染的可能性，从而确认vABV437和vABV442的同一性。
讨论现代重组DNA技术使我们可以在分子水平分析和修饰基因组，这样可更深地洞察其组织和表达。在RNA病毒的情况下，这要求产生基因组长度cDNA克隆，由此合成感染性转录物。在多数情况下，感染性克隆构建的前提是对可能是病毒RNA复制关键性的各个病毒基因组的末端序列的鉴定。在先前的研究中示出LV在3’末端含有一聚(A)尾部(Meulenberg et al.，1993a)。在本研究工作中，LV基因组的精确5’末端被确定。尽管已描述了检测病毒基因组RNAs或mRNAs的5’末端的一些方法，但其中多数有严重限制。已用于黄病毒和瘟病毒的方法是基于基因组RNA的环化，但此方法需附带分析以明确基因组5’和3’末端之间的界限。cDNA末端的5’快速扩增(5’RACE)方法是基于用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在第一链cDNA链加入一同聚物尾部。但加尾反应效率较低且该方法由于不能确定尾部的第一个核苷酸是代表病毒序列，还是酶促增加的尾部的一部分而需附加分析。在本研究中我们通过将具有特异性的一寡核苷酸与第一链引物延伸产物的连接及经PCR扩增确定了病毒基因组的5’最末端。在一些独立克隆中发现与公布列相比延伸的10个核苷酸(ATGATGTGTA)，从而被假定为代表病毒基因组的5’最末端核苷酸。总之这导致了一221个核苷酸的前导序列，其与EAV的前导序列长度(20个核苷酸；den Boon et al.，1991)，及SHFV的前导序列长度相似(208个核苷酸；Zeng et al.，1995)，但比LDV的前导序列(155个核苷酸；Chen et al.，1994)要长。但在这些动脉炎病毒的前导序列之间没有明显的同源性存在。
将5’最末端掺入基因组长度cDNA以产生感染性克隆。产生感染性病毒的主要问题是当在细菌中克隆时病毒序列的稳定性及正确的5’和3’末端的产生。尽管开始试图在pGEM-4Z中装配基因组长度cDNA克隆失败了，但LV的15207个核苷酸长基因组cDNA片段在低拷贝数质粒pOK12中保持稳定，且是目前现已产生的阳性RNA链病毒的最长感染性克隆。基因组长度cDNA克隆的转录物含5’帽结构，在5’末端含一额外非病毒G，在3’末端含一非病毒CG，但这些延伸未影响其感染性。一些研究人员已报导转录自全长cDNA克隆的RNA的初始感染降低，这是由于在5’或3’末端的无关的非真实序列或不完全加帽所致。缺失帽结构的LV全长cDNA的转录物是非感染性的。而感染性cDNA克隆转录物的感染性已在易感于病毒的细胞系中测试，我们不能确定来自基因组长度cDNA克隆的转录物或分离自用这些LV RNA转染的CL2621细胞的LVRNA的感染性。这是由于在CL2621细胞中较差的转染效率所致，从而病毒RNA链合成可能被不完全RNA片段或用有缺陷的干扰颗粒如只含有病毒基因组片段的裸衣壳对CL2621细胞的再感染产生的衣壳蛋白干扰或与其相互作用而被阻止。但全长cDNA克隆的转录物及细胞内LV RNA对BHK-21的转染导致感染性病毒的产生和释放，该病毒可在CL2621细胞中被拯救。用裸衣壳对BHK-21细胞的再感染不会发生，因此不能妨碍全长病毒RNA的合成。特异感染性大约为每μg体外转录的RNA400-1500个阳性细胞，而每μg LV细胞内RNA得到2-5个阳性细胞。但这些特异性感染性不能相比较，这是因为分离自LV感染的CL2621细胞的细胞内RNA只有非常少的一部分代表基因组LV RNA。另外用于转染的分离自病毒颗粒的基因组RNA量太少而不能准确地定量。
