哺乳动物趋化因子的制作方法

专利名称：哺乳动物趋化因子的制作方法
技术领域：
本发明考虑了涉及蛋白的组合物，所述蛋白在控制哺乳动物细胞(例如哺乳动物免疫系统细胞)的发育、分化、运输和生理学上起作用。具体地说，本发明提供了调节或证明不同细胞类型(包括造血细胞)的发育、分化和功能的蛋白。
背景技术：
哺乳动物循环系统的循环组分包括不同的细胞类型，包括类红细胞和髓样细胞谱系的红细胞和白细胞。参见例如，Rapaport(1987)Introduction to Hematology(第2版)Lippincott，费城，宾西法尼亚；Jandl(1987)Blood Textbook of Hematologv，Little，Brown and Co.，波士顿，MA.；和Paul(编辑)(1993)Fundamental Immunology(第3版)Raven出版社，NY。
一段时间以来，已知哺乳动物免疫应答是以一系列叫做“免疫网络”的复杂细胞相互作用为基础。近来的研究对这个网络的内部工作提供了新的理解。尽管明确的是，实际上在多数所述应答确实围绕淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞和其它细胞的网络样的相互作用进行，但现在免疫学家一般持下述观点，即已知为淋巴因子、细胞因子和单核因子的可溶性蛋白，在控制这些细胞相互作用中起关键作用。因此，值得研究细胞调节因子的分离、特征鉴定和作用机制，了解其应对诊断和治疗众多医学异常(例如免疫系统失调和其它失调)取得显著进展。
淋巴因子显然以种种方式介导细胞活性。已显示它们支持多能造血干细胞增殖、发育和分化为大量的祖细胞(progenitor)，所述祖细胞包括构成复杂免疫系统的不同细胞谱系。这些在所述细胞组分之间的相互作用对于健康免疫应答是必需的。在淋巴因子和其它介质一起给药时，这些不同的细胞谱系经常以不同的方式应答。
所述趋化因子是大且各异的蛋白超家族。根据在所述趋化因子基元中的前两个半胱氨酸是否相邻(称为“C-C”分支)，或是否由间插残基间隔(“C-X-C”)，所述超家族再分为两个典型分支。新近鉴定的趋化因子的分支在对应的基元中缺少两个半胱氨酸，并由称为淋巴趋化因子(lymphotactins)的趋化因子代表。另一近来鉴定的分支在所述两个半胱氨酸之间有三个间插残基，例如CX3C趋化因子。参见例如Schall和Bacon(1994)Current Opinion in Immunology 6865-873；和Bacon和Schall(1996)int.Arch.Allergy & Immunol.10997-109。
人们已经鉴定了许多影响前体细胞分化程序、或调节特定细胞类型生理或迁移特性的因子。这些发现表明，存在至今未识别在免疫功能中中作用的其它因子。这些因子提供多种生物活性，其作用范围与已知的分化或激活因子可能不同。对有关在体内调节细胞生理学的调节因子的结构、生物和生理特性缺乏了解，妨碍了对这种因子作用的调变。因此，需要调节相关细胞发育或生理学的疾病仍然难以控制。
发明摘要本发明揭示了先前未知的趋化因子基元的存在，所述趋化因子基元包括本文称为DNAX Vic-1(DVic-1)和DNAX腹股沟伤口表达的CC(DNAX Groin Wound expressed CC)趋化因子(DGWCC)的分子。根据对下文所述的趋化因子蛋白序列的序列分析，显然所述DVic-1和DGWCC属于CC趋化因子家族。
在优选的实施方案中，本发明提供了由下述物质中选择的物质组合物大体纯或重组的DVic-1蛋白或肽，所述蛋白或肽在至少大约12个氨基酸长度内同SEQ ID NO2显示至少大约85％的序列同一性；SEQID NO2的天然序列DVic-1；包含DVic-1序列的融合蛋白；大体纯或重组的DGWCC蛋白或肽，所述蛋白或肽在至少大约12个氨基酸长度内同SEQ ID NO6或8显示至少大约85％的序列同一性；SEQ ID NO6或8的天然序列DGWCC；和包含DGWCC序列的融合蛋白。在大体纯或分离的蛋白实施例中，本发明提供包含下述区段的蛋白，所述区段同DVic-1或DGWCC的对应部分显示同一性的序列；对于同DVic-1的对应部分显示同一性的序列，其中所述同源是至少大约90％同一性，而所述部分是至少大约9个氨基酸；所述同源是至少大约80％的同一性，而所述部分是至少大约17个氨基酸；或所述同源是至少大约70％的同一性，而所述部分是至少大约25个氨基酸；对于同DGWCC的对应部分显示同一性的序列，其中所述同源是至少大约90％同一性，而所述部分是至少大约9个氨基酸；所述同源是至少大约80％同一性，而所述部分是至少大约17个氨基酸；或所述同源是至少大约70％同一性，而所述部分是至少大约25个氨基酸。其它多肽实施例包括那些多肽，其中DVic-1包含SEQ ID NO2的成熟序列；DVic-1蛋白或肽来自包括人的灵长类；包含至少一个SEQ ID NO2的多肽区段；显示多个部分显示同一性；是DVic-1的天然等位变异体；有至少大约30个氨基酸的长度；显示至少两个对灵长类DVic-1特异的非重叠表位；在至少大约20个氨基酸长度内同DVic-1显示至少大约90％的序列同一性；显示至少两个对DVic-1特异的非重叠表位；在至少大约20个氨基酸长度内同DVic-1显示至少大约90％的序列同一性；是糖基化的；是合成多肽；附着于固相基质上；和另一个化学部分缀合；为来自天然序列的5重取代或更少取代的取代体(a 5-fold or less substitution)；或是天然序列的缺失或插入变异体；DGWCC包含SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的成熟序列；或DGWCC蛋白或肽来自包括灵长类或啮齿类的哺乳动物；包含至少一个SEQ ID NO6或8的多肽区段；显示多个部分显示同一性；是DGWCC的天然等位变异体；有至少大约30个氨基酸的长度；显示至少两个对灵长类DGWCC特异的非重叠表位；在至少大约20个氨基酸长度内同DGWCC显示至少大约90％的序列同一性；显示至少两个对DGWCC特异的非重叠表位；在至少大约20个氨基酸长度内同DGWCC显示至少大约90％的序列同一性；是糖基化的；是合成多肽；附着于固相基质上；和另一个化学部分缀合；为来自天然序列的5重取代或更少取代的取代体；或是天然序列的缺失或插入变异体。提供的其它多肽制剂包括组合物，所述组合物包含无菌的DVic-1蛋白或肽；所述DVic-1蛋白或肽和载体，其中所述载体是包括水、盐水和/或缓冲液的水性化合物；和/或配制用于经口、直肠、鼻、体表或肠胃外给药；无菌的DGWCC蛋白或肽；或所述DGWCC蛋白或肽和载体，其中所述载体是包括水、盐水和/或缓冲液的水性化合物；和/或配制用于经口、直肠、鼻、体表或肠胃外给药。
其它多肽形式包括融合蛋白，包含SEQ ID NO2或12的成熟蛋白·序列；SEQ ID NO6或8的成熟蛋白序列；检测或纯化标记，包括FLAG、His6或Ig序列；或另一趋化因子蛋白序列。提供包含这样的蛋白或多肽的试剂盒，所述试剂盒还包括包含所述DVic-1蛋白或多肽的区室；包含所述DVic-1蛋白或多肽的区室；或使用或处理所述试剂盒中试剂的说明。
提供包含例如抗体的抗原结合部分的结合化合物和组合物，所述抗原结合部分特异性地结合天然的DVic-1蛋白、DGWCC蛋白，对于所述DVic-1蛋白，其中所述蛋白是灵长类蛋白；所述结合化合物是Fv、Fab或Fab2片段；所述结合化合物缀合于另一化学部分；或产生针对包含SEQ ID NO2或12的成熟多肽的肽序列的抗体；产生针对成熟DVic-1的抗体；产生针对纯化的DVic-1的抗体；免疫选择抗体；所述抗体是多克隆抗体；所述抗体结合变性的DVic-1；所述抗体显示对抗原的Kd至少为30mM；所述抗体附着于包括珠粒或塑料膜的固相基质上；所述抗体是在无菌组合物中；或可检测地标记所述抗体，包括放射性标记或荧光标记；对于所述DGWCC蛋白，其中所述蛋白是灵长类或啮齿类蛋白；所述结合化合物是Fv、Fab或Fab2片段；所述结合化合物缀合于另一化学部分；或产生针对包含SEQ ID NO6或8的成熟多肽的肽序列的抗体；产生针对成熟DGWCC的抗体；产生针对纯化的DGWCC的抗体；免疫选择所述抗体；所述抗体是多克隆抗体；所述抗体结合变性的DGWCC；所述抗体显示对抗原的Kd至少为30mM；所述抗体附着于包括珠粒或塑料膜的固相基质上；所述抗体是在无菌组合物中；或可检测地标记所述抗体，例如放射性标记或荧光标记。
使用结合组合物的试剂盒实施方案包括那些使用这种结合化合物的试剂盒，所述试剂盒还包括包含所述结合化合物的区室；和/或使用或处理试剂盒中试剂的说明。所述试剂盒一般能够进行定性或定量分析。提供其它不同的组合物，所述组合物例如包括这种无菌结合化合物；或这种结合化合物和一载体，其中所述载体是包括水、盐水和/或缓冲液的水性化合物；和/或配制用于经口、直肠、鼻、表面或肠胃外给药。
提供的核酸包括编码所述蛋白或肽或融合蛋白的分离或重组的核酸，其中所述DVic-1蛋白来自包括人的灵长类；或所述DVic-1核酸编码SEQ ID NO1-4或11-12中任何一个的抗原肽序列；编码SEQ IDNO1-4或11-12中的多个抗原肽序列；显示同编码所述区段的天然cDNA至少大约80％的同一性；是表达载体；还包含复制起点；来自天然来源；包含可检测的标记；包含合成核苷酸序列；少于6kb，优选少于3kb；来自包括人的灵长类；包含天然全长编码序列；是用于编码所述DVic-1蛋白的基因的杂交探针；或是PCR引物、PCR产物或诱变引物；而所述DGWCC蛋白来自包括人或小鼠的灵长类或啮齿类；或所述DGWCC核酸编码SEQ ID NO6或8的抗原肽序列；编码SEQ ID NO6或8的多个抗原肽序列；显示同编码所述区段的天然cDNA至少大约80％的同一性；是表达载体；还包含复制起点；来自天然来源；包含可检测的标记；包含合成核苷酸序列；少于6kb，优选少于3kb；来自包括人或小鼠的灵长类或啮齿类；包含天然全长编码序列；是用于编码所述DGWCC蛋白的基因的杂交探针；或是PCR引物、PCR产物或诱变引物。
也提供包含这种重组核酸的细胞或组织，其中所述细胞是原核细胞、真核细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、小鼠细胞、灵长类细胞或人类细胞。提供包括所述核酸的试剂盒，所述试剂盒例如包含所述核酸和包含所述核酸的区室；还包含DVic-1或DGWCC蛋白或多肽的区室；和/或使用或处理所述试剂盒中试剂的说明。所述试剂盒一般能够进行定性或定量分析。
这类核酸包括以下那些核酸，所述核酸在30℃和低于2M盐、45℃和/或500mM盐、或55℃和/或150mM盐洗涤条件下同SEQ ID NO1杂交；在至少大约30个核苷酸的序列内同DVic-1显示至少大约85％的同一性、显示同DVic-1至少大约90％的同一性和/或所述序列至少大约55个核苷酸、或显示同DVic-1至少大约95％的同一性和/或所述序列至少为大约75个核苷酸；在30℃或低于2M盐、45℃和/或500mM盐、或55℃和/或150mM盐的洗涤条件下同SEQ ID NO5或7杂交；在至少大约30个核苷酸的序列内同DGWCC显示至少大约85％的同一性、显示同DGWCC至少大约90％的同一性和/或所述序列至少为大约55个核苷酸、或显示同DGWCC至少大约95％的同一性和/或所述序列至少为大约75个核苷酸。
另外，提供调制细胞或组织培养细胞的生理学或发育的方法，所述方法包括使所述细胞处于DVic-1或DGWCC的激动剂或拮抗物作用之下。本发明也提供检测与一化合物的特异性结合的方法，包括使所述化合物和选自以下的一种组合物接触特异结合DVic-1趋化因子的抗原结合位点；编码DVic-1趋化因子或其片段的表达载体；大体纯的蛋白，上述抗原结合位点特异性地识别所述蛋白；大体纯的DVic-1趋化因子或其肽，或包含DVic-1趋化因子序列的30个氨基酸序列部分的融合蛋白；特异性结合DGWCC趋化因子的抗原结合位点；编码DGWCC趋化因子或其片段的表达载体；大体纯的蛋白，上述抗原结合位点特异识别所述蛋白；和大体纯的DGWCC趋化因子或其肽，或包含DGWCC趋化因子序列的30个氨基酸序列部分的融合蛋白；或检测所述化合物同所述组合物的结合。
详细描述I.一般描述本发明提供编码蛋白的灵长类DNA序列，其中所述蛋白显示细胞因子或趋化因子特征性的结构特性或基元。对于趋化因子家族的综述，参见例如Lodi等(1994)Science 2631762-1767Gronenborn和Clore(1991)Protein Engineering 4263-269；Miller和Kranger(1992)Proc.Nat′1 Acad. Sci. USA 892950-2954Matsushima和Oppenheim(1989)Cytokine 12-13；Stoeckle和Baker(1990)New Biol.2313-323；Oppenheim等(1991)Ann.Rev.Immunol.9617-648；Schall(1991)Cvtokine 3165-183；和细胞因子手册Academic Press，NY。
本文所述新细胞因子命名为DNAX Vic-1(DVic-1)和DNAX腹股沟伤口表达CC趋化因子(DGWCC)。
SEQ ID NO3和4确定了两个分别从HHFFQ25R人胎心文库和HOEDH11R人成骨细胞文库获得的EST′s。这些显示了高同源性，并且可能是来自相似转录物的EST′s。比较这两个EST′s的趋化因子基元，并衍生共有序列，接着证实所述共有序列编码人DVic-1(SEQ ID NO1)。在Ala和Ile之间显示一个信号序列，尽管该信号序列在不同的细胞系中可能不同。也公开了另一个人DVic-1的更长的转录物，所述转录物具有未显示特征性趋化因子基元(SEQ ID NO11和12)的N-末端延伸。
在SEQ ID NO5和6中公开了人DGWCC的多肽和核酸序列。所述人DGXCC趋化因子核酸序列的编码序列在SEQ ID NO5的大约核苷酸1开始，并在大约核苷酸336结束。在SEQ ID NO6的氨基酸残基9-10中可以发现特征性CC基元。表明一个信号序列，但以相关基因为基础，在不同的细胞类型中可能发生稍微不同的加工。SEQ ID NO7和8中公开了小鼠DGWCC趋化因子(先前称作mDVic-1，参见USSN08/761,071)的核酸序列和对应的氨基酸序列。polyA信号来自核苷酸384-389，并包括终止密码子部分。信号P预示了在Ala(-1)和Leul之间的切割；但实际的切割可能在残基的两侧或左右。
为示范目的，下文所述涉及例如人的灵长类实施方案，但同样适用于其它实施方案(例如天然)包括啮齿类的哺乳动物源的相关实施方案。这些来源应当包括各种脊椎动物，一般是温血动物，例如鸟和哺乳动物，尤其是家畜、啮齿类和灵长类。表1提供了同其它趋化因子的对比。表1线型蛋白序列。人MCP-1(SEQ ID NO9)是核苷酸序列库新增号S71513；人MIP-3a(SEQ ID NO10)是核苷酸序列库新增号U77035；以及人DVic-1(SEQ IDNO2)。相似的线型核苷酸序列将指示同一和差别的区域。hMCP-1 MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLAQPDAINAPVTCCYNF-TNRKISVQRLASY-RRITShMIP-3a MCCTKSLLLAALMSVLLLHLCGESEA--ASNFDCCLGY---TDRILHPKFIVGFTRQLANhDVicMQ-QRGLAIVALAVCAALHASEAILP---IASSCCTEVSHHISRRLLERVNMCR-IQRADhDGWCC M-KGPPTFCSLLLLSLLLSPDPTAAFLLPPSTACCTQLYRKPLSDKLLRKVIQVELQEADmDGWCCMMEGLSPASSLPLLLLLLSPAPEAALPLPSSTSCCTQLYRQPLPSRLLRRIVHMELQEAD* . . ** . .hMCP-1 SKCPKEAVIFKTIVAKEICADPK--QKWVQDSMDHLDKQTQTPKT-----------hMIP-3a EGCDINAIIFHTKKKLSVCANPK---QTWVKYIVRLLSKKVKDM-----------hDVic GDCDLAAVILHVKRRR-ICVSPHNHTVKQWMKVQAAKKNGKGNVCHRKKHHGKRNSNRAHhDGWCC GDCHLQAFVLHLAQRS-ICIHPQNPSLSQWFEHQERKLHGTLPKLNFGMLRKMG------mDGWCC GDCHLQAVVLHLARRS-VCVHPQNRSLARWLERQGKRLQGTVPSLNLVLQKKMYSNPQQQ* *. .** *hMCP-1 --------hMIP-3a --------hDVic QGKHETYGHKTPYhDGWCC --------mDGWCC N--------本发明的趋化因子蛋白，由其物理化学和生物特性而部分确定。本文所述的例如DVic-1或DGWCC的趋化因子的生物性质，由其氨基酸序列和成熟大小部分确定。它们还应当同其它相似的趋化因子享有至少一些生物性质。一名技术人员容易识别一些可以耐受、且没有明显改变所述分子的生物活性的序列变异，例如对于受体相互作用或重要的三级结构特征的关键的残基的保守置换或远离该残基的位置。相反，非保守置换可能适合于删除选择的功能。
