一种酶的制作方法

专利名称：一种酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶。本发明还涉及编码该酶的核苷酸序列。
Boos和同事们在1981和1982年(1，2)通过大肠杆菌E.coli中乙酰-辅酶A的乙酰基团被转移到麦芽糖上而证明了一种能够使麦芽糖乙酰化的酶存在。特别地，Boos等人(1)观察到在E.coli中麦芽糖和寡聚麦芽糖苷(maltooligosides)积累后形成乙酰麦芽糖和乙酰寡聚麦芽糖苷(acetyl-oligomaltosides)。Boos等人(2)也观察到当把麦芽糖或麦芽三糖，乙酰-辅酶A和E.coli的细胞质提取液混合后，形成了乙酰麦芽糖和乙酰寡聚麦芽糖苷。
Boos等人于1981年声明对麦芽糖和麦芽糖糊精乙酰化作用的活性是未知的。但是，他们在1982年(2)的进一步的研究中，Feundlieb和Boos将这种未知的酶命名为“麦芽糖转乙酰酶”，但是接着说E.coli中的麦芽糖转乙酰酶的功能尚不清楚。
后来Brand和Boos(3)分离出了缺少编码麦芽糖转乙酰酶基因的E.coli突变株。该突变株使他们能够将该基因作图于E.coli连锁图上的10.4分钟。另外，他们在一个高拷贝质粒中克隆了含有该基因的一个3.4kb的DNA片段。然后从带有上述质粒的E.coli菌株无细胞提取液中将过量表达的麦芽糖转乙酰酶纯化至均质。该酶被证明是一种有两个相同的20kDa亚基的同源二聚体。该酶对底物葡萄糖，麦芽糖和乙酰-辅酶A的km(mM)和Vmax(μmol/min×mg酶)值分别是62和200，90和110，以及0.018和166。发现麦芽三糖和其它寡糖的乙酰化速率是所测定葡萄糖乙酰化速率的2％。另外，Brand和Boos提供了下述相对乙酰化速率葡萄糖1，麦芽糖0.55，甘露糖0.2，果糖0.07，半乳糖0.04，麦芽三糖和其它寡聚麦芽糖0.02。寡糖是含有少于10个糖基的糖类。
尽管有这些发现，Brand和Boos没有对编码麦芽糖乙酰转移酶的核苷酸及这种酶进行测序。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶活性的酶，其中，该酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或其变体，同系物或片段。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶活性的重组酶，其中，该酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或其变体，同系物或片段。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶活性的重组酶，其中，该酶具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶活性的重组酶，其中，该重组酶同用本发明上述方面的纯化的重组酶制备的抗体发生免疫反应。
根据本发明的第五方面，本发明提供了一种编码本发明酶的核苷酸序列或与其互补的序列。
根据本发明的第六方面，本发明提供了一种含有如SEQ ID No.2所示序列的核苷酸序列，或其变体，同系物或片段或者是同其互补的序列。
根据本发明的第七方面，本发明提供了一种具有如SEQ ID No.2所示序列的核苷酸序列。
根据本发明的第八方面，本发明提供了一种构建体，该构建体含有或表达本发明的核苷酸序列或酶。
根据本发明的第九方面，本发明提供了一种载体，该载体含有或表达本发明的构建体或核酸序列或酶。
根据本发明的第十方面，本发明提供了一种质粒，该质粒含有或表达本发明的载体，构建体，核苷酸序列或酶。
根据本发明的第十一方面，本发明提供了一种转基因生物，该转基因生物含有或表达本发明的质粒，载体，构建体或核苷酸序列或酶。
根据本发明的第十二方面，本发明提供了一种修饰糖(优选为淀粉)，该修饰糖是用含有或表达或使用本发明的方法制备的。
本发明的酶可从任何一种细菌，真菌，藻类，酵母，或植物中获得。优选的，该酶从E.coli中获得。
本发明的α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶有时被称作Mac。编码本发明α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶的基因有时被称作mac基因。
优选的，该酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或其变体，同系物或片段。
优选的，该酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
优选的，该酶由含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列的核苷酸序列或者其变体，同系物或片段或者与其互补的序列所编码，优选的，该酶由如SEQ ID No.2所示的核苷酸编码。
优选的，该生物体是一种植物。
优选的，该核苷酸序列是一种DNA序列。
所述酶或编码它的核苷酸序列可以同一种或多种其它的酶或编码它们的核苷酸序列相组合，用于体内或体外，这些酶或编码它们的核苷酸序列优选是用重组DNA技术制备。
因此，根据本发明的一个方面，在体内酶促修饰反应之后接着是一体外酶促修饰反应。在这些修饰步骤中，不必使用相同的酶。
同所述酶相关的术语“变体”，“同系物”或“片段”包括任何从所述序列中取代，变异，修饰，替代，缺失或添加一个(或多个)氨基酸的序列，只要所得氨基酸序列具有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶的活性，优选的至少具有同SEQ ID No.1所示的酶一样的活性。尤其是，如果所得的酶具有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶活性，术语“同系物”则包括在结构和/或功能上的同源性。就序列的同源性而言，优选的是与SEQ ID No.1所示的序列具有至少75％的同源性，更优选的是至少有85％的同源性，更优选的是至少有90％的同源性。更优选的是同SEQ ID No.1所示的序列具有95％的同源性，更加优选的是具有98％的同源性。
同编码所述酶的核苷酸序列相关的术语“变体”，“同系物”或“片段”包括任何从该序列中取代，变异，修饰，替代，缺失或增加一个(或多个)核苷酸的序列，只要所得到的核苷酸序列编码一种具有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶的活性的酶，优选至少具有同如SEQ IDNo.1所示的酶一样的活性。尤其是，如果该所得核苷酸序列编码一种具有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶活性的酶，术语“同系物”包括在结构和/或功能上的同源性。就序列的同源性而言，优选的是与SEQ IDNo.2所示的序列具有至少75％的同源性，更优选的是至少有85％的同源性，更优选的是至少有90％的同源性。更优选的是同SEQ ID No.2所示的序列具有95％的同源性，更加优选的是具有98％的同源性。
