植物糖传感蛋白及其用途的制作方法

专利名称：植物糖传感蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
本发明背景本申请涉及植物糖代谢；具体地讲，涉及转导糖传感信号的酶，其编码基因及其用途。
糖被认为是调节分子，它能控制生理学、代谢、细胞周期、发育和基因表达。在高等植物的生命周期中，从萌芽至开花至衰老，糖都影响着生长和发育。近来，已认识到糖是能够抑制或激活植物基因的生理信号，该信号涉及很多重要过程，包括光合作用、乙醛酸循环、呼吸、淀粉和蔗糖合成和降解、氮代谢和贮存、防御病原体、创伤响应、细胞周期渐进、色素形成和衰老(Sheen，光合作用研究39,427(1994)；Thomas和Rodriguez，植物生理学106,1235(1994)；Knight和Gray分子基因遗传学242,586(1994)；Lam等人，植物生理学106,1347(1994)；Chen等，植物杂志6,625(1994)；Reynolds和Smith，植物分子生物学29,885(1995)；Herbers等，植物分子生物学29,1027(1995)；Mita等，植物生理学107,895(1995))。对多种植物物种所做的研究还表明，糖的体内稳态似乎是受严格调控的。升高的糖浓度会导致生长障碍，光合作用减弱，叶片卷曲，缺氯症，坏死的叶片和花青苷积累(Casper等，植物生理学79,11(1985)；Von Schaewen等，EMBO J.9,3033(1990)；Dickinson等，Plant Physiol.95,420(1991)；Tsukaya等，植物生理学97,1414(1991)；Sonnewald等，植物杂志1,95(1991)；Huberet和Hanson，植物生理学99,1449(1992)；Sonnewald等，在转基因烟草植物中对糖积累的植物反应，pp.246-257，见M.A.Madore,W.J.Lucas(著)，植物中的碳分配及源库相互作用，美国植物生理学家协会，Rockville,M D,(1995))。另外，已有人提出诸如CO2浓度升高的环境因素和诸如不同转化酶含量的内在的遗传变异可以通过糖调节来影响光合能力(Stitt，植物细胞环境14,741(1991)；Stitt等，植物183,40(1991)；Van Oosten等，植物细胞环境17,913(1994)；Nie等，植物生理学108,975(1995)；Goldschmidt和Huber，植物生理学99,1443(1992))。
本发明概述通过操纵植物己糖激酶蛋白(HXK)的表达，我们发现该蛋白是一种传感蛋白，它可以在植物中介导多种糖响应。具体地讲，我们已通过基因工程方法生产出转基因植物，这种植物或是(a)由于一种反义己糖激酶基因的表达而表达较低水平的己糖激酶蛋白，并因此表现出对糖较低的敏感性；或(b)表达较高水平的己糖激酶蛋白，并因此表现出对糖较高的敏感性。我们的发现已拓宽了操作农作物的含义，用于提高作物的产量和品质并降低生产成本。
一般，本发明的特征是一种用于降低转基因植物细胞中植物己糖激酶蛋白含量的方法，该方法包括在所述转基因植物细胞(例如，源于单子叶植物、双子叶植物或裸子植物的细胞)中表达一种反义己糖激酶核酸序列。由此产生对糖(例如，葡萄糖、蔗糖、果糖或甘露糖)不太敏感的转基因植物。
在优选实施方案中，所述反义己糖激酶核酸序列是由整合到所述转基因植物细胞基因组中的转基因编码的；该反义己糖激酶核酸序列包括一个植物反义己糖激酶DNA序列(例如基于

图1F的AtHXK1核苷酸序列(SEQ ID NO:3)或图1G的AtHXK2核苷酸序列(SEQ IDNO:4)的序列)；而且，所述方法还包括培养源于所述转基因植物细胞的转基因植物，从而降低所述转基因植物中己糖激酶蛋白的含量。
在相关方面，本发明的特征还在于能表达一种反义己糖激酶核酸序列的植物细胞(例如，源于单子叶植物、双子叶植物或裸子植物的植物细胞)；以及一种包括一种反义己糖激酶核酸序列的植物表达载体，其中，所述序列可操作地连接于一个表达控制区上。
在另一方面，本发明的特征还在于一种用于提高转基因植物细胞中己糖激酶蛋白含量的方法，该方法包括在所述转基因植物细胞中表达己糖激酶核酸序列。在优选实施方案中，所述己糖激酶核酸序列源于一种植物(例如，与图1F的AtHXK1核苷酸序列(SEQ ID NO:3)相同的DNA序列，或大体上与图1G的AtHXK2核酸序列(SEQ IDNO:4)相同的DNA序列)。该方法能产生具有增强的对糖的敏感性的转基因植物。
在相关方面，本发明的特征在于一种大体上纯的植物HXK多肽，该多肽包括一个大体上与AtHXK1(SEQ ID NO:1)或AtHXK2(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在以上两方面的优选实施方案中，所述HXK多肽获自一种植物，所述植物包括，但不限于单子叶植物(例如，稻、玉米、小麦或大麦)、双子叶植物(例如，茄科的一员(例如，马铃薯)或十字花科的一员(例如，拟南芥属、花基甘蓝、甘蓝、抱子甘蓝、油菜、羽衣甘蓝、芥蓝、花椰菜或辣根))，以及裸子植物。
在又一个相关方面，本发明的特征在于编码一种植物HXK多肽的大体上纯的DNA，所述多肽包括大体上与AtHXK1(SEQ ID NO:1)或AtHXK2(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在优选实施方案中，所述DNA包括图1F所示的核苷酸序列(SEQ IDNO:3)或者包括大体上与图1G所示的序列(SEQ ID NO:4)相同的核苷酸序列。上述DNA可获自任意的植物，包括，但不限于单子叶植物(例如，稻、玉米、小麦和大麦)、双子叶植物(例如，茄科的一员(例如，马铃薯)或十字花科的一员(例如，拟南芥属、花基甘蓝、甘蓝、抱子甘蓝、油菜、羽衣甘蓝、芥蓝、花椰菜或辣根)，以及裸子植物。在其它优选实施方案中，本发明的DNA可操作地连接于一个组成型或调节型启动子上。
在又一个相关方面，本发明的特征是一种载体，该载体包括本发明大体上纯的DNAs中的任意一种，该载体能指导由含有载体的细胞中的DNA编码的蛋白的表达；一种细胞，例如含有本发明的任意一种DNA的原核细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)细胞)或真核细胞(例如，植物细胞)；以及一种转基因植物(或者源自上述转基因植物的细胞或种子)，其含有整合到该植物基因组中的本发明DNAs中的任一种，其中，所述DNA在该转基因植物中表达。
在各种优选实施方案中，所述植物细胞含有沿有义取向的所述DNA，并对糖具有较高的敏感性；所述植物细胞含有沿反义取向的DNA，而且对糖不太敏感；所述DNA的表达在一种组成型启动子或调节型启动子的控制之下。
在另外两个方面，本发明的特征在于一种生产植物HXK多肽的方法，该方法包括(a)提供一种用编码一种多肽的基因转化的细胞，所述多肽或包括一个大体上与AtHXK1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列或一种大体上与AtHXK2的氨基酸序列(SEQID NO:2)相同的氨基酸序列，该基因的位置适合于在该细胞中表达；(b)表达所述植物HXK多肽；和(c)回收所述植物HXK多肽。
所述“己糖激酶”或“HXK”是指一种多肽，它能催化依赖于ATP的己糖向己糖-6-磷酸的转化。用于测定上述酶促活性的方法在本领域中是公知的，例如，在本文中所描述的由Renz和Stitt提出的方法(植物190,166(1993))。
“降低植物己糖激酶蛋白含量”一句是指相对对照植物(例如，野生型植物)中的含量而言，植物己糖激酶蛋白的含量至少降低30-50％，优选降低50-80％，更优选降低80-95％。己糖激酶蛋白含量的降低可以通过一种反义植物己糖激酶核苷酸序列在转基因植物中的表达而实现。植物己糖激酶蛋白含量可以用任何标准方法监测，包括但不限于免疫印迹(例如，由本文所描述的)。另外，植物己糖激酶蛋白的含量可以通过标准的己糖磷酸化测定来定量(例如，由本文所描述的)。
“提高植物己糖激酶蛋白含量”一句是指相对对照植物(例如，野生型植物)中的含量而言，植物己糖激酶蛋白的含量至少提高50％，优选提高100％，更优选提高200％以上。植物己糖激酶蛋白的含量可以用任何标准方法监测，包括但不限于免疫印迹(例如，由本文所描述的)。另外，植物己糖激酶蛋白的含量可以通过标准的己糖磷酸化测定来定量(例如，由本文所描述的)。
“反义己糖激酶序列”是指互补于植物己糖激酶信使RNA的核苷酸序列。一般，这样的反义序列长度通常至少有15个核苷酸，优选大约15-200个核苷酸，更优选200-2,000个核苷酸。所述反义序列可以互补于所述植物己糖激酶mRNA核苷酸序列的全部或一部分(例如，本文所描述的AtHXK1和AtHXK2反义构建体，而且正如本领域技术人员所了解的，所述反义序列的具体结合位点以及该反义序列的长度可以改变，这种变化取决于所期望的抑制程度以及所述反义序列的唯一性。一种表达植物己糖激酶反义核苷酸序列的转录构建体沿其转录方向包括一个启动子，在有义链上编码所述反义RNA的序列，以及一个转录终止区。可以用本文所述的方法或公知的方法构建并表达反义HXK序列，例如，所述公知方法可参见Van der Krol等，基因72,45(1988)；Rodermel等，细胞55,673(1988)；Mol等，FEBS通讯268,427(1990)；Weigel和Nilsson，自然377,495(1995)；Cheung等，细胞82,383(1995)；和美国专利US5,107,065。
“对糖不太敏感”是指通常由内部或外部糖浓度调节或控制的发育、生理学或分子过程表现出对糖(例如，葡萄糖、果糖、甘露糖或蔗糖)的存在的反应有所减弱。例如，一种对糖具有减弱的敏感性的植物能够激活正常情况下因糖的存在而受到抑制的一类基因(例如，光合基因)，或者这种植物能够在即使有在其它场合下会妨碍或抑制其发育的糖浓度的情况下通过其正常发育途径进行发育。对植物的对糖的敏感性的分析是用多种生物测定实现的(例如，在本文中所描述的)。这些测定包括，但不限于评价并监测基因表达，种子萌发，子叶发育(例如，子叶伸长)、子叶变绿、叶的发育、胚根发育、下胚轴伸长、花青苷积累、淀粉积累，以及开花所需要的时间。通过比较野生型植物和候选植物(例如，能表达反义己糖激酶基因的植物)的表型，人们能很容易地测定所述候选转基因植物是否具有减弱的对糖的敏感性。例如，业已发现糖能抑制光合基因(例如，核酮糖二磷酸羧化酶小亚基和集光叶绿素a/b结合蛋白)和非光合基因(例如，α-淀粉酶，蔗糖合酶，苹果酸合酶和天冬酰胺合酶)的表达。因此，在对糖不太敏感的植物中，上述可被糖抑制的基因具有降低的、减弱的或减轻程度的由糖介导的抑制。