这些趋化因子存在于特定组织类型中，例如皮肤组织，而所述蛋白与受体的相互作用对介导不同方面的细胞生理或发育很重要。表达编码DVic-1或DGWCC的信息的细胞类型表明，在细胞分化和发育中重要的信号由所述细胞传递。参见例如，Gilbert(1991)发育生物学(第3版)Sinauer Associates，桑德兰，马萨诸塞州；Brower等，(1991)发育生物学(第3版)Saunders，费城，宾西法尼亚州Russo等(1992)发育分子遗传方案Springer-Verlag，纽约，纽约州；和Wilkins(1993)动物发育的遗传分析(第2版)Wiley-Liss，纽约，纽约州。并且，DVic-1或DGWCC的表达或应答性应起标记的作用，例如，限定某些细胞亚群。
通过对数据库序列的检索和细致分析发现了所述新的趋化因子。序列在可用数据库中不存在强有力地表明，所述信息表达很少和/或在很低水平表达。这样可能反映出在多数细胞类型中细胞表达的高度限制和/或水平很低。
可以使用标准方法进行RNA印迹分析，参见例如，Maniatis等(1982)分子克隆，实验室指南，冷泉港实验室，冷泉港出版社，NY；Sambrook等(1989)分子克隆，实验室指南(第2版)，第1-3卷，CSH出版社，NY；Ausubel等，生物学Greene Publishing Associates，布鲁克林，NY；和Ausubel等(1987和增补本)分子生物学现时方案Wiley/Greene，NY。II.定义所述术语“结合组合物”表示例如在抗体-抗原相互作用中特异性和选择性地结合DVic-1或DGWCC趋化因子的分子。然而，其它化合物，例如受体蛋白，也可以特异性和/或选择性地结合DVic-1或DGWCC趋化因子，以便排斥其它分子。所述结合一般将在天然生理相关的蛋白-蛋白相互作用中为或者共价或者非共价的，并可以包括多蛋白复合物的成员，包括载体化合物或二聚化配偶体(partner)。所述分子可以是聚合物或化学试剂。关于DVic-1还是DGWCC趋化因子一定是凸起形状的分子，例如配体-受体相互作用中的配体或受体，这种含意不必说明，除了所述相互作用是否显示相似特异性，例如特异亲和性。功能类似物可以是具有修饰结构的配体，或者可以是完全不相关的分子，例如具有同适当配体相互作用的分子形状的分子，其中所述配体结合决定基。所述配体可以用做所述受体的激动剂或拮抗剂，参见例如，Goodman等(编辑)(1990)Goodman & Gilman’sThe PharmacologicalBases of Therapeutics(第8版)Pergamon出版社，Tarrytown，NY。
本文使用的所述术语“结合剂趋化因子蛋白复合物”，是指结合剂和趋化因子(例如DVic-1或DGWCC)蛋白通过所述结合剂同所述趋化因子蛋白的特异结合形成的复合物。所述结合剂的特异性或选择性结合是指所述结合剂具有特异性结合位点，例如抗原结合位点，所述结合剂在DVic-1趋化因子蛋白上识别在许多其它蛋白中不共用的位点。例如，产生的针对DVic-1趋化因子蛋白并识别所述趋化因子蛋白上的表位的抗体，能够通过特异性和选择性结合形成结合剂DVic-1趋化因子蛋白复合物。结合剂DVic-1趋化因子蛋白复合物的形成，一般允许在其它蛋白和生物制品的混合物中测定DVic-1趋化因子蛋白。同样，所述术语“抗体DGWCC趋化因子蛋白复合物”是指一个实施方案，在所述实施方案中，所述结合剂例如是抗体的抗原结合部分。所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或抗体的结合片段，例如Fab或F(ab)2片段。所述抗体优选是用于交叉反应性测试目的的多克隆抗体。
在对比时，“同源的”核酸序列显示显著的相似性或同一性。在核酸中同源性的标准，或者是通过序列比较和/或系统发生关系一般在本领域中使用的同源性的衡量，或者基于杂交条件。在下文更详细地描述了杂交条件。
“分离的”核酸是例如RNA、DNA或混合多聚体的核酸，所述核酸基本上与其它生物组分分离，所述生物组分天然伴随天然序列，例如来自原始种的蛋白和侧翼基因组序列。所述术语包含从其天然产生环境中取出的核酸序列，并包括重组的或克隆的DNA分离物和化学合成类似物，或由异源系统生物合成的类似物。大体纯的分子包括分离形式的所述分子。分离的核酸通常包含同源核酸分子，但在某些实施方案中，所述核酸包含序列异源性小的核酸。一般在对所需生物功能或活性不重要的多聚体末端或部分中发现这种异源性。
当在蛋白范围内使用时，本文使用的所述术语“DVic-1趋化因子蛋白”将包括这样的蛋白，其氨基酸序列特别是来自SEQ ID NO2所示的趋化因子基元部分，或者包括这种蛋白特有的和/或特征性有效片段，优选是天然实施方案。同样对于人和小鼠DGWCC，应包含SEQ IDNO6和8所示的氨基酸序列的蛋白。本发明也包括同这种趋化因子显示相似结构的多肽，例如同DVic-1或DGWCC特异性结合组分的相互作用的多肽。这些结合组分，例如抗体，一般高亲合性地(例如以至少大约100nM，通常优于大约30nM，优选优于大约10nM，更优选优于大约3nM)结合或者DVic-1趋化因子或者DGWCC趋化因子。
本文使用的术语“多肽”或“蛋白”包括例如DGWCC趋化因子的趋化因子基元部分的有效片段或区段，并包括至少大约8个氨基酸的一段氨基酸残基，一般至少10个氨基酸，更一般至少12个氨基酸，经常至少14个氨基酸，更经常至少16个氨基酸，典型至少18个氨基酸，更典型至少20个氨基酸，通常至少22个氨基酸，更通常至少24个氨基酸，优选至少26个氨基酸，更优选至少28个氨基酸，而在特别优选的实施方案中，至少大约30个或更多的氨基酸，例如35、40、45、50、60、70、80等等。所述区段可能具有合适长度的氨基和羰基末端，例如在例如残基1、2、3等开始，和在例如残基95、94、93、92等结束。本发明包括由包含多个所述区段的蛋白。
“重组”核酸或者由其生产方法定义，或者由其结构定义。关于其生产方法，例如通过工艺制造产物，所述工艺使用重组核酸技术，例如包括在核苷酸序列中人的干涉，一般为选择或生产。另一方面，它可以是通过产生包含两个片段的融合体的序列制造的核酸，所述片段互相不是天然连接的，而是指除去天然产物，例如天然产生的突变体。因此，例如包括通过用任何非天然产生的载体转化细胞制造的产物，也包括包含使用任何合成寡核苷酸方法衍生的序列的核酸。经常用编码相同或保守的氨基酸的丰余密码子进行密码子置换，同时引入或除去序列的识别位点。或者，将所需功能的核酸区段连接在一起，以产生单一遗传实体(entity)，所述实体包含在通常可利用的天然形式中未发现的所需功能的组合。限制酶识别位点经常是这种人工操作的靶，但是可以通过设计引入其它位点特异靶，例如启动子、DNA复制位点、调节序列、控制序列或其它有用的特征。相似的观念准备用作重组体，例如融合体、多肽。特别包括合成核酸，所述核酸优于遗传密码丰余性，编码同这些抗原的片段相似的多肽和来自各种不同物种变异体的序列融合体。
在Svedberg装置中测定的沉降反映了“溶解度”，所述装置是在特定条件下分子沉降速度的测量工具。用分析超离心机对所述沉降速度进行标准的测定，但现在一般用标准超离心机测定所述沉降速度。参见Freifelder(1982)物理生物化学(第2版)W.H.Freeman & Co.，旧金山，CA；和Cantor和Schimmel(1980)生物物理化学第1-3章，W.H.Freeman & Co.，旧金山，CA。作为粗测定，用标准满容量超离心机，以大约50K rpm离心包含估计可溶的多肽的样品大约10分钟，则可溶分子保留在上清液中。可溶性微粒或多肽一般小于大约30S，更一般小于大约15S，通常小于大约10S，更通常小于大约6S，而在具体实施方案中，优选小于大约4S，更优选小于大约3S。多肽或片段的溶解性取决于所述环境和所述多肽。许多参数影响多肽的溶解性，包括温度、电解质环境、所述多肽的大小和分子特征和溶剂的性质。一般在从大约4℃到大约65℃的温度范围内使用所述多肽。通常使用的所述温度大约高于18℃，更通常大约高于22℃。为诊断目的，所述温度通常大约在室温或更高，但低于在所述测定中组分的变性温度。为治疗目的，尽管在某些情况下在原位或在体外可以升高或降低所述温度，但所述温度通常是体温，对于人一般是大约37℃。
所述多肽的大小和结构一般应在大致稳定的状态，而通常不处于变性状态。例如所述多肽在四级结构中可以和其它多肽结合(例如赋予溶解性可溶性)，或者可以同脂质或去污剂以近似天然类脂体双分子层相互作用的方式结合。
所述溶剂通常是一种用于保存生物活性类型的生物相容性缓冲液，通常近似于生理溶剂。通常所述溶剂的pH值为中性，典型的大约在5和10之间，而优选约为7.5。在某些时候，加入去污剂，一般是温性非变性去污剂，例如CHS(胆固醇半琥珀酸酯)或CHAPS(3-[3-胆氨基丙基(cholaminopropyl)-二甲基铵基]-1-丙烷磺酸盐)，或加入足够低浓度的去污剂，以避免显著破坏所述蛋白的结构或生理特性。
在蛋白范围内的“大体纯的”一般指与其它污染蛋白、核酸和其它得自原始源生物的生物制品分离的蛋白。可以通过标准方法检测纯度或“分离”，普通至少大约50％纯度，更普通至少大约60％纯度，一般至少大约70％纯度，更一般至少大约80％纯度，经常至少大约85％纯度，更经常至少大约90％纯度，优选至少大约95％纯度，更优选至少大约98％纯度，而在最优选的实施方案中，至少99％纯度。相似的概念适用于例如抗体或核酸。
在所述核酸序列比较范围内，“大体相似性”指当对比时，或者所述区段或者其互补链，在以插入或缺失合适的核苷酸进行最佳对比时，至少大约50％的核苷酸相一致，一般至少56％，更一般至少59％，普通至少62％，更普通至少65％，经常至少68％，更经常至少71％，典型至少74％，更典型至少77％，通常至少80％，更通常至少大约85％，优选至少大约90％，更优选至少大约95％-98％或更多，而在特定实施方案中，高达大约99％或更高的核苷酸相一致。另一方面，当所述区段在选择杂交条件下杂交时，同一条链或其互补链存在着大致相似性，所述链或其互补链一般使用由SEQ ID NO1、5或7衍生的序列。一般当一段至少大约30个核苷酸的序列中至少大约55％相似时，将发生选择杂交，优选在一段至少大约25个核苷酸中至少大约65％相似，更优选至少大约75％相似，而最优选在大约20个核苷酸中至少大约90％相似。参见Kanehisa(1984)Nuc.Acids Res.12203-213。所述的相似对比的长度可以为更长的一段序列，在某些实施方案中为一段至少大约17个核苷酸的序列，通常至少大约20个核苷酸，更通常至少大约24个核苷酸，典型至少大约28个核苷酸，更典型至少大约40个核苷酸，优选至少大约50个核苷酸，而更优选至少大约75-100或更多个核苷酸，例如150，200等等。
涉及杂交范围内的同源性或大致相似性，“严格条件”将是一般在杂交反应中控制的那些盐、温度、有机溶剂和其它参数的严格组合条件。所述参数组合比任何单个参数的测定更重要。参见例如，Wetmur和Davidson(1968)J.Mol.Biol.31349-370。在严格条件下结合靶核酸的核酸探针对于所述靶核酸是特异性的。这样的探针长度一般多于11个核苷酸，并在于严格杂交条件下结合所述靶的探针序列限定的区域内地与靶核酸足够相同或互补。
可以通过密切相关的物种的杂交种杂交，克隆和分离来自其它哺乳动物物种的DGWCC趋化因子。参见例如下文。在远缘物种之间相似性可能相对较低，因此使相对密切相关的物种杂交是合理的。另一方面，制备表现出物种特异性较低的抗体制备物在表达克隆方法上可能是有用的。
词组“特异结合抗体”或“与……特异性免疫反应”，当适是指蛋白或肽时，表示一种结合反应，所述结合反应在存在蛋白和其它生物组分的异质群体时，证明存在所述蛋白。因此，在指定的免疫测定条件下，给定的抗体结合特定的蛋白，而与存在于所述样品中的其它蛋白没有显著结合。在这种条件下特异性结合抗体可能需要抗体，根据对特定蛋白的特异性选择所述抗体。例如，可以选择针对具有SEQID NO2或6或8描述的氨基酸序列的DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白免疫原产生的抗体，以获得与DGWCC趋化因子蛋白特异性免疫反应、而不与其它蛋白特异免疫反应的抗体。所述抗体可以是物种特异，例如还识别多态或剪接或发育变异体。III.核酸DGWCC趋化因子是结构和功能相关蛋白的范例。这些可溶性的趋化因子蛋白在不同细胞类型之间用于传递信号。在标准步骤中使用公开的优选实施方案，以从不同的个体或其它物种诸(如鸟和哺乳动物)中分离基因。交叉杂交允许分离编码来自个体、菌株或物种的蛋白的相关基因。基于本文提供信息，多种不同的方法可以用于成功分离的合适的核酸克隆。DNA印迹杂交研究可以在特定杂交条件下定性测定人、猴、大鼠、小鼠、狗、猫、牛和兔基因组中同源基因的存在。
互补序列也用作探针或引物。根据对可能的氨基末端的鉴定，例如结合锚式载体或poly-A互补PCR技术或结合其它肽的互补DNA，其它多肽应当特别有用。
在Sambrook等(1989)分子克隆实验室指南(第2版)第1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港出版社，NY中概述了用于核酸操作编码DGWCC趋化因子蛋白的基因的技术，诸如将编码多肽的核酸序列亚克隆入表达载体内、标记探针、DNA杂交等等，该文献通过引用结合到本文中。这个指南在下文称为“Sambrook等”。
有各种方法分离编码DGWCC趋化因子蛋白的DNA序列。例如，用标记寡核苷酸探针从基因组或cDNA文库中分离DNA，所述探针具有同本文公开的序列相同或互补的序列。可以使用全长探针，或者可以通过对比公开的所述序列产生寡核苷酸探针。在杂交测定中可以直接使用这种探针，以分离编码DGWCC趋化因子蛋白的DNA，或者可以设计用于诸如PCR的扩增技术的探针，以分离编码DGWCC趋化因子蛋白的DNA。反向翻译计算机程序也可以提供可供选择的编码相同蛋白的核酸序列。
为制备cDNA文库，从表达DGWCC趋化因子蛋白的细胞中分离mRNA。由mRNA制备cDNA，并将其连接入重组载体。将所述载体转染到重组宿主中，以繁殖、筛选和克隆。制备和筛选cDNA文库的方法是广为人知的。参见Gubler和Hoffman(1983)Gene 25263-269和Sambrook等。
关于基因组文库，可以从组织中提取所述DNA，并且或者可以机械剪切所述DNA，或者可以酶促消化所述DNA，以产生大约12-20kb的片段。然后通过梯度离心分离所述片段，并在噬菌体λ载体中克隆所述片段。按在Sambrook等中所述，在体外包装这些载体和噬菌体。用在Benton和Davis(1977)Science 196180-182中所述的噬菌斑杂交分析重组噬菌体。按照在例如Grunstein等(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.723961-3965中的概述进行菌落杂交。
可以在或者cDNA文库中，或者基因组文库中，通过其与本文所述的核酸探针杂交的能力，鉴别编码DGWCC趋化因子蛋白的DNA，例如在菌落杂交或噬菌斑杂交测定中鉴别。通过本领域内那些技术人员熟知的标准方法分离对应的DNA区。参见例如Sambrook等。
也可以使用不同的扩增靶序列的方法，诸如多聚酶链式反应，以制备编码DGWCC趋化因子蛋白的DNA。使用多聚酶链式反应(PCR)技术，直接从mRNA、从cDNA、和从基因组文库或cDNA文库中扩增这种核酸序列。也可以使用编码DGWCC趋化因子蛋白的分离序列作为模板，用于PCR扩增。
一般用PCR技术合成寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物和在待扩增的DNA区中的两个5′区互补。然后用所述两个引物进行多聚酶链式反应。参见Innis等(编辑)(1990)PCR方案方法和应用指南AcademicPress，San Diego，CA。可以选择引物，以扩增编码全长DGWCC趋化因子蛋白的整个区域，或扩增所述较小的DNA区段。只要通过PCR扩增这个区，就可以对它们测序，并可以由使用标准技术得到的序列制备寡核苷酸探针。然后可以使用这些探针分离编码DGWCC趋化因子蛋白的DNA。
通常按照由Beaucage和Carruthers(1983)Tetrahedron Lett.22(20)1859-1862中首先描述的固相亚磷酰胺三酯方法，或如Needham-VanDevanter等(1984)Nucleic Acids Res. 126159-6168所述使用自动合成仪，化学合成用作探针的寡核苷酸。例如，通过天然丙烯酰胺凝胶电泳，或通过在Pearson和Regnier(1983)J.Chrom.255137-149中所述的阴离子交换HPLC进行寡核苷酸纯化。可以使用例如Maxam和Gilbert在Grossman和Moldave(编辑1980)Methods in Enzvmology 65499-560Academic Press，纽约中的化学降解法，证实所述合成寡核苷酸的序列。
鉴定编码DGWCC趋化因子蛋白的分离的核酸。在SEQ ID NO1或5或7中提供所述核酸序列和对应的可读框。