上述术语与所述序列的等位变异体是同义的。
术语“互补”指的是本发明也包括能够同本发明序列杂交的序列。
对于本发明来说，术语“核苷酸”包括基因组DNA，cDNA，合成DNA以及RNA。优选的指的是DNA，更优选的指的是编码本发明序列的cDNA。
优选的，所述核苷酸序列不是一个天然核苷酸序列。关于这一点，术语“天然核苷酸序列”是指一个处于其天然环境下的全长核苷酸序列并且当有效地连接到一个与其天然相关的完整启动子上时，该启动子也处于其天然环境中。
因此，本发明的酶可通过其天然生物体内的核苷酸序列来表达，但是所述的核苷酸序列不在该生物体内与其相关的启动子的控制之下。
本发明的酶可同其它的酶组合使用。
优选的，所述酶不是天然酶。关于这一点，术语“天然酶”是指一种由其天然核苷酸序列所表达的处于其天然环境中的完整的酶。
术语“构建体”-与诸如“结合物”，“表达盒”以及“杂合体”的术语具有相同的含义-包括直接或间接与一个启动子相连或融合的核苷酸序列。间接相连的例子是提供象内含子序列一样的合适的间隔基团，例如Sh1内含子或ADH内含子，插入启动子和所述核苷酸序列之间。
在每种情况下，更优选的是这些术语不包括编码该酶的基因同野生型基因启动子均处于天然环境时它们之间通常的天然结合。因此，本发明的一个优选的实施例涉及将本发明的核苷酸序列有效的连接到一个异源启动子上。
所述构建体甚至可以含有或表达一种标记物以便于从植物-如马铃薯中选择出已经被转入其中的遗传构建体。现有多种标记物可供选用，比如那些编码6-磷酸-甘露糖异构酶(特别对于植物而言)或用于抗生素抗性-例如对G418，潮霉素，博来霉素，卡那霉素以及庆大霉素具有抗性的标记物。
术语“载体”包括表达载体以及转化载体。
术语“表达载体”是指能够在体内或体外表达的构建体。
术语“转化载体”是指能够从一个物种转移到另一个物种中的构建体-例如从E.coli质粒到土壤杆菌中再到植物中。
术语“组织”包括组织和器官，可以是分离出的组织或器官，也可以是在生物体内的组织或器官。
本发明所涉及的术语“生物体”包括含有编码本发明酶的核苷酸序列的任何生物体和/或从中得到的产物，和/或其中本发明所述核苷酸序列在该生物体中能够进行表达。
优选的生物是植物。
本发明中所涉及的术语“转基因生物体”包括含有编码本发明酶的核苷酸序列的任何生物体和/或从中得到的产物，和/或其中本发明的核苷酸序列在该生物体中能够进行表达。优选的，所述核苷酸序列被整合到该生物体的染色体组中。
优选的，所述转基因生物是植物。
因此，本发明的转基因生物包括含有编码本发明的酶的核苷酸序列，本发明的构建体，本发明的载体，本发明的质粒，本发明的细胞，本发明的组织，或其产物之任何一种或其组合的生物。例如，该转基因生物也可以含有在异源启动子控制下的编码本发明酶的核苷酸序列。所述转基因生物不包括启动子和核苷酸序列对该生物均是天然的并且均处于它们的天然环境中的状态下的编码本发明的酶的核苷酸序列和启动子的结合。
术语“启动子”是本领域常用的意思，例如Jacob-Mond的基因表达理论中的RNA聚合酶结合位点。
所述启动子可以额外地具有一种或多种特性以确保或增强在适宜的宿主中的表达。例如，这些特性可以是诸如Pribnow框或TATA框的保守区。该启动子甚至可以带有其它序列以影响(比如保持，增强，降低)本发明核苷酸序列的表达水平。例如，适宜的其它序列包括Sh1-内含子或ADH-内含子。其它的序列包括诱导因子-比如温度，化学，光或激应诱导因子。
也应当有促进转录或翻译的适宜因子存在。后面的因子的一个例子是TMV5’信号序列(见Sleat基因217217-225；以及Dawson植物分子生物学2397)。
因此，一方面，本发明的核苷酸序列是在启动子的控制之下，该启动子使所述核苷酸序列能够表达。在这方面，该启动子可以是细胞或组织特异性启动子。例如，如果该生物是一种植物，那么该启动子是可以在种子，茎，块茎，芽，根以及叶组织的任何一个或多个中影响该核苷酸序列的表达的启动子。
可以在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis T.(编者)的分子克隆。实验手册。第二版，冷泉港实验室出版社，纽约1989，中找到关于重组DNA技术的一般性指导。
虽然在EP-B-0470415和CA-A-2006454中没有公开本发明的酶和核苷酸序列，但是两个文件中的确提供了制备本发明的转基因植物的有用的背景技术评论。这些背景技术指导中的一部分包括在下述评论中。
构建遗传修饰植物的基本原理是将遗传信息插入到植物的染色体中并使插入遗传材料能稳定保持。
现有许多用作插入遗传信息的技术，两种主要的原理是遗传信息的直接导入和用载体系统来导入遗传信息。可以在Potrykus的文章(植物生理学分子生物学年报42205-225)和Christou的文章(农业-食品-工业高技术3月/4月1994 17-27)中找到对这些常用技术的评论。
因此，一方面，本发明涉及一种携带有本发明的核苷酸序列或构建体的载体系统，该载体能够将所述核苷酸序列或构建体引入某种生物比如植物的染色体组中。
所述载体系统可以含有一个载体，但是也可以包括两个载体。在含有两个载体的情况下，通常将该载体系统称作双载体系统。Gynheung An等(1980)，在双载体，植物分子生物学手册A3，1-19一文中对双载体系统作了进一步的详细描述。
一个广泛使用的以特定的启动子或核苷酸序列或构建体转化植物细胞的系统是以使用来自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti质粒或来自发根农杆菌(agrobacteriumrhizogenes)的Ri质粒为基础的(An等(1986)，植物生理学，81，301-305以及Butcher D.N.等(1980)，植物病理学家组织培养方法，编辑Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。)已经构建了适用于构建上述植物或植物细胞构建体的几种不同的Ti和Ri质粒。
本发明的核苷酸序列或构建体应优选插入Ti质粒的T-DNA末端序列或相邻T-DNA序列之间，以避免紧邻T-DNA边缘的序列被破坏，因为至少看起来这些区域之一对于修饰的T-DNA插入植物染色体组中是必需的。
从上述解释中可以理解，如果该生物是一种植物，那么本发明的载体系统优选含有对感染该植物所必需的序列(例如vir区)以及至少一个T-DNA序列的边缘部分，该边缘部分位于同遗传构建体相同的载体上。
另外，该载体系统优选是根癌农杆菌Ti质粒或毛根农杆菌Ri质粒或其衍生物，因为这些质粒是公知的而且广泛用于转基因植物的构建，许多现有的载体系统是以这些质粒或它们的衍生物为基础的。