“增强的敏感性”是指通常由内部或外部糖浓度调节或控制的发育、生理学或分子过程对糖(例如，葡萄糖、果糖、甘露糖或蔗糖)的存在表现出增强了的或提高了的反应。例如，对糖具有增强的敏感性的植物能够提高、加强或促进正常情况下由糖的存在而被激活的一类基因(例如，营养贮存蛋白)的活化。植物对糖的敏感性的分析是用多种生物测定方法实现的。这些测定包括，但不限于评价并监测基因表达、种子萌发、子叶发育(例如，子叶伸长)、子叶变绿、叶的发育、胚根发育、下胚轴伸长、花青苷积累、淀粉积累，以及开花所需要的时间。通过比较野生型植物和候选植物(例如，能表达至少一个额外的己糖激酶基因拷贝的植物)的表型，人们可以很方便地测定上述候选转基因植物是否对糖具有增强的敏感性。例如，业已发现糖能激活诸如硝酸盐还原酶、β-淀粉酶、蔗糖合酶和马铃薯贮存蛋白的基因的表达。因此，在对糖具有增强的敏感性的植物中，上述糖诱导型基因具有增强的、提高的或升高的糖介导的表达水平。
“多肽”或“蛋白”是指任意的氨基酸链，不论其长度或翻译后修饰的情况(例如，糖基化或磷酸化)。
“大体上与AtHXK1相同”是指这样一种植物己糖激酶多肽，该多肽包括一个N-末端，该N-末端与AtHXK1的N-末端(图1B的1-61号氨基酸；SEQ ID NO:1)的同一性至少为50％，优选75％，更优选85-90％，最优选95％。比较的长度通常至少为15个氨基酸，优选至少30个氨基酸，更优选至少40个氨基酸，最优选60个氨基酸。
“大体上与AtHXK2相同”是指一种植物己糖激酶多肽或核酸的序列，所述序列与AtHXK2的氨基酸或核酸序列(图1B和1G；SEQ IDNO:2和4)的同一性至少为86％，优选90％，更优选95％，最优选99％。
序列同一性通常是用序列分析软件(例如，遗传学微机小组(威斯康星大学生物技术中心，1710大学大道，麦迪逊，WI 53705)的序列分析软件包，BLAST，或PILEUP/PRETTYBOX程序)来测量的。上述软件通过确认与各种取代、缺失、取代及其它修饰的同源性程度将类似的序列配对。保守的取代通常包括发生在以下各组内的取代甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“大体上纯的多肽”是指一种已和与之天然相随的成分分离的植物己糖激酶多肽(例如，AtHXK1或AtHXK2)。通常，当按重量计所述多肽至少有60％不含所述蛋白和与之天然结合的天然存在的有机分子时，则该多肽是大体上纯的。理想的是，所述制剂至少含有75％、更优选至少90％、最优选至少99％重量百分比的植物己糖激酶多肽。例如，大体上纯的植物己糖激酶多肽可以通过从天然来源(如植物细胞)中提取而获得；通过表达编码一种植物己糖激酶多肽的重组核酸而获得；或通过化学合成所述蛋白而获得。纯度可以用任何适当的方法测定，例如，柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或HPLC分析。
“大体上纯的DNA”是指这样的DNA该DNA不含在产生本发明DNA的生物的天然存在的基因组中位于该基因旁侧的基因。因此，举例来说，该术语包括掺入到一种载体上的重组DNA；掺入到自主复制的质粒或病毒上的重组DNA；或掺入到原核生物或真核生物的基因组DNA上的重组DNA；或是作为独立于其它序列的独立分子(例如，由PCR或限制性内切酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)而存在的重组DNA。该术语还包括一种重组DNA，该DNA是编码其它多肽序列的杂合基因的部分。
“转化的细胞”是指一种通过重组DNA技术将编码一种HXK多肽(例如，AtHXK1或AtHXK2)的DNA分子(如在本发明中所使用的)导入其中(或导入其祖先中)的细胞。
“定位于适于表达的位置”是指所述DNA分子位于接近一种DNA序列处，该DNA序列可指导所述序列的转录与翻译(即例如促进诸如AtHXK1或AtHXK2的植物己糖激酶多肽、重组蛋白或RNA分子的产生)。
“启动子”是指足以指导转录的最小序列。在本发明中，包括足以使启动子依赖型基因表达对于细胞、组织或器官特异性的基因表达来说是可以控制的启动子元件，或者可由外部信号或试剂诱导的元件(例如，光、病原体、创伤或激素诱导型元件)；上述元件可位于天然基因的5′或3′区。
“可操作地连接”是指一个基因和一个调节序列以这种方式连接，以便当合适的分子(例如，转录激活蛋白)与所述调节序列结合时所述基因能够表达。
“植物细胞”是指任意的由半透膜包围并含有质体的自主繁殖的细胞。如果需要进一步的繁殖的话，该细胞还需要一个细胞壁。本文所使用的植物细胞包括，但不限于藻类、蓝细菌、种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、茎、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“转基因”是指任意的通过人工方法插入细胞并成为由该细胞发育的生物的基因组的部分的DNA片段。所述转基因可以包括对转基因生物而言部分或全部异源(即外源)的基因，或者可以表示与该生物的内源基因同源的基因。
“转基因的”是指任意的包括一种DNA序列的细胞，该序列是通过人工方法插入细胞中，并成为由该细胞发育的生物的基因组的部分。在本文中，转基因生物一般是指转基因植物，而所述DNA(转基因)是通过人工方法插入其核或质体的基因组中的。
通过以下优选实施方案的说明及权利要求书，可以了解本发明的其它特征和优点。
详细说明首先对附图进行说明。附1A-E是表示拟南芥(Arabidopsis thaliana)HXK基因的分子特征的各个方面的示意图。图1A表示用一种带有拟南芥HXK同系物AtHXK1和AtHXK2的酵母hxk1/hxk2双突变株(命名为DBY2219)获得的功能互补HXK催化活性。所示出的pFL61作为用于上述互补研究的对照载体。图1B是表示拟南芥己糖激酶AtHXK1(SEQ ID NO:1)；拟南芥己糖激酶AtHXK2(SEQ ID NO:2)、人GLK(SEQID NO:5)、大鼠GLK(SEQ ID NO:6)、酿酒酵母HXK1(酵母1)(SEQ ID NO:7)、酿酒酵母HXK2(酵母2)(SEQ IDNO:8)和乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)RAG5(酵母3)(序列9)的氨基酸序列比较的示意图。有下划线的区域1和2表示保守的磷酸1区和2区；有下划线的阴影区表示腺苷相互作用区。有下划线的带星号的氨基酸表示保守的糖结合域。序列分析是用设定为标准参数的PILEUP/PRETTYBOX程序完成的。相同与相似的残基分别是指加框的部分和突出的部分。图1C是表示AtHXK1和AtHXK2分别在拟南芥属的Ⅳ号和Ⅱ号染色体上的图位的示意图。图1D为表示AtHXK是由多基因家族编码的DNA印迹分析的照片。将该印迹与AtHXK1(命名为AtHXK1，示于左侧)或AtHXK(命名为AtHXK2，示于右侧)的全长cDNA探针杂交。在该印迹左侧所标出的数字是指以千碱基计的分子大小标记。图1E是拟南芥基因组DNA的DNA印迹分析的照片，该基因组DNA用Hind Ⅲ消化、通过凝胶电泳分离、转移至尼龙膜上、并在低严格条件下与AtHXK1全长cDNA探针杂交。图1F是表示AtHXK1的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)的示意图。图1G是表示AtHXK2的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)的示意图。
图2A-B是表示HXK在拟南芥属中表达的系列示意图。图2A是显示AtHXK1和AtHXK2在叶(花结叶和茎生叶)、茎、花、长角果和根组织中表达的RNA印迹的照片。图2B是表示AtHXK1和AtHXK2的表达是由光和糖诱导的RNA印迹的照片。
图3A-F是说明HXK在植物中作为糖传感蛋白的拟南芥属幼苗的彩色照片。图3A是转基因拟南芥属幼苗的照片，这些幼苗是在含有6％葡萄糖的1/2MS平板上萌发的，其有义-AtHXK1(左)或反义-AtHXK1(中)构建体的表达得以加强。野生型(对照)植物示于右侧。图3B是转基因拟南芥属幼苗的照片，这些幼苗是在含有0.8mM2-dGlc的1/2MS平板上萌发的，其有义-AtHXK1(左)或反义-AtHXK1(中)构建体的表达得到加强。野生型(对照)植物示于右侧。图3C是表示有义-AtHXK1(左)和反义-AtHXK1(右)植物的T3纯合群体的照片，所述植物是在含有6％葡萄糖的1/2 MS平板上萌发的。图3D是表示有义-AtHXK1(左)和反义-AtHXK1(右)植物的T3纯合群体的照片，所述植物是在含有0.8mM 2-dGlc的1/2 MS平板上萌发的。图3E是表示有义-AtHXK 1(左)、反义-AtHXK 1(中)和对照(右)植物的照片，所述植物是在含有6％甘露糖醇的1/2MS平板上萌发的。图3F是表示有义-AtHXK1(左)、反义-AtHXK1(中)和对照(右)植物的照片，所述植物是在含有6％3-MeGlc的1/2平板上萌发的。
图4A-C是表示由AtHXK介导的对幼苗生长和发育的糖的作用的一系列彩色照片。让幼苗在黑暗中生长6天，随后光照12小时，生长是在含有不同葡萄糖浓度(所示为逐渐提高的葡萄糖浓度(Glc％)2、3、4、5或6％)的培养基上实现的。图4A是表示较高浓度的葡萄糖抑制野生型(对照)植物的下胚轴伸长和膨大，以及子叶变绿的照片。图4B是对葡萄糖超敏的有义-AtHXK1植物的照片，正如对幼苗发育的强抑制作用所示。图4C是反义-AtHXK1植物的照片，该植物对葡萄糖不太敏感，正如当与野生型植物比较时对幼苗发育的降低的抑制作用所示。