这些DVic-1和DGWCC趋化因子显示同部分趋化因子有限的相似性。参见例如Matsushima和Oppenheim(1989)Cytokine 12-13；Oppenheim等(1991)Ann.Rev.Immunol. 9617-648；Schall(1991)Cytokine 3165-183；和Gronenborn和Clore(1991)Protein Engineering4263-269。所述DGWCC趋化因子和趋化因子家族之间其它特征的对比很明显。参见例如Lodi等(1994)Science 2631762-1766。具体而言，可以使用例如RASMOL程序确定b-折叠和a-螺旋残基，参见Sayle和Milner-White(1995)TIBS 20374-376；或Gronenberg等(1991)ProteinEngineering 4263-269；并在Lodi等(1994)Science 2631762-1767中详细说明了其它结构特征。除了合适的半胱氨酸残基间隔之外，这些二级和三级特征帮助进一步确定了C、CC、CXC和CX3C结构特征。
本发明提供编码DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白的分离的DNA或片段。另外，本发明提供分离或重组的编码蛋白或多肽的DNA，所述DNA能够在例如高严格性的合适条件下，同本文所述的DNA序列杂交。所述生物活性蛋白或多肽可以是完整配体或片段，并具有如在SEQID NO2或6或8中公开的氨基酸序列，尤其是天然实施方案。优选实施方案将是全长天然序列，它来自例如在非糖基化时大小约为11,000至12,500道尔顿的分离物，或来自至少大约6,000道尔顿、更优选至少大约8,000道尔顿的片段。在糖基化形式时，所述蛋白可以超过12,500道尔顿。而且，本发明考虑编码下述蛋白的分离或重组的DNA或其片段的用途，所述蛋白同DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白同源，或使用编码DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白的cDNA作为探针分离的。所述分离的DNA可以在5′和3′侧翼具有各自的调节序列，例如启动子、增强子、poly-A添加信号和其它信号。还包括制备具有这些序列的表达载体的方法、或者制备(例如表达或纯化)蛋白产物的方法。IV. 制备DVic-1、DGWCC趋化因子可以通过化学合成、筛选cDNA文库，或通过筛选由各种各样的细胞系或组织样品制备的基因组文库，获得编码DVic-1或DGWCC趋化因子或其片段的DNA。本文描述了用于上述操作或制备表达载体的方法。
可以在各种各样的宿主细胞中表达这些DNA，用于合成全长的蛋白或片段，所述蛋白或片段可以依次，例如用于产生多克隆或单克隆抗体；用于结合研究；用于构建和表达修饰分子；并用于结构/功能研究。每种DVic-1或DGWCC趋化因子或其片段可以在用合适的表达载体转化或转染的宿主细胞中表达。可以大体纯化这些分子，以除去蛋白或细胞污染物，而不是纯化那些由所述重组宿主衍生的分子，并因此在和药学上接受的载体和/或稀释剂结合时，特别可用于药物组合物。所述抗原，例如DGWCC趋化因子或其部分，可以作为与其它蛋白的融合体或具有表位标记的融合体表达。
表达载体通常是自主复制DNA或RNA构成物，所述构成物包括所需抗原基因或其片段，通常可操作的连接到在合适宿主细胞中识别的合适的遗传控制元件。实现表达所需的特定类型的控制元件取决于最后使用的宿主细胞。一般来说，所述遗传控制元件可以包括原核生物启动子系统或真核生物启动子表达控制系统，一般包括转录启动子、控制转录开始的可选的操作子、提高mRNA表达水平的转录增强子、编码合适的核糖体结合位点的序列、和终止转录和翻译的序列。表达载体通常也包含复制起点，所述复制起点允许所述载体独立于所述宿主细胞而复制。
本发明的载体包括编码DVic-1或DGWCC趋化因子或其片段的DNA，所述DNA一般编码例如生物活性多肽或蛋白。所述DNA可以处于病毒启动子控制之下，并可以编码选择标记。本发明还考虑了这种表达载体的用途，所述载体能够在原核生物或真核生物宿主中表达编码DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白的真核生物cDNA，其中所述载体和所述宿主相容，并且将编码所述蛋白的真核生物cDNA插入到所述载体中，以使包含载体的所述宿主生长，其中所述载体表达上述cDNA。通常设计表达载体用于在其宿主细胞中稳定复制，或用于扩增，以大大增加每个细胞的所需基因拷贝总数。通常不必需要在宿主细胞中复制表达载体，例如，使用不包括所述宿主细胞识别的复制起点的载体可能影响所述蛋白或其片段在不同的宿主中瞬时表达。也可能使用引起DVic-1或DGWCC趋化因子基因或其片段通过重组整合到所述宿主DNA中的载体，或者也可能整合控制内源基因表达的启动子。
本文使用的载体，考虑了质粒、病毒、噬菌体、可整合DNA片段和其它能够将DNA片段整合到所述宿主基因组中的载体。表达载体是包含遗传控制元件的特殊的载体，所述遗传控制元件影响可操作连接的基因的表达。质粒是最通常使用的载体形式，但许多其它形式的起相同作用的载体也适于本文。参见例如Pouwels等(1985和增补本)克隆载体实验室指南Elsevier，纽约；和Rodriquez等(编辑)(1988)载体分子克隆载体及其应用的调查Buttersworth，波士顿，MA。
合适的宿主细胞包括原核生物、低等真核生物和高等真核生物。原核生物包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌生物，例如大肠杆菌和枯草杆菌。低等真核生物包括酵母，例如啤酒酵母和毕赤酵母属和网柄菌属。高等真核生物既包括来自例如昆虫细胞和鸟类的非哺乳动物起源的动物细胞的确立组织培养细胞株，也包括来自例如人、灵长类和啮齿类的哺乳动物起源的动物细胞的确立组织培养细胞株。
原核宿主载体系统包括各种各样的用于多种不同物种的载体。本文使用的大肠杆菌及其载体一般包括在其它原核生物中使用的相当的载体。用于扩增DNA的代表性的载体是pBR322或其衍生物。可以用于表达DGWCC趋化因子或DGWCC趋化因子片段的载体包括但不限于，诸如那些包含lac启动子(pUC系列)、trp启动子(pBR322-trp)、Ipp启动子(所述pIN系列)、λ-pP或pR启动子(pOTS)、或诸如ptac(pDR450)的杂种启动子的载体。参见Brosius等(1988)“使用λ-、trp-、lac-和Ipp-衍生启动子的表达载体”，在Rodriguez和Denhardt(编辑)载体分子克隆载体及其应用的调查10205-236 Buttersworth，波士顿，MA。
低等真核生物，例如酵母和网柄菌属，可以用包含DVic-1或DGWCC趋化因子序列的载体转化。对本发明来说，最普通的低等真核生物宿主是面包酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。尽管也可以利用多种其它菌株和物种，但所述低等真核生物宿主一般用来代表低等真核生物。酵母载体一般由复制起点(除了所述整合类型)、选择基因、启动子、编码所需蛋白或其片段的DNA和用于翻译终止、多腺苷酸化和转录终止的序列组成。用于酵母的合适的表达载体包括诸如3-磷酸甘油酸激酶和其它各种糖酵解酶基因启动子的组成型启动子，或诸如乙醇脱氢酶2启动子或金属硫蛋白启动子的诱导型启动子。合适的载体包括下述类型的衍生物自主复制低拷贝数(诸如YRp系列)、自主复制高拷贝数(诸如YEp系列)；整合类型(诸如YIp系列)，或微型染色体(诸如YCp系列)。
高等真核生物组织培养细胞一般是优选的用于表达功能活性的DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白的宿主细胞。原则上，可以使用许多高等真核组织培养细胞系，例如昆虫杆状病毒表达系统，不论其来自无脊椎动物源还是来自脊椎动物源。然而，优选哺乳动物细胞是为了获得共翻译以及翻译后两者的正确加工。这种细胞的转化或转染和繁殖是常规技术。有用的细胞系包括海拉细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、幼鼠肾(BRK)细胞系、昆虫细胞系、鸟细胞系和猴(COS)细胞系。用于这些细胞系的表达载体一般包括复制起点、启动子、翻译起始位点、RNA剪接位点(例如如果使用基因组DNA)、多腺苷酸化位点和转录终止位点。这些载体也可以包括一个选择基因或扩增基因。合适的表达载体可以是携带启动子的质粒、病毒或具有启动子的反转录病毒，所述启动子例如得自诸如腺病毒、SV40、细小病毒、痘苗病毒或巨细胞病毒的来源。合适的表达载体的代表性实施方案包括pCDNA1；pCD，参见Okayama等(1985)Mol.Cell Biol. 51136-1142；pMClneo Poly-A，参见Thomas等(1987)Cell 51503-512；和诸如pAC373或pAC 610的杆状病毒载体。
可能DVic-1或DGWCC趋化因子不需要糖基化，以引起生物应答。然而，偶尔希望它在提供特别或限定的糖基化型式的系统中表达DVic-1或DGWCC趋化因子多肽。在这种情况下，常用的型式将是由所述表达系统天然提供的型式。然而，通过将例如非糖基化形式的所述多肽暴露于引入到异源表达系统中的合适糖基化蛋白，而修饰所述型式。例如，所述DGWCC趋化因子基因可以同一个或多个编码哺乳动物或其它糖基化酶的基因共转化。现在更加了解过度糖基化可能损害DGWCC趋化因子生物活性，而技术人员可以进行常规的测试，以最优化提供最佳生物活性的糖基化程度。
可以工程改造DVic-1或DGWCC趋化因子或其片段，以将磷脂酰肌醇(PI)连接到细胞膜上，但可以通过用磷脂酰肌醇切割酶，例如磷脂酰肌醇磷脂酶-C处理，从膜上除去所述磷脂酰肌醇(PI)。这释放了生物活性形式的抗原，并允许用标准的蛋白化学步骤纯化。参见例如Low(1989)Biochem. Biophhvs. Acta 988427-454；Tse等(1985)Science 2301003-1008；和Brunner等(1991) J.Cell Biol.1141275-1283。
现在已特征鉴定了DVic-1和DGWCC趋化因子，可以通过用于合成肽的常规方法制备其片段或其衍生物。这些包括诸如在Stewart和Young(1984)固相肽合成Pierce Chemical Co.，洛克福德，伊力诺伊州；Bodanszky和Bodanszky(1984)肽合成实践Springer-Verlag，纽约，纽约州；和Bodanszky(1984)肽合成原理Springer-Verlag，纽约，纽约州中所述的方法。例如可以使用叠氮化物法、盐酸工法、酸酐法、混合酐法、活性酯法(例如对硝基苯酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯或氰甲酯)、碳化二咪唑法、氧化还原法、或二环己基碳二亚胺(DCCD)/加成法。固相和液相合成都适用于前述方法。也参见化学连接，例如Dawson等(1994)Science 266776-779，通过肽键连接长合成肽的方法。
可以通过肽分离，例如通过提取、沉淀、电泳和不同形式的层析等等，从所述反应混合物中分离和纯化所述制备的蛋白和其片段。根据其希望的用途，可以以不同的纯度获得本发明的DVic-1或DGWCC趋化因子。通过使用已知的蛋白纯化技术或例如在免疫吸收亲合性层析中使用本文所述的抗体或结合配偶体，可以完成纯化。首先通过将抗体同固相支持体连接，然后将连接的抗体与可溶性的合适源细胞的裂解液、表达所述配体的其它细胞的裂解液、或利用重组DNA技术(参见下文)产生所述DVic-1或DGWCC趋化因子的细胞的裂解液或上清液接触，进行此免疫吸附亲合层析。
可以筛选多个细胞系，得到同其它细胞相比，以高水平表达DGWCC趋化因子的细胞系。可以从天然源，或通过使用合适表达载体的转化细胞的表达，分离天然DVic-1或DGWCC趋化因子。通过标准步骤获得表达蛋白的纯化，或者可以将表达蛋白的纯化与工程方法组合，以高效率地有效地从细胞裂解液进行纯化裂解液。可以使用表位或其它标记，例如FLAG或His6区段，作为这种纯化特征。V.抗体可以产生不同的针对各种DVic-1或DGWCC趋化因子的抗体，包括个体的、多态的、等位的、菌株或物种的变异体及其片段，不论其是天然产生(全长)形式，还是重组形式。另外，可以产生针对或者活体形式、或者非活体形式的DVic-1或DGWCC趋化因子的抗体。也可以使用抗独特型抗体。所述抗体可以显示对于物种、个体或多态变异体的不同的结合特异性。
A.生产抗体可以使用多种免疫原生产与DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白特异反应的抗体。重组蛋白是优选的用于生产单克隆或多克隆抗体的免疫原。也可以使用或者纯形式或者非纯形式的天然产生的蛋白。也可以使用用本文所述的DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白序列制备的合成肽，作为用于生产针对DVic-1或DGWCC趋化因子的抗体的免疫原。可以在本文所述的真核或原核细胞中表达重组蛋白，并如所述对其纯化。可以适当地使用天然折叠或变性的材料生产抗体。可以生产或者单克隆抗体或多克隆抗体，以后将其应用于检测所述蛋白的免疫测定中。
生产多克隆抗体的方法是本领域那些技术人员已知的。一般来说，将免疫原，优选是纯化的蛋白，同佐剂混合，并用此混合物对动物免疫。通过取测试血和测定对目的DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白的反应效价，监视动物对所述免疫原制备物的免疫应答。当获得针对所述免疫原的合适的高效价抗体时，通常在重复免疫后，从所述动物中收集血液，并制备抗血清。如果需要，可以对所述抗血清进行进一步的分级分离，以富集对所述蛋白反应的抗体。参见例如Harlow和Lane；或Coligan。
可以通过本领域那些技术人员熟悉的各种技术获得单克隆抗体。一般来说，通常通过和骨髓瘤细胞融合(参见Kohler和Milstein(1976)Eur.J.Immunol. 6511-519，通过引用结合到本文中)，使来自用所需抗原免疫的动物的脾细胞无限增殖化。无限增殖化的替代方法包括用埃-巴二氏病毒、癌基因或反转录病毒或本领域已知的其它方法转化。筛选由单种无限增殖化细胞产生的集落，以生产对所述抗原具有所需特异性和亲合性的抗体，可以用各种技术，包括注射到脊椎动物宿主的腹膜腔中，增加由这种细胞生产的单克隆抗体的产量。或者，例如按照由Huse等(1989)Science 2461275-1281概述的一般方案，通过筛选来自人B细胞的DNA文库，可以分离编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。
可以通过用如上所述的片段和载体蛋白的缀合物使动物免疫，产生针对DGWCC趋化因子的预定测片段的抗体，包括结合片段和单链形式。由分泌所需抗体的细胞制备单克隆抗体。可以筛选这些抗体，根据结合正常或缺陷的DVic-1或DGWCC趋化因子，或者根据例如通过受体介导的激动或拮抗活性，筛选这些抗体。这些单克隆抗体结合的KD通常至少大约1mM，更通常至少大约300μm，典型至少大约10μm，更典型至少大约30μm，优选至少大约10μm，和更优选至少大约3μM或更少。
在某些情况下，最好是由不同的哺乳动物宿主，诸如小鼠、啮齿类、灵长类、人等制备单克隆抗体。例如在通过引用结合到本文中的Stites等(编辑)基础和临床免疫学(第4版)Lange Medical Press，LosAltos，CA；Harlow和Lane(1988)抗体实验室指南CSH出版社；Goding(1986)单克隆抗体原理与实践(第2版)Academic Press，纽约，纽约州中可以发现制备这种单克隆抗体的技术的描述；特别是在Kohler和Milstein(1975)Nature 256495-497中，讨论了一个产生单克隆抗体的方法。简单来说，这个方法涉及用免疫原注射动物。然后处死所述动物，并从其脾脏中取出细胞，将所述细胞然后同骨髓瘤细胞融合。结果得到能够在体外繁殖的杂种细胞或“杂交瘤”。然后筛选杂交瘤种群，以分离单个克隆，每个所述单个克隆分泌针对所述免疫原的单个抗体物质。以这种方式，获得的单个抗体物质是来自所述免疫动物的无限增殖化和克隆单种B细胞的产物，所述产物响应在免疫原性物质上的特异识别位点而产生。
其它合适的技术涉及选择在噬菌体或相似的载体中的抗体文库。参见例如Huse等(1989)“在λ噬菌体中的免疫球蛋白所有组成成分的大组合文库的产生”Science 2461275-1281；和Ward等(1989)Nature341544-546。也可以使用修饰或未修饰的本发明所述多肽和抗体，包括嵌合抗体或人源化抗体。常常通过或者共价或者非共价的连接提供检测信号的物质，标记所述多肽或抗体。已知各种各样的标记和缀合技术，并在科学和专利文献中都大量报道了所述技术。合适的标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制子、荧光部分、化学发光部分、磁性颗粒等等。说明这些标记应用的专利包括第3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241号美国专利。而且也可以生产重组免疫球蛋白。参见Cabilly，第4,816,567号美国专利；和Queen等(1989)Proc. Nat’l Acad.Sci.USA 8610029-10033。