另外，在IDMA中用LV特异性MAbs记录了BHK-21细胞产生的抗原，其与感染性病毒的产生不是必然相关，这一点清楚地在如下实验中表明，在CL2621细胞上分析，用2μg细胞内LV RNA转染的BHK-21细胞的上清液比用2.5μg全长cDNA克隆的转录物转染的BHK-21细胞的上清液含较高滴度的噬斑形成单位。尽管以前表明许多病毒的聚(A)尾部的长度影响病毒转录物的感染性(Holy and Abouhaidar，1993；Sarow，1989)，我们未观察到在含45个或109个A残基尾部的基因组cDNA克隆的转录物之间感染性有何不同。这也许是45个A残基的尾部在阈长度之上，低于此相应转录物的稳定性将发生变化。我们已发现ORFla中第1084位氨基酸的克隆差异，在此位PRO与LEU的比率是1∶1。此氨基酸对感染性没有影响，这是由于含这一LEU或PRO密码子的全长cDNA克隆的转录物在对BHK-21细胞的感染性方面未示出有任何不同。
基因组长度感染性克隆用于产生表达PRRSV株ATCC VR2332的核衣壳蛋白的嵌合病毒。另外基因组长度感染性克隆用于产生表达鼠病毒LDV的核衣壳蛋白的嵌合病毒。这些嵌合病毒可用株特异性MAbs与亲代病毒中区别开来，它们对与PRRSV的Ter Huurne株的N(ORF7)蛋白特异反应的单克隆抗体不染色。另外其中PRRSVN蛋白被LDV N蛋白取代的嵌合病毒与与PRRSV N蛋白反应的猪恢复期抗体不起反应。由于所有为PRRSV感染的猪均产生抗PRRSVN蛋白的抗体，此嵌合病毒可在未来的计划中应用，使用抗PRRSV的新的活疫苗且将该病毒用作载体系统，特异性地瞄定宿主细胞肺泡巨噬细胞。在此方面需提及的是初始试图用灭活病毒或重组亚单位去进行保护是失败的。到目前为止可利用的唯一的抗PRRS的有效疫苗是基于US株的修饰的活疫苗(Gorcyca，et al.，1995)。但经此修饰的活性产物接种的猪不能与被野生型病毒感染的猪区别开来。PRRSV的感染性克隆由此经基因组的定位诱变提供了一种的所谓的标志疫苗，如此接种的猪与野生病毒感染的猪基于血清抗体的不同可以区分开来。
本文所述的LV感染性克隆，是到目前为止所开发的正链RNA病毒的最长的感染性克隆，并是动脉炎病毒家族的第一例。该PRRSV感染性克隆的产生开创了对该病毒的病理、宿主嗜性及复制和转录的研究方面的新机会。动脉炎病毒和冠形病毒共享一种特异的转录机制，其也指作前导序列引导的转录，其涉及含共有的5’前导序列的所谓嵌套式的一组次基因组RNAs的产生(Spaan et al.，1998；Plagemann and Moennig，1991)。前导序列引导的转录是一复杂过程，现在还不十分清楚。病毒学家对冠形病毒病毒的阐明前导序列引导的转录的未明了机制的研究受限于检测干扰RNAs的cDNAs的分析及定位诱变，这是由于大基因组(28-30kb)妨碍了感染性克隆的构建。PRRSV感染性克隆被用模型系统去研究及阐明动脉炎病毒及冠形病毒的转录和复制的机制。
衍生自PRRSV的感染性克隆也可用作插入PRRSV基因组的外源抗原的输送系统或载体疫苗病毒，因为该病毒可感染骨髓中的巨噬细胞和巨噬细胞系细胞及免疫系统的其它细胞，并通过其子代细胞分布含抗原的病毒。在含动脉炎病毒或PRRSV的ORF7或N蛋白的片段的抗原的特例中，这些抗原将在感染的细胞的细胞膜外侧被表达，从而进一步增强免疫应答。该免疫加强效力将导致抗该病原体的终生免疫(由于在低水平持续刺激)。通过加入其它病原生物体或物质的表位信息，我们可以用该病毒作为抗原携带者。一些携带外源表位信息的修饰的PRRS病毒可以混合在一起并在同一个时间内给药。