在转基因植物的构建中，可将本发明的核苷酸序列或构建体在插入植物体之前首先在能够使其复制并且易于扩增的微生物中构建。一个有用的微生物的例子是E.coli，但是也可以使用具有上述特性的其它微生物。当在E.coli中构建上述定义的载体系统中的载体时，如果需要，就将该载体转入适宜的农杆菌菌株中，例如根癌农杆菌中。这样，优选的将带有本发明核苷酸序列或构建体的Ti-质粒转入到农杆菌菌株中，例如根癌农杆菌中，以获得带有本发明核苷酸序列或构建体的农杆菌细胞，然后将该DNA转入待修饰的植物细胞中。
如CA-A-2006454中所报道的，有大量的克隆载体可供选用，所述载体含有E.coli复制系统以及使转化细胞能够被选出的标记物。所述载体包括例如pBR322，pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。这样，本发明的核苷酸或构建体可以被导入所述载体中适宜的限制性位点上。将含有的质粒用于转化E.coli。在适宜的营养培养基中培养这些E.coli细胞然后回收并裂解。然后回收质粒。作为一种分析方法，这里通常用序列分析，限制性分析，电泳和进一步的生物化学分子生物学方法。每次操作后，用限制酶切割所用DNA序列并同另一个DNA序列连接起来。可将每个序列克隆在相同或不同的质粒中。
每次根据本发明的方法将构建体或核苷酸序列引入植物后还可能需要存在和/或插入另外的DNA序列，例如，如果用Ti-或Ri-质粒转化植物细胞，那么作为引入基因的侧翼区，至少Ti-或Ri-质粒T-DNA的右边界而且通常是右边界同左边界应被连接起来。已经对用T-DNA进行植物细胞转化有了深入细致的研究并在EP-A-120516中作了描述；见Hoekema的The Binary Plant Vector SystemOffset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第5章；Fraley，等，植物科学评论，41-46；以及An等，欧洲分子生物学杂志(1985)4277-284。
用土壤杆菌属直接侵染植物组织是一种已被广泛使用并且由Butcher D.N.等在(1980)，植物病理学家的组织培养方法，编辑D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208页中作了描述的简单技术。对于这一主题的进一步的介绍见Potrykus(植物生理学植物分子生物学年报42205-225)和Christou(农业-食品-工业高技术3月/4月1994 17-27)。用这种技术，可侵染植物特定的部分或组织，即叶子，块茎，根，茎的一部分或该植物的其它部分。
一般地，用带有本发明核苷酸序列的农杆菌属直接侵染植物组织时，要用例如剃刀划伤植物或用针刺破植物或用研磨剂对植物擦磨以使待侵染的组织受伤。然后用农杆菌属在伤口处接种。然后将被接种的植物或植物的一部分在适宜的培养基中培养，使其发育成成熟的植物。
当构建植物细胞时，可根据公知的组织培养方法使这些细胞生长并保存下来，比如将细胞在适宜的含有氨基酸，植物激素，维生素等必需的生长因子的培养基中培养。
用已知的用于由细胞或组织培养物再生植物的方法可使转化的细胞再生成遗传修饰过的植物，例如，用一种抗生素选择出转化的芽并在含有适宜营养物，植物激素等的培养基中对其传代培养。
在丹麦的专利申请No.940662(1994年6月10日申请)和/或英国专利申请No.9702592.8(1997年2月7日申请)中可找到对植物转化的更进一步的有用的介绍。
更可以参考Spngstad等(1995年植物细胞组织器官培养40第1到15页)，因为这些作者对转基因植物的构建作了一般性的综述。
总之，本发明涉及一种具有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶活性的酶及编码这种酶的核苷酸序列。本发明还提供了可用该酶得到的修饰的糖类(优选的是淀粉)。
根据布达佩斯条约，于1996年3月7日将下面的样品保藏在位于23 St.Machar Drive，Aberdeen，苏格兰，英国，AB2 1RY的认可的保藏机构-国家工业及海洋细菌保藏有限公司(NCIMB)。
DH5α-pMAC3(它包含来自E.coli的含有mac基因的一个3.2kbEcoRI-Pst1片段)。
保藏号为NCIMB 40789。
相关的保藏质粒是pMAC3。
根据布达佩斯条约，于1996年3月7日将下面的样品保藏在位于23 St.Machar Drive，Aberdeen，苏格兰，英国，AB2 1RY的认可的保藏机构-国家工业及海洋细菌保藏有限公司(NCIMB)。
NF1830-pMAC5(含有E.coli的mac基因)。
保藏号为NCIMB 40790。
相关的保藏质粒是pMAC5。
因此本发明的一个更优选的方面涉及一种具有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶活性的酶，其中，所述酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或其变体，同系物，或其片段；并且所述酶是由可从保藏号NCIMB 40789或保藏号NCIMB 40790中得到的核苷酸序列所表达的。
因此，本发明的另一个更优选的方面涉及一种含有如SEQ ID No.2所示序列的核苷酸序列，或其变体，同系物，或其片段，或与其互补的序列；并且所述核苷酸序列可从保藏号NCIMB 40789或保藏号NCIMB40790中得到。
本发明还提供了用这一质粒可得到的一种修饰糖类(优选的是淀粉)。
现将本发明仅以举例的方式予以描述，其中参考下列附图

图1显示了相当于SEQ ID No.2的核苷酸序列；图2显示了相当于SEQ ID No.1的氨基酸序列；图3显示了含有相当于SEQ ID No.2序列的核苷酸序列；图4是pMAC1的质粒图谱；图5是pMAC2的质粒图谱；图6是pMAC3的质粒图谱；图7是pMAC5的质粒图谱；图8是pMAC8的质粒图谱；
图9是pMAC9的质粒图谱；并且图10是pMAC10的质粒图谱。
附图的一些详情如下图1相当于Seq ID No 2的核苷酸序列图2相当于Seq ID No 1的氨基酸序列183个氨基酸20076 MW图4质粒名称pMAC1质粒大小7.26kb说明来自λ151的一个4.3kb的EcoR1片段插入pBluscript IISK+的EcoR1位点中。
图5质粒名称pMAC2质粒大小7.26kb说明来自λ151(Kohara保藏中心)的一个4.3kb的EcoR1片段插入pBluscript II SK+的EcoR1位点中。
图6质粒名称pMAC3质粒大小7.26kb说明从pMAC2中去除1.1kb的Pst1片段。
图7质粒名称pMAC5质粒大小4060bp说明用下面的引物扩增E.coli mac基因#B411(有EcoRI位点的上游引物)CGG AAT TCC GCC ATG AAG ACA TAC CC#B412(有HindIII位点的下游引物)CAC AAG CTT ATT TTG CAT AAC AGT TGC用pMAC3作模板。
用EcoR1和HindIII消化704bp的PCR产物并插入到用相同的限制酶消化的pUHE21-2中。