图5A-F是表示各种基因在对照-、有义-、和反义-植物中表达的系列示意图。图5A是用光照的黄化幼苗进行的RNA印迹分析的照片，该幼苗是在含有6％葡萄糖的1/2 MS平板上萌发的。作为对照监测UBQ的表达。图5B是RNA的RNA印迹分析照片，该RNA是由光照生长的绿色植物(光照)(该植物是在无外源糖的条件下繁殖的)和光照生长的绿色植物(黑暗)(该植物适应黑暗3天，然后光照4小时)制备的。图5C是几种RNA印迹的照片，表示有义和反义构建体在转基因植物中的表达。从生长在含有6％葡萄糖的1/2MS平板上的黄化幼苗中提取RNA。将基因和链特异探针用于揭示有义-AtHXK1(有义-1)、有义-AtHXK2(有义-2)、反义-AtHXK1(反义-1)和反义-AtHXK2(反义-2)转录物。让表现出有义-AtHXK1(有义-1)表达的印迹比其它印迹曝光更长的一段时间。将野生型植物用作对照。图5D是显示AtHXK1表达的蛋白印迹分析的照片。有义-AtHXK1植物表现出提高的AtHXK1表达，而反义-AtHXK1植物表现出减弱的表达。将野生型植物用作对照。图5E是表示黄化幼苗中总己糖磷酸化活性的直方图。图5F是表示光照生长植物中总己糖磷酸化活性的直方图。误差线表示标准偏差。
图6A-C是表示糖信号传导是与糖代谢解偶的系列示意图。图6A所示为证实野生型株系而不是双突变株hxk1/hxk2在2-dGlc/棉子糖平板(左)上的生长受到抑制的照片。在hxk1/hxk2株系中增强了的AtHXK 1或AtHXK 2的表达不会恢复葡萄糖抑制，正如该株系在2-dGlc/棉子糖平板上的生长水平所示的，这一结果类似于单用载体(pFL61)转化的双突变株(右)。图6B是表示在转基因拟南芥属幼苗(即YHXK2植物)中增强的酵母HXK2表达的显性干涉作用的彩色照片，所述幼苗在含有6％葡萄糖的1/2MS平板上生长7天。图6C是表示在黄化或绿色YHXK2、有义-AtHXK1和对照植物中的总己糖磷酸化活性的直方图。误差线表示标准偏差。
以下是对两种拟南芥属HXK-编码cDNA的克隆和鉴定的说明，所述cDNA可用于本发明中，以及对其调节糖代谢能力的鉴定。提供这些实例的目的是为了说明本发明，并不构成对本发明的限制。拟南芥属HXK基因的分子鉴定为了揭示HXK作为糖传感蛋白的作用，通过功能互补克隆拟南芥属HXK基因，其中了采用一种缺乏HXK活性的酵母菌株-酿酒酵母hxk1/hxk2双突变株(被命名为DBY2219)(Ma和Botstein，分子细胞生物学6,4046(1986))。我们用该方法鉴定了两种cDNA,被称为AtHXK 1(图1F；SEQ ID NO:3,GenBank入藏号U28214)和AtHXK 2(图1G；SEQ ID NO:4,GenBank入藏号U28215)。所述cDNA的长度分别为2.0和1.9kb，已发现其可再现性地互补所述酵母双突变株，并让其在含有果糖作为唯一碳源的选择平板上生长。典型结果示于图1A中；用AtHXK1或AtHXK2 cDNA转化的突变的酵母细胞能够在选择培养基上生长，表明这些基因互补于所述双突变株。相反，仅用质粒载体pF61转化的突变株不能在同一种选择培养基上生长(图1A)(Minet等，植物杂志2,417(1992))。
对AtHXK1(图1F,SEQ ID NO:3)和AtHXK2(图1F,SEQ ID NO:4)所做的DNA序列分析分别预测出496个和502个氨基酸的开放读框(图1B)。已发现这些基因拥有82％的核苷酸的同一性和85％的氨基酸的同一性。另外，数据库检索和序列比较揭示出上述AtHXKs与人和大鼠GLKs拥有34-35％的序列同一性(Nishi等，Diabetologia 35,743(1992)；Magnuson等，美国科学院学报86,4838(1989))，并与几种酵母HXKs拥有36-38％的序列同一性(Stachelek等，核酸研究14,945(1986)；Prior等，分子细胞生物学13,3882(1993))。在两种AtHXK基因的预测的氨基酸序列中还鉴定到了保守的ATP-和糖-结合域。如图1B所示，鉴定了3个参与ATP结合的功能域(Bork等，蛋白质科学2,31(1993))。在图1B中还示出了糖结合域，它类似于在哺乳动物GLK中发现的葡萄糖结合位点(Bork等，蛋白质科学2,31(1993))。一般，我们的序列比较表明拟南芥属HXKs的整个序列和构建体类似于哺乳动物GLK和酵母HXKs的序列和构建体，但不同于植物果糖激酶的(Smith等，植物生理学102,1043(1993))。
随后，我们通过对重组近交系中的限制片段长度多态性(RFLPs)所做的标准分离分析测定了AtHXK 1和AtHXK 2基因的染色体图位(Nam等，植物细胞1,699(1989)；Lister和Dean，植物杂志4，745(1993)；Hauge等，植物杂志3,745(1993)；Schmidt等，科学270,480(1995)；Zachgo等，基因组研究6,19(1996))。通过上述分析，我们发现AtHXK1位于4号染色体上，其旁侧为染色体标记mi232和g8300(图1C)，而AtHXK2位于2号染色体上，其旁侧为染色体标记mi148和mi238(图1C)。
通过基因组DNA(Southern)印迹分析测定AtHXK基因的拷贝数。用标准方法从拟南芥中制备基因组DNA(Landsberg er)，用BglⅡ、Eco RI、Hind Ⅲ、或XbaⅠ消化，通过凝胶电泳分离，转移到尼龙膜上，并与AtHXK1或AtHXK2的全长cDNA随机引物探针杂交(Ausubel等，见下文)。基因组DNA印迹分析表明AtHXK1能在高度严格的条件下与相当于两个AtHXK基因的两个DNA片段杂交(图1D，印迹命名为AtHXK1)。另外，当在相同杂交条件下将AtHXK2用作探针时，在相同的印迹上至少可以见到一个其它的片段(图1D，印迹被命名为AtHXK2)。使用该相同方法还鉴定了第三个cDNA(AtHXK3)，这进一步支持了在拟南芥属中存在3个同源HXK基因的假说。在低严格条件下，还检测到大量其它的条带，这表明有3个以上的基因与AtHXK1拥有序列相似性(图1E)。AtHXK基因表达为了检测AtHXK基因表达，以如下方式进行RNA印迹实验。用标准方法从花结叶、茎生叶、茎、花、长角果和根中提取RNA。对所提取的RNAs进行凝胶分离，并将其转移到尼龙膜上(例如，在Ausubel等的著述所描述的，见下文)。然后用标准技术让印迹与AtHXK1、AtHXK2或遍在蛋白(UBQ)探针(Greenberg等，细胞77,551(1994))与杂交。在上述实验中，将UBQ探针用作对照。将等量的RNA加入每个泳道中。
RNA印迹分析表明，AtHXK1和AtHXK2探针均能检测到长度大约为2kb的RNA带。如图2A所示，AtHXK1和AtHXK2转录物的含量在长角果中最大，在花和花结叶中中等，在茎和茎生叶中最低。在根中，AtHXK1的表达高于AtHXK2的表达。AtHXK1和AtHXK2表达的不同水平反映出其生理作用的多样性，例如，在诸如花结叶的源组织(即糖供应组织)中对光合作用的反馈调节，以及在诸如长角果和花的沉积(sink)组织(即糖受体)中的糖代谢。
由于光是植物通过光合作用产生糖所必需的，我们研究了光线对AtHXK基因表达的作用。按上文所述方法用由黑暗中生长的黄化植物和光照生长、适应黑暗的野生型植物制备的总RNA进行RNA印迹分析，所述植物用或不用灯光照射(在图2B中分别用黑暗和光照表示)。具体地讲，让黑暗中生长的黄化幼苗在装有含或不合6％葡萄糖的1/2Murashige-Skoog(MS)培养基(在图2B中分别以+糖和-糖表示)的平板上萌发并生长。让植物在黑暗中生长6天，然后用白光(120μEm-2S-1)照射4小时。光照生长、适应黑暗的植物为15日龄的光照生长的绿色植物，对其进行3天的黑暗适应并仍留在黑暗中，或进行光照，然后用3％的葡萄糖浇注(在图2B中用光照+糖表示)。生长条件如Cheng等所述(美国科学院学报89,1861(1992))。
如图2B所示，已发现AtHXK1和AtHXK2在非光合作用的黄化幼苗中以极低的水平表达，即便在经过4小时的光照之后也是如此。不过，其表达是通过添加外源糖诱导的。在适应黑暗的绿色植物中，AtHXK1和AtHXK2的转录物含量都很低，但在进行光照时得到明显的诱导，并可由糖进一步加强(图2B)。已发现UBQ基因的表达同时受到光照和糖的影响。上述结果表明，AtHXK的表达受特定条件的限制，其中，糖传感和代谢是必须的，这表明植物糖的体内稳态是通过自身调节机制由AtHXK的含量控制的。AtHXK作为植物中的糖传感蛋白为了验证AtHXKs在全植株中作为糖传感蛋白的假说，通过导入有义和反义基因以改变AtHXK的含量而建立转基因植物模型。通过标准的农杆菌属介导的根转化方法(Czako等，分子基因遗传学235,33(1992))用带有与CaMV35S启动子和有义AtHXK1(sense-AtHXK1)、有义AtHXK2(Sense-AtHXK2)、反义AtHXK1(anti-AtHXK1)或反义AtHXK2(anti-AtHXK2)融合的基因的二元载体转化野生型(Bensheim)拟南芥属植物。通过NPTⅡ表达和所产生的卡那霉素抗性并通过DNA印迹分析测定转基因的存在。为了进一步进行分析，选择在所述有义或反义转基因上纯合的几个T3代转基因品系。
通过用6％葡萄糖或0.8mM 2-脱氧葡萄糖(2-dGlc)(一种不可代谢的葡萄糖类似物)进行生物测定来检验转基因植物的糖敏感性。在6％葡萄糖平板上，在恒定光照下长成的对照(野生型)拟南芥属幼苗的子叶变绿并膨大、开始出现真叶以及下胚轴和根的伸长都受到抑制(图3A，右)。由葡萄糖引起的这些抑制作用在包括Bensheim(BE)、C24、Columbia(Col)、Landsberg erecta(Ler)、RLD和Wassilewskija(WS)在内的6种不同的拟南芥属生态型中都得到了证实(资料未发表)。此外，在对照植物中发现子叶的变绿受到低浓度2-dGlc的抑制(图3B，右)。这种表型与所述发现吻合即2-dGlc可以起到潜在的糖信号的作用，它可以触发编码光合蛋白的基因的总体抑制。
与对照植物相比，有义-AtHXK1植物表现出对6％葡萄糖的超敏性，这表现在子叶、下胚轴和根的生长受到抑制(图3A，左)。相反，反义-AtHXK1植物变绿并正常伸长(图3A，中)，这表明其对糖不太敏感。图3C表示在T3代转基因植物群体中，糖超敏性和不敏感性表现一致。与在葡萄糖试验中一样，有义-AtHXK1植物对2-dGlc超敏，其表现为严重抑制子叶变绿(图3B，左；图3D，左)。反义-AtHXK1植物对糖不太敏感，并且在有2-dGlc的条件下萌发时现绿(图3B，中；图3D，右)。
如表1(见下文)所示，在所产生的带有有义或反义AtHXK1或AtHXK2的多个独立转基因品系中观察到类似的表型。示于表1中的计数表型是基于对光照生长的7日龄幼苗的检验来测定的，所述幼苗是在含有6％葡萄糖或0.8mM 2-dGlc的1/2MS平板上萌发的。记录糖不敏感型(Ins)、超敏型(Hyp)和两性(A)表型的数目，并制成表格。该分析的结果示于表1(见下文)中。
