致病性大肠杆菌相关蛋白的制作方法

专利名称：致病性大肠杆菌相关蛋白的制作方法
技术领域：
概括地说，本发明是关于致病性微生物的毒力，更具体地说，是关于与致肠道病细菌有关的毒力因子。
背景技术：
抗生素已经使用了多年，成功地治疗了多种细菌感染。但是，细菌对抗生素的抗性，在以往的的若干年内已经成为日益严重的问题。许多病原菌现在已对几种抗生素有抗性，在某些情况下，它们引起的疾病已不再能用常规的抗生素治疗。尽管抗生素有过去成功的历史，但是，在以往的二十年间，即使有，也只发展了少数几种新的抗生素。还对现有的药物引入了新的改变，但是，通常在短时间内，对这些化合物又产生了抗性。
很多研究已表明，如果使编码毒力因子的基因发生突变，含有此基因的有机体则不再有致病性。另外，如果对宿主作预防毒力因子的接种，则常常可以阻止疾病发生。但是，尚未有研究表明，对毒力因子的特异性抑制能减少疾病的发生。
已对毒素、粘附、侵入和细胞内产生感染的作用机制进行了研究。但是，每种毒力因子采用不同的机制，这就使发展广谱抑制剂成为不可能。每一个被认为可能是治疗靶标的保守因子，都是一个双组成的调节系统。但是，此系统对毒力因子不是特异性的，并在几个细菌管家系统中被使用。加之在真核细胞系统中已发现了这些系统，如果使用抑制剂，将增加对宿主毒性的危险性。为了发展理想的抗感染剂，抗生素影响的细菌致病机制对许多病原体应该是通用的，对致病机制是特异性的，而在宿主细胞中不存在。最近发现的这样一个系统是细菌Ⅲ型分泌系统。
革兰氏阴性菌利用专门的机构排出分子跨越它们的双层膜和外原生质，这是一个将毒力因子转移到细菌表面的关键性过程，在细菌表面它们才能与宿主成分相互作用。革兰氏阴性菌分泌作用已被区分为四种主要的途径。第一是Ⅰ型分泌作用，是小分子毒素家族和大肠杆菌原型溶血素采用的分泌作用。第二是Ⅱ型分泌系统，是大多数革兰氏阴性菌用以排出包括某些毒力因子的多种分子的主要输出途径；它与哺乳动物的药物抗性有相同的机制。第三是Ⅳ型分泌系统，它被编码在分泌产物内，作为分泌机制的一部分切割自身；奈瑟氏球菌属(Neisseria)IgA蛋白酶是此系统的原型。第四是Ⅲ型途径，是最近发现的分泌途径。
Ⅲ型分泌系统最初被描述是作为耶尔森氏菌属(Yersinia)分泌毒力蛋白YOPs的分泌系统，它对耶尔森氏菌的毒力是关键性的。尔后在几种植物病原体中发现了同源分泌系统，包括丁香假单胞菌，青枯假单胞菌和野油菜黄单胞菌。这些植物病原菌利用这种分泌路径分泌对引起植物疾病所需要的毒力因子(harpins及其它的)。虽然分泌系统相似，但是harpins和YOPs(即所分泌的毒力因子)不是同源多肽。更最近在其它一些病原菌中，发现了对毒力所必需的另外几种Ⅲ型分泌系统。这些系统包括沙门氏菌属(Salmonalla)和志贺氏菌属(Shigella)用于进入细胞和引起疾病的侵染系统。在沙门氏菌属中还发现了另一个对疾病起决定性作用的Ⅲ型分泌系统，虽然对此路径的分泌产物和毒力机制尚未确定。绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)具有分泌胞外酶S，一种蛋白质毒力因子，所必需的Ⅲ型分泌系统。
致肠病大肠杆菌(EPEC)是婴儿腹泻的主要原因，是发现引起胃肠炎的第一个大肠杆菌(大肠杆菌)。致肠道病大肠杆菌激活宿主上皮细胞的信号传导途径，并引起细胞骨架重排，同时形成底坐状和附着/表面损伤性病灶。
可用三阶段模型描述致肠道病大肠杆菌的致病机理。开始是定位粘附于上皮细胞，是由TV型细菌纤毛介导的，随后是激活宿主上皮细胞信号传导途径，并紧密地附着在宿主细胞上。最后的二步被统称为附着和表面损伤。宿主上皮细胞内的信号传导作用包括，激活宿主细胞酪氨酸激酶的活性，导致90千道尔顿的宿主膜蛋白Hp90的酪氨酸磷酸化，以及流出细胞内的磷酸肌醇(IP3)和钙。经过这种信号传导作用之后，细菌紧密地粘附于上皮细胞的表面，同时损伤了宿主上皮细胞的微绒毛，并在细菌下面堆积了细胞骨架蛋白。