图8质粒名称pMAC8质粒大小4935bp说明用下列引物并以pMAC3为模板扩增E.coli的mac基因#B478 CGG GAT CCG AGC ACA GAA AAA GAA AAG ATG(有BamHI位点的上游引物)#B479 AAC TGC AGA TTT TGC ATA ACA GTT GC(有PstI位点的下游引物)用BamHI和PstI消化PCR产物并插入到用同样的酶消化了的pBETP5中。
用引物#C028对SBE TP-mac融合物进行控制测序用引物#B456或#C027对35S中止子-mac融合物测序。
图9质粒名称pMAC9质粒大小9.37kb说明将来自pMAC8的2294bp的EcoRI片段(Patatin启动子-SBE TP-mac-35S终止子)插入到pVictor IV Man的EcoRI位点上。
图10质粒名称pMAC10质粒大小9.37kb说明将pMAC8的2294bp的EcoRI片段(Patatin启动子-SBETP-mac-35S终止子)插入到pVictor IV Man的EcoRI位点上。
来自E.coli的mac基因的克隆与测序首先根据Boos和Brand的指导(3)，从Kohara保藏中心的λ噬菌体8C4(151)的4.3kb EcoRI片段中分离出mac基因(4)。将该片段以两种取向插入到质粒pBluescriptII SK(+)的EcoRI位点从而生成质粒pMAC1和pMAC2(图4和图5)。当E.coli携带这些质粒时，麦芽糖乙酰转移酶的量大大增高，说明4.3kb EcoRI片段含有mac基因。
为了在4.3kb EcoRI片段上定位mac基因，从质粒pMAC2中去除1.1kb的EcoRI片段。该质粒构建体pMAC3(图6)也使有这种质粒的菌株的麦芽糖转乙酰酶表达量大大增高，因此证明mac基因存在于3.2kb的EcoRI-PstI片段上。
然后用A.L.F测序仪自动测序以确定插入pMAC3的3.2kbEcoRI-PstI的核苷酸序列。3137bp的DNA序列揭示了E.coli acrB基因的3’端的372bp区以及可能分别编码蛋白质的124，126和183个氨基酸的三个开放阅读框(图3)。
相应的，用含有pMAC3的E.coli小细胞做35S-甲硫氨酸标记试验，表明具有相当于这些分子量大小的蛋白质的合成。
由于E.coli麦芽糖转乙酰酶有一个估计分子量为20000的亚基(3)，预测编码分子量为20073蛋白的183个密码子(图2)是mac基因。
Mac酶在E.coli中的过量表达为了纯化Mac酶，在pUHE21-2中可被异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导的噬菌体T7-启动子之后插入mac基因，得到pMAC5(图7)。当向生长培养基中加入IPTG以诱导mac基因的表达时，发现获得了pMAC5的E.coliNF1830菌株培养物(MC1000，recA1，F’lacIq1Ztm5，由哥本哈根大学的Niels Fiil惠赠)中有大量的麦芽糖转乙酰酶。
生长条件在NF1830-pMAC5的A1L LB培养基物添加氨苄青霉素(100μg/ml)及卡那霉素(25μg/ml)，并在37℃下强力振动培养直到A600达到0.7。加入IPTG使最终浓度为2mM并继续培养4小时。离心(4000×g下10分钟)回收细胞并在200ml 0.9％的NaCl中重悬浮洗涤。然后将细胞沉淀物重悬浮于pH值为7.5并含有0.4mM PMSF，0.4mg/ml胃蛋白酶抑制剂以及1.6mM EDTA的250ml的20mM磷酸钾中。用Vibra Cell VC600及19mm的High Gain Horn以及充填器(均由Sonics and Materials有限公司提供，美国)将悬浮液用超声处理5×1分钟。在4℃下以90000×g离心60分钟使细胞匀浆澄清，然后用0.22μm的滤膜过滤。
重组Mac的纯化将所得的粗提取物以2ml/min的流速流经用20mM pH 7.5的磷酸钾(下文中称作“缓冲液A”)平衡的Q-Sepharose 26/10柱(Pharmacia生物技术公司)。用300ml缓冲液A洗涤该柱并用线性梯度浓度为0到3M NaCl的缓冲液A(300ml)洗脱附着蛋白。收集具有酶活性的馏分以1ml/min的低流速使其流经用缓冲液A平衡的8mlAffi-Gel Blue(Biorad)柱(16mm×26mm)。用50ml含有0.4M NaCl相同的缓冲液洗涤该柱。然后用含有2M NaCl的相同缓冲液洗脱该酶。在缓冲液A中将活性收集液透析过夜，并用Centriprep-30(Amico)浓缩到大约3ml。使馏分以0.3ml/min的低流速流经用缓冲液A平衡的6ml Acetyl-coA-Minileak柱。室温下在10ml pH 11的1M NaCO3中将200mg的Acetyl-coA和5g(干重)的Minileak High(Kem-En-Tek，丹麦)偶联20小时制备成吸附树脂。用20ml的缓冲液A洗涤该柱。然后倒置并用少于20ml的含有0.5M NaCl的缓冲液A洗脱纯化酶。
经三个层析步骤后，使纯化的麦芽糖乙酰转移酶变为均质。从1升培养基中我们能够获得5.8mg纯化Mac。回收率为29％并且该酶被纯化了80-倍。用SDS-PAGE和质谱分析法来确定酶的纯度。后一方法揭示分子量为19，982 Da。
酶浓度和活性的测定根据(5)的Mac的氨基酸组分的测定，以0.66为消先系数，用分光光度计法在280nm处确定纯Mac溶液的浓度。按照改进的Alpers的分析法(6)，用分光光度计分析Mac的乙酰转移酶的活性。使用Perkin Elmer生产的Lambda 18分光光度计。总体积为1ml的分析混合物含有50mM的磷酸钾，pH 7.5的2mM EDTA缓冲液，1M的麦芽糖100μl，0.4mM的乙酰-辅酶A 100μl，溶于甲醇的40mM的5，5’-二硫双(2-苯甲酸)(DTNB)10μl以及10μl的酶。通过加入酶或麦芽糖来起始反应并于25℃下在412nm处监测。将25℃下每分钟能提高一个吸光度的酶量定义为一个活性单位。为了计算乙酰辅酶A的消耗量，用13,600M-1×cm-1作为DTNB的消光系数。
对重组Mac的N-端测序用应用生物系统公司的476A蛋白质测序仪对纯Mac的N-末端测序。在装入测序仪前，用反向高效液相层析在C2柱(4.6/30)中将1纳摩尔的蛋白质脱盐。已将Mac的N-端序列测定到残基48并与mac基因(图1)的核苷酸序列完全一致。而且，在成熟蛋白上没有N-末端的甲硫氨酸残基(图2)。
用重组Mac生产多克隆抗体在6周中每隔2周用90μg被弗氏佐剂乳化(1∶1，体积比)的纯化蛋白给兔子予以皮下注射免疫，此后免疫间隔时间为4周。用免疫印迹检测Mac的抗血清并发现其具有高度的特异性。
重组Mac的性质鉴定及活性分布图经质谱研究表明Mac是一个三聚体。
在PhastGel IEF 4-6.5(Pharmacia)上通过等电聚焦测定Mac的等电点为5.7。
在含有100mM NaCl的50mM缓冲液中，麦芽糖浓度为100mM下，在pH为5和8.5之间研究Mac的pH值分布图。在这样的条件下，最佳pH值为7.7。