本发明所述抗体可用于分离DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白的亲合层析。可以制备柱，其中所述抗体连接到固相支持体，例如，诸如琼脂糖、SEPHADEX等等的微粒，其中可以使细胞裂解液或上清液通过所述柱，洗涤所述柱，接着增加温和变性剂浓度，由此释放纯化的DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白。同样，结合所述趋化因子的抗体可能能够中和受体的结合，并可以用作受体拮抗剂。它们也可以用做蛋白质印迹检测试剂或ELISA试剂。
也可以使用所述抗体筛选用于特定表达产物的表达文库。通常用一个部分标记在该方法中使用的所述抗体，使可以易于通过抗体结合检测抗原的存在。
针对DVic-1或DGWCC趋化因子的抗体可以用于鉴别表达DVic-1或DGWCC趋化因子的细胞群。通过检测表达例如DGWCC趋化因子的细胞的表达产品，可以诊断疾病，例如无免疫应答疾病。
针抗每种DVic-1或DGWCC趋化因子产生的抗体也可以用于产生抗独特型抗体。这些抗体将可用于检测或诊断与所述抗体表达相关的不同的免疫疾病。
B.免疫测定可以通过各种免疫测定方法检测特定蛋白。一般关于免疫学和免疫测定方法的综述，参见Stites和Terr(编辑)(1991)基础和临床免疫学(第7版)。此外，本发明所述免疫测定可以以许多形式进行，所述免疫测定在Maggio(编辑)(1980)酶免疫测定CRC出版社，Boca Raton，佛罗里达州；Tijan(1985)“酶免疫测定的实践和理论”，生物化学和分子生物学中的实验室技术，Elsevier Scienee Publishers B.V.，阿姆斯特丹；和Harlow和Lane(1988)抗体，实验室指南中广泛的综述，上述每个文献均通过引用结合到本文中。也参见Chan(编辑)(1987)免疫测定实践指南Academic Press，奥兰多，佛罗里达州；Price和Newman(编辑)(1991)免疫测定的原理和实践Stockton出版社，纽约；和Ngo(编辑)(1988)非同位素免疫测定Plenum出版社，纽约。
可以通过本领域那些技术人员已知的各种方法，进行用于检测例如DVic-1趋化因子蛋白的免疫测定。简单的说，检测所述蛋白的免疫测定或者可以是竞争结合测定，或者可以是非竞争结合测定。在竞争结合测定中，待分析样品和标记的分析物竞争捕捉剂上的特异结合位点，所述捕捉试剂与固体表面结合。最好是所述捕捉剂是同如上所述产生的DVic-1趋化因子蛋白特异反应的抗体。与捕捉剂结合的标记分析物的浓度与所述样品中存在的游离分析物的量成反比。
在竞争结合免疫测定中，存在于所述样品中的DVic-1趋化因子蛋白与标记蛋白竞争结合特异性结合剂，例如与所述DVic-1趋化因子蛋白特异反应的抗体。所述结合剂可以与固体表面结合，以实现结合的标记蛋白与非结合的标记蛋白的分离。另一方面，可以在液相中进行所述竞争结合测定，并可以使用本领域已知的各种技术分离所述结合的标记蛋白与非结合的标记蛋白。在分离后，检测结合标记蛋白的量。存在于所述样品中的蛋白的量与标记蛋白结合的量成反比。
或者，可以进行均相免疫测定，在所述均相免疫测定中不需要分离步骤。在这些免疫测定中，通过所述蛋白与其特异性结合剂的结合改变所述蛋白上的标记。在所述标记蛋白中的这种改变造成由标记发射的信号减少或增加，以使在所述免疫测定结束时标记的检测便于所述蛋白的检测与定量。
也可以通过各种非竞争免疫测定方法检测DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白。例如可以使用双位点固相夹心免疫测定。在这种类型的测定中，用于所述蛋白的结合剂，例如抗体，附着于固体支持体上。标记第二个蛋白结合剂，所述结合剂也可以是抗体，并在不同的位点结合所述蛋白，将该结合剂标记。在所述蛋白上的两个位点出现结合后，除去未结合的标记结合剂，并检测结合于所述固相的标记结合剂的量。标记结合剂的结合量与所述样品中的蛋白量成正比。
可以使用蛋白质印迹分析，检测样品中例如DGWCC趋化因子蛋白的存在。例如，对怀疑含有所述蛋白的组织样品进行电泳。在电泳分离所述蛋白后，将所述蛋白转移至合适的固相支持体上，例如硝化纤维滤膜，用和所述蛋白反应的抗体温育所述固相支持体。可以标记这个抗体，或者可以通过随后用结合所述初级抗体的第二种标记抗体温育检测这个抗体。
上述的免疫测定程式使用标记的测定组分。所述标记可以按照本领域熟知的方法，直接或间接地同所需检测组分偶联。可以使用各种各样的标记和方法。传统上使用掺入3H、125I、35S、14C或32P的放射性标记。非放射性标记包括结合标记抗体的配体、荧光团、化学发光介质、酶和可以用作用于标记配体的特异结合配对成员的抗体。根据所需的敏感性、易于与所述化合物缀合、稳定性需要和可使用的仪器选择标记。关于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述，参见通过引用结合到本文中的第4,391,904号美国专利。
也可以通过各种免疫测定方法检测与特定蛋白反应的抗体。关于适用于通过免疫测定技术检测抗体的免疫学和免疫测定方法的综述，参见上述的Stites和Terr(编辑)基础和临床免疫学(第7版)；上述的Maggio(编辑)酶免疫测定；和上述的Harlow和Lane抗体，实验室指南。
简单地说，检测与例如DVic-1趋化因子蛋白反应的抗血清的免疫测定可以是或者竞争结合测定，或者非竞争结合测定。在竞争结合测定中，所述样品分析物与标记分析物竞争在捕捉剂上的特定结合位点，所述捕捉剂结合于固体表面。最好是所述捕捉剂是如上所述生产的纯化的重组DVic-1趋化因子蛋白。也可以使用其它的DVic-1趋化因子蛋白源，包括分离的或部分纯化的天然产生的蛋白。非竞争测定包括夹心测定，在所述夹心测定中，所述样品分析物结合于两个分析物特异性结合试剂之间。所述结合剂之一用做捕捉剂，并同固体表面结合。标记第二个结合剂，并通过目视或仪表方法用其测量或检测得到的复合物。可以使用多种组合的捕捉剂和标记结合剂。也可以使用与上述那些相似的用于检测DGWCC趋化因子蛋白的各种不同的免疫测定程式、分离技术和标记。VI.纯化的DVic-1或DGWCC趋化因子在SEQ ID NO1和2中提供了人DVic-1核苷酸序列和氨基酸序列。在SEQ ID NO5和6中提供了人DGWCC核苷酸序列和氨基酸序列；在SEQ ID NO7和8中提供了小鼠DGWCC核苷酸序列和氨基酸序列。
纯化的蛋白或确定的多肽可用来通过如上所述的标准方法产生抗体。可以将合成肽或纯化蛋白提呈给免疫系统，以产生多克隆或单克隆抗体。参见例如Coligan(1991)免疫学现时方案Wilev/Greene，纽约；和Harlow和Lane(1989)抗体实验室指南，冷泉港出版社，纽约，上述文献通过引用结合到本文中。另一方面，DVic-1或DGWCC趋化因子受体可以用作特异性结合试剂，并可以利用其结合特异性进行例如纯化DGWCC趋化因子配体的。
可以使用特异性结合组合物，筛选由表达DGWCC趋化因子的细胞系产生的表达文库。可以利用许多筛选方法，例如表面表达的配体的标准染色或通过淘选。也可以通过不同的染色或免疫荧光方法进行细胞内表达的筛选。所述结合组合物可以用于亲合纯化或分选出表达所述配体的细胞。
所述肽区段，除了与同源基因对比，也可以用于产生合适的寡核苷酸，以筛选文库。所述遗传密码可以用于选择合适的可用作筛选探针的寡核苷酸。结合多聚酶链式反应(PCR)技术，合成寡核苷酸将可用于从包括天然等基因多态变异体的文库中选择所需克隆。
所述多肽序列使得可以制备多肽，以产生识别这种区段的抗体，并使得可以制备编码这种序列的寡核苷酸。所述序列也可以供合成制备之用，例如参见Dawson等(1994)Science 266776-779。因为DVic-1和DGWCC趋化因子可以是分泌性蛋白，所以所述基因一般具有N-末端信号序列，加工和分泌时除去所述信号序列。然而，在不同的细胞类型中可以改变确切的加工点，并且也经常检测到不同长度的形式。例如使用Nielsen等(1997)Protein Eng. 101-8中所述方法，可以进行所述信号切割点的预测。与最密切相关的报道序列相比，对所述结构特征的分析已显示同其它细胞因子，特别是同已知为CC和CXC趋化因子的该类蛋白的相似性。VII.物理变异体本发明也包括其的氨基酸序列和DVic-1或DGWCC趋化因子的氨基酸序列大致相似的蛋白或多肽。天然变异体包括个体、多态、等位、菌株或物种变异体。
通过最优化残基匹配，如果需要，通过根据需要导入间隙，检测氨基酸序列相似性或序列同一性。在将保守置换考虑为匹配时，这种相似性或同一性会改变。保守置换一般包括在下列组别中的置换甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸。同源氨基酸序列包括在所述蛋白序列中的天然多态、等位和种间变异。典型的同源蛋白或肽将具有同所述DGWCC趋化因子的氨基酸序列从50-100％的相似性(如果可以导入间隙)，至75-100％的相似性(如果包括保守置换)。相似性检测为至少大约50％，一般至少60％，更一般至少65％，通常至少70％，更通常至少75％，优选至少80％，更优选至少80％，而在特别优选的实施方案中，为至少85％或更高。也参见Needleham等(1970)J.Mol.Biol. 48443-453；Sankoff等(1983)TimeWarps，String Edits，and MacromeleculesThe Theorv amd Practice ofSequence Comparison第一章，Addison-Wesley，Reading，马萨诸塞州；和来自IntelliGenetics软件包装，Mountain View，加利福尼亚州；和威斯康星大学遗传计算机组，麦迪逊，威斯康星州。
编码哺乳动物DVic-1趋化因子蛋白的核酸一般在严格条件下同SEQ ID NO1的核酸序列杂交。例如，编码DVic-1趋化因子蛋白的核酸一般在严格杂交条件下，同SEQ ID NO1的核酸杂交。一般来说，是在确定的离子强度和pH下，选择比用于探针序列的热变性点(Tm)低大约10℃的严格条件。Tm是(在确定的离子强度和pH下)50％的所述靶序列同完全匹配探针杂交的温度。严格条件一般是那些条件，在所述条件下，盐浓度在pH7时大约为0.2M，而温度为至少大约50℃。其它因素可以显著影响杂交严格性，其中包括碱基组成和互补链的大小、存在诸如甲酰胺的有机溶剂和碱基错配的程度。优选的实施方案包括在50％甲酰胺和200mM NaCl中于42℃结合所公开序列的核酸。
可以通过核苷酸置换、核苷酸缺失、核苷酸插入和一段核苷酸序列的短倒位，轻易修饰分离的DGWCC趋化因子DNA。这些修饰产生编码DVic-1或DGWCC趋化因子抗原、其衍生物或具有高度相似生理、免疫原性或抗原活性的新DNA序列。
修饰序列可以用于产生突变抗原或增强表达。增强表达可以包括基因扩增、增加转录、增加翻译和其它机制。这种突变DGWCC趋化因子衍生物包括所述蛋白或其片段的预定或位点特异性的突变。“突变DGWCC趋化因子”包括在其它方面属于上述人DGWCC趋化因子的同源物定义的多肽，但无论是由于缺失、置换还是插入，该多肽具有不同于天然发现的DGWCC趋化因子的氨基酸序列。具体而言，“位点特异性突变DGWCC趋化因子”一般包括同具有SEQ ID NO6或8的序列的蛋白具有明显相似的蛋白，例如天然实施方案，和由于享有各种各样的生物活性(例如抗原性或免疫原性)而同那些序列具有相似性的蛋白，在优选的实施方案中，“位点特异性突变DGWCC趋化因子”包括大部分或全部公开的序列。这也适用于来自不同个体的多态变异体。相似的概念适合于不同的DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白，特别是那些在各种温血动物(例如哺乳动物或鸟)中发现的DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白。如前所述，需强调指出，描述一般指包括其它DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白，不限于具体讨论的小鼠或人的实施方案。
尽管预先确定了位点特异性突变的位点，但突变体不需要是位点特异性的。例如，可以通过制造氨基酸插入或缺失，进行DGWCC趋化因子诱变。可以产生置换、缺失、插入或任何组合，以得到最终构成物。插入包括氨基或羧基末端融合物，例如表位标记。对靶密码子进行随机诱变，然后可以根据所需活性筛选表达突变。在具有已知序列的DNA中在预定位点上进行置换突变的方法在本领域是广为人知的，例如通过M13引物诱变或聚合酶链式反应(PCR)技术。也参见Sambrook等(1989)和Ausubel等(1987和增补本)。在所述DNA中的突变一般不应将编码序列置于读框之外，最好将创造可以杂交的互补区，以产生诸如环状结构或发夹结构的二级mRNA结构。
本发明也提供重组蛋白，例如使用来自这些蛋白的区段的异源融合蛋白。异源融合蛋白是蛋白或区段的融合体，所述融合体一般不以相同的方式天然融合。因此，免疫球蛋白与DGWCC趋化因子多肽的融合产物是具有下述序列的连续蛋白分子，所述序列以典型肽链接融合，一般作为单一翻译产物产生，并显示得自每个源肽的特性。相似的概念适用于异源核酸序列。
另外，可以组合来自其它蛋白的相似功能域产生新构成物。例如，结合蛋白区段或其它区段可以在不同的新融合多肽或片段之间“交换”。参见例如Cunningham等(1989)Science 2431330-1336；和O′Dowd等(1988)J.Biol.Chem.26315985-15992。因此，显示特异性新组合的新嵌合多肽将由蛋白结合特异性和其它功能域的功能链接产生。VIII.结合剂趋化因子蛋白复合物一般在免疫测定中测定DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白，所述蛋白特异性地或选择性地结合下述抗体，或特异性地与该抗体免疫反应的，所述抗体是针对免疫原、诸如SEQ ID NO2或8的氨基酸序列组成的免疫原而产生的。所述免疫测定使用针对SEQ ID NO2、6或8的蛋白产生的多克隆抗血清。选择对于其它趋化因子具有较低交叉反应性的这种抗血清，并在用于所述免疫测定之前通过免疫吸附除去任何这种交叉反应性。
为了生产用于免疫测定的抗血清，如本文所述分离SEQ ID NO2或6或8的蛋白。例如，可以在哺乳动物细胞系中产生重组蛋白。使用诸如弗氏佐剂的标准佐剂和标准小鼠免疫方案(参见上述Harlow和Lane)，用SEQ ID NO2或6或8的蛋白免疫诸如BALB/c的小鼠近交品系。另一方面，可以使用优选是近于全长的合成肽作为免疫原，所述合成肽由本文公开的序列衍生，并缀合于载体蛋白。收集多克隆血清，并在免疫测定中测其对免疫原蛋白的效价，所述免疫测定例如在固相支持体上具有固定化免疫原的固相免疫测定。选择104或更大效价的多克隆抗血清，并使用诸如在上述Harlow和Lane中第570-573页所述的竞争结合免疫测定，测试多克隆抗血清对C、CC、CX3C和CXC趋化因子的交叉反应性。在这个测定中最好和人DGWCC趋化因子一起使用两种趋化因子。
竞争结合形式的免疫测定可以用于所述交叉反应性测定。例如，可以将SEQ ID NO2或SEQ ID NO6和/或8的蛋白固化到固相支持体上。加入到所述测定中的蛋白与所述抗血清竞争结合所述固定化抗原。将上述蛋白同所述抗血清竞争结合固定化蛋白的能力与SEQ IDNO2的蛋白或SEQ ID NO6和/或8的蛋白相比较。使用标准计算法计算上述蛋白的交叉反应性百分比。选择并合并那些和上文列出的每种蛋白的交叉反应性低于10％的抗血清。然后用上文列出的蛋白通过免疫吸附，从合并的抗血清中除去交叉反应抗体。
然后如上所述，在竞争结合免疫测定中使用免疫吸附和合并的抗血清，以将第二个蛋白和所述免疫原蛋白(例如SEQ ID NO6或8的DGWCC趋化因子基元)相比。为了进行该对比，在较大浓度范围内测定所述两种蛋白的每一种，并测定每种蛋白抑制所述抗血清与固定化蛋白50％的结合所需的量。如果需要的所述第二种蛋白的量少于所述蛋白(例如SEQ ID NO6或8的蛋白)量的两倍，则一般认为所述第二种蛋白特异性地结合针对所述免疫原产生的抗体。