表1T3纯合转基因植物的糖敏感性
糖不敏感性被认为是由共抑制所致。
为了排除转基因和对照植物之间糖传感的差异是由渗透作用所致的可能性，在对照实验中使用甘露糖醇和3-O-甲基葡萄糖(3-MeGlc)。当以6％甘露糖醇(图3E)或6％3-MeGlc(一种葡萄糖类似物，它不能被HXK磷酸化)(图3F)铺平板时，在对照和转基因植物之间未见明显差异。总之，上述结果表明，转基因植物中的糖传感是特异的，因为无论甘露糖醇还是3-MeGlc都不能代替葡萄糖并与AtHXKs相互作用。由AtHXK介导的糖对植物生长和发育的作用随后，我们比较了在野生型和转基因植物中糖对下胚轴和子叶发育的影响。为了进行上述实验，让拟南芥属幼苗在含有2-6％葡萄糖的平板上于黑暗中生长6天。由于下胚轴伸长在黑暗中更容易发生，由糖所引起的抑制作用可以目测评价。由于光照可以触发子叶膨大和变绿，对这些黑暗生长的幼苗进行12小时的光照，以测定糖对子叶发育的影响。我们的结果示于图4中。
具体地讲，在对照植物中，下胚轴的长度与葡萄糖的浓度成反比(图4A)。在类似的生长条件下，有义AtHXK植物对糖超敏，正如由在有3-6％的葡萄糖存在的条件下生长时下胚轴的长度降低所揭示的(图4B)。相反，即使是在有5或6％葡萄糖的条件下，反义AtHXK植物也能够伸长(图4C)。尽管在有其它养分的条件下葡萄糖浓度低于2％时能促进幼苗生长(资料未发表)，但由浓度高于2％的葡萄糖产生的对下胚轴的抑制反映了通过AtHXK介导的糖传感。
与光照相反，在对照植物中葡萄糖(浓度为4-6％)抑制子叶变绿和膨大(图4A)。在有义-AtHXK植物中所造成的损害较大，正如由黄化子叶所表明的(图4B)。不过，已发现反义-AtHXK植物对所有浓度的葡萄糖都不太敏感，并能正常变绿(图4C)。子叶发育的糖抑制作用被解释为在有丰富的外界糖的条件下植物转变成异养生长而不是光自养生长的能力，对于光自养生长来说，子叶膨大和变绿是必需的。我们还观察到在黑暗生长的对照的根和反义幼苗中缺乏糖的抑制作用(图4A和图4C)。这可能是在黑暗中AtHXK在根中低水平表达的结果，因为在有义植物中，异位AtHXK表达可产生由葡萄糖决定的对根生长的抑制(图4B)。上述结果表明，在不同组织中由于AtHXK的不同表达可能出现不同的糖效应(图2)。由AtHXK介导的糖抑制和基因表达的激活为了测定HXK是否参与了基因表达的糖调节，我们比较了两种糖抑制型基因、即集光叶绿素a/b结合蛋白(CAB1)和核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(RBCS)，和一种糖诱导型基因、即硝酸盐还原酶(NR1)基因在对照、有义-和反义-AtHXK植物中的表达水平(Sheen，光合作用研究，39,427(1994)；Thomas和Rodriguez，植物生理学106,1235(1994)；Cheng等，美国科学院学报89,1861(1992))。
如上文所述，我们首先检验了在6％葡萄糖上繁殖的光照的、黑暗生长的黄化幼苗。同样如上文所述，用获自拟南芥属的1.1kb CAB1、0.5kb RBCS、和3.2kb NR1探针进行RNA印迹分析。
在对照植物中，CAB1和RBCS的转录水平低，而在表现糖超敏性的有义-AtHXK1和有义-AtHXK2植物中几乎废止(图5A)。相反，在表现出糖不敏感性的两种反义-AtHXK植物中，两种基因均以高水平表达。与上述见解一致的是，有义转基因植物对糖超敏，NR1在有义-AtHXK1和有义-AtHXK2植物中都被激活，但在反义-AtHXK或对照植物中却不能(图5A)。总之，上述资料表明，AtHXK是在高等植物中介导糖抑制型和糖诱导型基因表达的传感蛋白。另外，在缺乏糖的条件下长成的有义-AtHXKs植物和对照植物中CAB1和RBCS的转录水平相似(资料未发表)，这表明由AtHXKs进行的糖传感是专一的，而且，外源糖至少是用于光照的黄化幼苗的一个信号。
为了证实AtHXK能在生理条件下调节基因表达，我们检验了在不加外源糖的条件下光照生长的绿色植物中CAB1和RBCS的表达(如上文所述)。上述实验的结果表明，两种基因的转录物水平在有义-AtHXK植物中比在反义-AtHXK或对照植物中低将近5倍(图5B)。这种表达差异可能是由于内源糖通过增强AtHXK的表达而介导的对光诱导性的抑制，因为在黑暗中两种基因在转基因植物和对照植物中一律表现为低水平表达(图5B)(关于AtHXK2的资料未发表)。在转基因植物中改变AtHXK的表达为了证实在转基因植物中所观察到的糖超敏性或不敏感性与转基因表达相关，以下述方法进行RNA和蛋白印迹分析。RNA印迹分析是用对所述有义和反义构建体的基因和链特异的探针进行的，所述构建体是在转基因植物中表达的。探针是用Greenberg等所披描述的聚合酶链式反应(PCR)方法(细胞77,551(1994))合成的。用作PCR引物的寡核苷酸是由AtHXK1的序列(SEQ ID NO:3)和AtHXK2的序列(SEQ ID NO:4)设计的，并将其用于扩增与其相应的CDNA片段。AtHXK1和AtHXK2的有义引物分别为5′-ATGGGTAAAGTAGCTGTT-3′(SEQ ID NO:10)和5′-ATGGGTAAAGTGGCAGTTGCAA-3′(SEQ ID NO:11)。AtHXK1和AtHXK2的反义引物分别为5′-TTAAGAGTCTTCAAGGTAGAG-3′(SEQ ID NO:12)和5′-TTAACTTGTTTCAGAGTCATCTTC-3′(SEQ ID NO:13)。将含有AtHXK1或AtHXK2全长cDNA的质粒(pBluescriptTMKS+)用作PCR反应的模板。从生长在含有6％葡萄糖平板上的光照黄化幼苗中提取RNAs，凝胶分离，吸印到尼龙膜上，并按上述方法与每一种探针杂交。在光照的黄化幼苗中，AtHXK1(有义-1)转录物在有义-AtHXK1植物中的含量和AtHXK2(有义-2)转录物在有义-AtHXK2植物中的含量比对照植物高20倍以上(图5C)。在反义植物中，AtHXK1(反义-1)和AtHXK2(反义-2)的反义RNA在其相应的反义转基因植物中表达。相反，在反义-AtHXK1和反义-AtHXK2植物中，AtHXK1的内源转录物减少到不足对照含量的20％(图5C)。对有义-2印迹较长时间的曝光显示，在反义-AtHXK1和反义-AtHXK2植物中内源AtHXK2的表达也减弱了(资料未发表)。上述结果表明，无论反义AtHXK1或是反义AtHXK2的RNA都能降低AtHXK1和AtHXK2的内源RNA水平，这可能是由于其高度的序列同一性。在对15日龄光照生长的绿色转基因植物进行分析时得到了类似结果(资料未发表)。
蛋白印迹分析也是用幼苗进行的，所述幼苗是在装有含或不含6％葡萄糖的1/2 MS培养基的平板上萌发的，并在黑暗中生长6天，然后用白光(120μEm-2S-1)照射4小时。同样用从15日龄光照生长的绿色植物中提取的蛋白进行上述分析，让所述植物适应黑暗3天，然后光照4小时。用如下方法制备用于上述实验的抗体。将含有整个开放读框的AtHXK1亚克隆到质粒载体pET-19b(Novagen)中，以便按标准方法在大肠杆菌(Escherichia coli)中超量表达。然后对超量表达的AtHXK1进行凝胶纯化，并用于生产兔多克隆抗体。对所述抗体进行亲和纯化，并用PhototopeTM-Star Western印迹检测试剂盒(新英格兰生物实验室)进行蛋白印迹分析。用传统方法(Wei等，细胞78,1994；Tots等，EMBO杂志6,1843(1987))提取蛋白。
蛋白印迹实验的结果表明，AtHXK1在有义-AtHXK1中的表达比在对照植物中高5-10倍。在反义-AtHXK1植物中，AtHXK1的含量显著低于对照植物中的，不过，不能将其完全清除(图5D)。转基因植物中的己糖磷酸化活性为了测定改变的AtHXK表达是否能影响转基因植物中己糖磷酸化的总催化活性，我们用Renz和Stitt所描述的方法(植物190,166(1993))进行了一系列标准的己糖磷酸化测定。
在光照的黄化幼苗中(按上述方法长成)，发现有义-AtHXK1植物具有最大的己糖磷酸化活性，而其它植物表现出较低的活性(图5E)。在AtHXK基因表达增强了的植物中测出的较高活性与酵母转化实验的结果一致，这表明与AtHXK2相比，AtHXK1具有较高的催化活性(资料未发表)。
我们还用15日龄光照生长的绿色植物进行了酶促测定，所述植物在黑暗中适应3天，并光照4小时。如图5F所示，与反义-AtHXK和对照植物相比，有义-AtHXK1和有义-AtHXK2植物具有较高的己糖磷酸化活性。总之，上述资料提供了得出以下结论的证据即操纵AtHXK的表达足以改变拟南芥属中糖传感和糖调节的活性。因此，证实了糖与HXK(例如AtHXK1和AtHXK2)之间的特异的相互作用、而不是HXK的总催化活性是植物的糖传感机制的关键决定因素。植物中糖信号传导与糖代谢是解偶联的上述观察提示在植物中HXK存在调节功能，而且糖的信号传导是与代谢解偶联的。为了证实上述假说，我们试图加强异源HXK的表达，这可以提供过量的针对糖代谢的催化活性，但没有调节功能。已提出酵母HXK2(YHXK2)具有催化和调节功能，而且似乎是该实验良好的候选对象(Entian，分子基因遗传学178,633(1980)；Entian和Frshlich，细菌学杂志158,29(1984)；Entian等，分子细胞生物学5,3035(1985))。首先，我们通过检验在酵母hxk1/hxk2双突变株(DBY 2219)中加强AtHXK的表达对葡萄糖抑制的影响测定了猜测的YHXK2和AtHXK的调节功能是否可以互换。所述测定基于在2-dGlc/棉子糖平板上由YHXK2-介导的对野生型酵母细胞的生长抑制(即葡萄糖抑制)。所述葡萄糖抑制测定是按照Ma等所描述的方法(分子细胞生物学9,5643(1989))在有2-脱氧葡萄糖(0.02％)的条件下用含有2％棉子糖作碳源的YP平板进行的。葡萄糖类似物2-dGlc通过诱导对转化酶基因(SUC2)强的抑制模拟葡萄糖，但其本身不能被用作碳源。因此，野生型酵母菌株具有葡萄糖抑制作用，并且不能在上述测定条件下生长；相反，在hxk1/hxk2双突变株中，SUC2的表达被脱阻抑，使棉子糖水解，并释放用于在测试平板上生长的果糖。如图6A所示，由于缺乏YHXK2和转化酶基因表达的脱抑制，DBY2219可以在2-dGlc/棉子糖平板上生长。不过，在用YHXK2转化并恢复葡萄糖抑制之后该菌株的生长受到抑制(图6A)(Ma和Botstein，分子细胞生物学6,4046(1986)；Ma等，分子细胞生物学9,5643(1989))。