发明概述本发明是基于在致病菌中例如致肠道病大肠杆菌中发现的一种与毒力有关的蛋白质。
对eaeA和espB之间肠道细胞表面损伤基因座(Locus of EnterocyteEffacemant)的DNA序列分析，发现了一个与25千道尔顿致肠道病大肠杆菌分泌蛋白氨基末端序列匹配的基因(espA)。在espA中带有插入序列的突变体不分泌这种蛋白质，也不能激活上皮细胞信号传导作用或引起细胞骨架重排。但是，这些功能可以通过一个克隆化野生型espA基因来弥补。
对分别编码分泌性毒力因子EspA和EspB的二个致肠道病大肠杆菌基因espA和espB，进行了克隆和测序。已表明这些蛋白质与宿主上皮细胞信号传导路径和侵染过程的启动有关。因为EspA是一种分泌性蛋白，所以它理想地适合用于与所需多肽连接的融合蛋白中。
Ⅲ型分泌路径是潜在抑制剂理想的靶标，因为它是在细菌中发现的一条毒力因子特异性的保守性路径。本发明提供了一种方法，用于鉴定Ⅲ型分泌系统的抑制剂。本发明的目标是指向发展新的抗菌治疗法。不同于其它抗生素，通过本发明的方法鉴别的化合物并不杀死病原菌或抑制病原菌生长；而是这种化合物将阻止分泌对引起疾病起决定性作用的毒力因子。因为Ⅲ型分泌系统是在多种病原菌中显示较大程度保守性的首要毒力机制，所以借助于本发明方法鉴别的某些化合物将是广谱性治疗剂。其优点是将可能找到一种可用于治疗某些人，动物和植物疾病的新治疗剂。
附图简要说明

图1显示espA的核苷酸序列和推导的氨基酸序列(在此分别被称为SEQID NO:1和SEQ ID NO:2)。对可能的核蛋白体结合位点下面加线标明。包含在引物Donne-99和Donne-100中的位于在pLCL121中构建的缺失侧翼的核苷酸加阴影标明。
图2显示espA中非极性突变的构建。引物Donne-90和其反引物被用于扩增含有基因5′部分的片段，然后被克隆进入pCRscript，构成pLCL119。引物Donne-100和此通用引物用于扩增含3′部分的片段，该片段被克隆进入pCR script，构成pLCL120。将新NruⅠ位点掺入Donne-99和Donne-100中，以便pLCL120的NrnⅠ-SalⅠ片段可被克隆进入pLCL119，构成pLCL121，在其espA基因中有一个150bp的缺失。将来自pUC 18K的SmaⅠ片段克隆进入pLCL 121的NruⅠ位点，构成pLCL 122，此pUC 18K中含有aphA-3卡那霉素抗性基因。这种插入导致aphA-3基因的转录融合和espA基因3′末端的翻译融合，同时保存espA读框。核糖体结合位点下面被加线标明。
图3表示质粒的基因图谱，质粒中含有RDEC-1(A)和致肠道病大肠杆菌(EPEC)(B)的espA,espD和espB基因。箭头指示在espA和espB中作终止密码子插入的位置(A)，以及被构建进入espD中BglⅡ位点的移码突变(B)。espB中250碱基对的缺失被用//标记出。实心粗线和空心粗线表示开放读框和预测的开放读框。限制性内切酶以如下标明Bam,BamHⅠ；Ec,EcoRⅠ；Bg,BglⅡ；Xb,XbaⅠ；Sa,SalⅠ。