不用说，DGWCC趋化因子蛋白是一组同源蛋白杂交种的物质形式，所述杂交种包括密切相关的基因。对特定的基因产物，诸如所述DGWCC趋化因子，所述术语不仅指本文公开的氨基酸序列，而且指其它为多态、等位或非等位变异体的蛋白。也不用说，术语“DGWCC”包括下述非天然突变，所述突变通过使用诸如单位点突变的常规重组技术进行有意突变，或通过切下编码DGWCC趋化因子蛋白的DNA的短片段，或通过置换新氨基酸或加入新氨基酸而引入的。这种小改变应当大致保持了原始分子的免疫同一性和/或其生物活性。因此，这些改变包括同定为天然产生的DGWCC趋化因子蛋白(例如在SEQ ID NO6或8中显示的DGWCC趋化因子蛋白)特异性免疫反应的蛋白。可以通过在合适的细胞系中表达所述蛋白，并测定合适的生物活性，例如趋化作用，测定所述改变蛋白的生物特性。认为较小的特定的蛋白修饰应包括具有相似化学特性的氨基酸的保守置换，所述化学特性如上对于作为整体的DGWCC趋化因子所述。通过将一种蛋白与SEQ ID NO6或8的蛋白进行最佳序列对比，和通过使用本文所述的测定免疫同一性的常规免疫测定，或通过使用淋巴细胞趋化性测定，可以测定本发明所述蛋白组合物。IX.功能变异体对DVic-1或DGWCC趋化因子的生理反应的阻断，可能是因为抑制所述蛋白同其受体的结合，例如通过竞争抑制。因此，本发明的体外测定通常使用分离蛋白、来自表达重组膜结合DVic-1或DGWCC趋化因子的细胞的膜、包含这些蛋白的受体结合区段的可溶性片段、或附着于固相基质上的片段。这些测定也便于诊断测定或者结合区段突变和修饰的影响，或者例如蛋白类似物的蛋白突变和修饰的影响。本发明也考虑了竞争性药物筛选检测的应用，例如其中针对抗原或受体片段的中和抗体同测试化合物竞争结合所述蛋白。以这种方式，可以使用所述抗体检测多肽的存在，所述多肽享有一个或多个所述蛋白的抗原结合位点，也可以使用所述多肽占据在其它情况下同受体相互作用的所述蛋白上的结合位点应。
例如DGWCC趋化因子抗原的“衍生物”包括氨基酸序列突变体、糖基化变异体和同其它化学部分共价或聚集的缀合物。可以通过本领域熟知的技术，通过同在DGWCC趋化因子氨基酸侧链或在N-末端或C-末端发现基团的进行官能团连接，制备共价衍生物。这些衍生物可以包括但不限于，羧基末端的脂族酯或酰胺、或包含羧基侧链的残基的脂族酯或酰胺、含羟基残基的O-酰基衍生物和氨基末端氨基酸或含氨基残基(例如赖氨酸或精氨酸)的N-酰基衍生物。酰基选自烷基部分，包括例如C3至C18正烷基，由此形成烷酰基芳酰基物质。当免疫原性部分是半抗原时，同载体蛋白共价结合可能很重要。
具体而言，包括糖基化变化，例如在多肽合成和加工中，或在进一步的加工步骤过程中，通过修饰多肽的糖基化型式产生的糖基化变化。特别优选的用于完成该糖基化变化的方法是通过将所述多肽暴露于糖基化酶中，所述酶由一般提供这种加工的细胞衍生，例如哺乳动物糖基化酶。也考虑了去糖基化酶。也包括具有其它小修饰的相同一级氨基酸序列的形式，包括磷酸化氨基酸残基(例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸)或其它部分，包括核酸基基团或交联试剂。
一组主要的衍生物是DGWCC趋化因子或其片段同其它蛋白或多肽的共价缀合物。可以在重组培养物中合成诸如N-末端或C-末端融合体的这些衍生物，或者利用在本领域已知的可用于通过反应性侧基交联蛋白中的试剂，合成这些衍生物。优选的具有交联剂的蛋白衍生物位点是在游离氨基基团、糖部分和半胱氨酸残基上。
也提供在DGWCC趋化因子和其它同源或异源蛋白之间的融合多肽。许多生长因子和细胞因子是同二聚体实体，重复构成物可能具有各种优势，包括降低对蛋白水解酶降解的敏感性。而且，许多受体需要配体二聚化以转导信号，可能需要不同的二聚体蛋白或域重复片段。异源多肽可以是不同的表面标记之间的融合体，产生例如显示受体结合特异性的杂种蛋白。同样，可以构建异源融合体，所述融合体将显示所述衍生物蛋白的特性或活性的组合。典型的例子是受体多肽融合体，例如具有蛋白区段或域(例如受体结合区段)的荧光素酶，以便可以容易测定所述融合蛋白的存在或位置。参见例如Dull等，第4,859,609号美国专利。其它基因融合配偶体包括细菌b-半乳糖苷酶、trpE、A蛋白、β-内酰胺酶、α淀粉酶、乙醇脱氢酶和酵母α交配因子。参见例如Godowski等(1988)Science 241812-816。
这种多肽也可以具有这样的氨基酸残基，所述氨基酸残基通过磷酸化、磺化、生物素酰化或加入或除去其它部分、特别是那些分子性状同磷酸酯基团相似的部分而化学修饰。在某些实施方案中，所述修饰可用于标记试剂，或用作纯化靶，例如亲合配体。
本发明也考虑了DGWCC趋化因子衍生物的用途，所述衍生物没有氨基酸序列或糖基化中的变异。这种衍生物可以包括同化学部分共价结合或聚集结合。这些衍生物一般属于三种类型(1)盐，(2)侧链和末端残基共价修饰和(3)例如与细胞膜的吸附复合物。这种共价或聚集衍生物可用作免疫原，在免疫测定或在诸如用于配体或其它结合配体的亲合纯化的纯化方法中用作试剂。例如，可以通过同诸如溴化氰活化的SEPHAROSE的固相支持体共价结合，利用本领域熟知的方法，固定化DGWCC趋化因子抗原，或者可以在用或不用戊二醛交联时，在聚烯烃表面吸附近DGWCC趋化因子抗原，用于测定或纯化抗-DGWCC趋化因子抗体或其受体。也可以用检测基团标记DGWCC趋化因子，例如可以将DGWCC趋化因子通过氯胺T法放射性碘化，共价结合于稀土螯合物，或者缀合与另一用于诊断检测的荧光部分。固定化抗体或受体可以影响DGWCC趋化因子的纯化。
分离的DGWCC趋化因子基因将允许转化缺乏对应DGWCC趋化因子表达的细胞，例如缺乏对应蛋白并显示阴性本底活性的或者物种类型或者细胞。转化基因的表达使得可以用确定的变异体或单个物种变异体分离抗原性纯的细胞系。这个方案便于敏感性更高地检测和鉴别DGWCC趋化因子受体蛋白的生理作用。可以分离和使用亚细胞片段，例如胞质体或膜片段。使用DGWCC作为实施例的描述一般也同时适用于DVic-1。X.用途本发明提供发现用于诊断应用的试剂，所述诊断应用如在本文别处所述，例如在在对发育异常的一般描述中，或下文对诊断试剂盒的描述。
DGWCC趋化因子核苷酸，例如DGWCC趋化因子DNA或RNA，可以作为法医检测中的组分使用。例如，可以使用例如32P或生物素标记提供的核苷酸序列，并将其用作探针探测标准限制片段多态性印迹，提供可检测特征来帮助区分个体或例如物种源。可以在诸如基因指纹的熟知的法医技术中使用这种探针。另外，可以在原位检测中使用由DGWCC趋化因子序列产生的核苷酸探针，以测定染色体异常。例如可以通过广为人知的原位技术，使用和其它已知染色体标记结合的DGWCC趋化因子探针，检测编码DGWCC趋化因子基因的人染色体的重排。
可以使用针对DGWCC趋化因子蛋白或核酸的抗体和其它结合剂，以纯化对应的DGWCC趋化因子分子。如下文实施例所述，抗体纯化DGWCC趋化因子组分既是可能的，也是可行的。也可以在诊断方式中使用抗体和其它结合剂，以使用本文所述的熟知的技术，测定DGWCC趋化因子组分是否存在于组织样品或细胞群中。结合剂结合DGWCC趋化因子的能力提供了一个诊断与DGWCC趋化因子不规则有关的疾病的方法。抗体和其它DGWCC趋化因子结合剂也可以用作组织标记。如下文实施例所述，DGWCC趋化因子表达限于特定的组织类型。通过将诸如抗体和核酸的探针导向DGWCC趋化因子，使用所述探针原位或体外区分组织和细胞类型是可能的。
本发明也提供具有显著治疗价值的试剂。除了鉴别为对DGWCC趋化因子具有结合亲合性的化合物，所述DGWCC趋化因子(天然产生或重组)、其片段和其抗体可用于治疗与异常生理或发育有关的疾病，包括异常增殖，例如癌症或退行性疾病。可以使用本文提供的组合物，通过合适的治疗性治疗，调制异常增殖、再生、退化和萎缩。例如，与DGWCC趋化因子异常表达或异常信号有关的疾病或病征是用于所述蛋白的激动剂或拮抗剂的靶。所述蛋白可能在神经元细胞或例如淋巴细胞的造血细胞的调节或发育上起作用，影响免疫应答。
已知在RNA印迹分析显示具有DVic-1或DGWCC趋化因子mRNA的细胞类型中的其它异常发育病征。参见Berkow(编辑)默克诊断和治疗指南Merck & Co，Rahway，新泽西州；和Thorn等Harrison’s Principlesof Internal Medicine McGraw-Hill，纽约。例如所述神经元或免疫系统的发育或功能异常，引起明显的医学异常和病征，所述异常和病征可能对使用本文提供的混合物预防或治疗敏感。
某些趋化因子也和病毒复制机制有关。参见例如Cohen(1996)Science 272809-810；Feng等(1996)Science 272872-877；和Cocchi等(1995)Science 2701811-1816。所述DVic-1或DGWCC趋化因子可以在相似的范围内使用。
可以纯化重组的DVic-1或DGWCC趋化因子或趋化因子抗体，然后将其给予病人。可以例如在常规药学上可接受的载体或稀释剂(例如免疫佐剂)与生理上无害的稳定剂和赋形剂中，将这些试剂与额外活性成分或惰性成分混合，用于治疗用途。可以无菌过滤这些组合物，并通过在剂量瓶中冻干将其以剂量形式放置，或以稳定的水性制剂贮藏。本发明也考虑了抗体或其片段的作用，包括不是补体结合的形式。
使用抗体或其受体或其片段的药物筛选可以鉴别具有对DVic-1或DGWCC趋化因子的结合亲合性的化合物，包括分离有关组分。然后可以利用后来的生物测定，以检测所述化合物是否具有内在的刺激活性，以及所述化合物是否因此是阻滞剂或拮抗剂，因为它阻断所述蛋白活性。同样，具有内在刺激活性的化合物可以激活所述受体，并因此是一个激动剂，因为它刺激了例如DGWCC趋化因子的活性。本发明还考虑了针对DGWCC趋化因子的抗体作为拮抗剂的治疗用途。这个方案对其它DGWCC趋化因子物种变异体应当特别有用。
用于有效治疗所必需的试剂量取决于许多不同因素，包括给药方法、靶位点、病人的生理状态和给服的其它药物。因此应当确定治疗剂量，以最优化安全性和有效性。一般在体外使用的剂量可以为这些试剂的原位给药用量提供有用的指南。用于治疗特定病状的有效剂量的动物测试将对人的剂量提供进一步的推断指南。例如在Gilman等(编辑)(1990)Goodman和Gilman’sThe Pharmacological Bases ofTherapeutics(第8版)Pergamon出版社；和(1990)Remington’sPharmaceutical Sciences(第17版)Mack Publishing Co.，Easton，CA中描述了各种考虑。在其中和下文讨论了给药方法，例如口服、静脉内、腹膜内、或肌内给药、经皮肤扩散和其它方法。药学上可接受的载体包括水、盐、缓冲液和例如在Merck Index，Merck & Co.，Rahway，NJ中所述的其它化合物。一般预期具有合适载体的剂量范围低于1mM浓度，一般低于大约10μM浓度，通常低于大约100nM，优选低于大约10pM(皮摩尔浓度)，最优选低于大约1fM(费摩尔浓度)。为了连续给药，经常使用缓释配方或缓释设备。
可以直接向待治疗的宿主给予DVic-1或DGWCC趋化因子、其片段和其抗体或其片段、拮抗剂和激动剂，或者可以根据所述化合物的大小，可能最好在给药前将所述化合物同载体蛋白缀合，所述载体蛋白诸如卵清蛋白或血清白蛋白。可以以任何常规给药制剂给予治疗制剂。尽管可能独自给予活性成分，但最好是作为药用制剂将其提呈。制剂一般包括至少一种如上文定义的活性成分，连同一种或多种可接受的载体。每种载体在与其它成分相容、且伤害病人的意义上，应当既是药学上可接受的，也是生理上可接受的。制剂包括那些适于口服、直肠、鼻或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉在内和皮内)给药的制剂。所述制剂通常可以以单位剂量形式存在，并可以通过任何药剂学领域熟知的方法制备。参见例如Gilman等(编辑)(1990)Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Bases of Therapeutics疗(第8版)Pergamon出版社；和(1990)Remington’s Pharmaceutical Sciences(第17版)MackPublishing Co.，Easton，宾西法尼亚州；Avis等(编辑)(1993)Pharmaceutical Dosage FormsParenteral Medications Dekker，纽约州；Lieberman等(编辑)(1990)Pharmaceutical Dosage FormsParentalMedications Dekker，纽约州；和Lieberman等(编辑)(1990)PharmaceuticalDosage FormsDisperse Systems Dekker，纽约州。本发明所述疗法可以和其它治疗因子组合，或与其它治疗因子结合使用。
本发明所述DVic-1或DGWCC趋化因子，不论是天然产生形式，还是重组形式，在能够筛选对所述蛋白具有结合活性的化合物的试剂盒和测定方法中特别有用。近几年发展了几个自动检测的方法，以使在短期内筛选几万个化合物成为可能。参见例如Fodor等(1991)Science251767-773和其它化学多样性文库的描述，所述描述介绍了检测大量化合物的结合亲合性的方法。可以通过使用本发明提供的大量纯化的可溶性DGWCC趋化因子，大大促进合适测定的发展。
例如，一旦在结构上定义所述蛋白，一般可以发现拮抗剂。现在，使用纯化受体，依靠高度自动化测定方法的发展，检测潜在的蛋白类似物是可能的。具体而言，通过使用本文所述的筛选技术，将发现新的激动剂和拮抗剂。特别重要的化合物是发现对多种DGWCC趋化因子受体具有组合结合亲合性的化合物，例如可以用作对DGWCC趋化因子物种变异体的拮抗剂。
本发明特别可用于通过使用重组蛋白，以各种药物筛选技术筛选化合物。使用重组蛋白筛选特定配体的优势包括(a)提高来自特定来源的DGWCC趋化因子的可再生源；(b)在测定中每个细胞潜在的产生更好的信号与噪音之比的配体数目大；和(c)物种变异体特异性(理论上给予较大生物学特异性和疾病特异性)。
一个药物筛选方法使用真核或原核宿主细胞，所述宿主细胞用表达趋化因子受体的重组DNA分子稳定转化。在与任何其它细胞分离中可以分离表达受体的细胞。可以将这种或者以活体形式、或者以固定形式的细胞用于标准配体/受体结合测定。也参见Parce等(1989)Science246243-247；和Owicki等(1990)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 874007-4011，其描述了灵敏地检测细胞反应的方法。竞争测定特别有用，其中，用标记受体或同所述配体具有已知结合亲合性的抗体(诸如125I-抗体)以及待测试其同所述结合组合物的结合亲合性的测试样品，接触并温育所述细胞(DGWCC趋化因子源)。然后分离所述结合和游离的标记结合组合物，以评价配体结合程度。测试化合物的结合量同结合已知源的标记受体结合量成反比。可以使用众多技术中的任何一个，从游离配体中分离结合配体，以评价配体结合程度。这个分离步骤一般可以包括诸如附着于滤膜后洗涤，附着于塑料后洗涤或离心所述细胞膜。也可以使用活体细胞，以根据筛选药物对DGWCC趋化因子介导功能的影响例如第二信使水平，即Ca++；细胞增殖；肌醇磷酸库变化等等进行筛选。一些检测方法允许去掉分离步骤，例如近灵敏的检测系统。钙敏感性染料对于用荧光计或荧光细胞分类器检测Ca++水平是有用的。
另一个方法使用来自转化的真核或原核宿主细胞的膜作为DGWCC趋化因子源。用指导表达DGWCC趋化因子(例如工程改造膜结合形式)的DNA载体稳定转化这些细胞。实质上，可以由所述细胞制备所述膜，并在诸如上文所述的竞争测定的受体/配体结合测定中使用所述膜。
再一个方案是使用可溶性未纯化的、或可溶性纯化的DGWCC趋化因子，所述趋化因子来自转化的真核或原核宿主细胞。这使“分子”结合测定具有增加特异性、自动化能力和药物检测通过量高的优势。
另一个用于药物筛选的技术包括提供高通过量地筛选化合物的方法，其中所述化合物对DGWCC趋化因子抗体具有稳定结合亲合性，在1984年9月13日公开的Geysen的第84/03564号欧洲专利申请中详细描述了这个技术。首先在固体基质(例如在塑料杆(pin))或其它一些合适的表面上合成大量不同的小肽测试化合物，参见上述Fodor等。然后所有的所述杆同可溶性未纯化的或可溶性纯化的DGWCC趋化因子抗体反应，并洗涤。下一步包括检测结合的DGWCC趋化因子抗体。
也可以根据对DGWCC趋化因子和其它效应物或类似物的分子形状的结构研究，合理地设计药物。参见例如Methods in Enzymology第202和203卷。效应物可以是响应配体结合介导其它功能的蛋白，或一般和受体相互作用的其它蛋白。一个测定哪些位点同特定的其它蛋白相互作用的方法是物理结构测定，例如X射线晶体学或双向NMR技术。这些将提供关于哪些氨基酸残基形成分子接触区域的指南。对蛋白结构测定的详细描述，参见例如Blundell和Johnson(1976)蛋白质晶体学Academic Press，NY。
可以将纯化的DGWCC趋化因子直接包被到平板上，以用于前述的药物筛选技术。然而，可以使用对这些配体的非中和抗体作为捕捉抗体，以将相应的配体固化在所述固相上。用DVic-1趋化因子替换进行使用DGWCC的实施例。XI.试剂盒本发明也考虑了DVic-1或DGWCC趋化因子蛋白、其片段、肽和其融合产物，在检测趋化因子或趋化因子受体存在的各种诊断试剂盒和方法中的应用。一般所述试剂盒有一个区室，所述区室包括识别一种或另一种例如受体片段或抗体的或者确定的DVic-1或DGWCC趋化因子肽、或者基因区段、或者试剂。
