专利名称：酰基转移酶和编码酰基转移酶的基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及分离用于制备糖聚酯的酰基转移酶并涉及编码用于制备糖聚酯的酰基转移酶的基因。
发明的背景糖聚酯是包括但不限于脂肪酸和其它羧酸的葡萄糖和蔗糖酯的各类分子。
糖基中可利用的羟基的部分酰化提供了饲料拒食剂(害虫驱避剂)特性(用于农业)，乳化特性(用于食品和化妆品工业)和柔软特性(用于化妆品工业)。将8个可利用的蔗糖羟基与6至8个脂肪酸酯化提供了非热量的脂肪代用品。
目前，糖聚酯通过合成有机化学技术制备。
发明概述本发明以从植物中分离酰基转移酶为基础，该酶催化提供糖酯和糖聚酯的酯化反应。
在第一个实施方案中，本发明涉及基本上纯的包含序列表SEQ IDNO:8所示序列的酰基转移酶和涉及基本上纯的包含序列表SEQ ID NO:8所示序列以及序列表SEQ ID NO:5和6所示序列的酰基转移酶。
以酰基转移酶的分离为基础，分离了编码酰基转移酶的基因。这些分离的基因对于制备用于生产酰基转移酶的转基因酵母或转基因大肠杆菌或用于制备转化成含有编码酰基转移酶的基因的产生糖聚酯的并经过收获回收糖聚酯的转基因植物有用。
在第二个实施方案中，本发明涉及一种编码酰基转移酶的分离的基因，它含有序列表SEQ ID NO:9所示的序列。
在第三个实施方案中，本发明涉及制备葡萄糖的棕榈酰酯的方法，该方法包括将1-O-棕榈酰-β-D-葡萄糖与葡萄糖或与葡萄糖的棕榈酰部分酯在酰基转移酶存在下反应，所述酰基转移酶包括在序列表SEQ IDNO:8中列出的序列或包括在序列表SEQ ID NO:8中列出的序列并且也包括在序列表SEQ ID NO:5和6中列出的序列。
本文使用的术语“基本上纯化”是指满足纯化到没有污染的蛋白质的标准，即在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上，在还原，或完全变性条件下电泳并且用Ponceau染剂染色，只有一个单一的蛋白质谱带或代表相同蛋白质的不同糖基化水平的多个谱带或代表一个蛋白质或其亚单位或多个亚单位的多个蛋白质谱带和/或满足具有至少35纳开特/毫克的比活性的标准。
详细发明本文所述的酰基转移酶是由野生型西红柿种Lycopersiconpennelli(LA716)的基因组的基因编码的并且是从该种分离和衍生的，所述西红柿品种可以从西红柿遗传资源中心获得。
为了纯化该酶，叶提取物是从本文实施例Ⅰ描述的Lycopersiconpennelli(LA716)的叶制备的并且该酶是从叶提取物获得的，并且是以连续的5个纯化步骤从提取物纯化的。纯化过程的第一个步骤是硫酸铵沉淀步骤，其中该蛋白质是通过加入固体硫酸铵即(NH4)2SO4而沉淀的，将硫酸铵加入到提取物中到80％的饱和度。随后进行离心。保留上清液并且透析。纯化过程的第二个步骤是聚乙二醇沉淀步骤。加入聚乙二醇提供0.15克/毫升。随后进行离心。在弃去沉淀之后，再加入聚乙二醇至终浓度为0.22克/毫升，此时沉淀蛋白质，通过离心收集。纯化过程的第三个步骤涉及在DEAE(二乙氨基乙氧基离子交换成分)琼脂糖上进行离子交换。来自于第二个纯化步骤的蛋白质悬浮液传递过含有DEAE琼脂糖柱，然后利用0-250毫摩尔氯化钾梯度进行洗脱。收集活性组分并且通过超滤浓缩。纯化过程的第四个步骤涉及将来自于第三个纯化步骤的浓缩的活性组分在含有伴刀豆球蛋白A(结合糖的一种蛋白质，有时称之为ConA)的柱上进行亲和层析。糖基化的蛋白质被结合，并且由于分离的酰基转移酶是糖基化的，该酶结合。该第四个纯化步骤涉及用Tris-氢氧化钾(pH7.5)+10％甘油作为加样缓冲液洗涤，然后用Tris缓冲液和10％甘油+50mMα-甲基糖苷首先洗脱以转移以前结合的无关的蛋白质，然后用Tris缓冲液和10％甘油+100mMα-甲基糖苷洗脱所需的酶。收集活性组分并且通过超滤浓缩。该纯化过程的第五个步骤涉及将来自于第四个纯化步骤的浓缩的活性组分在pH梯度4-6条件下，在层析聚焦柱上进行HPLC。再收集活性组分并且通过超滤浓缩。
通过在待测定酶活性的样品存在下，测量1-O-β-(14C-异丁酰)葡萄糖歧化形成1-O-β-(14C-异丁酰)-二-O-(14C-异丁酰)葡萄糖，1-O-β-(14C-异丁酰)-三-O-(14C-异丁酰)葡萄糖，即从1-O-β-(14C-异丁酰)葡萄糖转移[14C]-异丁酰基团到其它1-O-β-(14C-异丁酰)葡萄糖，易于实施测定酶活性的试验。涉及酰基转移的优选的测试描述于下文实施例Ⅰ。
通过测量异丁酰从1-O-异丁酰-β-葡萄糖到(U-14C)葡萄糖的异头转移也可以实施酶活性测试。涉及异头转移的优选的测试如下。该测试是在15微升的总体积中完成的，所述总体积含有50mMHepes pH7.5,10mM二硫苏糖醇，2mM 1-O-异丁酰-β-D-葡萄糖，40μM(U-14C)葡萄糖(2×105cpm)和1-100纳克酰基转移酶。允许反应在37℃进行30分钟，然后上样到硅胶薄层层析板，在氯仿/甲醇/水(75∶22∶3)中洗脱。然后干燥薄层层析板，在自动自显影胶片上曝光，根据显色的自动自显影图象，从该板上刮落对应于2-,3-，和4-(14C-异丁酰)葡萄糖迁移的区域的硅胶，用甲醇洗脱并且通过液体闪烁法定量放射性活性。
详细的酶纯化过程描述于下文的实施例Ⅰ。
在制备酶之后在还原条件下通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，与已知分子量的蛋白质的迁移比较，发现采用上述方法纯化的酰基转移酶由分子量33千道尔顿和22千道尔顿的两个亚单位组成，并且在凝胶渗透柱上具有100,000千道尔顿的天然分子量，并且采用在5％聚丙烯酰胺天然凝胶上，pH3.5-9梯度时进行等电聚焦测定其等电点是5.2。
通过用胰蛋白酶处理从酰基转移酶获得7肽组分，并且测定通过反相高压液相层析(HPLC)分离获得的肽具有序列表中SEQ ID NOS:1-7列出的序列。与基于7肽组分获得的分离基因的序列一致的酰基转移酶的部分序列在序列表的SEQ ID NO:8中列出。
酰基转移酶的功能是催化酰基取代基从1-O-酰基-β-D-葡萄糖异头转移到葡萄糖，2-脱氧葡萄糖，3-O-甲基葡萄糖或部分酰基化的葡萄糖以及催化1-O-酰基-β-D葡萄糖两个分子之间的歧化以导致形成二酰基葡萄糖和葡萄糖。在部分酰基化的葡萄糖中含有的酰基取代基可以例如含有1-18个碳原子并且可以是分支链或直链并且是饱和的或不饱和的，例如可以是异丁醇基或月桂酰或棕榈酰。