这使主动免疫可以抗一种病原体的不同抗原或使主动免疫可以抗不同的病原体。修饰的PRRSV疫苗的安全性(如非释放的)可以经缺失那些产生有包膜感染性病毒所需的病毒蛋白的信息而确保。该病毒需在组成型表达包膜蛋白的细胞系中增殖。在此互补细胞系中复制的病毒具有完整的包膜，且能感染猪巨噬细胞。在复制一轮之后，丧失包膜蛋白信息的子代病毒不能作为有完整包膜的病毒感染其它细胞。裸衣壳仍能感染体内巨噬细胞。以这种方式疫苗保持在接种动物的体内而不会传播给其它动物。
图1LV基因组长度cDNA克隆的构建。上部(A)示出在pGEM-4Z中的已测序(Meulenberg et al.，1993a)的cDNA克隆的融合。所用的这些克隆的pABV号及限制位点已标明。黑条代表在下一克隆步骤中融合的cDNA克隆部分。用R.T.标明的浅灰色条是经RT-PCR新产生的cDNA克隆，黑灰色条代表经PCR产生的新cDNA克隆。下部(B)示出较长cDNA克隆pABV331/369，pABV384，及pABV368与含T7 RNA聚合酶启动子的5’末端克隆pABV396，及含聚(A)尾部的3’末端克隆pABV395，在低拷贝数载体pOK12中的装配。在pOK12的多克隆位点内和外的限制性位点已标明。这些限制性内切酶位点是A，ApaI；Ap，ApoI；B，BamHI；Bg，BglII；Bs，BspEl；Bc，BclI；E，EcoRI；Ec，EcoRV；H，HindIII；K，KpnI；N，NarI；Nc，NcoI；S，SacII；Sp，SpeI；Sa，SalI；Sc，ScaI；P，PstI；Pm，PmlI；X，XbaI；Xh，XhoI。
图2克隆的全长LV cDNA及转录自该cDNA克隆的感染性RNA的末端序列。基因组长度cDNA克隆用PvuI线性化，并用T7 RNA聚合酶在合成的帽状类似物m7G(5’)ppp(5’)G存在下转录。所得RNA在5’末端应包含一个额外核苷酸(G)，在3’末端含两个额外核苷酸(GC)。RNA中的箭头相应于真正的LV RNA序列的5’至3’末端核苷酸。
图3LV野生型病毒TH，LV4.2.1及重组病毒vABV414和vABV416在猪肺泡巨噬细胞(A)和CL2621细胞(B)中的生长曲线。BHK-21细胞中产生的重组病毒vABV414和vABV416可直接使用(BHK)，或在猪肺泡巨噬细胞(PAM)中繁殖后使用。TH病毒在猪肺泡巨噬细胞(PAM)中制备，而LV4.2.1在CL2621细胞(CL)中制备。将细胞培养物用所标明的病毒以0.05MOI感染，并在标明时间收集。经终点稀释试验检测在猪肺泡巨噬细胞或CL2621细胞上的病毒滴度(TCID50/ml)。
图4将单一PacI和SwaI位点导入LV感染性cDNA克隆中。PacI和SwaI位点可经如在材料和方法中所述的PCR介导的诱变法产生。将含PacI和SwaI位点的cDNA片段在pABV414中用其已标明的单一HpaI和XbaI位点交换，分别产生pABV437和pABV442。
参考文献Benfield，D.A.，E.Nelson，E.Collins，J.E.，Harris，L.，Goyal，S.M.，Robison，D.，Christianson，W.T.，Morrison，R.B.，Gorcyca，D.E.，andChladek，D.W.(1992).猪不育性及呼吸综合症病毒(ATCC-VR2332分离物)的鉴别，兽医诊断研究4，127-133.
Boyer，J.，and Haenni，A.(1994)RNA病毒的感染性转录物及cDNA克隆，病毒学198，415-426.