图4显示RDEC-1 espA的核苷酸序列(A)(在此分别称为SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4)，以及espB的核苷酸序列(B)(在此分别称为SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6)。星号指示终止密码子。可能的核糖体结合位点下面被加线标明。预测的EspA和EspB氨基酸序列在C)中排列成直线(SEQ IDNO:7-10)。阴影区域表示完全相同。已被存入EMBL GenBank(欧洲分子生物学实验室核酸序列)的核苷酸和氨基酸序列，以及它们的检索号码如下RDEC-1 espA(U80908),RDEC-1 espB(U80796)，致肠道病大肠杆菌E2348/69株的espA(Z54352)，致肠道病大肠杆菌E2348/69株的espB(Z21555)，致肠道病大肠杆菌E2348/69株的espD(Y09228)，致肠道出血大肠杆菌EDL933血清型0157株的espB(X96953)，致肠道出血大肠杆菌413/89-1血清型026株的espB(X99670)。
详细说明本发明提供了一种被称为EspA的多肽，它是由致病性大肠杆菌，如致肠道病大肠杆菌(EPEC)和致肠道出血大肠杆菌(EHEC)分泌的。对由这种致病性大肠杆菌引起疾病的诊断可借助可标准的技术进行，例如那些基于应用抗体的技术，此抗体能与EspA结合而对此蛋白质进行检测，以及那些基于应用核酸探针的技术，用于检测编码EspA多肽的核酸。本发明还提供了编码EspA多肽的分离的核酸序列，EspA肽，用于产生重组EspA的重组构建方法，能与EspA结合的抗体，以及用于检测产生EspA的大肠杆菌的试剂盒。本发明还提供了一种以EspA免疫宿主，以便诱发对EspA预防性免疫反应的方法。
本发明的优选实施方案在以下附图和详述具体叙述。一旦…的细节。
在此使用的名称“EspA”(EPEC Secreted〔or signaling〕Protein A,EPEC分泌〔信号〕蛋白A)指的是一种多肽，它是来自致肠道病或致肠出血大肠杆菌的分泌性蛋白，通过SDS-PAGE测定具有大约25千道尔顿的分子量。EspA是致肠道病大肠杆菌分泌的蛋白质，它对激活上皮细胞信号传导，紧密接触，并形成附着和表面损伤病灶，激活与疾病相关的过程是必需的。上皮细胞是示例性细胞。
在此使用的名词“多肽”，包括其任何天然存在的等位基因变异体以及人工重组体形式。在此使用的EspA多肽，既包括天然存在的形式，也包括重组体形式，即某种蛋白质和肽的非天然存在形式，它与天然存在的EspA肽充分地相似，使之具有引起致病性的类似功能。这种多肽的实例包括来自致肠道病大肠杆菌和致肠道出血大肠杆菌的EspA多肽，但是不局限于这些。蛋白质和多肽还包括其衍生物，相似物和拟态肽。另一方面，EspA肽可以用本领域技术人员熟知的合成技术进行化学合成，优选地是使用自动肽合成仪，以NaFmoc氨基酸在聚乙二醇-聚苯乙烯(PEGPS)接合树脂上进行合成。例如可利用适当的接头如肽酰胺接头(PAL)，形成碳氧酰胺(Carboxamide)末端基团。
名词“基本上纯的”在此用于描述一种分子如多肽(例如EspA多肽，或者其片断)，其中基本上不含有其它蛋白质，脂类，碳水化合物，核酸和天然与它结合的其它生物物质。例如，一种基本上纯的分子如多肽，可以是至少60％的干重是所需分子。本领域的技术人员可用标准的蛋白质纯化法纯化EspA多肽，用标准的方法测定此多肽的纯度，这些方法包括例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(如SDS-PAGE)，柱层析(如高效液相层析法(HPLC))，以及氨基末端氨基酸序列分析。
本发明的EspA多肽可以具有一个来自人或家兔致肠道病大肠杆菌的EspA氨基酸序列，例如图1或图4的氨基酸序列。EspA多肽，如在图1和4中显示的多肽，可通过以SDS-PAGE测定时，具有大约25kD分子量对其进行鉴定。