由于在自然界中没有发现该反应，与1-O-棕榈酰-β-D葡萄糖的反应据认为是意想不到的。
在催化有效量例如每毫摩尔1-O-酰基-β-D葡萄糖为0.01到1微克的纯化的酰基转移酶存在下，利用化学数量的1-O-酰基-β-D葡萄糖在pH为6.5-7.5的缓冲液或含水介质中，20-40℃时进行10-60分钟易于进行涉及从1-O-酰基-β-D-葡萄糖异头转移到葡萄糖，2-脱氧葡萄糖，3-O-甲基葡萄糖或部分酰基化的葡萄糖的反应。
在催化有效量例如每毫摩尔1-O-酰基-β-D葡萄糖为0.01到1微克的纯化的酰基转移酶存在下，在pH为6.5-7.5的缓冲液或含水介质中，20-40℃时进行10-60分钟易于完成涉及歧化的反应。
例如通过将α-乙酰溴葡糖和异丁酸缩合，随后与向日葵酯酶脱乙酰可以制备1-O-酰基-β-D-葡萄糖起始材料。另一种可选的方法，通过将酰基氯与四苄基葡萄糖在62℃干燥的苯中反应，并且根据Pfeffer,P.E.等人，有机化学杂志41,2925-2927(1976)的程序进行脱保护可以制备1-O-酰基-β-D葡萄糖。
现在我们转向编码酰基转移酶的基因从分离，采用描述于Yerger,E.H.等人，植物生理学99,1-7(1992)的干冰磨损方法从Lycopersiconpennelli叶制备分离的丝状体。将丝状体悬浮于缓冲液中，根据描述于Hunt,M.D.等人，植物分子生物学，21,59-68(1993)的方法，提取总RNA，纯化mRNA。按照Frohman,M.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8998-9002(1982)和Loh,E.Y.，等人，科学243:217-220(1998)描述的程序克隆酰基转移酶基因。由编码酰基转移酶基因的内部部分组成的基因片段按照如下所述从总的纯化的mRNA获得。利用寡聚(dT)15和逆转录酶将总的纯化的mRNA逆转录为cDNA。然后将获得的混合物的试样用于反应混合物进行聚合酶链反应，所述反应混合物含有对应于上面提到的7肽片段的最少的两个简并体的引物混合物和Taq聚合酶。通过琼脂糖凝胶电泳分析聚合酶链反应产物并且从凝胶切除主要的扩增产物，并且洗脱和纯化，连接到用于进行测序的PCRⅡ载体并且测定序列。然后按照下面所述从总的纯化的mRNA获得包括该基因的5’末端的基因片段。用基因特异性引物(基于测定的中间片段的5’末端的部分序列)启动来自于总的纯化的mRNA获得的逆转录产物的试样。获得的cDNA在5’末端是加了dC尾的并且利用具有基于测定的中间片段的5’末端的另一部分序列的嵌合引物和锚引物通过聚合酶链反应扩增5’末端，按照如下所述切除主要的扩增产物并且回收，克隆到用于测序的pAMP1，测定5’末端的序列。接着按照如下所述从总的纯化的mRNA获得包括基因的3’末端的基因片段。利用基因特异性引物(基于测定的中间片段的3’末端的部分序列)进行聚合酶链反应，扩增从总的纯化的mRNA逆转录获得的混合物的试样，利用嵌合引物进行第二轮聚合酶链反应以提供丰富的3’末端cDNA片段。将代表cDNA的3’末端的聚合酶链反应产物克隆到用于测序的pAMP1载体并且测序。已经对cDNA的5’末端和3’末端进行克隆和测序之后，合成对应于这些末端并且也掺入了BamHⅠ和EcoRⅠ限制性位点的引物，按照前面描述的程序将这些引物用于扩增整个基因序列。然后将该基因克隆到大肠杆菌载体pBluescript，该载体已经用BamHⅠ和EcoRⅠ制备，并且转化到用于测序的XL1-蓝细胞，测序反应提供了整个基因的序列。从Lycopersicon pennelli(LA716)分离和鉴定编码酰基转移酶的基因的详细描述在下文的实施例Ⅱ中。在序列表的SEQ ID NO:9中提供了该基因的序列。对应于SEQ ID NO:9的核酸序列的碱基对1-54的氨基酸序列组成了信号肽。因此，SEQ ID NO:1的肽是该酶N-末端的片段。SEQID NO:9的核酸序列指出了对应于SEQ ID NO:4的肽片段的残余部分，在该序列中SEQ ID NO:4序列中位置编号为3的氨基酸是苯丙氨酸而不是异亮氨酸。再者，SEQ ID NO:9的核酸序列指出了对应于SEQ IDNO:7的肽片段的残余部分，在该序列中SEQ ID NO:7序列中位置编号为14的氨基酸是半胱氨酸而不是亮氨酸。SEQ ID NO:9的核酸序列中对应于1-54碱基对的信号肽后面的序列显示由其余的碱基对编码的酰基转移酶应该含有446个氨基酸并且具有约49个千道尔顿的分子量，并且具有在序列表的SEQ ID NO:10中列出的序列。这表明本文的酰基转移酶由小基因簇编码的，并且分离到的基因与编码分离到的酰基转移酶的基因稍微有不同。
由十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(总的55千道尔顿的33千道尔顿和22千道尔顿的亚单位分子量)测定的分子量和从分离的基因的序列推测的成熟蛋白的分子量(49千道尔顿)之间的不同不是经常观察到的，并且不受关心的。该蛋白质是糖基化的，其引起的电泳行为与多肽的质量不一致。小片段(≤20千道尔顿)的曲解的氨基酸组成导致在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳上产生异常的迁移。
通过将整个酰基转移酶cDNA序列插入到啤酒酵母表达载体pYES2以产生质粒pYAGT2并且转化该质粒到啤酒酵母，将分离的基因转移到酵母；通过用半乳糖诱导实现表达。合适的程序详细描述于实施例Ⅲ。
通过克隆到pBluescript并且借助于电击穿将获得的质粒转化到大肠杆菌而将分离的基因转移到大肠杆菌(例如由Stratagene供应的大肠杆菌XL-蓝)；根据供应商的说明利用X-Gal(由Stratagene供应)诱导lac启动子获得表达。
按照Fraley,R.F.等人，CRC植物科学的关键性评论4:1-86(1986)描述的程序将分离的基因用于转化植物，例如烟草植物。
在下面的工作实施例中阐明了本发明的实施方案实施例Ⅰ从Lycopersicon pennelli(LA716)分离和鉴定酰基转移酶从Davis,CA 95616-8746的加利福尼亚大学，蔬菜作物系，西红柿遗传资源中心获得Lycopersicon pennelli(LA716)种子，并且在温室中生长。“LA”的命名是西红柿属的保藏号，是指收集原始种子的地方；在这种情况下是指Peruvian Andes南部的太平洋版面。