Chen，Z.，Faaberg，K.S.，and Plagemann，P.G.W.(1994)通过两种独立途径确定乳酸脱氢酶升高病毒基因组的5’一末端，普通病毒学杂志75，925-930Collins，J.E.，Benfield，D.A.，Christianson，W.T.，Harris，L.，Hennings，J.C.，Shaw，D.P.，Goyal，S.M.McCullough，S.，Morrison，R.B.Joo，H.S.，Gorcyca，D.E.，猪不育性及呼吸综合症病毒(ATCC-VR2332分离物)在北美的分离及在定菌猪中实验产生该病，兽医诊断研究杂志4，117-126.
Conzelmann，K.K.，Visser，N.，van Woensel，P.，and Tiel，H.J.(1993).猪生殖呼吸综合征病毒，一种动脉炎病毒的分子学鉴定，病毒学193，329-339.
den Boon，J.A.，Faaberg，K.S.，Meulenberg，J.J.M.，Wassenaar，A.L.M.，Plagemann，P.G.W，Gorbalenya，A.E.，and Snijder，E.J.(1995)动脉炎病毒复制酶ORFla蛋白质的N-末端区的加工和评价两种木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶的鉴定，病毒学杂志694500-4505.
Davis，N.L.，Willis，L.V.，Smith，J.F.，and Johnston，R.E.(1989).一种昆虫病毒的Venezuelan马脑炎病毒RNA的体外合成，美国科学院院刊83，63-66.
Deng，R.，and Wu，R.(1981).利用末端转移酶将高聚物加到DNA的3′末端的改进程序，核酸研究9，4173-4188.
Edwards，J.B.D.M.，Delort，J.，and Mallet，J.(1991)单链cDNA的寡脱氧核糖核苷酸连接；一种通过体外扩增克隆mRNA的5’末端及构建cDNA文库的新工具，核酸研究19，5227-5232.
Gorcyca，D.，Schlesinger，K.，Chladek，D.，et al.，(1995)Proc.Am.Assoc.of Swine Pract..，Ohama，NE，1-22.
Holy，S.，and Abouhaidar，M.G.(1993).从三叶草黄色花叶病毒cDNA克隆生产感染性体外转录物，普通病毒学杂志74，781-784.
Kim，H.S.，Kwang，J.，and Yoon，I.Y.(1993).在MA-104细胞系的均质亚群中增强复制猪生殖呼吸综合症病毒，病毒学档案133，477-483.
Klump，W.M.，Bergmann，I.，Muller，B.C.，Ameis，D.，and Kandolf，R.(1990)感染性柯萨奇病毒B3 cDNA的完整核苷酸相连在正链RNA合成中重新获得2个起始5′鸟嘌呤残基，病毒学杂志64，1573-1583.
Lai，C.J.，Zhao，B.，Hori，H.，and Bray，M.(1991)从4型登革病毒的稳定克隆的全长cDNA转录的感染性RNA，美国科学院院刊88，5139-5143.
Liljestrom，P.And Garoff，H.(1991).基于Semliki Forest病毒复制子的新一代动物细胞表达载体，生物工程9，1356-1361.
Liljestrom，P.，and Garoff，H.(1993)用Semliki Forest病毒载体表达蛋白，分子生物学当前技术，p.16.xx.1-16.xx.00，F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.A.Smith，J.G.Seidman and K.Stmhl(Eds.).Greene Publishing associates and Wiley interscience，NewYork.
Meulenberg，J.J.M.，Hulst，M.M.，de Meijer，E.J.，Moonen，P.L.J.M.，den Besten，A.，de Kluyver，E.P.，Wensvoort，G.，and Moormann，R.J.M.(1993a).莱利斯塔德病毒，猪流行性流产和呼吸综合征(PEARS)的致病原与LDV和EAV相关，病毒学192，62-74.
Meulenberg，J.J.M.，de Meijer，E.J.，and Moormann，R.J.M.(1993b).莱利斯塔德病毒的次基因组RNA含有一保守的连接序列，普通病毒学杂志74，1697-1701.