为了测定在植物中加强YHXK2的表达的作用，将一种表达YHXK2的转基因构建体pCaMV35S-YHXK2导入拟南芥属中，采用的是上文所述农杆菌介导的方法。在多次测定中都发现具有增强的YHXK2表达的转基因植物(YHXK2植物)表现出糖不敏感性。例如，YHXK2幼苗对6％葡萄糖不如对照和有义-AtHXK植物敏感。在有义-AtHXK1或对照植物中发现下胚轴伸长、根生长和子叶变绿受到抑制，但在YHXK2植物中不是这样(图6B)。RNA印迹分析证实，无论是在有或是没有外源葡萄糖的条件下生长，YHXK2植物中的CAB1和RBCS转录物均未受到抑制(资料未发表)。
为了确保YHXK2在植物中产生己糖磷酸化活性，用黄化和绿色转基因植物进行酶促测定。图6C显示，YHXK2的总己糖磷酸化活性比在对照植物中高一些，并且类似于或者高于有义-AtHXK植物的。不过，YHXK2植物是糖不敏感型的，而不是超敏型的(图6B)。YHXK2在转基因植物中的这种显性干扰作用可能是由增强的YHXK2表达所致，YHXK2与AtHXK竞争糖，但它不能传递信号。根据AtHXK1和AtHXK2在YHXK2植物中的正常表达，我们排除了基因沉默效应的可能性(结果未发表)。
上述实验表明，HXK的催化功能在酵母与植物之间是可以互换的，但对糖信号传导的调节功能不能互换。我们的最新结果还证实了第三种AtHXK不能补充HXK的调节功能(资料未发表)。因此，葡萄糖信号传导无须彻底代谢，而且当YHXK2在植物中超量表达时减弱。
总之，根据对获得或丧失AtHXK功能的转基因植物的分析和显性干扰YHXK2，我们发现了HXK介导高等植物中的糖传感。分离其它HXKcDNAs和基因组DNAs基于本文所述的上述HXK基因和多肽的分离，可以用本领域所熟知的标准方法和技术分离其它的植物HXK编码序列。例如，使用HXK多肽的全部或部分氨基酸序列，人们可以方便地设计出包括HXK简并寡核苷酸探针(即特定氨基酸序列的一切可能的编码序列的混合物)在内的HXK-特异性寡核苷酸探针。所述寡核苷酸可以基于DNA链的序列和HXK序列的任意的合适部分(例如，分别见图1F-G；SEQ IDNO:3和4)。用于设计和制备上述探针的一般方法记载于诸如Ausubel等的著述中(1996，现代分子生物学方法，Wiley Interscience纽约)，以及Berger和Kimmel的著述中(分子克隆技术指南，1987，学术出版社，纽约)。上述寡核苷酸可用于HXK基因的分离，或是通过将其用作能够与HXK互补序列杂交的探针或用作用于各种扩增技术，例如聚合酶链式反应(PCR)克隆方法的引物。
杂交技术和筛选方法为本领域技术人员所熟知，并描述于诸如Ausubel等(同上)、Berger和Kimmel(同上)和Sambrook等(分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，纽约)的著述中。如果需要，可将不同的寡核苷酸探针的组合用于筛选重组DNA文库。可以用本领域公知方法对所述寡核苷酸进行可检测的标记，并将其用于探测源自重组DNA文库的复制滤膜。重组DNA文库是用本领域所熟知方法制备的，例如，由Ausubel等所描述的(同上)，或是可以从商业渠道获得。
为了检测或分离同一性大于80％的密切相关的HXK序列，优选使用高度严格的条件；上述条件包括在大约65℃温度下在50％左右的甲酰胺中杂交；在大约65℃的条件下，在大约2×SSC和1％SDS中进行第一次洗涤，随后在大约65℃的温度下，在大约0.1％SDS和l×SSC中进行第二次洗涤。用于检测与本文所述的HXK基因有大约30-50％序列同一性的HXK基因的较低严格条件包括例如，在无甲酰胺的条件下在大约45℃下杂交；在大约45℃的温度下，在约6×SSC和约1％SDS中进行第一次洗涤，和在大约50℃的温度下，在约6×SSC和约1％SDS中进行第二洗涤。上述严格条件是示例性的；其它合适条件可以由本领域技术人员确定。
如上文所述，HXK寡核苷酸也可以用作扩增克隆方法中的引物，例如用PCR。PCR方法在本领域中广为人知，并描述于以下文献中例如，PCR技术，Erlich著，Stockton出版社，伦敦，1989；PCR方法方法和应用指南，Innis等著，学术出版社有限公司，纽约，1990；和Ausubel等(同上)。选择性地将引物设计成可将所述扩增产物克隆到合适的载体中，例如，通过使扩增片段的5′和3′末端包括合适的限制位点(如本文所述)。如有必要，可以用PCR“RACE”技术或快速扩增cDNA末端来分离HXK(例如，参见Innis等(同上))。通过该方法，使基于HXK序列的寡核苷酸引物沿3′和5′方向取向，并用于产生重叠的PCR片段。合并上述重叠的3＇-和5＇-末端RACE产物，以产生完整的全长cDNA。该方法描述于Innis等(同上)和Frohman等(美国科学院学报85,8998(1988))的著述中。
另外，任何植物cDNA表达文库都可以通过酵母hxk1/hxk2双突变株的功能互补进行筛选，如本文所述的由Ma和Botstein介绍的方法(分子细胞生物学6,4046(1986))。
可以从任何合适的生物中分离有用的HXK序列。与HXK多肽家族的序列相关性的证实可以用多种传统方法实现，这些方法包括、但不限于功能互补测定和序列比较。另外，任何HXK序列的活性均可以用本文所述的任何方法进行评价。多肽表达HXK多肽可以通过用位于合适的表达载体上的全部或部分HXKcDNA(例如，上文所述的cDNA)或者用为了提高一种HXK多肽(同上)在体内的表达通过基因工程方法设计的质粒构建体转化合适的宿主细胞来生产。
分子生物学领域的技术人员可以理解的是，可以用多种表达系统中的任一种产生所述重组蛋白。对于本发明来说，所用的确切的宿主细胞并不重要。所述HXK蛋白可以在原核宿主中生产，例如在大肠杆菌(E.coli)中生产，或是在真核宿主中生产，例如酿酒酵母、哺乳动物细胞(例如，COS1或NIH3T3细胞)或许多植物细胞中的任一种，这些植物细胞包括、但不限于藻类、树木物种、观赏植物物种、温带果树种、热带果树种、蔬菜种、豆类种、单子叶植物、双子叶植物，或是在有商业或农业价值的任何植物中生产。合适的植物宿主的具体例子包括，但不限于针叶树、矮牵牛、蕃茄、马铃薯、烟草、拟南芥属、莴苣、向日葵、油菜、亚麻、棉花、甜菜、芹菜、大豆、苜蓿、苜蓿属、莲、豇豆属、黄瓜、胡萝卜、茄子、花椰菜、辣根、牵牛花、白杨、胡桃、苹果、芦笋、稻、玉米、粟、洋葱、大麦、鸭茅、燕麦、黑麦和小麦。
上述细胞可获自多种来源，包括美国典型培养物收藏所(Rockland,MD)；或多家种子公司中的任一家，例如W.Atlee Burpee种子公司(Warminster,PA),Park种子公司(Greenwood,SC)、Johnny种子公司(Albion,ME)或Northrup King种子公司(Harstville,SC)。关于有用的宿主细胞的说明和来源还可以在以下文献中找到Vasil I.K.，植物细胞培养和体细胞遗传学，Vol.Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，实验室方法及其应用，学术出版社，纽约，1984；.Dixon.R.A.，植物细胞培养-实践方法，IRL出版社，牛津大学，1985；Green等，植物组织和细胞培养，学术出版社，纽约，1987；和Gasser和Fraley，科学244,1293(1989)。
为了进行原核生物表达，将编码HXK多肽的DNA携带于能够实现在原核宿主中表达的可操作地连接于控制信号的载体上。如果必要，所述编码序列可以在其5′末端含有一个编码任何已知的信号序列的序列，该信号序列可以实现所表达的蛋白向宿主细胞外周质间隙的分泌，以便促进回收该蛋白以及随后的纯化。最常用的原核生物是大肠杆菌的各种菌株；但也可以使用其它微生物的菌株。所使用的质粒载体含有复制起点、选择标记和控制序列，该质粒源于与所述微生物宿主相容的种。所述载体的例子见于Pouwels等(同上)或Ausubel等(同上)的著述中。本文所定义的常用的真核控制序列(也被称作“控制元件”)包括用于启动转录的启动子，选择性地具有一个操纵基因，以及核糖体结合位点序列。常用于指导蛋白表达的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖(lac)(Chang等，自然198,1056(1977))、色氨酸(Trp)(Goeddel等，核酸研究8,4057(1980))，和tac启动子系统，以及λ-衍生的PL启动子和N-基因核糖体结合位点(Simatake等，自然292,128(1981))。
一种用于HXK多肽生产的具体的细菌表达系统是大肠杆菌pET表达系统(Novagen公司，麦迪逊，WI)。按照该表述系统，将编码一种HXK多肽的DNA沿被设计成可以表达的方向插入pET载体中。由于HXK基因被置于T7调节信号的控制之下，所以HXK的表达通过在宿主细胞中诱导T7 RNA聚合酶的表达来诱导。这通常是用对IPTG诱导产生反应而表达T7 RNA聚合酶的宿主菌株而实现的。一旦产生重组HXK多肽，即可用本领域已知的标准方法，如本文所述的方法分离所述多肽。
用于HXK多肽生产的另一种细菌表达系统是pGEX表达系统(Pharmacia)。该系统使用了一种GST基因融合系统，该系统是为了以融合蛋白形式高水平表达基因或基因片段而设计的，可以快速纯化并回收功能性基因产物。把所述感兴趣的蛋白与获自日本血吸虫(Schistosoma japonicum)的谷胱甘肽S-转移酶蛋白的羧基末端融合，并可以通过亲和层析用Glutathione Sepharose 4B从细菌裂解液中方便地纯化。可以在温和的条件下通过用谷胱甘肽洗脱来回收融合蛋白。裂解所述融合蛋白的谷胱甘肽S-转移酶功能域是通过位于该功能域上游的位点专一性蛋白酶的识别位点的存在来促进的。例如，在pGEX-2T质粒中表达的蛋白可以用凝血酶裂解；而在pGEX-3X中表达的蛋白可以用元件Xa裂解。