利用下面的程序获得叶提取物在500毫升的50mm Hepes·氢氧化钠，pH7.0/250mM蔗糖(其功能是稳定蛋白质)/10mM二硫苏糖醇(抑制提取物氧化为棕色)/1％(W/V)酸-洗涤的聚乙烯吡咯烷酮(结合酚醛塑料)/0.1％(W/V)二乙基二硫氨基甲酸酯(抑制多酚氧化酶)中将200克的冰冻的叶和茎组织匀浆。将匀浆液以15000×g离心20分钟以去除碎片。用固体硫酸将上清液调整到80％的饱和度，在冰上放置30分钟之后，以20000×g离心30分钟。将沉淀悬浮于10毫升的50mMHepes·氢氧化钠，pH7.0/1mM二硫苏糖醇/0.5mM的苯甲基磺酰基氟化物(抑制蛋白酶活性)/10％(体积/体积)甘油(功能是稳定蛋白质)中并且在相同缓冲液中透析。该阶段酰基转移酶的比活性是7.2×10-3纳开特/毫克。
然后利用0.15-0.22克/毫升固体聚乙二醇(分子量3350)沉淀经过透析的提取物。将以20000×g离心30分钟之后获得的沉淀重新悬浮于50mMHepes-氢氧化钠，pH7.0,1mM二硫苏糖醇，0.5mM的苯甲基磺酰基氟化物，10％(体积/体积)甘油。这导致酰基转移酶活性纯化5倍，即纯化到比活性为3.7×10-2纳开特/毫克。将该制剂上样到在相同缓冲液中平衡的DEAE-琼脂糖柱，用10个柱体积的缓冲液洗涤，用0-250mM氯化钾梯度洗脱。由酶促活性监测各个组分的酰基转移酶活性，收集大多数活性组分，在约150mM氯化钾处洗脱，通过超滤浓缩，纯化了23倍，即比活性为0.17纳开特/毫克。然后将样品上样到伴刀豆球蛋白柱，用10倍体积的上样缓冲液洗涤。然后将该柱用50毫升部分上样缓冲液洗涤，回收到50mMα-甲基糖苷。然后用100mMα-甲基糖苷洗脱酰基转移酶活性。然后将该样品在50mM Hepes-氢氧化钠，pH7.0和10％(体积/体积)甘油中透析，通过超滤浓缩，导致产生1274倍纯化的酰基转移酶活性，即比活性为9.4纳开特/毫克。然后将该制剂上样到Mono P高压液相层析聚焦柱，在pH4.8时进行洗脱，总共纯化了5000倍，即比活性为36纳开特/毫克。
制备酶之后在还原条件下通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，与已知分子量的蛋白质的迁移相比测定酰基转移酶的产物由33千道尔顿和22千道尔顿分子量的两个亚单位组成。用于获得这些数据的标准蛋白质是从Sigma化学公司获得的并且具有从66-14.3范围内的分子量。这些标准蛋白质和其分子量是牛血清白蛋白(66千道尔顿)，卵蛋白(45千道尔顿)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(36千道尔顿)，碳酸酐酶(29千道尔顿)，胰蛋白酶原(24千道尔顿)，胰蛋白酶抑制剂(20千道尔顿)，和α-乳清蛋白(14.3千道尔顿)。
利用50mM Hepes-氢氧化钠，pH7.0和10％(体积/体积)甘油洗脱Sephadex G100柱测定天然酶的分子量。分子量标记物由抑肽酶(6.5千道尔顿)，细胞色素c(12.4千道尔顿)，碳酸酐(29.0千道尔顿)，血清白蛋白(66.0千道尔顿)，和醇脱氢酶(150千道尔顿)组成。在这些条件下，酰基转移酶显示相对分子量为100千道尔顿。
通过具有3.5-9pH梯度的5％聚丙烯酰胺天然凝胶上的聚焦电泳测定该酶的等电点。当电泳聚焦完成后，以水平方向将凝胶切成2mM带状片，将各个片悬浮于水中。直接测定这些悬浮液的pH并且检测各个样品的酰基转移酶活性。证明在这些条件下该酶具有5.2的pI。
将纯化5000倍的酰基转移酶上样到SDS-PAGE并且按照由Matsudaira描述的技术(酶学方法182:602-613(1990))电影印到聚(亚乙烯二氯)膜。用Ponceau染剂将该膜染色，切除含该酶的谱带，在甲醇中脱色，重新悬浮于水。用胰蛋白酶处理脱色的膜，利用从0.1％含水三氟乙酸到100％乙腈，0.1％三氟乙酸的梯度通过高压液相层析分离获得的蛋白裂解产物。利用自动埃德曼降解程序7个获得的肽有足够均匀的序列，被测定分别具有SEQ ID NOS:1-7的序列。
通过在待测定酶活性的样品存在下，测量1-O-β-(14C-异丁酰)葡萄糖歧化形成2-,3-，和4-异丁酰葡萄糖，即从1-O-β-(14C-异丁酰)葡萄糖转移(14C-异丁酰)基团到其它1-O-β-(14C-异丁酰)葡萄糖，可以对纯化步骤中酶活性进行测定。
通过(14C-异丁酰)基团从供体1-O-β-(14C-异丁酰)-β-D-葡萄糖到受体1-O-β-(14C-异丁酰)-β-D-葡萄糖的分子间转移，导致较高序的异丁酰葡萄糖酯的形成，测定歧化活性。反应是在15毫升的总体积进行的，所述体积含有50mM Hepes,pH7.5,10mM二硫苏糖醇，1mM 1-O-(14C-异丁酰)-β-D-葡萄糖(105cpm)，和1-100纳克酰基转移酶。允许反应在37℃进行30分钟，然后上样到硅胶薄层层析板并且在氯仿/甲醇/水(75∶22∶3)中洗脱。然后干燥薄层层析板，在自动自显影胶片上曝光，根据显色的自动自显影图象，从该板上刮落对应于2-,3-，和4-(14C-异丁酰)葡萄糖迁移的点的区域的硅胶，用甲醇洗脱并且通过液体闪烁法定量放射性活性。
测试纯化的酶抗羧肽酶底物苄氧羰基-苯丙氨酸-丙氨酸，苄氧羰基-苯丙氨酸-亮氨酸，苄氧羰基-甘氨酸-苯丙氨酸和苄氧羰基-脯氨酸-苯丙氨酸的活性。没有检测到抗这些底物的活性。
实施例Ⅱ从Lycopersicon pennelli(LA716)分离编码酰基转移酶的基因按照Yerger,E.H.等人，植物生理学99,1-7(1992)的干冰磨损方法从Lycopersicon pennelli(LA716)的叶获得分离的丝状体，不同的是首先用纤维玻璃网(1.4平方毫米网眼)将研碎的干冰过筛。将丝状体悬浮于新鲜制备的Tris-盐酸，pH7.0(缓冲液)/1mM氯化镁(蛋白质结构和酶促活性的稳定剂)/0.1％二乙基二硫氨基甲酸酯(具有铜络合剂的作用以抑制多酚氧化酶)/0.1％二硫苏糖醇(具有铜络合剂的作用以抑制多酚氧化酶和作为醌类，多酚氧化酶的反应产物的清除剂)/2％聚乙烯吡咯烷酮(多酚氧化酶抑制剂；具有多酚氧化酶的底物酚醛塑料的清除剂的作用)。
从丝状体悬浮液提取总RNA，根据描述于Hunt,M.D.等人，植物分子生物学，21,59-68(1993)的方法，纯化mRNA。