于25℃下在pH 3.0到10.0之间检测pH的稳定性。在pH为3.0时Mac马上失活，但在pH 4.0到10.0之间至少稳定6个小时。
pH为7.5时，在40℃和70℃之间研究Mac的热稳定性。在40℃和50℃下温浴4小时后，Mac的剩余活性分别为100％和75％。其在60℃和70℃下的半衰期分别为70分钟和22分钟。
按照“酶的浓度及活性的测定”中所述的方法，通过测量不同糖(在50和100mM的浓度下)的乙酰化初始速度来研究糖乙酰基受体底物中优选的Mac底物。结果如表1，2和3所示。在试验过的单糖中，葡萄糖是最佳底物，在试验过的二糖中，麦芽糖和异麦芽糖是最佳底物。
表1.以不同的单糖作为乙酰基受体时Mac的相对活性比较
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表2.以不同的二糖作为乙酰基受体时Mac的相对活性比较。
表3.以不同的寡聚麦芽糖作为乙酰基受体时Mac的相对活性比较。
动力学研究对Mac催化乙酰化反应的动力学研究表明受体底物的Km值在mM的范围而乙酰-辅酶A的Km值在μM的范围。因此，Mac对于乙酰-辅酶A的亲和性是对受体的亲和性的1000倍。
NMR研究用Mac得到葡萄糖和麦芽糖的乙酰化产物，并对产物的1H-NMR结构鉴定进行研究。
为了研究关于Mac受体底物乙酰化位点的底物区域特异性，我们通过将10mg葡萄糖或麦芽糖同E.coliMac和1mg乙酰-辅酶A在pH7.5的磷酸缓冲液中一起温浴48小时从而制备了毫克量的乙酰化葡萄糖和麦芽糖。在温浴的过程中另加入1mg等分试样的乙酰-辅酶A。通过薄层层析分离反应物并从层析谱中分离出乙酰化的葡萄糖和麦芽糖并冷冻干燥。用1H-NMR鉴定这些乙酰化糖的结构。葡萄糖仅在C6位置被乙酰化，麦芽糖的乙酰化位点在其非还原萄葡糖部分的C6位置。结果表明Mac乙酰化六糖的C6位点。
E.coli中的SBE-Mac融合体的活性由于下面描述的pMAC9和pMAC10中的SBE-Mac融合体的27个氨基酸的SBE部分会影响乙酰转移酶的活性，为了使融合酶在E.coli中过量表达并分析其活性，将SBE-Mac融合体插入到E.coli表达载体pAL781(Invitrogene，San Diego，美国)中。在SDS凝胶上比较大大过量表达的SBE-Mac融合体与纯化的野生型Mac酶，结果表明由于增加的27个氨基酸使融合体的迁移速度略有降低。而且，融合体保持了麦芽糖作为乙酰化底物的能力。因此，看起来E.coli中的融合酶是完整的并且具有完全的活性。所以，可以设想SBE-Mac融合酶在马铃薯中将是有活性的。
马铃薯淀粉的体内修饰在我们的另外的正在审查之中的专利申请PCT/EP96/03053，PCT/EP96/03052，PCT/EP94/01082中(每个申请的内容均被收作本文的参考文献)可以找到有关于马铃薯转化的一般性介绍。
对本研究而言，采用下述方法。
构建质粒以在马铃薯中表达E.coli mac基因。
用下面的引物并以pMAC3作为模板扩增E.coli mac基因5’-CGG GAT CCG AGC ACA GAA AAA GAA AAG ATG-3’(有BamHI位点的上游引物)和5’-AAC TGC AGA TTT TGC ATA ACA GTT GC-3’(有PstI位点的下游引物)。
用BamHI和PstI消化PCR产物并插入用同样的酶消化的pBETP5(见PCT专利申请No.WO94/24292，该申请的内容被收作本文的参考文献)中以得到pMAC8。这样，mac基因插入到了可提供块茎特异性表达-从patatin启动子开始并在CaMV 35S终止子处终止转录的表达盒中。而且，Mac酶同马铃薯淀粉分支酶N-端的102个氨基酸的融合，其中包括引导mac基因产物至马铃薯块茎造粉体的75个氨基酸的转运肽。在进入造粉体中时，切除75个氨基酸的转运肽，以得到具有来自成熟淀粉分支酶N-端的27个氨基酸的Mac融合蛋白。从pMAC8中分离出2294bp EcoRI表达盒并插入植物转化载体pVictorIV Man的EcoRI位点中(见PCT专利申请No.WO 94/24292和英国专利申请No.951443.8，每个专利申请的内容均被收作本文的参考文献)从而得到质粒pMAC9和pMAC10(分别为图9和图10)。
马铃薯小块茎的制备含有节(nodium)的片段-即从该节上部2mm到其下部5mm的片段-从体外生长的马铃薯植物或甘露糖选择根上切出的片段(关于甘露糖选择我们以前的专利申请WO 93/05163和/或WO 94/20627)上切下的。从所述节段上去除叶子后垂直放在含有MS培养基(Sigma)的琼脂平板上，该培养基添加每升60g的蔗糖和每升2mg的6-苄基-氨基嘌呤。在20℃下使所述节段以16小时的光照周期和8小时的黑暗周期生长7天。然后，用铝箔将平板包起来并置于20℃下的黑暗中。28天后收集小块茎并用蛋白质印迹分析以检测Mac的表达。
马铃薯小块茎中SBE-Mac融合物的表达通过蛋白质印迹分析用E.coli麦芽糖乙酰转移酶制备的抗体和E.coli mac基因的表达以检测被构建体pMAC9和pMAC10转化的马铃薯小块茎。分析结果清楚地证明了5个MAC9小块茎中的3个和7个MAC10小块茎中的5个明显有E.coli麦芽糖乙酰转移酶的表达。阳性小块茎表达了209个氨基酸的SBE-Mac融合物，该融合物同一个在E.coli中表达的相似构建体共迁移。这些结果表明最初同209个氨基酸的SBE-Mac融合体融合的75个氨基酸的SBE转运肽已从SBE-融合体中去除。而且，这意味着在造粉体细胞膜中的信号肽酶正确地对转运肽进行了处理，并且SBE-Mac融合体已经被引入造粉体中。
马铃薯块茎提取物的免疫印迹在冰中用20％的三氯乙酸将0.5ml马铃薯蛋白提取物沉淀30分钟。离心后回收蛋白质沉淀并在50μl SDS-PAGE样品缓冲液中重悬浮。然后向15％的聚丙烯酰胺凝胶中加入25μl。在电泳后通过半干印迹把蛋白质转移到Problot PVDF膜上。为了进行免疫检测，将Mac抗血清稀释为1∶2000，并把第二抗体同碱性磷酸酶偶合。
同上述的小块茎的蛋白质印迹分析相一致，转基因块茎的蛋白质印迹分析清楚地证明了209个氨基酸的SBE-Mac融合体在块茎中得到表达。
用马铃薯块茎分析Mac的活性选出可大小相当的马铃薯块茎并切成片，并用研钵和研杵或电动捣碎机使其在提取物缓冲液和Dower(1％，w/vol)中形成匀浆。每克马铃薯用5ml提取缓冲液(50mM磷酸钾pH7.5，2mM EDTA，0.5mMPMSF)。将混合物置于冰上30分钟并通过离心去除不溶物。用BCA试剂(Pierce)测定蛋白质浓度。
用如下方法测定Mac的活性，重复2次或3次在微量滴定板加样孔中混合0，50，100或200μl马铃薯提取物，1mM的乙酰-辅酶A10μl，1M的葡萄糖25μl以及试验缓冲液(50mM的磷酸钾，2mM的EDTA，pH 7.5)并使每个加样孔中的总体积为250μl。加入乙酰-辅酶A以起始反应。在室温下反应10分钟后，加入4mM的新制备的DTNB并立即测量A405值。给每一次测试准备两个加样孔，一个有葡萄糖一个没有。从含有葡萄糖的加样孔的吸光度中扣除不含葡萄糖加样孔的吸光度(背景吸光度)从而计算出活性。