对于真核生物的表达而言，转化或转染的方法，以及用于表达HXK多肽的载体的选择将取决于所选择的宿主系统。例如，转化和转染方法描述于以下文献中Ausubel等(同上)；Weissbach和Weissbach，植物分子生物学方法，学术出版社，1989；Gelvin等，植物分子生物学手册，Kluwer学术出版社，1990；Kindle,K.，美国科学院学报87,1228(1990)；Potrykus,Ⅰ.，植物生理学植物分子生物学年度综述42,205(1991)；以及BioRad(Hercules,CA)技术公报#1687(Biolistic粒子送递系统)。表达载体可以选自在以下文献中所提供的载体例如，参见克隆载体实验室手册(P.H.Pouwels等，1985,Supp.1987)；Gasser和Fraley(同上)；Clontech分子生物学目录(目录1992/93分子生物学家使用的工具，Palo Alto,CA)；以及上文所引用的参考文献。
一种优选的真核表达系统是用pMAMneo表达载体(Clontech)转染过的小鼠3T3成纤维宿主细胞。pMAMneo具有一个与地塞米松诱导型MMTV-LTR启动子连接的RSV-LTR增强子，一个可以在哺乳动物系统中复制的SV40复制起点，一个可选择的新霉素基因，和SV40剪接和聚腺苷酸化位点。将编码一种HXK多肽的DNA沿被设计成可以表达的取向插入pMAMneo载体中。然后按如下方法分离重组HXK蛋白。可以与所述pMAMneo表达载体组合使用的其它优选宿主细胞包括COS细胞和CHO细胞(ATCC入藏号分别为CRL1650和CCL61)。
另外，如果必要，通过稳定转染的哺乳动物细胞系生产HXK多肽。适于稳定转染哺乳动物细胞的多种载体是公众可以得到的，例如，参见Pouwels等(同上)；用于构建上述细胞系的方法也可以公开获得，例如，参见Ausubel等(同上)。在一个实例中，将编码所述HXK多肽的cDNA克隆到一种表达载体中，该载体包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。通过在细胞培养基中含有0.01-300μM氨甲蝶呤来选择把质粒整合到宿主细胞染色体中，从而HXK编码基因也整合到所述染色体中(如由Ausubel等所述的，同上)。这种显性选择可以在大多数类型的细胞中实现。重组蛋白的表达可以通过由DHFR-介导的转染基因的扩增而加强。选择具有基因扩增的细胞系的方法描述于Ausubel等的著述中(同上)；上述方法通常包括在含有浓度逐渐增高的氨甲蝶呤的培养基中延长时间的培养。常用于上述目的的含有DHFR的表达载体包括pCVSEⅡ-DHrF和pAdD26SV(AX描述于Ausubel等的著述中，同上)。上述任何宿主细胞，或优选DHFR-缺陷型CHO细胞系(例如，CHO DHFR细胞，ATCC入藏号为CRL 9096)均属于优选用于稳定转染的细胞系的DHFR选择或DHFR-介导的基因扩增的宿主细胞。
最理想的是，HXK多肽是由稳定转染的植物细胞系或由转基因植物生产的。公众可以获得适于稳定转染植物细胞或用于建立转基因植物的多种载体；上述载体描述于Pouwels等(同上)、Weissbach和Weissbach(同上)和Gelvin等(同上)的著述中。用于构建上述细胞系的方法描述于诸如Weissbach和Weissbach(同上)，以及Gelvin等(同上)的著述中。一般，植物表达载体包括(1)一个受5′和3′调节序列的转录控制的克隆的植物基因，和(2)一个显性选择标记。如有必要，上述植物表达载体还可以包括一个启动子调节区(例如，可以产生诱导型或组成型、环境-或发育-调节的、或细胞-或组织特异性表达的调节区)，一个转录起始位点，一个核糖体结合位点，一个RNA加工信号，一个转录终止位点，和/或一个聚腺苷酸化信号。
另外，HXK多肽可以用一种瞬时表达系统(例如，由Sheen所述的玉米瞬时表达系统，植物细胞2,1027(1990))生产。
一旦获得想要的HXK核酸序列，即可用本领域公知的多种方法对其进行操作。例如，如果所述序列涉及非编码的旁侧区，即可对该旁侧区进行诱变。
如果需要，本发明的HXKDNA序列可以多种方式与其它DNA序列结合。本发明的HXK DNA序列可以与通常与所述HXK蛋白有关的基因序列的全部或部分一起使用。在其组成部分，将编码一种HXK蛋白的DNA序列与具有转录起始控制区的DNA构建体结合，所述控制区可以促进在宿主细胞中的转录和翻译。
一般，所述构建体可以包括能在植物中起作用的调节区，它可以提供如本文所述的HXK蛋白的改进的生产。编码HXK蛋白或其功能性片段的开放读框在其5′末端与一个转录起始调节区接合，所述调节区如自然存在于HXK构建体基因5′上游区的序列。可以获得可提供组成型或诱导型调节的许多其它的转录起始区。
为了应用于需要发育、细胞、组织或环境表达的场合，从其它基因获得合适的5′上游非编码区；例如，获自在种子发育、胚发育或叶发育期间调节的基因。
在本发明的DNA构建体中还可以带有调节转录终止区。转录终止区可以由编码所述HXK蛋白的DNA序列或源于不同基因来源的任何常见的转录终止区提供。所述转录终止区可以含有位于产生该终止区的构建体基因3′端的优选至少1-3kb的序列。具有以HXK作为用于表达的感兴趣的DNA序列的植物表达构建体(以有义或反义取向)可应用于多种植物生命，尤其是与贮存备用物的生产有关的植物生命(例如，与碳和氮代谢有关的物质)。上述基因工程植物可用于下文所述的多种工业和农业应用中。重要的是，本发明可应用于双子叶植物和单子叶植物，并可方便地应用于任何新的或改进的转化或再生方法。
本发明的一种有用的植物启动子的例子是花椰菜花叶病毒组启动子，例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子。上述启动子可以在大部分植物组织中高水平表达，而且，这些启动子的活性并不取决于由病毒编码的蛋白。CaMV是35S和19S启动子的来源。在转基因植物的大部分组织中，CaMV35S启动子是一种强启动子(例如，参见Odell等，自然313,810(1985))。所述CaMV启动子在单子叶植物中也十分活跃(例如，参见Dekeyser等，植物细胞2,591(1990)；Terada和Shimamoto，分子基因遗传学220,389,(1990))。而且，通过双份的CaMV35S启动子可以使该启动子的活性进一步加强(即提高了2-10倍)(例如，参见Kay等，科学236,1299(1987)；Ow等，美国科学院学报84,4870(1987)；和Fang等，植物细胞1,141(1989))。
其它有用的植物启动子包括，但不限于胭脂氨酸合酶启动子(An等，植物生理学88,547(1988))和章鱼氨酸合酶启动子(Fromm等，植物细胞1,977(1989))。
对于某些用途来说，可能希望在适当的组织中，以合适的水平，或在适当的发育时期生产所述HXK基因产物。为此，存在一类基因启动子，它们各自具有其体现在其调节序列上的独特特征，已证实其可以根据环境、激素和/或发育线索进行调节。其中包括决定热调节型基因表达的基因启动子(例如，参见Callis等，植物生理学，88,965(1988)；Takahashi和Komeda，分子基因遗传学219,365(1989)；和Takahashi等，植物杂志2,751(1992))，决定光调节型基因表达的基因启动子(例如，由Kuhlemeier等所述的豌豆rbcS-3A，植物细胞1,471(1989)；由Schffner和Sheen所述的玉米rbc S启动子，植物细胞3,997(1991)；或由Simpson等所述的在豌豆中发现的叶绿素a/b-结合蛋白基因，EMBO杂志4,2723(1985)),决定激素调节型基因表达的基因启动子(例如，由Marcotte等所述的源于小麦Em基因的脱落酸(ABA)效应序列，见植物细胞1,969(1989)；由Straub等所述的用于大麦和拟南芥属的ABA-诱导型HVA1和HVA22、以及rd29A启动子，见植物细胞6,617(1994)，Shen等，植物细胞7,295(1994)，和Yamaguchi-Shinosaki等，创伤诱导的基因表达(例如，由Siebertz等所述的wunⅠ，植物细胞1，961(1989))，或决定器官特异性基因表达的基因启动子(例如，由Roshal等所述的块茎特异性储存蛋白基因，EMBO杂志6,1155(1987)；由Schernthaner等所述的获自玉米的23-kDa玉米醇溶蛋白基因，见EMBO杂志7,1249(1988)；或由Bustos等所述的菜豆β-云扁豆蛋白基因，见植物细胞1,839(1989))。
植物表达载体也可以选择性地包括RNA加工信号，例如内含子，已证实其在进行有效的RNA合成和积累方面起着重要作用(Callis等，基因及发育1,1183(1987))。所述RNA剪接序列的位置能够显著影响转基因在植物中的表达水平。就上述事实而言，内含子可以位于所述转基因中的HXK多肽编码序列的上游或下游以调制基因的表达水平。
除了上述5′调节控制序列之外，所述表达载体还可以包括一般存在于植物基因的3′区中的调节控制区(Thomburg等，美国科学院学报84,744(1987)；An等，植物细胞1,115(1989))。例如，在所述表达载体中可以包括所述3′末端区，以提高其mRNA的稳定性。一种这样的终止区可以源自马铃薯的PⅠ-Ⅱ终止区。另外，其它常用的终止子源于章鱼氨酸或胭脂氨酸合酶信号。
所述植物表达载体通常还含有一个显性选择标记基因，将该基因用于鉴定那些已被转化的细胞。可用于植物系统的选择基因包括编码抗生素抗性基因的基因，例如，编码对潮霉素、卡那霉素、博来霉素、G418、链霉素或壮观霉素的抗性的基因。也可将光合作用所需的基因用作光合缺陷型菌株的选择标记。另外，可以将源于水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白用作选择标记(Sheen等，植物杂志8∶777,1995；Chiu等，现代生物学6,325(1996))。最后，编码除草剂抗性的基因可以用作选择标记；有用的除草剂抗性基因包括编码膦丝菌素乙酰转移酶并赋予对广谱性除草剂Basta(Hoechst AG,Frankfurt，德国)的抗性的bar基因。
选择标记的有效利用是通过测定一种植物细胞对一种特定的选择试剂的易感性和测定所述试剂有效地杀伤大部分(如果不是全部的话)被转化细胞的浓度来促进的。用于烟草转化的抗生素的某些有用的浓度包括，例如，75-100μg/ml(卡那霉素)、20-50μg/ml(潮霉素)、或5-10μg/ml(博来霉素)。用于针对除草剂抗性选择转化体的有用方法举例来说由Vasil等描述(同上)。