按照Frohman,M.A.，等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8998-9002(1988)和Loh,E.Y.，等人，科学243:217-220(1980)描述的程序克隆酰基转移酶基因。
由编码酰基转移酶基因的内部片段的序列按照如下所述测定利用寡聚(dT)15和逆转录酶(Superscript Ⅱ RHase H-,Gibco-BRL，根据制造商的说明与0.1微克mRNA在10微升反应中一起使用)将纯化的mRNA逆转录为cDNA。
然后将获得的1微升混合物在100微升的反应混合物中用于聚合酶链反应，所述反应混合物含有10mM Tris-盐酸8.3,50mM氯化钾，1.5mM氯化镁，0.1％(W/V)明胶，200μM dNTPs,3.2μM的20碱基引物PT50(具有序列表中SEQ ID NO:11的序列)，1.6μM引物RE24(具有序列表中SEQ ID NO:12的序列)，和2.5单位的Taq聚合酶。对于SEQ IDNO:12的序列，N表示次黄苷。引物PT50和RE24对应于实施例Ⅰ所述的和描述了序列的7肽至少两个简并体。聚合酶链反应进行下列所述的步骤的34个循环和一个72℃,10分钟循环，所述34个循环任一个包括变性(92℃,1分钟)，退火(50℃,40秒)，和聚合反应(72℃,1分钟)。通过琼脂糖凝胶电泳分析聚合酶链反应产物并且从凝胶切除主要的扩增产物，并且利用GeneCleanⅡ核酸清洁试剂盒(从Bio101购买)，按照制造商的说明进行洗脱和纯化，按照ATR克隆方法(由Invitrogen提供)将它连接到PCRⅡ载体(由Invitrogen提供)，进行DNA测序以验证作为酰基转移酶基因一个成分的扩增片段并且鉴定从纯化的酶获得的对应于胰蛋白酶裂解肽(对应于所使用的引物)的序列，并且提供了引物的测序信息以获得下文描述的酰基转移酶基因的5’末端和3’末端。
然后按照下面所述获得包括该基因的5’末端的基因片段用20碱基对的基因特异性引物(基于上文测定的中间片段的5’末端的部分序列)启动来自于总的纯化的mRNA逆转录产物的混合物试样，所述的引物具有序列表SEQ ID NO:13列出的序列。获得的cDNA在5’末端是加了dC尾的并且利用具有序列表SEQ ID NO:14列出的序列的20个碱基对的嵌合引物(基于上文描述的测定的中间片段的5’末端的另一部分序列)和具有序列表SEQ ID NO:15列出的序列的锚引物(Gibco-BRL catalog#18388-017)通过聚合酶链反应扩增5’末端。对于SEQ ID NO:15的序列，N是次黄苷。按照如上所述切除主要的扩增产物并且回收，按照制造商的说明，克隆到用于测序的pAMP1(Gibco-BRL)，测定序列。
接着按照如下所述获得包括基因的3’末端的基因片段利用用结合到连接物引物的寡聚(dT)引物启动的逆转录从纯化的mRNA合成cDNA。利用Gibco-BRL 3-RACE(快速扩增cDNA末端)试剂盒扩增cDNA的3’末端。在第一轮的扩增中，使用了具有序列表SEQ ID NO:16列出的序列的20个碱基对引物(基于上面描述的测定的中间片段的3’末端的部分序列)。利用在序列表SEQ ID NO:17列出的序列的20个碱基对的嵌合引物(基于上文描述的测定的中间片段的5’末端的另一部分序列)进行第二轮聚合酶链反应，以提供丰富的3’末端cDNA片段。按照制造商的说明将聚合酶链反应产物克隆到pAMP1载体(Gibco-BRL)。
已经对cDNA的5’和3’末端进行克隆和测序之后，合成对应于这些末端并且也掺入了BamHⅠ和EcoRⅠ限制性位点的引物，将它们用于从纯化的mRNA获得的cDNA扩增整个酰基转移酶基因的序列。所使用的引物分别具有序列表SEQ ID NO:18列出的序列(包括该序列的开始的9个碱基的BamHⅠ限制性位点)和序列表SEQ ID NO:19列出的序列(包括该序列的开始的7个碱基的EcoRⅠ限制性位点)。然后将扩增的整个基因克隆到大肠杆菌载体pBluescript(由Stratagene提供)，该载体已经用BamHⅠ和EcoRⅠ制备，并且按照制造商的说明转化到大肠杆菌XL1-蓝细胞(由Stratagene提供)，用于测序。
通过自动的DNA测序程序测定该基因的序列，并且确定具有序列表的SEQ ID NO:9中提供的序列。
实施例Ⅲ将编码酰基转移酶的基因转化到啤酒酵母并且诱导酰基转移酶的表达A．通过将整个酰基转移酶cDNA序列插入到啤酒酵母表达载体pYES2以产生pYAGT2而构建表达克隆pYAGT2通过聚合酶链反应将对应于酰基转移酶的5’和3’末端并且导入了BamHⅠ和EcoRⅠ限制性位点的寡聚核苷酸引物用于直接从cDNA扩增该基因(在实施例Ⅱ分离的)。引物分别具有序列表中SEQ ID NO:18和SEQID NO:19列出的序列。在纯化和用BamHⅠ和EcoRⅠ处理之后，利用T4 DNA连接酶将该基因连接到啤酒酵母表达载体pYES2(Invitrogen)，该pYES2用相同的限制性酶制备。将获得的质粒命名为pYAGT2。为了验证是否连接了正确的基因，将连接反应物转化到XL-1蓝大肠杆菌细胞，并且通过DNA测序从转化体验证正确连接的产物。根据布达佩斯条约的规定，于1996年6月15日将质粒pYAGT2保藏在美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852并且获得保藏号为ATCC97613。
B．pYAGT2转化到啤酒酵母按照Gietz,D.，等人，核酸研究20:1425(1992)描述的程序将啤酒酵母菌株KT1115(MATa leu2-3 leu2-112 ura-52)用作为pYES2转化的受体细胞型。将掉落尿嘧啶的培养基(分子生物学短方案，目前的分子生物学方案的方法概要，Ausubel,FM.，等人，editors，第2版，绿色出版协会和John Wiley和Sons，纽约，1992)用作为选择性培养基。
C．诱导由重组质粒编码的蛋白质的表达将带挡板的发酵瓶用于生长酵母培养物用于表达Lycopersiconpennelli酰基转移酶。将转化的酵母细胞接种到掉落尿嘧啶的培养基(以5％(w/v)的棉籽糖替代2％的(w/v)葡萄糖)，直到OD600达到0.4-0.5。然后将半乳糖加入到最终浓度为2％(w/v)以诱导该蛋白质的表达。在加入半乳糖之后在4,8,24和48小时收集10每升的样品。