Meulenberg，J.J.M.，Petersen-den Besten，A.，de Kluyver，E.P.，Moormann，R.J.M.，Wensvoort，G(1995).由莱利斯塔德病毒的ORF2-7编码的蛋白质的鉴定，病毒学206，155-163.
Meulenberg，J.J.M.，and Petersen-den Besten(1996)莱利斯塔德病毒的第6个结构蛋白的鉴定由ORF2编码的糖蛋白GP2掺入病毒颗粒，病毒学，待出版。
Meulenberg et al.，1997Murtaugh，M.P.，Elam，M.R.，and Kakach(1995)PRRS病毒的VR-2332和莱利斯塔德病毒株的结构蛋白编码序列的比较，病毒学档案140，1451-1460.
Nelson，E.A.，Christopher-Hennings，J.，Drew，T.，Wensvoort，G.，Collins，J.E.，and Benfield，D.A.(1993).通过单克隆抗体区分猪生殖呼吸综合征病毒的美国和欧洲分离株，临床微生物学杂志31，3184-3189.
Plagemann，P.G.W.，and Moennig，V.(1991).乳酸脱氢酶升高病毒、马动脉炎病毒及猿出血热病毒一组新的正链RNA病毒，病毒研究进展41，99-192.
Rice，C.M.，Levis，R.，Strauss，J.H.，and Huang，H.V.(1987).从新培斯病毒cDNA克隆生产感染性RNA转录物致死突变的定位、温度敏感性标记的获救及体外诱变以产生规定的突变体，病毒学杂志61，3809-3819.
Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.(1989)分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约Sarnow，P.(1989)3′末端序列在体外制备的脊椎灰质炎病毒转录物的感染性中的作用，病毒学杂志63，467-470.
Snijder，E.J.，and Horzinek，M.C.(1993)Torovirus复制、进化及与冠形病毒类超家族的其它成员的比较，普通病毒学74，2305-2316.
Spaan，W.J.M.，Cavanagh，D.，and Horzinek，M.C.(1988)冠形病毒结构和基因组表达，普通病毒学69，2939-2952.
Sumiyoshi，H.，Hoke，C.H.，and Trent，D.W.(1992).感染性日本脑炎病毒RNA可从体外连接的cDNA模板合成，病毒学杂志66，5425-5431.
Van Nieuwstadt，A.P.，Meulenberg，J.J.M.，van Essen-Zandbergen，A.，Petersen-den Besten，A.，Bende，R.J.，Moormann，R.J.M.，andWensvoort，G.(1996)莱利斯塔德病毒(动脉炎病毒属)基因组的ORF3和4编码的蛋白是病毒颗粒的结构蛋白，病毒学杂志70，4767-4772.
Viera，J.，and Messing，J.(1991)具有不同的选择性标记和DNA复制起点的新的pUC衍生的克隆载体，基因100，189-194.
Wensvoort，G.，de Kluyver，E.P.，Luijtze，E.A.，de Besten，A.，Harris，L.，Collins，J.E.，Christianson，W.T.，and Chladek，D.(1992)莱利斯塔德病毒和猪不育呼吸(SIRS)病毒的抗原性比较，兽医诊断研究杂志4，134-138.
Wensvoort，G.，Terpstra，C.，Boonstra，J.，Bloemraad，M.，and VanZaane，D.(1986)抗猪发热病毒的单克隆抗体的产生及其在实验诊断中的应用，兽医微生物学12，101-108.
Wensvoort，G.，Terpstra，C.，Pol，J.M.A.，Ter Laak，E.A.，Bloemraad，M.，de Kluyver，E.P.，Kragten，C.，van Buiten，L.，den Besten，A.，Wagennaar，F.，Broekhuijsen J.M.，Moonen，P.L.J.M.，Zetstra，T.，deBoer. E.A.，Tibben，H.J.，de Jong，M.F.，van’t Veld，P.，Groenland，G.J.R.，van Gennep，J.A.，Voets，M.Th.，Verheijden，J.H.M.，andBraamskamp，J.(1991).荷兰的神秘的猪类疾病莱利斯塔德病毒的分离，兽医学季刊13，121-130.