分子生物学领域、尤其是植物分子生物学领域的技术人员很容易理解的是，基因的表达水平不仅取决于启动子、RNA加工信号、和终止元件的组合，而且取决于如何将这些元件用于提高选择标记基因表达的水平。植物转化在构建植物表达载体时，有几种标准方法可用于将载体导入植物宿主中，从而产生转基因植物。这些方法包括(1)农杆菌介导的转化(根瘤农杆菌(A.tumefaciens)或毛根农杆菌(A.rhizogenes))(例如，参见Lichtenstein和Fuller遗传工程，第6卷，PWJ Rigby著，伦敦，学术出版社，1987；和Lichtenstein,C.P.，和Draper,J.，见DNA克隆，第Ⅱ卷，D.M.Glover著，牛津，IRI出版社，1985),(2)粒子送递系统(例如，参见，Gordon-Kamm等，植物细胞2,603(1990)；或BioRad技术简报1687，同上),(3)显微注射方法(例如，参见Green等，同上),(4)聚乙二醇(PEG)方法(例如，参见Draper等，植物细胞生理学23,451(1982)；或例如，Zhang和Wu，理论应用遗传学76,835(1988)),(5)脂质体介导的DNA摄入(例如，参见Freeman等，植物细胞生理学25,1353(1984)),(6)电穿孔方法(例如，参见Gelvin等，同上；Dekeyser等，同上；Fromm等，自然319,791(1986)；Sheen，植物细胞2,1027(1990)；或Jang和Sheen，植物细胞6,1665(1994)),和(7)涡旋方法(例如，参见Kindle，同上)。对于本发明来说，转化方法并不重要。任何能提供有效转化的方法均可使用。当有转化作物或其它宿主细胞的更新的方法时，可以直接使用这些方法。
以下是概述一种具体技术-农杆菌介导的植物转化的一个例子。通过该技术，用于操作待转移到植物细胞基因组中的基因的一般方法是分两个阶段完成的。首先，在大肠杆菌中完成克隆和DNA修饰步骤，并通过接合或电穿孔将含有感兴趣的基因构建体的质粒转移到农杆菌中。其次，将所得到的农杆菌菌株用于转化植物细胞。因此，对于非特异性的植物表达载体来说，所述质粒含有一个可以使其在农杆菌中复制的复制起点，和可以在大肠杆菌中起作用的高拷贝数的复制起点。这有利于在大肠杆菌中进行转基因的生产和试验，然后再转移到农杆菌中，以便随后导入植物中。多个抗性基因可以携带于所述载体上，一个用于在细菌中选择，例如选择链霉素抗性，而另一个将在植物中起作用，例如编码卡那霉素抗性或除草剂抗性的基因。在所述载体上还存在用于加入一个或几个转基因以及定向T-DNA边界序列的限制性内切酶位点，这些位点在被农杆菌的转移功能识别之后，确定将要转移到所述植物中的DNA区的界限。
在另一个例子中，可以通过将在其上沉积有克隆DNA的钨微粒射入植物细胞中而转化该细胞。在用于射击的Biolistic装置(Bio-Rad)中，由一批火药(22号口径Power Piston Tool Charge)或空气驱动的爆炸驱动塑料大粒子通过一个枪管。将一等份的钨粒子悬浮液放在所述塑料大粒子前面，所述钨粒子上已沉积有DNA。将塑料大粒子射在丙烯酸挡板上，在该挡板上有一个穿过档板的孔，该孔太小以至于所述大粒子不能通过。结果，所述塑料大粒子撞碎在所述挡板上，而钨微粒通过该板上的孔继续朝着其目标前进。对于本发明而言，所述目标可以是任何的植物细胞、组织、种子或胚。导入所述细胞中的所述微粒上的DNA被整合到其细胞核中或是整合到叶绿体中。
一般，转基因在植物细胞中的转移和表达对于本领域技术人员而言已成为常规实践，并且已成为在植物中进行基因表达研究和生产有农业或商业价值的改进的植物品种的主要工具。转基因植物再生举例来说，可以按照标准的植物组织培养技术由单细胞、愈伤组织、或叶盘再生用一种植物表达载体转化过的植物细胞。本领域所熟知的是，可以对源于几乎一切植物的多种细胞、组织和器官进行成功地培养，以再生出全植株；上述技术描述于诸如Vasil(同上)；Green等(同上)；Weissbach和Weissbach(同上)；和Gelvin等(同上)的著述中。
在一个具体实例中，将一种克隆的HXK多肽或反义构建体转化到农杆菌属中，所述构建体受35SCaMV启动子和胭脂氨酸合酶终止子的控制并带有一个选择标记(例如，卡那霉素抗性)。用含有载体的农杆菌转化叶盘(例如，烟草叶盘)是按照Horsch等所述的方法(科学227,1229(1985))实现的。几周之后(例如3-5周)，在含有卡那霉素(例如，100μg/ml)的植物组织培养基上选择推定的转化体。然后将抗卡那霉素的芽放在无激素的植物组织培养基上，进行生根。然后选择卡那霉素抗性植物用于温室生长。如有必要，然后可以将来自花受精的转基因植物的种子播种到少土(soil-less)培养基中，并在温室中生长。通过将经过表面消毒的种子播种在无激素的含卡那霉素的培养基上来选择卡那霉素抗性子代。对转基因整合的分析是通过标准技术(例如，参见Ausubel等，同上；Gelvin等，同上)实现的。
然后针对所述转基因DNA的传递通过标准的免疫印迹和DNA检测技术筛选表达所述选择标记的转基因植物。每一个阳性转基因植物及其转基因子代与用同一种转基因建成的其它转基因植物相比都是独一无二的。转基因DNA向植物基因组DNA中的整合在大多数场合下都是随机的，而且整合的位点可以显著影响转基因表达的水平和组织与发育的方式。因此，针对每种转基因通常筛选许多转基因系，以便鉴定和选择具有最适宜的表达特征的植物。
对转基因系的转基因表达水平进行评价。首先测定RNA水平上的表达，以便鉴定并定量表达-阳性和植物。采用用于RNA分析的标准技术，这些技术包括用寡核苷酸引物进行的PCR扩增测定，所述引物被设计成仅能扩增转基因RNA模板，以及用转基因特异性探针进行的溶液杂交测定(例如，参见Ausubel等，同上)。然后通过Western免疫印迹分析，用HXK特异性抗体来分析RNA-阳性植物的蛋白表达(例如，参见Ausubel等，同上)。另外，可以分别用转基因特异性核苷酸探针和抗体按照标准方法进行原位杂交和免疫细胞化学，以便在转基因组织中定位表达位点。
一旦重组HXK蛋白在任何细胞或转基因植物(例如，如上文所述)中表达，即可以用诸如亲和层析的方法分离它。在一个实例中，可以将一种抗-HXK抗体(例如，用Ausubel等所述的方法(同上)生产，或用任何标准方法生产)结合在一个柱上，并将其用于分离所述多肽。在亲和层析之前进行的HXK-生产细胞的裂解和分离可以通过标准方法完成(例如，参见Ausubel等，同上)。一旦分离到所述重组蛋白，如果必要的话即可对其做进一步的纯化，例如，通过高效液相层析纯化(例如，参见Fisher，生物化学和分子生物学实验室技术，Work和Burdon编，Elsevier,1980)。
上述多肽表达和纯化的一般方法也可用于生产和分离有用的HXK片段或类似物。用途本文所述的发明可应用于多种农业和商业目的，包括，但不限于提高作物产量、改善作物和观赏植物的品质，以及降低农业生产的成本。例如，可将本文所述的方法、DNA构建体、蛋白和转基因植物用于改善水果和蔬菜的特征，包括口味、质地、大小、颜色、酸度或甜度；营养含量；抗病性；和成熟过程。
上文所提供的我们的结果证实，可以通过提供一种己糖激酶序列的转录来调节己糖激酶基因在转基因植物中的表达，所述序列互补于一种内源植物己糖激酶的mRNA。这样，可以对各种植物过程进行改进、控制或操作，导致糖类(例如，蔗糖和淀粉)产物的产量提高、植物生长、细胞分化和发育的改变、植物表型改变、以及碳/氮分配和积累的改变。另外，如上文所述，如果必要可以细胞-、组织-、器官-或发育-特异性方式控制反义表达。因此，使用反义控制可以提供对己糖激酶基因表达的基本抑制或不同程度的减弱。这样，可以在不产生额外的蛋白并且具体针对特殊基因的前提下改进细胞的表型。
例如，可将表达反义己糖激酶RNA构建体的转基因植物用于消除光合作用的反馈抑制(例如，通过糖诱导的光合基因的抑制)，这种抑制是由糖代谢物(例如，光合作用终产物蔗糖和葡萄糖)的积累造成的。正如本文体所证实的，表达反义己糖激酶基因的转基因植物对糖不太敏感，而且不再受生长的限制和局限，这种限制和局限是糖抑制(例如，光合基因表达减弱)的结果。具体地讲，我们业已发现表达反义己糖激酶基因的转基因植物可以在由于反馈抑制而通常会限制和局限植物生长的条件下正常地发育并茁壮成长(例如，野生型植物中芽的发育被高己糖浓度所抑制，但表达反义己糖激酶的转基因植物的芽可以正常发育)。因此，可将表达反义己糖激酶的转基因植物用于各种农业目的，包括，但不限于促进生长速度和发育、种子萌发、刺激开花和提高作物产量，特别是在不利的环境条件下，例如，强光照、高温和高CO2条件下。
另外，上面所提供的结果表明，通过提高己糖激酶蛋白的含量可以调节植物对糖的敏感性。具体地讲，我们发现提高了己糖激酶蛋白的浓度可用于促进糖激活基因(例如，NRI)的加强表达。这样，通过提高己糖激酶蛋白在特定的植物细胞、组织或器官中的含量，可以调节或操作由糖控制、调制或激活的各种植物过程。上述基因表达的遗传工程可用于增强储存蛋白的积累和氮的积累、改善植物的创伤反应和防病机制，以及为了观赏和园艺目的而改进植物组织(例如，果实和花)的色素(例如，花青苷)形成。例如，加强己糖激酶的表达可用于操作或促进编码一类蛋白的多种糖激活基因的表达，所述蛋白包括，但不限于马铃薯储存蛋白patatin、大豆营养储存蛋白、sporamin、蛋白酶抑制剂Ⅱ、蔗糖磷酸合酶、稻和玉米的蔗糖合酶、查耳酮合酶、和硝酸盐还原酶。
在本说明书中所提及的一切出版物和专利均以相同的相关度收作本文的参考资料，有如每一份独立的出版物或专利被特别或独立地收作本文的参考资料。其它实施方案通过以上说明可以理解，可以对本文所述的发明进行改变和改进，以使其适应各种用途和条件。这样的实施方案也属于以下权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人The General Hospital Corporation(ⅱ)发明题目植物糖传感蛋白及其用途(ⅲ)序列数目13(ⅳ)通讯地址(A)收信人Clark & Elbing LLP(B)街道(C)城市波士顿(D)州MA(E)国家美国(F)邮编(ⅴ)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Releaes #1.0,Version #1.30(ⅵ)当前申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(ⅶ)在先申请资料(A)申请号US 08/622，191(B)申请日1996年3月25日(C)分类(ⅷ)律师/代理人资料(A)姓名Lech,Karen.F.