D．测定酰基转移酶形式的表达的蛋白质将诱导的细胞离心，用冷水洗涤，然后用冷FT缓冲液，即冷冻和冻融缓冲液100mM Hepes,pH7.5和20％(体积/体积)甘油，0.1％(体积/体积)Triton X-100洗涤。将沉淀的细胞重新悬浮于等体积的冷FT缓冲液并且在-80℃冷冻过夜或更长时间。为了测试活性，将渗透过的细胞在30℃快速冻融并且按照Miozzari(Miozzari,G.F.等人，分析生物化学90:220-223(1978))的描述去除样液。在标准条件下按照如上所述取出10毫升的细胞，利用1-O-(14C-异丁酰)-β-葡萄糖用于测试酰基转移酶活性，仅转化了pYES2载体的啤酒酵母细胞不具有可检测的酰基转移酶活性，在用半乳糖诱导之后的任何时间点产生高级结构的葡萄糖酯。但是，携带含有酰基转移酶基因的pYAGT2质粒的啤酒酵母细胞显示在用半乳糖诱导之后4,8,24小时时间点形成高级结构酯，证明表达了酰基转移酶活性。发现在诱导之后24小时有最高的活性，在48小时的活性稍微低于24小时的活性。
实施例Ⅳ从1-O-棕榈酰-β-D-葡萄糖和葡萄糖制备一棕榈酰葡萄糖在干燥苯，62℃时将四苯甲基葡萄糖(1.8克，3.3毫摩尔)，Pfanstiehl化学公司与棕榈酰氯(Sigma化学公司)反应并且采用Pfeffer,P.E.等人，有机化学杂志41,2925-2927(1976)程序脱保护以产生1-O-棕榈酰-β-D-葡萄糖。
在15微升的50mM Hepes-氢氧化钠，pH7.0(缓冲液)，10mM氯化镁(蛋白质结构和酶促活性的稳定剂)，和10mM二硫苏糖醇(多酚氧化酶的稳定剂；具有酮络合剂和作为醌类，多酚氧化酶的反应产物的清除剂的作用，也通过保持酰基转移酶的必要的Cys残基的还原形式促进高级结构酯化)的混合物中制备含有2mM 1-O-棕榈酰-β-D-葡萄糖，40μM(U-14C)葡萄糖(2×105cpm)和1毫克/毫升的酰基转移酶蛋白质(比活性为4×10-2纳开特/毫克)的反应混合物并且在37℃进行保温。采用Ghangas,G.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:9911-9915(1993)描述的TLC监测反应进展。在1小时之后，2小时之后和3小时之后，一酰基(14C)葡萄糖的％cpm分别是2.3,4.4和4.7。
当以1-O-异丁酰-β-D-葡萄糖替代1-O-棕榈酰-β-D-葡萄糖时，在1小时之后，2小时之后和3小时之后，一酰基(14C)葡萄糖的％cpm分别是3.08,5.80和6.20。
实施例Ⅴ从1-O-棕榈酰-β-D-葡萄糖制备二棕榈酰葡萄糖在0.5毫升的50mM的Pi钠，pH6.5中，42℃，将来自于Lycopersicon pennelli的1毫克酰基转移酶(比活性约0.037纳开特/毫克)和1-O-棕榈酰-β-D-葡萄糖(0.1mM)和80μM(U-14C)葡萄糖(2×107cpm)保温2小时。通过加入1毫升的冷乙醇终止反应，在离心之后，回收上清液，浓缩并且在制备性的TLC板上样以分离1-O-棕榈酰-β-D-葡萄糖谱带。
制备含有3×104cpm 1-O-棕榈酰-β-D-(14C-葡萄糖)，和50mM Hepes-氢氧化钠，pH7.0,10mM二硫苏糖醇(抑制氧化为棕色)，10mM氯化镁(蛋白质结构的稳定剂)和酰基转移酶(3.6毫克/毫升蛋白质；比活性为0.037纳开特/毫克)的15微升的反应混合物并且在37℃进行保温。采用Ghangas,G.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:9911-9915(1993)描述的TLC分离和监测产物。副产物(14C)葡萄糖总％cpm是40％，表明出现了歧化反应以提供二棕榈酰葡萄糖。
当以1-O-异丁酰-β-D-葡萄糖替代1-O-棕榈酰-β-D-葡萄糖时，副产物(14C)葡萄糖总％cpm是44.8％，表明出现了歧化反应以提供二异丁酰葡萄糖。
实施例Ⅵ从1-O-棕榈酰-β-D-葡萄糖制备三棕榈酰葡萄糖在37℃将含有1-O-棕榈酰-β-D-葡萄糖(1mM),(U-14C)葡萄糖(2×105cpm)和溶于100mM磷酸钠pH6.5的2.5毫克的Lycopersicon pennelli LA716叶粗提取物蛋白质/毫升的15微升反应混合物保温28小时。采用Ghangas,G.S和Steffens JC,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:9911-9915(1993)描述的TLC分离和监测产物。转化为三棕榈酰葡萄糖的总cpm相当于8pmol。在相同反应中形成的一和二棕榈酰葡萄糖分别是2660和459pmol。在相同条件下，1-O-异丁酰-β-D-葡萄糖分别产生3410,34和14pmol的一，二和三异丁酰葡萄糖。
对本领域内技术人员来说对本发明进行改变是显而易见的。因此本发明由下面的权利要求定义。
序列表(1)总的资料(ⅰ)申请人Cornell研究基金公司(ⅱ)发明名称酰基转移酶和编码酰基转移酶的基因(ⅲ)序列数19(ⅳ)通信地址(A)收信人The Procter&Gamble Company(B)街道5299 Spring Grove大道(C)城市Cincinnati，(D)州Ohio(E)国家美国(F)邮编45217-1087(ⅴ)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0,#1.25版(ⅵ)当前申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(ⅶ)先前的申请资料(A)申请号US08/665966(B)申请日1996年6月21日(ⅷ)代理机构/代理人资料(A)姓名T.David Reed(B)登记号32931(C)档案号6479#/KL(ⅸ)电信资料(A)电话513-627-7025
(B)传真513-627-6333(2)SEQ ID NO:1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度12个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1Glu His Phe Ile Val Glu Thr Leu Pro Gly Phe His15 10(2)SEQ ID NO:2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Leu Glu Leu Asn Ser Tyr Ser Trp15(2)SEQ ID NO:3的资料(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Ile Tyr Asp Gly Ile Glu Val Gly Asp Arg Pro1 5 10(2)SEQ ID NO:4的资料(ⅰ)序列特征