例如，检测测试化合物对DGWCC趋化因子的结合亲合性的试剂盒，一般包括测试化合物；标记化合物，例如，具有已知对所述DGWCC趋化因子结合亲合性的受体或抗体；DGWCC趋化因子源(天然产生或重组)；和从游离标记化合物中分离结合标记化合物的工具，诸如用于固化所述DGWCC趋化因子的固相。一旦筛选出化合物，则可以在合适的本领域中熟知的生物测定中，评价那些对所述DGWCC趋化因子具有合适结合亲合性的化合物，以测定它们是否作为对所述受体的激动剂或拮抗剂起作用。可利用的重组DGWCC趋化因子多肽也提供用于校准这种测定的完全确定的标准。
优选的用于检测样品中例如DGWCC趋化因子浓度的试剂盒一般包括标记化合物，例如已知对所述DGWCC趋化因子具有结合亲合性的受体或抗体；DGWCC趋化因子源(天然产生或重组)；和用于从游离标记化合物中分离结合标记化合物的工具，例如用于固化所述DGWCC趋化因子的固相。一般将提供包含试剂的区室和说明。
对DGWCC趋化因子或配体片段特异的抗体，包括抗原结合片段，在检测提高水平的DGWCC趋化因子和/或其片段的存在的诊断应用中是有用的。这种诊断测定可以使用裂解液、活细胞、固定细胞、免疫荧光、细胞培养物、体液，并且还可以包括检测与血清中配体相关的抗原等等。诊断检测可以是均相(在游离试剂和抗原-DGWCC趋化因子复合物之间没有分离步骤)或异相的(有分离步骤)。存在各种商业测定，诸如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、酶倍增免疫测定技术(enzyme-multipliedimmunoassay)(EMIT)、底物标记荧光免疫测定(SLFIA)等等。例如通过使用标记的第二抗体，可以使用未标记抗体，所述第二抗体识别针对DGWCC趋化因子或其特定片段的抗体。在文献中也广泛讨论了相似的测定。参见例如Harlow和Lane(1988)抗体实验室指南CSH出版社，纽约州；Chan(编辑)(1987)免疫测定实践指南Academic Press，奥兰多，佛罗里达州；Price和Newman(编辑)(1991)免疫测定的原理和实践Stockton出版社，纽约州；和Ngo(编辑)(1988)非同位索免疫测定Plenum出版社，纽约州。
抗独特型抗体可以相似地用来诊断抗DGWCC趋化因子抗体的存在，因此这种抗体可以诊断各种异常状态。例如，过量产生DGWCC趋化因子可以导致产生各种免疫学反应或其它医学反应，所述其它医学反应可以诊断例如在细胞生长、活化或分化中的异常生理状态。
常常在试剂盒中提供所述用于诊断检测的试剂，以便最优化所述检测的灵敏性。为了本发明目的，根据测定的性质、方案和标记，或者提供标记或未标记的抗体或受体，或者提供标记的DGWCC趋化因子。这通常和其它附加物结合，诸如缓冲液、稳定剂、诸如酶底物的信号产生必需的材料等等。最好是所述试剂盒也包括对正确使用和使用后处理内容物的说明。一般所述试剂盒有用于每种有用试剂的区室。最好是，以冻干粉提供所述试剂，其中所述试剂可以在水性介质中重建，提供合适的用于进行所述测定的试剂浓度。
可以不加修改地使用上述的药物筛选和诊断测定的许多组分，或者可以对其以各种方式修改。例如，通过共价或非共价地连接直接或间接提供检测信号的部分，可以实现标记。在任何这些检测中，可以或者直接者间接地标记所述蛋白、测试化合物、DGWCC趋化因子或其抗体。可能用于直接标记的包括标记基团诸如125I的放射标记、诸如过氧化物酶和碱性磷酸酶的酶(第3,645,090号美国专利)和能够监测荧光强度、波长改变或荧光偏振的荧光标记(第3,940,475号美国专利)。可能用于间接标记的包括一个组分的生物素酰化，接着结合偶联于上述标记基团之一的抗生物素蛋白。
也有许多从游离配体中分离结合配体，或者从游离的测试化合物中分离结合化合物的方法。可以在各种基质上固化所述DGWCC趋化因子，然后洗涤。合适的基质包括诸如ELISA板的塑料、滤膜和珠粒。将DGWCC趋化因子固化到基质上的方法包括但不限于，直接附着到塑料上、使用捕捉抗体、化学偶联和生物素-抗生物素蛋白。在这个方案中最后的步骤包括通过使用几个方法中的任何一个，包括那些例如使用诸如聚乙二醇的有机溶剂或诸如硫酸铵的盐的方法，沉淀配体/受体或配体/抗体复合物。其它合适的分离技术包括但不限于，在Rattle等(1984)Clin.Chem.301457-1461中描述的荧光素抗体可磁化微粒法，和在第4,659,678号美国专利中所述的双抗体磁性微粒分离。
在所述文献中广泛报告了用于将蛋白或其片段同各种标记连接的方法，本文并不需要详细讨论。所述技术许多涉及活化羧基的应用，或者通过使用碳二亚胺或者通过使用活性酯形成肽键，涉及通过巯基与诸如氯乙酰的活化卤素或诸如马来酰亚胺的活化链烯烃反应，形成硫醚等等。在这些应用中也发现使用融合蛋白。
本发明另一诊断方面包括使用取自DGWCC趋化因子序列的寡核苷酸或多核苷酸序列。可以使用这些序列作为检测样品中DGWCC趋化因子信使(message)水平的探针，所述样品来自天然源或怀疑有异常病症(例如癌症或发育问题)的病人。RNA和DNA二者核苷酸序列的制备、所述序列的标记和所述序列的优选大小在所述文献中得到了充分描述和讨论。一般寡核苷酸探针应当具有至少大约14个核苷酸，通常至少大约18个核苷酸，而所述多核苷酸探针最多可以达到几千个碱基。可以使用各种标记，最常用的是放射性核素，特别是32P。然而，也可以使用其它技术，诸如使用生物素修饰的核苷酸，用于引入到多核苷酸中。然后所述生物素用作结合抗生物素蛋白或抗体的位点，所述抗生物素蛋白或抗体可以用各种各样的标记物标记，诸如放射性核素、荧光团、酶等等。另一方面，可以使用可以识别特异双链体的抗体，所述双链体包括DNA双链体、RNA双链体、DNA-RNA杂种双链体或DNA-蛋白双链体。可以按顺序标记所述抗体，并进行所述测定，其中所述双链体结合于一表面，以便可以根据在所述表面上的双链体的形成，检测结合于所述双链体的抗体的存在。使用许多常规技术，诸如核酸杂交、加减筛选、重组探针探测、杂交分子释放翻译(HRT)和杂交分子终止翻译(HART)，可以实现对新反义RNA的探针的应用。这也包括诸如聚合酶链式反应(PCR)的扩增技术。
也考虑了诊断试剂盒，所述试剂盒也用于定性或定量测试这些标记和其它标记的存在。诊断或预后可以依靠用做标记的多种指示的组合。因此，试剂盒可以测试标记组合。参见例如Viallet等(1989)Progressin Growth Factor Res.189-97。可以通过标准方法，在蛋白或mRNA水平上评价每种趋化因子定性或定量的表达。XII.受体分离只要分离了特异相互作用的结合配偶体，就存在分离反配偶体的方法。参见Gearing等(1989)EMBO J.83667-3676。例如，可以检测标记DVic-1或DGWCC趋化因子、而不干扰同其受体结合的方法。例如，亲合标记或表位标记可以同所述配体的或者氨基末端或者羧基末端融合。可以筛选表达文库，以特异性地结合DVic-1或DGWCC趋化因子，例如通过细胞分类或其它筛选以检测表达这种结合组分的亚群。参见例如Ho等(1993)Proc.Nat’l Sci.USA 9011267-11271。另一方面，可以使用淘选法。参见例如Seed和Aruffo(1987) Proc.Nat’l Sci.USA843365-3369。也可以使用双杂交体选择系统，产生合适的具有可利用趋化因子序列的构成物。参见例如Fields和Song(1989)Nature 340245-246。也可以使用标准Ca++通量法。参见例如Coligan等(编辑)(1992和定期增补本)免疫学现时方案Greene/Wiley，纽约，纽约州。
具有标记的蛋白质交联接技术可以用于分离DVic-1或DGWCC趋化因子的结合配偶体。这应当允许鉴别例如以配体-受体样方式同DVic-1或DGWCC趋化因子特异相互作用的蛋白。所述趋化因子家族一般结合七跨膜受体家族的受体，而所述DVic-1或DGWCC趋化因子的受体可能显示相似的结构。因此，通过在下述系统中表达而发现所述受体是合理的，所述系统能够以可以显示配体结合能力的形式表达这种膜蛋白。
参照下述实施例，可以最好的理解本发明的广阔范围，所述实施例无意将本发明限制在特定实施例中。
实施例I.一般方法例如在以下文献中描述和引用了许多下文中所述的标准方法Maniatis等(1982)分子克隆，实验室指南冷泉港实验室，冷泉港出版社，纽约；Sambrook等(1989)分子克隆实验室指南(第2版)第1-3卷，CSH出版社，NY；Ausubel等，生物学Greene Publishing Associates，Brooklin，NY；或Ausubel等(1987和增补本)分子生物学现时方案Wiley/Greene，NY；Innis等(编辑)(1990)PCR方案方法和应用指南Academic Press，NY。用于蛋白纯化的方法包括诸如硫酸铵沉淀、柱层析、电泳、离心、结晶等等的方法。参见例如Ausubel等(1987和定期增补本)；Deutscher(1990)“蛋白质纯化指南”Methods in Enzvmology第182卷和在这个系列中的其它卷；和生产商使用蛋白纯化产品的文献，例如Pharmacia，Piscataway，NJ或Bio-Rad，Richmond，CA。结合重组技术允许同合适的区段(表位标记)融合，例如同FLAG序列或可以融合的例如通过蛋白酶可去除序列的相当序列融合。参见例如Hochuli(1989)Chemische Industrie 1269-70；Hochuli(1990)“用金属螯合物吸收剂纯化重组蛋白”载于Setlow(编辑)遗传工程、原理和方法1287-98，Plenum出版社，NY；和Crowe等(1992)OIAexpress高水平表达和蛋白纯化系统QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，CA。
例如在Coligan(1991)免疫学现时方案Wiley/Greene，NY；和Methods in Enzymology第70、73、74、84、92、93、108、116、121、132、150、162和163卷中描述了标准免疫学技术。例如在Wouterlood(1995年编辑)神经科学方案第10单元，Elsevier；神经科学方法Academic Press；和神经方法Humana出版社，Totowa，新泽西中描述了对神经细胞生物活性的检测。例如在Meisami(编辑)人类生长和发育生物学手册CRC出版社；和Chrispeels(编辑)发育生物学中的分子技术和方案Interscience中描述了发育系统方法学。
在Melamed等(1990)流式细胞计量术和分类Wiley-Liss，Inc.，NY，NY；Shapiro(1988)实用流动式胞计量术Liss，纽约，纽约州；和Robinson等(1993)流式细胞计量法手册Wiley-Liss，纽约，纽约州中描述了FACS分析。II.分离DVic-1或DGWCC趋化因子克隆通过许多不同可能的方法，从天然源中分离编码DVic-1或DGWCC趋化因子的克隆。已知本文提供的序列，选择和/或构建PCR引物或杂交探针，以分离或者基因组DNA区段或者cDNA反转录物。合适的细胞源包括下列组织，例如皮肤或上皮或伤口愈合文库。通过筛选个体种群，分离遗传和多态或等位变异体。
通过标准方法，最好使用来自所述编码序列的相反末端的引物，进行基于PCR的检测，但是为了特定目的可以选择侧翼区段。
另一方面，选择杂交探针。根据预期的同源性和预期的错配，选择探针的具体的AT或GC含量。选择合适的严格条件，以平衡合适的阳性信号与背景之比。使用连续的清洗步骤，以收集具较大同源性的克隆。
使用基于抗体的选择方法分离另外的克隆。使用的标准表达克隆方法包括例如膜结合表达产物的FACS染色。使用所述抗体鉴别产生识别蛋白的克隆。另一方面，使用抗体纯化DVic-1或DGWCC趋化因子，用蛋白序列和标准方法分离编码该蛋白的基因。
基于基因组序列的方法也可供鉴别天然可用的序列，或相反，可供鉴别同提供的序列显示同源性的序列。III.分离用于趋化因子克隆的灵长类对应物使用如上所述的相似的方法分离来自另一灵长类的合适的灵长类趋化因子基因。使用相似的源材料分离天然基因，包括遗传、多态、等位或菌株变异体。也使用相似的方法分离其它物种的变异体。另一方面，可以从基因数据库中检索合适的基元。IV.分离啮齿类趋化因子克隆如上选择合适的啮齿类源，例如大鼠、仓鼠等等。与人、其它灵长类序列相比，尽管啮齿类趋化因子的相似性程度一般较低，但仍可使用相似的方法分离物种变异体。V.染色体定位例如用生物素-14 dATP切口平移标记所述cDNA，并以5ng/μl的最终浓度同中期原位杂交，所述中期来自两个正常动物，优选为雄性。可以根据Callen等(1990)Ann.Genet.33219-221所述的方法修改荧光原位杂交法(FISH)，在所述方法中，在分析前用碘化丙锭(作为复染)和DAPI(用于鉴别染色体)二者将染色体染色。通过CCD照相机捕捉中期制备物的影象，并用计算机加强。检查合适的标记染色体的鉴定。对于这些分子的标准位置或不同位置的定位也可以提供关于功能的信息。
已将人DVic-1定位于人染色体9p13中。VI.表达；纯化；特征鉴定关于来自上述的合适的克隆，将所述编码序列插入到合适的表达载体中。这可以在特别选择的载体中，用于原核生物、酵母、昆虫或高等脊椎动物(例如哺乳动物)表达系统。将标准方法用于生产所述基因产物，优选为可溶的分泌分子，但在某些情况下，也作为分子内蛋白产生。一般分子内蛋白需要细胞裂解，以回收所述蛋白，而不溶性内含体是用于进一步纯化的常用的原材料。
关于编码DVic-1或DGWCC趋化因子的克隆，尽管可以从合适的源中纯化天然形式，但仍使用重组生产方法。通过蛋白纯化的标准方法纯化所述蛋白产物，在某些情况下，例如同免疫亲合法联合。免疫亲合法或者用作如上所述的纯化步骤，或者用作检测测定，以测定所述蛋白的分离特性。
优选将所述蛋白分泌到所述培养基中，并由可溶形式的培养基纯化可溶性产物。另一方面，如上所述，来自原核生物表达系统的内含体是有用的材料源。一般由所述内含体溶解所述不溶蛋白，并使用标准方法重折叠。如上所述制定纯化方法。
特征鉴定上述纯化方法的产物，以确定许多结构特征。使用标准物理方法，例如氨基酸分析和蛋白质序列分析。产生的蛋白须经CD波谱法和其它波谱法，例如NMR、ESR、质谱法等检测。特征鉴定所述产物，以测定其分子形式和大小，例如使用凝胶层析和相似的技术。了解所述层析特性将产生更温和或更有效的纯化方法。
例如按照在Hansen等(1995)Biochem.J.308801-813中的报告，可以进行糖基化位点的预测。VII.制备抗趋化因子的抗体使用用于表达的DNA、或例如如上所述产生的蛋白，对动物进行免疫以产生抗体。在某些情况下，使用未纯化抗原产生多克隆抗血清，尽管所得的血清将显示较高的背景值。优选使用标准蛋白纯化技术，包括例如使用如上指出的多克隆血清的亲合层析，纯化所述抗原。使用确定的合成肽片段测定特定抗体的存在。
产生抗纯化抗原(按上文指出的纯化)的多克隆血清，或使用例如许多合成肽产生多克隆血清。一系列包括所有所述全长序列的重叠合成肽，如果存在于动物中，将产生识别所述蛋白上大多数线性表位的血清。使用这样的抗血清亲合纯化蛋白，再使用所述纯化蛋白，以将完整的全长蛋白引入到另一动物中，以产生另一抗血清制备物。
使用相似的技术产生针对或者未纯化抗原、或者优选为纯化抗原的诱导单克隆抗体。所述抗血清或抗体可以识别天然蛋白，或者可以识别变性抗原。可以根据需要，免疫选择或免疫纯化所述制备物。VIII.细胞和组织的分布例如使用具有如上产生的抗体试剂的免疫组织化学，或通过筛选编码所述趋化因子的核酸，测定所述蛋白或基因产物的分布。使用杂交或PCR法测定DNA、cRNA或信使含量。组织化学允许测定组织中表达较高或较低水平的信使或DNA的特定细胞类型。抗体技术可用于定量测定在生物样品中的蛋白，所述生物样品包括体液或组织样品。制定免疫测定，以定量测定蛋白。而且可以使用FACS分析，以评价在细胞群中的表达。
已在胎鼠中测定了小鼠DGWCC序列，1个序列来自受孕后14.5天的胎鼠，3个序列来自受孕后19.5天的胎鼠。三个序列来自成熟鼠，每1个序列来自肝、胎盘和皮肤。Northern分析显示，在测试中的信号远远大于在脑中的信号，在脑中的信号远远大于在肺中的信号。IX.微量趋化性检测在微量趋化性测定中评价DGWCC趋化因子的促迁移(pro-migratory)活性。参见例如Bacon等(1988)Br.J.Pharmacol.95966-974。也使用其它的运输测定。参见例如Quidling-Jrbrink等(1995)Eur.J.Immunol. 25322-327；Koch等(1994)J.Clinical Investigation 93921-928；和Antony等(1993)J.Immunol.1517216-7223。
也可以在例如由H.Broxmeyer所述的造血检测中测定趋化因子的活性。参见Bellido等(1995)J.Clinical Investigation 952886-2895；和Jilka等(1995)Exptl Hematology 23500-506。可以如例如由Streiter等(1992)Am.J.Pathol.1411279-1284所述测定它们的血管生成活性。或对于在炎症中的作用，参见例如Wakefield等(1996)J.Surgical Res.6426-31。X.生物活性，直接和间接的如上所述例如在免疫细胞、神经元细胞或干细胞上选择粗壮和敏感的试样。将趋化因子以增加的剂量加入到所述试样中，以观察是否检测到剂量反应。例如在增殖检测中，将细胞接种到平板上。提供合适的培养基，并将趋化因子以不同的量加入到所述细胞中。在一段时间内监测生长，检测所述趋化因子或者对所述细胞直接影响，或者其间接影响。