9个转基因块茎中的8个可测定到相当高的Mac活性水平。一些块茎的Mac活性高于在未转化块茎中发现的几乎可忽略的活性15到20倍。
粘度研究用水悬浮液淀粉粘度测定仪Newport Scientific Rapid ViscoAnalyser对未转化的马铃薯和根据本发明转化的马铃薯的块茎中的淀粉样品进行分析。结果表明转化的马铃薯中的淀粉与未转化的马铃薯的淀粉的粘度测定图谱不同。
DSC研究用差分扫描比色法对未转化的马铃薯和本发明转化的马铃薯的块茎中的淀粉样品进行分析(用10％w/w的水淀粉悬浮液)。将样品以每分钟10℃的速度从20℃加热到100℃。所得结果表明转化的马铃薯淀粉与未转化的马铃薯淀粉具有不同的焓。我们也发现转化马铃薯的淀粉同未转化马铃薯的淀粉相比较，其凝胶化温度也有差别。
对本发明的其它的修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。参考文献1.Boos W.，Ferenci T.和Shuman H.A.1981.细菌学杂志146，725-732。
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GACGCTTGAT60GCGGTGCGGA TGCGTTTACG TCCGATCCTG ATGACCTCGC TGGCGTTTAT CCTCGGCGTT 120ATGCCGCTGG TTATCAGTAC TGGTGCTGGT TCCGGCGCGC AGAACGCAGT AGGTACCGGT 180GTAATGGGCG GGATGGTGAC CGCAACGGTA CTGGCAATCT TCTTCGTTCC GGTATTCTTT 240GTGGTGGTTC GCCGCCGCTT TAGCCGCAAG AATGAAGATA TCGAGCACAG CCATACTGTC 300GATCATCATT GATACAACGT GTAATCACTA AGGCCGCGTA AGCGGCCTTT TTTATGCATA 360ACCTACGAAC ATTAAGGAGT AATTGAACCA CCAACTCAGG ATCTCATACG AAAACCAGTA 420TTAACCACGG ATAAAATTCA TAAAAAATAC TGATTGTTAG TTAATTTATA TTAAGTAGCG 480CTAATAGATT TAATAATCCA TAATCATTTA GAGGCTATTC TTAATTATTT GCGGTAATTC 540TTTATTCATT CCTCGGTTAT TACGTCATAT TCAGAGCAAT CCTGGTATTA GTGTCACCAA 600TTTCATCTGG CGATAATCCT GAAATGTTAT GAATAGTTCG AGCAAACTGC TTTTACCTGC 660TGCGGGTTAG TGCTAGTATG AAAAAGTGAG TCCTGTCCCG CTTCCTTCCT AATTGTAATT 720TTTCGTAATA ATGCGATGAA AACCTGCAAA GAGTGGCTTA TAGTTAAGCT AACAAACGAG 780AGGGCAAGTC CAGGTCAGTA AGTTTTTTCC ATCCCGAAAG GTGTCCGTTA GTTCAACCGC 840TAAGAAGGGG ACGCGTTATG GATGAATACT CACCCAAAAG ACATGATATC GCACAGCTTA 900AGTTTCTCTG TGAAACCCTG TATCATGACT GCCTTGCAAA CCTTGAAGAA AGCAATCATG 960GCTGGGTAAA CGACCCAACC TCGGCGATCA ACCTCCAGTT GAATGAACTG ATTGAGCATA 1020TTGCGACCTT CGCACTTAAT TACAAAATTA AGTATAATGA AGACAATAAG CTCATTGAGC 1080AGATCGACGA ATATCTGGAT GACACCTTTA TGTTGTTCAG TAGTTATGGT ATTAATATGC 1140AGGATCTTCA GAAATGGCGG AAGTCAGGTA AHCGACTATH CCGTTGTTTT GTCAATGCGA 1200CGAAAGAGAA TCCTGCGAGT TTATCTTGTT AGAATTATTA CAACCATAGG TAGAAGTATG 1260TCCGAAAAAC CTTTAACGAA AACCGATTAT TTAATGCGTT TACGTCGTTG CCAGACAATT 1320GACACGCTGG AGCGGTTTAW TCGAGAAAAA TAAATACGAA TTATCAGATA ATGAACTGGC 1380GGTATTTTAC TCAGCCGCAG ATCACCGCCT CGCCGAATTG ACCATGAATA AACTGTACGA 1440CAAGATCCCT TCCTCAGTAT GGAAATTTAT TCGCTAATAA ATAATTCGCT TTCGGAGCTA 1500TAACCGGCTG TTTATTAAGA ATTTTATACT TTTTCGCCAT GAAGACATAC CCTATGTGAT 1560CTTTATCACA CAGATGTAAT GGGAACGTTC TCTTCACTGA CTTTTCGTCT TACTGTGTTG 1620CCGCATTTTC AGCAACCGGA GTCAGTAATG AGCACAGAAA AAGAAAAGAT GATTGCTGGT 1680GAGTTGTATC GCTCGGCAGA TGAGACGTTA TCTCGCGATC GCCTGCGCGC TCGTCAGCTT 1740ATTCACCGAT ACAATCATTC CCTGGCGGAA GAGCACACAT TACGCCAGCA AATTCTCGCT 1800GATCTATTCG GTCAGGTGAC AGAGGCTTAT ATTGAGCCAA CGTTTCGCTG TGACTATGGC 1860TATAACATTT TTCTCGGTAA TAATTTTTTC GCCAACTTCG ATTGCGTGAT GCTTGATGTC 1920TGCCCTATTC GCATCGGTGA TAACTGTATG TTGGCACCAG GCGTTCATAT CTACACGGCA 1980ACACATCCCA TCGACCCTGT AGCACGTAAT AGCGGTGCTG AACTGGGGAA ACCCGTCACC 2040ATCGGTAATA ACGTCTGGAT TGGCGGACGC GCGGTCATTA ACCCTGGTGT GACCATTGGT 2100GATAACGTCG TGGTAGCCTC AGGTGCAGTT GTCACAAAAG ATGTCCCGGA