(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Gly Tyr Ile Gln Gly Asn Ala Leu Thr Asp Arg1 5 10(2)SEQ ID NO:5的资料(ⅰ)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Ser Ile Asp Phe Asn Gly Arg1 5(2)SEQ ID NO:6的资料(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Tyr Ala Asn His Met Gly Leu Ile Ser Asp Lys1 5 10(2)SEQ ID NO:7的资料(ⅰ)序列特征
(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:
Asn Gly Asn Tyr Ile Asp Val Asp Pro Asn Asn Ile Leu Leu Leu Asn15 10 15Asp(2)SEQ ID NO:8的资料(ⅰ)序列特征(A)长度179个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Glu His Phe Ile Val Glu Thr Leu Pro Gly Phe His Gly Lys Leu Pro1 5 10 15Phe Leu Thr Glu Thr Gly Thr Ile Ser Val Gly Glu Glu Glu Lys Val202530Gln Leu Phe Tyr Phe Phe Val Gln Ser Glu Arg Asp Pro Arg Asn Asp35 40 45Pro Leu Met Ile Trp Leu Thr Gly Gly Pro Gly Cys Ser Gly Leu Ser5055 60Ser Leu Val Tyr Glu Ile Gly Pro Leu Thr Phe Asp Tyr Ala Asn Ser65 70 75 80Ser Gly Asn Phe Pro Lys Leu Glu Leu Asn Ser Tyr Ser Tyr Thr Lys85 90 95Val Ala Asn Ile Ile Phe Ile Asp Gln Pro Ala Gly Thr Gly Tyr Ser100 105 110Tyr Ala Asn Thr Ser Glu Ala Tyr Asn Cys Asn Asp Thr Leu Ser Val115 120 125Thr Leu Thr Tyr Asp Phe Leu Arg Lys Trp Leu Met Asp His Pro Glu130 135 140Tyr Leu Asn Asn Pro Leu Tyr Val Gly Gly Asp Ser Tyr Ser Gly Ile145 150 155160Phe Val Ala Leu Leu Thr Arg Lys Ile Tyr Asp Gly Ile Glu Val Gly165 170175Asp Arg Pro(2)SEQ ID NO:9的资料(ⅰ)序列特征(A)长度1604个碱基对(B)类型核酸(C)链数双链(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)姓名/关键词CDS(B)位置55..1392(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:ATGGCGCGGG TCACACTGTT TCTATTGCTG CTACTTGTATACGGTGTAGT CTCCGAG57Glu1CAC TTC ATT GTT GAA ACT CTT CCT GGG TTT CAT GGA AAA CTT CCATTT 105His Phe Ile Val Glu Thr Leu Pro Gly Phe His Gly Lys Leu Pro Phe510 15ACA CTC GAA ACT GGT TAT ATT AGT GTT GGA GAA GAG GAA AAAGTG CAG 153Thr Leu Glu Thr Gly Tyr Ile Ser Val Gly Glu Glu Glu Lys Val Gln202530CTA TTT TAT TTC TTT GTA CAA TCT GAG AGA GAC CCA CGA AAT GATCCT 201Leu Phe Tyr Phe Phe Val Gln Ser Glu Arg Asp Pro Arg Asn Asp Pro3540 45CTC ATG ATT TGG CTC ACC GGA GGT CCT GGT TGT TCT GGT CTG TCTTCC 249Leu Met Ile Trp Leu Thr Gly Gly Pro Gly Cys Ser Gly Leu Ser Ser50 55 60 65TTA GTA TAT GAA ATT GGC CCT TTA ACC TTT GAT TAT GCA AAT TCTAGT 297Leu Val Tyr Glu Ile Gly Pro Leu Thr Phe Asp Tyr Ala Asn Ser Ser7075 80GGA AAT TTC CCG AAA CTG GAG TTG AAC TCA TAT TCT TGG ACCAAG GTG 345Gly Asn Phe Pro Lys Leu Glu Leu Asn Ser Tyr Ser Trp Thr Lys Val85 90 95GCA 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AAG GAG AGA ACCGAG TCA 1065Arg Cys Asn Glu Ser Met His Tyr Arg Gly Lys Glu Arg Thr Glu Ser325 