另一方面，使用激活测定或吸引测定。选择合适的细胞类型，例如造血细胞、骨髓细胞(巨噬细胞、中性细胞、多形核细胞等等)或淋巴细胞(T细胞、B细胞或NK细胞)、神经细胞(神经元细胞、神经胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞等等)或干细胞，例如分化为其它细胞类型(例如肠隐窝细胞)的祖细胞和未分化细胞类型。
其它测定将是那些用其它趋化因子证明的测定。参见例如Schall和Bacon(1994)Current Qpinion in Immunology 6865-873；和Bacon和Schall(1996)Int.Arch.Allergy & Immunol.10997-109。XI.结构活性关系使用标准方法和分析，测定具体残基的关键性信息。例如通过在测定位置，例如在上述鉴别位置，产生许多不同的变异体，并评价所述变异体的生物活性，进行标准的诱变分析。可以在以下范围内进行该诱变分析测定修饰活性的位置，或者集中在特定位置，以测定可以置换以或者保留、阻断或者调节生物活性的残基。
另一方面，分析天然变异体可以指出耐受天然突变的位置。这可以由在个体或跨过菌株或物种中变异的种群分析得出。例如通过PCR分析和测序，分析来自所选择个体的样品。这可以评价种群多态现象。XII.筛选激动剂/拮抗物筛选能够诱导或阻断生物活性的激动剂或拮抗剂。测定候选化合物(例如天然DGWCC趋化因子的序列变异体)的生物活性。另一方面，筛选单独或组合的化合物，以测定其对生物活性的影响。XIII.分离趋化因子的受体DVic-1或DGWCC趋化因子可以用作特异结合的试剂，通过利用其结合的特异性，鉴别其结合配偶体，非常象使用抗体。或者如上所述(例如荧光或其它)标记结合试剂，或者将结合试剂固化到用于淘选法的基质上。典型的趋化因子受体是七跨膜受体。
使用所述结合组合物，例如趋化因子，筛选由细胞系表达结合配偶体(即受体)的细胞系产生的表达文库。使用标准染色技术检测或分类细胞内或表面表达的受体，或者通过淘选筛选表面表达转化细胞。通过不同的染色或免疫荧光技术进行细胞内表达的筛选。也参见McMahan等(1991)EMBO J.102821-2832。
可以使用标准Ca++通量方案鉴别DGWCC的受体，参见例如Coligan等(编辑)(1992和定期增补本)免疫学现时方案Greene/Wiley，纽约，纽约州。
例如在第0天，用每室1ml的10ng/ml纤连蛋白的PBS，于室温下在PBS中预包被2室permanox载玻片30分钟。用PBS清洗一次。然后以每室2-3×105细胞将COS细胞接种于1.5ml生长培养基中。于37℃温育过夜。
在第一天为每个样品制备0.5ml的66mg/ml DEAE-右旋糖酐、66mM氯奎和4mgDNA的无血清DME溶液。为每个组制备一个阳性对照，例如以1和1/200稀释的人DGWCC趋化因子cDNA，制备一个阴性模拟。用无血清DME清洗细胞。加入所述DNA溶液并于37℃温育5小时。除去所述培养基并加入0.5ml在DME中的10％ DMSO共2.5分钟。除去并用DME洗涤一次。加入1.5ml生长培养基并过夜温育。
在第二天，更换所述培养基。在第三天或第四天，固定所述细胞并染色。用Hank’s缓中盐溶液(HBSS)清洗所述细胞两次，并在4％的低聚甲醛(PFA)/葡萄糖中固定所述细胞5分钟。用HBSS洗涤3次。在除去所有的液体后可以将载玻片贮存在-80℃。对于每个室，如下进行0.5ml温育。加入具有32ml/ml 1M NaN3的HBSS/皂苷(0.1％)共20分钟。然后HBSS/皂苷洗涤细胞1次。向细胞加入趋化因子或趋化因子/抗体复合物，并温育30分钟。用HBSS/皂苷洗涤细胞两次。如果合适，加入第一抗体共30分钟。加入第二抗体，例如以1/200稀释的Vector抗小鼠抗体，并温育30分钟。制备ELISA溶液，例如Vector Elite ABC辣根过氧化物酶溶液，并预温育30分钟。使用例如每2.5ml HBSS/皂苷1滴A溶液(抗生物素蛋白)和1滴B溶液(生物素)。用HBSS/皂苷两次洗涤细胞。加入ABC HRP溶液并温育30分钟。用HBSS两次洗涤细胞，第二次清洗2分钟，封闭细胞。然后加入Vector二氨基苯甲酸(DAB)共5至10分钟。使用每5ml玻璃蒸馏水2滴缓冲液加上4滴DAB加上2滴H2O2。仔细地去除室，并用水清洗载玻片。风干几分钟，然后加入1滴Crystal Mount和盖玻片。于85-90℃烘烤5分钟。
评价阳性染色混合物并逐渐亚克隆，以分离负责所述结合的单个基因。
另一方面，使用趋化因子试剂，以亲合纯化或分类表达受体的细胞。参见例如Sambrook等或Ausbel等。
另一个策略是通过淘选筛选膜结合受体。如上所述构建所述受体cDNA。可以固定化所述配体，并使用其固定化表达细胞。通过使用合适的识别例如趋化因子融合构成物的FLAG序列的抗体，或通过使用针对所述第一抗体产生的抗体，可以实现固化。选择和扩增的递归循环导致合适的克隆富集和表达受体的克隆完全分离。
用趋化因子可以筛选噬菌体表达文库。合适的标记技术，例如抗-FLAG抗体，将允许特异标记合适的克隆。XIV.免疫组织化学定位使用上述抗体在不同的组织中鉴别DVic-1或DGWCC的表达。例如在Sheehan等(编辑)(1987)组织化学的理论与实践，Battelle出版社，Columbus，OH中描述了免疫组织化学染色的方法。
如同具体并单独指明将每个单独的出版物或专利申请通过引用整个结合到本文中一样，将在本文中提及的所有参考文献通过引用结合到本文中。
可以不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行许多修改与改变，所述修饰和改变对本领域那些技术人员是显而易见的。本文描述的具体实施方案仅仅是为了提供实施例，并且仅有所附的权利要求书以及全部范围的这种权利要求给予权利的相当物限制本发明。
序列表(i)申请人(A)申请人Schering Corporation(B)街道2000 Galloping Hill Road(C)城市Kenilworth(D)州新泽西(E)国家美国(F)邮政编码07033-0530(G)电话号码(908)298-5056(ii)发明名称哺乳动物趋化因子(iii)序列数12(iv)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机苹果MacIntosh(C)操作系统MacIntosh 7.1(D)软件Microsoft Word 5.1a(v)当前申请数据申请号(vi)在先申请数据(A)申请号US 60/031,805(B)提交日期1996年11月27日(vi)在先申请数据(A)申请号US 08/761,071(B)提交日期1996年12月5日(vi)在先申请数据(A)申请号US ××/×××，×××(B)提交日期1997年10月24日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度731个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置56..436(ix)特征(A)名称/关键词成熟肽(B)位置122..436(ix)特征(A)名称/关键词misc特征
(B)位置565(D)其它信息/注释＝“设计为C的核苷酸565和581，可以是A或C”(ix)特征(A)名称/关键词misc特征(B)位置712(D)其它信息/注释＝“设计为C的核苷酸712，可以是A、C、G或T”(ix)序列描述SEQ ID NO1GGCTGATCGA ACAGCCTCAC TTGTGTTGCT GTCAGTGCCA GTAGGGCAGG CAGGA ATG58Met-22CAG CAG AGA GGA CTC GCC ATC GTG GCC TTG GCT GTC TGT GCG GCC CTA 106Gln Gln Arg Gly Leu Ala Ile Val Ala Leu Ala Val Cys Ala Ala Leu-20 -15 -10CAT GCC TCA GAA GCC ATA CTT CCC ATT GCC TCC AGC TGT TGC ACG GAG 154His Ala Ser Glu Ala Ile Leu Pro Ile Ala Ser Ser Cys Cys Thr Glu-51 5 10GTT TCA CAT CAT ATT TCC AGA AGG CTC CTG GAA AGA GTG AAT ATG TGT 202Val Ser His His Ile Ser Arg Arg Leu Leu Glu Arg Val Asn Met Cys15 2025CGC ATC CAG AGA GCT GAT GGG GAT TGT GAC TTG GCT GCT GTC ATC CTT 250Arg Ile Gln Arg Ala Asp Gly Asp Cys Asp Leu Ala Ala Val Ile Leu3035 40CAT GTC AAG CGC AGA AGA ATC TGT GTC AGC CCG CAC AAC CAT ACT GTT 298His Val Lys Arg Arg Arg Ile Cys Val Ser Pro His Asn His Thr Val4550 55AAG CAG TGG ATG AAA GTG CAA GCT GCC AAG AAA AAT GGT AAA GGA AAT 346Lys Gln Trp Met Lys Val Gln Ala Ala Lys Lys Asn Gly Lys Gly Asn6065 7075GTT TGC CAC AGG AAG AAA CAC CAT GGC AAG AGG AAC AGT AAC AGG GCA 394Val Cys His Arg Lys Lys His His Gly Lys Arg Asn Ser Asn Arg Ala808590CAT CAG GGG AAA CAC GAA ACA TAC GGC CAT AAA ACT CCT TAT 436His Gln Gly Lys His Glu Thr Tyr Gly His Lys Thr Pro Tyr95100 105TAGAGAGTCT ACAGATAAAT CTACAGAGAC AATTCCTCAA GTGGACTTGGCCATGATTGG 496TTGTCCTGCA TACTGATGAA ACTACTGATG TCVGCTGGTC TGAAAGGACC TACGAGAAGC556TAAATCTCCA AGAATGCCAT TTCCCTATCC CTAATGATTC AATCTCCCTT ACCCTGACCA616ATCAGTGGCC CAAATTTTCC AGCCCCTTGC CTCCCAGAAC CCCAGCCCAG AACTCTTCAG676AGATTTAAGA ATCTCCTCCT ACCTCCTGAC TCAGCCCCAT GTAATCATTA AACTC 731(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度127个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Gln Gln Arg Gly Leu Ala Ile Val Ala Leu Ala Val Cys Ala Ala-22 -20-15 -10Leu His Ala Ser Glu Ala Ile Leu Pro Ile Ala Ser Ser Cys Cys Thr-5 1 510Glu Val Ser His His Ile Ser Arg Arg Leu Leu Glu Arg Val Asn Met1520 25Cys Arg Ile Gln Arg Ala Asp Gly Asp Cys Asp Leu Ala Ala Val Ile30 35 40Leu His Val Lys Arg Arg Arg Ile Cys Val Ser Pro His Asn His Thr45 50 55Val Lys Gln Trp Met Lys Val Gln Ala Ala Lys Lys Asn Gly Lys Gly6065 70Asn Val Cys His Arg Lys Lys His His Gly Lys Arg Asn Ser Asn Arg75 80 85 90Ala His Gln Gly Lys His Glu Thr Tyr Gly His Lys Thr Pro Tyr95100 105(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度496个碱基对(B)类型核酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA
(xi)序列描述SEQ ID NO3TCCTGATCGA ACAGCCTCAC TTGTNTTGCT GTCAGTGCCA GTAGGGCAGG CAGGAATGCA60GCAGAGAGGA CTCGCCATCG TGGCCTTGGN TGTCTGTGCG GCCCTACATG CCTCAAAAGC120CATACTTCCC ATTGCCTCCA GCTGTTGCAC GGAGGTTTCA CATCATATTT CCAGAAGGCT180CCTGGGAAAG AGTGAATATG TGTCGCATCC AGAGAGCTGA TGGGGATTGT NACTTGGCTG240CTGTCATCCT TCATGTCAAG CGCAGAAGAA TCTGTNTCAG CCCGNACAACCATACTGTTA 300AGCAGTGGNT GAAAGTGCAA GTTGCCAGGA AAAATGGTAA AGGAAATTTTTTCCACAGGG 360NGGAAACACC CTGGGNAAGG GGANCCGTTA CCAGGGNACT TNNGGGGAAANGGGAAANTT 420NGGGCNTNAA AAATCCCTTT TNNGGGGNTT TAAGGTAAAT TTTNNNGGGAAATTTTCCNA 480GGGGNTTTGG NCATTT496(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度445个碱基对(B)类型核酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GGCACGAGCT TTGGCAGCTT CTTCACGTCG GTCCTCTCCG CGCGCGGTAG GAACCGTCCA60CGGCCTTAAA GAAGCCTCCT CACCAGCCAT ACTTCCCATT GCCTCCAGCT GTTGCACGGA120GGTTTCACAT CATATTTCCA GAAGGCTCCT GGNAAAGAGT GAATATGTGT CGCATCCAGA180GAGCTGATGG GGATTGTGAC TTGGCTGCTG TCATCCTTCA TGTCAAGCGC AGAAGAATCT240GTGTTCAGCC CGCACAACCA TACTGTTGAA GCAGTGGATG AAAGTGCAAGCTGCCAAGAA 300AAATGGTAAA GGAAATGTTT GCCACAGGAA GAAACACCNG GCAAGAGGAACATTAACAGG 360NACTTCCAGG GGAAACACGA AACTNACGGG CCNGAAAAAT CCTTATTTAGAGATTNACCG 420TTAANCTACC GGGACATTCC CCAAT445(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度362个碱基对(B)类型核酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..336(ix)特征(A)名称/关键词成熟肽(B)位置73..336(xi)序列描述SEQ ID NO5ATG AAG GGG CCC CCA ACC TTC TGC AGC CTC CTG CTG CTG TCA TTG CTC 48Met Lys Gly Pro Pro Thr Phe Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu-24 -20 -15 -10CTG AGC CCA GAC CCT ACA GCA GCA TTC CTA CTG CCA CCC AGC ACT GCC 96Leu Ser Pro Asp Pro Thr Ala Ala Phe Leu Leu Pro Pro Ser Thr Ala-5 1 5TGC TGT ACT CAG CTC TAC CGA