CAACGTTGTC 2160GTGGGCGGTA ATCCAGCCAG AATAATTAAA AAATTGTAAT CGGTTTTTCG CAACTGTTAT 2220GCAAAATTGT GGTAGATCTG TTACTTCCCC TCTACTATTC CCACGTTAAA ATAGGGTGTT 2280CCCTGGAAAG TTGCAGATAC CACGAAGGCA AACGATGACC GAAATACAAC GCCTGCTGAC 2340CGAAACGATT GAGTCTCTGA ATACCCGCGA AAAACGCGAC AACAAACCCC GCTTTAGTAT 2400CAGTTTTATC CGTAAACATC CGGGGCTGTT TATCGGTATG TACGTTGCTT TTTTTGCCAC2460CCTGGCGGTG ATGTTGCAGT CCGAAACGCT GTCAGGCTCT GTCTGGCTAC TGGTTGTATT2520ATTTATCCTG CTTAATGGTT TCTTCTTTTT CGATGTCTAC CCACGCTACC GCTATGAAGA2580TATCGACGTG CTGGATTTCC GCGTTTGCTA TAACGGCGAA TGGTACAACA CGCGCTTTGT2640ACCTGCCGCG CTGGTTGAAG CCATCTTGAA CTCTCCGTGT CGCGGATGTT CATAAGGAAC2700AACTGCAAAA AATGATCGTC CGTAAAGGTG AACTGTCTTT TTACGATATT TTTACCCTCS2760TCGCGCCGAA TCAACATCTT AAGTTAGGGT TACATACCAG GCGTAAAGCT CTGCGCCTGG2820TCAAATGACA ATGATCGTTT CCACCCATCA CTTCATGAAA TACCAGCTCT ACCTCCTTAT2880CTCCAGCCAG CCTTTTTCCA CAATCAGATA TACTTTCCCT ACACTGTGTT AATAAGGATA2940TGCTGGTGAG AACACGACAT CTGGTCGGCC TTATTTCGGG AGTACTGATT CTTTCAGTAT3000TGCTGCCTGT CGGCTTAAGC ATCTGGCTGG CCCATCAGCA GGTAGAAACA TCGTTTATTG3060AAGAGCTGGA TACCTATTCC TCCCGCGTCG CTATTCGAGC CAATAAGGTG GCGACACAAG3120GGAAAGATGC GCTGCAG 3137SEQUENCE ID NO.4pMAC3中的3.2kb EcoRI-Pst片段的全长核苷酸序列。在mac基因编码序列下也给出了由其编码的Mac酶的氨基酸序列。GAATTCGCCAAAGACTTGATGGATAAAGAAGGTAAAGGTCTGATTGAAGCGACGCTTGAT 60GCGGTGCGGATGCGTTTACGTCCGATCCTGATGACCTCGCTGGCGTTTATCCTCGGCGTT 120ATGCCGCTGGTTATCAGTACTGGTGCTGGTTCCGGCGCGCAGAACGCAGTAGGTACCGGT 180GTAATGGGCGGGATGGTGACCGCAACGGTACTGGCAATCTTCTTCGTTCCGGTATTCTTT 240GTGGTGGTTCGCCGCCGCTTTAGCCGCAAGAATGAAGATATCGAGCACAGCCATACTGTC 300GATCATCATTGATACAACGTGTAATCACTAAGGCCGCGTAAGCGGCCTTTTTTATGCATA 360ACCTACGAACATTAAGGAGTAATTGAACCACCAACTCAGGATCTCATACGAAAACCAGTA 420TTAACCACGGATAAAATTCATAAAAAATACTGATTGTTAGTTAATTTATATTAAGTAGCG 480CTAATAGATTTAATAATCCATAATCATTTAGAGGCTATTCTTAATTATTTGCGGTAATTC 540TTTATTCATTCCTCGGTTATTACGTCATATTCAGAGCAATCCTGGTATTAGTGTCACCAA 600TTTCATCTGGCGATAATCCTGAAATGTTATGAATAGTTCGAGCAAACTGCTTTTACCTGC 660TGCGGGTTAGTGCTAGTATGAAAAAGTGAGTCCTGTCCCGCTTCCTTCCTAATTGTAATT 720TTTCGTAATAATGCGATGAAAACCTGCAAAGAGTGGCTTATAGTTAAGCTAACAAACGAG 780AGGGCAAGTCCAGGTCAGTAAGTTTTTTCCATCCCGAAAGGTGTCCGTTAGTTCAACCGC 840TAAGAAGGGGACGCGTTATGGATGAATACTCACCCAAAAGACATGATATCGCACAGCTTA 900AGTTTCTCTGTGAAACCCTGTATCATGACTGCCTTGCAAACCTTGAAGAAAGCAATCATG 960GCTGGGTAAACGACCCAACCTCGGCGATCAACCTCCAGTTGAATGAACTGATTGAGCATA1020TTGCGACCTTCGCACTTAATTACAAAATTAAGTATAATGAAGACAATAAGCTCATTGAGC1080AGATCGACGAATATCTGGATGACACCTTTATGTTGTTCAGTAGTTATGGTATTAATATGC1140AGGATCTTCAGAAATGGCGGAAGTCAGGTAAHCGACTATHCCGTTGTTTTGTCAATGCGA1200CGAAAGAGAATCCTGCGAGTTTATCTTGTTAGAATTATTACAACCATAGGTAGAAGTATG1260TCCGAAAAACCTTTAACGAAAACCGATTATTTAATGCGTTTACGTCGTTGCCAGACAATT1320GACACGCTGGAGCGGTTTAWTCGAGAAAAATAAATACGAATTATCAGATAATGAACTGGC1380GGTATTTTACTCAGCCGCAGATCACCGCCTCGCCGAATTGACCATGAATAAACTGTACGA1440CAAGATCCCTTCCTCAGTATGGAAATTTATTCGCTAATAAATAATTCGCTTTCGGAGCTA1500TAACCGGCTGTTTATTAAGAATTTTATACTTTTTCGCCATGAAGACATACCCTATGTGAT1560CTTTATCACACAGATGTAATGGGAACGTTCTCTTCACTGACTTTTCGTCTTACTGTGTTG 1620CCGCATTTTCAGCAACCGGAGTCAGTAATGAGCACAGAAAAAGAAAAGATGATTGCTGGT 1680M S T E K E K M