Zeng，L.，Godeny，E.K.，Methven，S.L.，and Brinton，M.A.(1995)猿出血热病毒(SHFV)次基因组RNA、连接序列及5’前导序列的分析，病毒学207，543-548.表1 LV的5’末端克隆的核苷酸序列
1)下划线的核苷酸代表在以前分离和测序的cDNA克隆(Meulenberg et al.，1993a)中未发现的额外的序列。
权利要求
1.一种产生基于正链RNA病毒基因组的感染性克隆的方法，所述方法包括产生一种重组核酸，其包含至少一个全长DNA拷贝或体外转录的RNA拷贝或两者中任一个的衍生物，其中该RNA病毒具有至少约15kb的基因组。
2.一种产生基于RNA病毒基因组的感染性克隆的方法，所述方法包括产生一种重组核酸，其包含至少一个全长DNA拷贝或体外转录的RNA拷贝或两者中任一个的衍生物，所述方法进一步包括用所述重组核酸转染宿主细胞以筛选感染性克隆，其中所述宿主细胞基本上不易感于所述病毒的感染。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述病毒是一种具有至少约15kb基因组的正链RNA病毒。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21细胞。
5.一种重组核酸，包括根据权利要求1-4任一项所述方法获得的感染性克隆。
6.如权利要求5所述的重组核酸，包括基于选自Nidovirales的任一种病毒的基因组的感染性克隆。
7.如权利要求6所述的重组核酸，包括基于选自动脉炎病毒科的任一种病毒的基因组的感染性克隆
8.如权利要求7所述的重组核酸，其中所述病毒是PRRSV。
9.如权利要求5-8任一项所述的重组核酸分子，其中编码毒力标志和/或血清学标志的核酸序列被修饰。
10.如权利要求9所述的重组核酸分子，其中编码所述标志的核酸序列位于编码病毒结构蛋白的任一种开放读框中。
11.如权利要求10所述的重组核酸分子，其中一个开放读框是动脉炎病毒科的任一种病毒的ORF7。
12. 权利要求5-8任一项所述的重组核酸分子，其中一开放读框由动脉炎病毒科的ORF7取代。
13. 如权利要求5-12任一项所述的重组核酸分子，其中插入了至少一个附加的异源核酸序列。
14. 如权利要求13所述的重组核酸分子，其中所述异源核酸序列编码一种抗原。
15. 如权利要求5-14任一项所述的重组核酸分子，其中开放读框已被修饰。
16. 一种修饰的RNA病毒，包括如权利要求5-15任一项所述的重组核酸。
17. 一种疫苗，包括如权利要求16所述的修饰的RNA病毒。
18. 一种用权利要求16的修饰的RNA病毒感染的细胞。
19. 一种从权利要求18的细胞培养物获得的蛋白质和/或抗原。
20. 一种使用权利要求19的蛋白质和/或抗原的诊断分析。
全文摘要
本发明包括一种产生基于具有至少15kb基因组的正链RNA病毒基因组的感染性克隆的方法。本发明进一步包括一种产生基于RNA病毒基因组的感染性克隆的方法,所述方法包括用所述重组核酸转染宿主细胞以筛选感染性克隆,其中所述宿主细胞基本上不易被所述病毒感染。本发明还提供了修饰的RNA病毒及其衍生的疫苗及诊断分析。
文档编号C12N5/10GK1240481SQ97180706
公开日2000年1月5日 申请日期1997年10月29日 优先权日1996年10月30日
发明者约翰娜·雅各芭·玛丽亚·莫伊伦贝格, 约翰尼斯·玛丽亚·安东尼厄斯·波尔, 朱迪·诺尔玛·阿莱塔·博斯－德勒伊特 申请人:农业技术研究基金会