330 335TAT GTG TAT GAT GTC CCA AGT GTC ATT GAT GAT CAT CAA CAT CTCACC 1113Tyr Val Tyr Asp Val Pro Ser Val Ile Asp Asp His Gln His Leu Thr340 345350AGC AAA TCC TGT CGA GCA CTA ATT TAC AGT GGT GAC CAT GACATG GTT 1161Ser Lys Ser Cys Arg Ala Leu Ile Tyr Ser Gly Asp His Asp Met Val355 360 365GTT CCT CAT TTG AGC ACG GAG GAA TGG ATA GAG ACT TTG AAACTT CCA 1209Val Pro His Leu Ser Thr Glu Glu Trp Ile Glu Thr Leu Lys Leu Pro370 375 380 385ATT GCA GAT GAT TGG GAG CCT TGG TTT GTT GAC GAT CAA GTAGCA GGA 1257Ile Ala Asp Asp Trp Glu Pro Trp Phe Val Asp Asp Gln Val Ala Gly390395 400TAC AAA GTG AAG TAT TTA CAA AAT GAT TAT GAA ATG ACA TATGCA ACT 1305Tyr Lys Val Lys Tyr Leu Gln ASn Asp Tyr Glu Met Thr Tyr Ala Thr405 410 415GTT AAG GGT GCG GGG CAT ACT GCT CCT GAA TAC AAG CCA GAACAA TGC 1353Val Lys Gly Ala Gly His Thr Ala Pro Glu Tyr Lys Pro Glu Gln Cys420 425430CTG CCC ATG GTT GAT AGG TGG TTT TCC GGT GAC CCT CTTTGATTTCACC1402Leu Pro Met Val Asp Arg Trp Phe Ser Gly Asp Pro Leu435 440 445CTTGCAAGAC ATTAATGTAC TCATTTGTTT CTCTGGATTGACATAAGCTT GCTTCTTTGA 1462GCAACATCAC ATTAAGCTTG TCTGTCATGT AATCTTGACATGTAAAATCA CACATTAAAA 1522AGTATATATC ATTCGAGGTT GACGTTAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1582AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 1604(2)SEQ ID NO:10的资料(ⅰ)序列特征(A)长度446个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Glu His Phe Ile Val Glu Thr Leu Pro Gly Phe His Gly Lys Leu Pro1 51015Phe Thr Leu Glu Thr Gly Tyr Ile Ser Val Gly Glu Glu Glu Lys Val20 25 30Gln Leu Phe Tyr Phe Phe Val Gln Ser Glu Arg Asp Pro Arg Asn Asp35 4045Pro Leu Met Ile Trp Leu Thr Gly Gly Pro Gly Cys Ser Gly Leu Ser505560Ser Leu Val Tyr Glu Ile Gly Pro Leu Thr Phe Asp Tyr Ala Asn Ser6570 75 80Ser Gly Asn Phe Pro Lys Leu Glu Leu Asn Ser Tyr Ser Trp Thr Lys8590 95Val Ala Asn Ile Ile Phe Ile Asp Gln Pro Ala Gly Thr Gly Tyr Ser100 105 110Tyr Ala Asn Thr Ser Glu Ala Tyr Asn Cys Asn Asp Thr Leu Ser Val115 120125Thr Leu Thr Tyr Asp Phe Leu Arg Lys Trp Leu Met Asp His Pro Glu130 135 140Tyr Leu Asn Asn Pro Leu Tyr Val Gly Gly Asp Ser Tyr Ser Gly Ile145 150 155160Phe Val Ala Leu Leu Thr Arg Lys Ile Tyr Asp Gly Ile Glu Val Gly165 170175Asp Arg Pro Arg Val Ile Ile Lys Gly Tyr Phe Gln Gly Asn Ala Leu180 185190Thr Asp Arg Ser Ile Asp Phe Asn Gly Arg Val Lys Tyr Ala Asn His195200 205Met Gly Leu Ile Ser Asp Lys Ile Tyr Gln Ser Ala Lys Ala Asn Cys210 215 220Asn Gly Asn Tyr Ile Asp Val Asp Pro Asn Asn Ile Leu Cys Leu Asn225 230 235 240Asp Leu Gln Lys Val Thr Arg Cys Leu Lys Asn Ile Arg Arg Ala Gln245 250 255Ile Leu Glu Pro Tyr Cys Asp Leu Pro Tyr Leu Met Gly Ile Leu Gln260 265 270Glu Thr Pro Thr Asn Gly Gln Ser Val Phe Pro Ile Ala Gly Pro Trp275280 285Cys Arg Glu Lys Asn Tyr Ile Tyr Ser Tyr Val Trp Ala Asn Asp Lys290 295 300Ala Val Gln Lys Ala