AAG CCA CTC TCA GAC AAG CTA CTG AGG 144Cys Cys Thr Gln Leu Tyr Arg Lys Pro Leu Ser Asp Lys Leu Leu Arg101520AAG GTC ATC CAG GTG GAA CTG CAG GAG GCT GAC GGG GAC TGT CAC CTC 192Lys Val Ile Gln Val Glu Leu Gln Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu25 3035 40CAG GCT TTC GTG CTT CAC CTG GCT CAA CGC AGC ATC TGC ATC CAC CCC 240Gln Ala Phe Val Leu His Leu Ala Gln Arg Ser Ile Cys Ile His Pro4550 55CAG AAC CCC AGC CTG TCA CAG TGG TTT GAG CAC CAA GAG AGA AAG CTC 288Gln Asn Pro Ser Leu Ser Gln Trp Phe Glu His Gln Glu Arg Lys Leu60 65 70CAT GGG ACT CTG CCC AAG CTG AAT TTT GGG ATG CTA AGG AAA ATG GGC 336His Gly Thr Leu Pro Lys Leu Asn Phe Gly Met Leu Arg Lys Met Gly758085TGAAGCCCCA ATAGCCAAAT AATAAA 362(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度112个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Lys Gly Pro Pro Thr Phe Cys Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu-24 -20-15-10Leu Ser Pro Asp Pro Thr Ala Ala Phe Leu Leu Pro Pro Ser Thr Ala-51 5Cys Cys Thr Gln Leu Tyr Arg Lys Pro Leu Ser Asp Lys Leu Leu Arg101520Lys Val Ile Gln Val Glu Leu Gln Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu2530 3540Gln Ala Phe Val Leu His Leu Ala Gln Arg Ser Ile Cys Ile His Pro4550 55Gln Asn Pro Ser Leu Ser Gln Trp Phe Glu His Gln Glu Arg Lys Leu60 6570His Gly Thr Leu Pro Lys Leu Asn Phe Gly Met Leu Arg Lys Met Gly758085(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度433个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置23..382(ix)特征(A)名称/关键词成熟肽(B)位置98..382
(xi)序列描述SEQ ID NO7GAAACCTCTA GGCTGAGTGA GC ATG ATG GAG GGG CTC TCC CCC GCC AGC AGC 52Met Met Glu Gly Leu Ser Pro Ala Ser Ser-25 -20CTC CCG CTG TTA CTG TTG CTT CTG AGC CCG GCT CCT GAA GCA GCC TTG 100Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Pro Ala Pro Glu Ala Ala Leu-15 -10-51CCT CTG CCC TCC AGC ACT AGC TGC TGT ACT CAG CTC TAT AGA CAG CCA 148Pro Leu Pro Ser Ser Thr Ser Cys Cys Thr Gln Leu Tyr Arg Gln Pro5 1015CTC CCA AGC AGG CTG CTG AGG AGG ATT GTC CAC ATG GAA CTG CAG GAG 196Leu Pro Ser Arg Leu Leu Arg Arg Ile Val His Met Glu Leu Gln Glu202530GCC GAT GGG GAC TGT CAC CTC CAG GCT GTC GTG CTT CAC CTG GCT CGG 244Ala Asp Gly Asp Cys His Leu Gln Ala Val Val Leu His Leu Ala Arg35 4045CGC AGT GTC TGT GTT CAT CCC CAG AAC CGC AGC CTG GCT CGG TGG TTA 292Arg Ser Val Cys Val His Pro Gln Asn Arg Ser Leu Ala Arg Trp Leu50 55 6065GAA CGC CAA GGG AAA AGG CTC CAA GGG ACT GTA CCC AGT TTA AAT CTG 340Glu Arg Gln Gly Lys Arg Leu Gln Gly Thr Val Pro Ser Leu Asn Leu7075 80GTA CTA CAA AAG AAA ATG TAC TCA AAC CCC CAA GAG CAA AAC 382Val Leu Gln Lys Lys Met Tyr Ser Asn Pro Gln Gln Gln Asn85 90 95TAATAAAGCA ACATTAGACG ACAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A433(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度120个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Met Glu Gly Leu Ser Pro Ala Ser Ser Leu Pro Leu Leu Leu Leu-25 -20 -15 -10Leu Leu Ser Pro Ala Pro Glu Ala Ala Leu Pro Leu Pro Ser Ser Thr-51 5Ser Cys Cys Thr Gln Leu Tyr Arg Gln Pro Leu Pro Ser Arg Leu Leu101520Arg Arg Ile Val His Met Glu Leu Gln Glu Ala Asp Gly Asp Cys His253035Leu Gln Ala Val Val Leu His Leu Ala Arg Arg Ser Val Cys Val His40 45 50 55Pro Gln Asn Arg Ser Leu Ala Arg Trp Leu Glu Arg Gln Gly Lys Arg60 65 70Leu Gln Gly Thr Val Pro Ser Leu Asn Leu Val Leu Gln Lys Lys Met7580 85Tyr Ser Asn Pro Gln Gln Gln Asn9095(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度99个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ile Ala Ala Thr1 5 1015Phe Ile Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ala Ile Asn Ala Pro Val202530Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr Asn Arg Lys Ile Ser Val Gln Arg Leu3540 45Ala Ser Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Val50 55 60Ile Phe Lys Thr Ile Val Ala Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Gln65 70 75 80Lys Trp Val Gln Asp Ser Met Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr85 9095Pro Lys Thr(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度96个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑学线性
(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu1 5 1015Leu Leu His Leu Cys Gly Glu Ser Glu Ala Ala Ser Asn Phe Asp Cys20 2530Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Leu His Pro Lys Phe Ile Val Gly35 4045Phe Thr Arg Gln Leu Ala Asn Glu Gly Cys Asp Ile Asn Ala Ile Ile50 5560Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gln Thr65 7075 80Trp Val Lys Tyr Ile Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asp Met85 9095(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度543个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..492(xi)序列描述SEQ ID NO11ATG TCG CGA TTG AGG AGA TAC GAG GTG GCG CTG GAA GCG GAG GAG GAG 48Met Ser Arg Leu Arg Arg Tyr Glu Val Ala Leu Glu Ala Glu Glu Glu1 510 15ATC TAC TGG GGC TGC TTC TAC TTT TTT CCT TGG CTG CGA ATG TGG CGC 96Ile Tyr Trp Gly Cys Phe Tyr Phe Phe Pro Trp Leu Arg Met Trp Arg2025 30AGG GAG CGG AGT CCG ATG TCT CCA ACA AGC CAG AGA CTA AGT CTG GAA 144Arg Glu Arg Ser Pro Met Ser Pro Thr Ser Gln Arg Leu Ser Leu Glu3540 45GCC CCC AGC CTC CCA CTG AGA AGC TGG CAT CCG TGG AAC AAG ACT AAG 192Ala Pro Ser Leu Pro Leu Arg Ser Trp His Pro Trp Asn Lys Thr Lys50 5560CAG AAG CAA GAA GCC TTG CCT CTG CCC TCC AGC ACT AGC TGC TGT ACT 240Gln Lys Gln Glu Ala Leu Pro Leu Pro Ser Ser Thr Ser Cys Cys Thr65707580CAG CTC TAT AGA CAG CCA CTC CCA AGC AGG CTG CTG AGG AGG ATT GTC 288Gln Leu Tyr Arg Gln Pro Leu Pro Ser Arg Leu Leu Arg Arg Ile Val859095CAC ATG GAA CTG CAG GAG GCC GAT GGG GAC TGT CAC CTC CAG GCT GTC 336His Met Glu Leu Gln Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu Gln Ala Val100 105 110GTG CTT CAC CTG GCT CGG CGC AGT GTC TGT GTT CAT CCC CAG AAC CGC 384Val Leu His Leu Ala Arg Arg Ser Val Cys Val His Pro Gln Asn Arg115 120 125AGC CTG GCT CGG TGG TTA GAA CGC CAA GGG AAA AGG CTC CAA GGG ACT 432Ser Leu Ala Arg Trp Leu Glu Arg Gln Gly Lys Arg Leu Gln Gly Thr130135 140GTA CCC AGT TTA AAT CTG GTA CTA CAA AAG AAA ATG TAC TCA AAC CCC 480Val Pro Ser Leu Asn Leu Val Leu Gln Lys Lys Met Tyr Ser Asn Pro145 150 155160CAA CAG CAA AAC TAATAAAGCA ACATTAGACG ACAAAAAAAA AAAAAAAAAA532Gln Gln Gln AsnAAAAAAAAAA A543(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度164个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO12Met Ser Arg Leu Arg Arg Tyr Glu Val Ala Leu Glu Ala Glu Glu Glu1 510 15Ile Tyr Trp Gly Cys Phe Tyr Phe Phe Pro Trp Leu Arg Met Trp Arg202530Arg Glu Arg Ser Pro Met Ser Pro Thr Ser Gln Arg Leu Ser Leu Glu35 4045Ala Pro Ser Leu Pro Leu Arg Ser Trp His Pro Trp Asn Lys Thr Lys50 5560Gln Lys Gln Glu Ala Leu Pro Leu Pro Ser Ser Thr Ser Cys Cys Thr65 707580Gln Leu Tyr Arg Gln Pro Leu Pro Ser Arg Leu Leu Arg Arg Ile Val859095His Met Glu Leu Gln Glu Ala Asp Gly Asp Cys His Leu Gln Ala Val100 105 110Val Leu His Leu Ala Arg Arg Ser Val Cys Val His Pro Gln Asn Arg115 120125Ser Leu Ala Arg Trp Leu Glu Arg Gln Gly Lys Arg Leu Gln Gly Thr130135 140Val Pro Ser Leu Asn Leu Val Leu Gln Lys Lys Met Tyr Ser Asn Pro145 150 155 160Gln Gln Gln Asn
权利要求
1.大体纯的DVic-1多肽，所述多肽包括SEQ ID NO2中叙述的成熟氨基酸序列。
2.大体纯的DGWCC多肽，所述多肽包括SEQ ID NO6或10中提出的成熟氨基酸序列。
3.包括权利要求1或2的多肽的融合蛋白。
4.特异性结合权利要求1或2的多肽的结合化合物。
5.权利要求4的结合化合物，所述结合化合物是抗体或抗体片段。
6.编码权利要求1或2的多肽的核酸。
7.包含权利要求6的核酸的表达载体。
8.包含权利要求7的载体的宿主细胞。
9.重组生产多肽的方法，包括在表达所述多肽的条件下培养权利要求8的宿主细胞。
全文摘要
提供来自人的新CC趋化因子,提供与其相关的试剂,包括纯化蛋白、特异抗体和编码这些趋化因子的核酸。也提供制备和使用所述试剂的方法和诊断试剂盒。
文档编号C12P21/02GK1245533SQ97181501
公开日2000年2月23日 申请日期1997年11月26日 优先权日1996年11月27日
发明者A·维卡里, J·莫拉勒斯, J·A·赫德里克, A·兹罗特尼克 申请人:先灵公司