I A GGAGTTGTATCGCTCGGCAGATGAGACGTTATCTCGCGATCGCCTGCGCGCTCGTCAGCTT 1740E L Y R S A D E T L S R D R L R A R Q LATTCACCGATACAATCATTCCCTGGCGGAAGAGCACACATTACGCCAGCAAATTCTCGCT 1800I H R Y N H S L A E E H T L R Q Q I L AGATCTATTCGGTCAGGTGACAGAGGCTTATATTGAGCCAACGTTTCGCTGTGACTATGGC 1860D L F G Q V T E A Y I E P T F R C D Y GTATAACATTTTTCTCGGTAATAATTTTTTCGCCAACTTCGATTGCGTGATGCTTGATGTC 1920Y N I F L G N N F F A N F D C V M L D VTGCCCTATTCGCATCGGTGATAACTGTATGTTGGCACCAGGCGTTCATATCTACACGGCA 1980C P I R I G D N C M L A P G V H I Y T AACACATCCCATCGACCCTGTAGCACGTAATAGCGGTGCTGAACTGGGGAAACCCGTCACC 2040T H P I D P V A R N S G A E L G K P V TATCGGTAATAACGTCTGGATTGGCGGACGCGCGGTCATTAACCCTGGTGTGACCATTGGT 2100I G N N V W I G G R A V I N P G V T I GGATAACGTCGTGGTAGCCTCAGGTGCAGTTGTCACAAAAGATGTCCCGGACAACGTTGTC 2160D N V V V A S G A V V T K D V P D N V VGTGGGCGGTAATCCAGCCAGAATAATTAAAAAATTGTAATCGGTTTTTCGCAACTGTTAT 2220V G G N P A R I I K K LGCAAAATTGTGGTAGATCTGTTACTTCCCCTCTACTATTCCCACGTTAAAATAGGGTGTT 2280CCCTGGAAAGTTGCAGATACCACGAAGGCAAACGATGACCGAAATACAACGCCTGCTGAC 2340CGAAACGATTGAGTCTCTGAATACCCGCGAAAAACGCGACAACAAACCCCGCTTTAGTAT 2400CAGTTTTATCCGTAAACATCCGGGGCTGTTTATCGGTATGTACGTTGCTTTTTTTGCCAC 2460CCTGGCGGTGATGTTGCAGTCCGAAACGCTGTCAGGCTCTGTCTGGCTACTGGTTGTATT 2520ATTTATCCTGCTTAATGGTTTCTTCTTTTTCGATGTCTACCCACGCTACCGCTATGAAGA 2580TATCGACGTGCTGGATTTCCGCGTTTGCTATAACGGCGAATGGTACAACACGCGCTTTGT 2640ACCTGCCGCGCTGGTTGAAGCCATCTTGAACTCTCCGTGTCGCGGATGTTCATAAGGAAC 2700AACTGCAAAAAATGATCGTCCGTAAAGGTGAACTGTCTTTTTACGATATTTTTACCCTCS 2760TCGCGCCGAATCAACATCTTAAGTTAGGGTTACATACCAGGCGTAAAGCTCTGCGCCTGG 2820TCAAATGACAATGATCGTTTCCACCCATCACTTCATGAAATACCAGCTCTACCTCCTTAT 2880CTCCAGCCAGCCTTTTTCCACAATCAGATATACTTTCCCTACACTGTGTTAATAAGGATA 2940TGCTGGTGAGAACACGACATCTGGTCGGCCTTATTTCGGGAGTACTGATTCTTTCAGTAT 3000TGCTGCCTGTCGGCTTAAGCATCTGGCTGGCCCATCAGCAGGTAGAAACATCGTTTATTG 3060AAGAGCTGGATACCTATTCCTCCCGCGTCGCTATTCGAGCCAATAAGGTGGCGACACAAG 3120GGAAAGATGCGCTGCAG 313权利要求
1.一种具有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶活性的酶，其中所述酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或其变体，同系物或片段。
2.一种具有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶活性的重组酶，其中，所述酶含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或其变异体，同系物或片段。
3.一种具有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶活性的重组酶，其中，所述酶具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
4.一种具有α(1，4)葡聚糖乙酰-转移酶活性的重组酶，其中，所述重组酶可同用根据权利要求3所述的纯化的重组酶制备的抗体发生免疫反应。
5.一种编码如权利要求1到4中任一项所述的酶的核苷酸序列或与其互补的序列。
6.一种根据权利要求5所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列是一个DNA序列。
7.一种核苷酸序列，含有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列或其变异体，同系物或片段或与其互补的序列。
8.一种具有如SEQ ID No.2所示序列的核苷酸序列。
9.一种含有或表达本发明权利要求1到8的任何一个的构建体。
10.一种含有或表达本发明权利要求1到9的任何一个的载体。
11.一种含有或表达本发明权利要求1到10的任何一个的质粒。
12.一种含有或表达本发明权利要求1到11的任何一个的转基因生物。
13.一种根据权利要求12所述的转基因生物，其中所述转基因生物是一种植物。
14.一种制备修饰糖类(优选的是淀粉)的方法，所述方法包括或表达或使用根据本发明权利要求1到13中的任何之一。
15.一种实质上如本文所描述的酶。
全文摘要
本发明公开了一种酶。该酶具有α(1,4)葡聚糖乙酰－转移酶活性。
文档编号C12N15/09GK1259997SQ97194352
公开日2000年7月12日 申请日期1997年3月7日 优先权日1996年3月13日
发明者F·达尔德甘, P·鲍尔森, J·马库森, S·奥克森波尔·索伦森 申请人:丹尼斯科有限公司