Leu Ser Val Arg Glu Gly Thr Thr Leu Glu Trp305 310 315 320Val Arg Cys Asn Glu Ser Met His Tyr Arg Gly Lys Glu Arg Thr Glu325 330 335Ser Tyr Val Tyr Asp Val Pro Ser Val Ile Asp Asp His Gln His Leu340 345 350Thr Ser Lys Ser Cys Arg Ala Leu Ile Tyr Ser Gly Asp His Asp Met355 360365Val Val Pro His Leu Ser Thr Glu Glu Trp Ile Glu Thr Leu Lys Leu370 375380Pro Ile Ala Asp Asp Trp Glu Pro Trp Phe Val Asp Asp Gln Val Ala385 390 395 400Gly Tyr Lys Val Lys Tyr Leu Gln Asn Asp Tyr Glu Met Thr Tyr Ala405 410 415Thr Val Lys Gly Ala Gly His Thr Ala Pro Glu Tyr Lys Pro Glu Gln420 425 430Cys Leu Pro Met Val Asp Arg Trp Phe Ser Gly Asp Pro Leu435 440 445(2)SEQ ID NO:11的资料(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)序列描述SEQ ID NO:11:
GARCAYTTYA TYGTKGARAC20(2)SEQ ID NO:12的资料(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)姓名/关键词misc-特征(B)位置3(C)其它信息/注释=“N是次黄苷”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:ARNCCCATRT GRTTWGCRTA20(2)SEQ ID NO:13的资料(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)几何结构线性
(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:ATCTGTTAGA GCATTGCCTT20(2)SEQ ID NO:14的资料(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO:14:GCCTGTCACC AACTTCAATA20(2)SEQ ID NO:15的资料(ⅰ)序列特征(A)长度48个碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)姓名/关键词mis-特征(B)位置36(D)其它信息/注释=“N是次黄苷”(ⅸ)特征(A)姓名/关键词mis-特征(B)位置37(D)其它信息/注释=“N是次黄苷”(ⅸ)特征(A)姓名/关键词mis-特征
(B)位置41(D)其它信息/注释=“N是次黄苷”(ⅸ)特征(A)姓名/关键词mis-特征(B)位置42(D)其它信息/注释=“N是次黄苷”(ⅸ)特征(A)姓名/关键词mis-特征(B)位置46(D)其它信息/注释=“N是次黄苷”(ⅸ)特征(A)姓名/关键词mis-特征(B)位置47(D)其它信息/注释=“N是次黄苷”(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:CUACUACUAC UAGGCCACGC GTCGACTAGT ACGGGNNGGGNNGGGNNG 48(2)SEQ ID NO:16的资料(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:GTTGGAGAAG AGGAAAAAGT 20(2)SEQ ID NO:17的资料(ⅰ)序列特征(A)长度20个碱基对
(B)类型核酸(C)链数单链(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:TACAATCTGA GAGAGACCCA 20(2)SEQ ID NO:18的资料(ⅰ)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18AAGGATCCAA TGGCGCGGGT CACACTGTT 292)SEQ ID NO:19的资料(ⅰ)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链数单链(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19AGAATTCTTA ACGTCAACCT CGAATGA 2权利要求
1．基本上纯化的酰基转移酶，它包括序列表中SEQ ID NO:8列出的序列。
2．根据权利要求1所述的基本上纯化的酰基转移酶，它另外还包括序列表中SEQ ID NO:5和6列出的序列。
3．根据权利要求2所述的基本上纯化的酰基转移酶，它包括序列表中SEQ ID NO:10列出的序列。
4．纯化的酰基转移酶，它包括序列表中SEQ ID NOS:1-7列出的序列。
5．一种分离的编码酰基转移酶的基因，所述基因包括序列表中SEQID NO:9列出的序列。
6．用于制备葡萄糖的棕榈酰酯的方法，它包括在含有序列表中SEQID NO:8列出的序列的酰基转移酶存在下将1-O-棕榈酰-β-D-葡萄糖与葡萄糖或与葡萄糖的棕榈酰部分酯反应。
全文摘要
本发明提供了基本上纯化的酰基转移酶,该酶具有催化形成糖酯的反应的功能。本发明也提供了分离的编码酰基转移酶的基因。本发明还提供了一种制备葡萄糖的棕榈酰酯的方法,包括在催化有效量的酰基转移酶存在下将1－O－棕榈酰－β－D－葡萄糖与葡萄糖或与葡萄糖的棕榈酰部分酯反应。
文档编号C12N9/10GK1224466SQ97195679
公开日1999年7月28日 申请日期1997年6月18日 优先权日1997年6月18日 公开号97195679.0
发明者J·C·斯蒂芬斯, G·S·格汉加斯 申请人:科奈尔研究基金会公司 被以下专利引用 (1),