(B)登记号35,238(C)参考/档案号00786/307 WO1(ⅸ)电信资料(A)电话617/723-6777(B)传真617/723-8962
(C)电传(2)SEQ ID NO:1资料(ⅰ)序列特征(A)长度453个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:Met Gly Lys Val Ala Val Gly Ala Thr Val Val Cys Thr Ala Ala Val1 5 10 15Cys Ala Val Ala Val Leu Val Val Arg Arg Arg Met Gln Ser Ser Gly20 25 30Lys Trp Gly Arg Val Leu Ala Ile Leu Lys Ala Phe Glu Glu Asp Cys35 40 45Ala Thr Pro Ile Ser Lys Leu Arg Gln Val Ala Asp Ala Met Thr Val50 55 60Glu Met His Ala Gly Leu Ala Ser Asp Gly Gly Ser Lys Leu Lys Met65 70 75 80Leu Ile Ser Tyr Val Asp Asn Leu Pro Ser Gly Asp Glu Lys Gly Leu85 90 95Phe Tyr Ala Leu Asp Leu Gly Gly Thr Asn Phe Arg Val Met Arg Val100 105 110Leu Leu Gly Gly Lys Gln Glu Arg Val Val Lys Gln Glu Phe Glu Glu115 120 125Val Ser Ile Pro Pro His Leu Met Thr Gly Gly Ser Asp Glu Leu Phe130135 140Asn Phe Ile Ala Glu Ala Leu Ala Lys Phe Val Ala Thr Glu Cys Glu145 150155 160Asp Phe His Leu Pro Glu Gly Arg Gln Arg Glu Leu Gly Phe Thr Phe165170 175Ser Phe Pro Val Lys Gln Thr Ser Leu Ser Ser Gly Ser Leu Ile Lys180 185 190Trp Thr Lys Gly Phe Ser Ile Glu 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Lys Tyr Met Gly Glu Leu Val Arg Leu290 295 300Val Leu Leu Lys Leu Val Asp Glu Asn Leu Leu Phe His Gly Glu Ala305 310 315 320Ser Glu Gln Leu Arg Thr Arg Gly Ala Phe Glu Thr Arg Phe Val Ser325 330 335Gln Val Glu Ser Asp Ser Gly Asp Arg Lys Gln Ile His Asn Ile Leu340 345 350Ser Thr Leu Gly Leu Arg Pro Ser Val Thr Asp Cys Asp Ile Val Arg355 360 365Arg Ala Cys Glu Ser Val Ser Thr Arg Ala Ala His Met Cys Ser Ala370 375 380Gly Lcu Ala Gly Val Ile Asn Arg Met Arg Glu Ser Arg Ser Glu Asp385 390 395 400Val Met Arg Ile Thr Val Gly Val Asp Gly Ser Val Tyr Lys Leu His405 410 415Pro Ser Phe Lys Glu Arg Phe His Ala Ser Val Arg Arg Leu Thr Pro420 425 430Asn Cys Glu Ile Thr Phe Ile Glu Ser Glu Glu Gly Ser Gly Arg Gly435 440 445Ala Ala Leu Val Ser Ala Val Ala Cys Lys Lys Ala Cys Met Leu Ala450 455 260Gln465(2)SEQ ID NO:7资料(ⅰ)序列特征(A)长度486个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型不相关(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Met Val His Leu Gly Pro Lys Lys Pro Gln Ala Arg Lys Gly Ser Met1 5 10 15Ala Asp Val Pro Lys Glu Leu Met Asp Glu 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ATGGGTAAAG TAGCTGTT 18(2)SEQ ID NO:11资料(ⅰ)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:
ATGGGTAAAG TGGCAGTTGC AA 22(2)SEQ ID NO:12资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:
TTAAGAGTCT TCAAGGTAGA G21(2)SEQ ID NO:13资料(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:
TTAACTTGTT TCAGAGTCAT CTTC 2权利要求
1．一种用于降低转基因植物细胞中植物己糖激酶蛋白含量的方法，所述方法包括在所述转基因植物细胞中表达一种反义己糖激酶核酸序列。
2．如权利要求1的方法，其中，所述植物细胞源自单子叶植物。
3．如权利要求1的方法，其中，所述植物细胞源自双子叶植物。
4．如权利要求1的方法，其中，所述植物细胞源自裸子植物。
5．如权利要求1的方法，其中，所述己糖激酶核酸序列由整合到所述转基因植物细胞的基因组中的转基因编码。
6．如权利要求1的方法，还包括由所述转基因植物细胞生长为转基因植物，从而降低所述转基因植物中所述己糖激酶蛋白的含量。
7．如权利要求1的方法，其中，所述反义己糖激酶核酸序列基于图IF所示的AtHXK1核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
8．如权利要求1的方法，其中，所述反义己糖激酶核酸序列基于图1G所示的AtHXK2核苷酸序列(SEQ ID NO:4)。
9．如权利要求6的方法，其中，所述转基因植物对糖不太敏感。
10．一种表述一种反义己糖激酶核酸序列的植物细胞。
11．如权利要求10的植物细胞，该细胞源于单子叶植物。
12．如权利要求10的植物细胞，该细胞源于双子叶植物。
13．如权利要求10的植物细胞，该细胞源于裸子植物。
14．一种含有一种反义己糖激酶核酸序列的植物表达载体，其中所述序列可操作地连接于一个表达控制区上。
15．一种大体上纯的植物HXK多肽，它含有大体上与AtHXK1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
16．如权利要求15的多肽，其中，所述多肽包括图1B所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
17．如权利要求15的多肽，其中，所述多肽源于单子叶植物。
18．如权利要求15的多肽，其中，所述多肽源于双子叶植物。
19．如权利要求18的多肽，其中，所述双子叶植物是茄科的一员。
20．如权利要求18的多肽，其中，所述双子叶植物是十字花科的一员。
21．如权利要求20的多肽，其中，所述十字花科植物是拟南芥属。
22．如权利要求15的多肽，其中，所述多肽源于裸子植物。
23．一种大体上纯的植物HXK多肽，它含有大体上与AtHXK2的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)相同的氨基酸序列。
24．如权利要求23的多肽，其中，所述多肽包括图1B所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
25．如权利要求23的多肽，其中，所述多肽源于单子叶植物。
26．如权利要求23的多肽，其中，所述多肽源于双子叶植物。
27．如权利要求26的多肽，其中，所述双子叶植物是茄科的一员。
28．如权利要求26的多肽，其中所述双子叶植物是十字花科的一员。
29．如权利要求28的多肽，其中所述十字花科植物是拟南芥属。
30．如权利要求23的多肽，其中，所述多肽源于裸子植物。
31．编码一种植物HXK多肽的大体上纯的DNA，所述多肽含有大体上与AtHXK1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列。
32．如权利要求31的DNA，其中，所述DNA包括图1F所示的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。
33．如权利要求31的DNA，其中所述DNA源于单子叶植物。
34．如权利要求31的DNA，其中所述DNA源于双子叶植物。
35．如权利要求34的DNA，其中所述双子叶植物是茄科的一员。
36．如权利要求34的DNA，其中所述双子叶植物是十字花科的一员。
37．如权利要求36的DNA，其中，所述十字花科植物是拟南芥属。
38．如权利要求31的DNA，其中，所述DNA源于裸子植物。
39．编码一种植物HXK多肽的大体上纯的DNA，所述多肽含有大体上与AtHXK2的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)相同的氨基酸序列。
40．如权利要求39的DNA，其中所述DNA包括图1F所示的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)。
41．如权利要求39的DNA，其中，所述DNA源于单子叶植物。
42．如权利要求39的DNA，其中所述DNA源于双子叶植物。
43．如权利要求42的DNA，其中所述双子叶植物是茄科的一员。
44．如权利要求42的DNA，其中，所述双子叶植物是十字花科的一员。
45．如权利要求44的DNA，其中，所述十字花科植物是拟南芥属。
46．如权利要求39的DNA，其中，所述DNA源于裸子植物。
47．如权利要求31的DNA，其中所述DNA可操作地连接于一个组成型或调节型启动子上。
48．如权利要求39的DNA，其中，所述DNA可操作地连接于一个组成型或调节型启动子上。
49．一种载体，含有权利要求31的大体上纯的DNA，所述载体可以在含有载体的细胞中指导由所述DNA编码的蛋白的表达。
50．一种细胞，它包括权利要求31的DNA。
51．如权利要求50的细胞，所述细胞是一种植物细胞。
52．如权利要求50的细胞，所述植物细胞对糖是超敏的。
53．如权利要求50的细胞，所述植物细胞对糖不太敏感。
54．一种载体，含有权利要求39的大体上纯的DNA，所述载体可以在含有载体的细胞中指导由所述DNA编码的蛋白的表达。
55．一种细胞，它包括权利要求39的DNA。
56．如权利要求55的细胞，所述细胞是一种植物细胞。
57．如权利要求55的细胞，所述植物细胞对糖是超敏的。
58．如权利要求55的细胞，所述植物细胞对糖不太敏感。
59．一种转基因植物，含有整合到所述植物的基因组中的权利要求31的DNA，其中，所述DNA是在所述转基因植物中表达的。
60．如权利要求59的植物，其中，所述DNA是在一种组成型启动子的控制下表达的。
61．如权利要求59的植物，其中，所述DNA是在一种调节型启动子的控制下表达的。
62．一种获自权利要求59的转基因植物的种子。
63．一种转基因植物，含有整合到所述植物的基因组中的权利要求39的DNA，其中，所述DNA是在所述转基因植物中表达的。
64．如权利要求63的植物，其中，所述DNA是在一种组成型启动子控制下表达的。
65．如权利要求63的植物，其中，所述DNA是在一种调节型启动子控制下表达的。
66．一种获自权利要求63的转基因植物的种子。
67．一种生产一种植物HXK多肽的方法，包括(a)提供一种用编码一种多肽的基因转化过的细胞，所述多肽含有大体上与AtHXK1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)相同的氨基酸序列，所述基因的位置适合于在所述细胞中表达；(b)表达所述植物HXK多肽；和(c)回收所述植物HXK多肽。
68．一种生产一种植物HXK多肽的方法，包括(a)提供一种用编码一种多肽的基因转化过的细胞，所述多肽含有大体上与AtHXK2的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)相同的氨基酸序列，所述基因的位置适合于在所述细胞中表达；(b)表达所述植物HXK多肽；和(c)回收所述植物HXK多肽。
69．一种用于提高转基因植物细胞中己糖激酶蛋白含量的方法，所述方法包括在所述转基因植物细胞中表达一种己糖激酶核酸序列。
70．如权利要求69的方法，其中，所述己糖激酶核酸序列包括一个与图1F所示的AtHXK1核苷酸序列(SEQ ID NO:3)大体上相同的DNA序列。
71．如权利要求69的方法，其中，所述己糖激酶核酸序列包括一个与图1G所示的AtHXK2核苷酸序列(SEQ ID NO:4)大体上相同的DNA序列。
72．如权利要求69的方法，其中，所述转基因植物对糖具有增强了的敏感性。
全文摘要
公开了用于操作植物的糖传感能力的方法及基因,涉及降低或提高己糖激酶蛋白在转基因植物中的含量。
文档编号C12N5/10GK1219966SQ97194948
公开日1999年6月16日 申请日期1997年2月27日 优先权日1996年3月25日
发明者J·舍恩, J·C·扬 申请人:综合医院公司