具有与EspA多肽序列例如图1和4中的EspA多肽，基本上相同序列的多肽也包括在本发明中。“基本上是相同的”氨基酸序列，是仅通过保守氨基酸的替代而不同于标准序列的序列，例如以一个氨基酸代替另一个同类氨基酸(例如以一个疏水性氨基酸如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸，代替另一个疏水性氨基酸，或者以一个极性氨基酸代替另一个极性氨基酸，例如以精氨酸代替赖氨酸，以谷氨酸代替天冬氨酸，或以谷氨酰胺代替天冬酰胺)，或者是通过一个或几个非保守替代，缺失，或插入而不同于标准序列的序列，只要该多肽还保留至少一种EspA特异性活性或一个EspA特异性表位。例如，EspA多肽中可缺失一个或几个氨基酸，导致多肽结构发生改变，而不明显地改变其生物活性。例如对EspA生物活性不是必需的氨基末端或羧基末端的氨基酸可以被除去。这种修饰可导致产生较小活性的EspA多肽。
包括在本发明中的其他EspA多肽是，具有与EspA多肽的氨基酸序列，如图1和4中EspA的氨基酸序列，有至少50％相同氨基酸序列的多肽。在氨基酸序列同源性的测定中，比较的长度可以是例如至少15个氨基酸，或者至少20,25或35个氨基酸。可以用标准的序列分析软件(例如GeneticComputer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,WI 53705的序列分析软件包；也可参见Ausubel等，同上)。
本发明还包括保留至少一种EspA特异性活性或表位的EspA多肽片段。例如，含有至少8-10个氨基酸的EspA多肽片段，可在产生EspA特异性抗体中用作免疫原。此片段可以含有，例如，EspA中保守的氨基酸序列。除了用作肽免疫原之外，上述EspA片段还可以用于免疫测定，如ELISA，检测样品中EspA特异性抗体的存在。
用任何一种标准的方法都可以获得本发明的EspA多肽。例如，EspA多肽可以在标准的重组表达系统中产生(见下面)，通过化学合成(这种方法可能仅局限于EspA小肽片段)，或者从它们在其中被天然表达的组织中纯化得到(参见例如Ausubel,et al，同上)。
本发明还提供了编码上述EspA多肽的分离的核酸分子以及其片段。例如，编码如图1和4中EspAs的核酸被包括在本发明中。这些核酸可以含有天然存在的核苷酸序列(见图1和4)，或者可以是由于遗传密码的简并，而不同于编码EspAs的天然核酸但编码相同氨基酸的核苷酸序列。本发明的核酸可以含有DNA或RNA核苷酸，二者的组合或其修饰形式。
用“分离的核酸”意指不与5′和3′侧翼序列直接邻接的核酸如DNA或RNA分子，当存在于其来源生物体的天然存在的基因组中时，正常情况下是与这种侧翼序列直接邻接，因此该名词是描述例如被整合进载体如质粒或病毒载体中的核酸；被整合进异种细胞基因组中(或者是同种细胞的基因组中，但是在不同于其自然存在的位点上)的核酸；以及作为单独分子存在的核酸，如通过PCR扩增或限制性内切酶消化产生的DNA片段，或通过体外转录产生的RNA分子。该名词还用于描述构成编码辅助多肽序列的杂合基因一部分的重组核酸，该辅助多肽序列可用于例如产生融合蛋白。
本发明的核酸分子在产生EspA基因产物(如EspA RNA和EspA多肽，见下文)的标准方法中，可以被用作模板。此外，编码EspA多肽(及其片段)的核酸分子和相关的核酸，可在以其杂交特性为基础的方法中应用，该相关的核酸包括例如(1)此核酸含有与编码EspA多肽的核酸互补的，或可与之杂交的序列，或者是此核酸的片段(例如含有至少12,15,20，或25个核苷酸的片段)；以及(2)此核酸含有可与如下序列杂交的序列，该序列与编码EspA多肽的核酸是互补的，或者是此核酸的片段(例如含有至少12,15,20，或25个核苷酸的片段)。例如在下面将要进一步详述的，这样一些核酸分子可被用于如下的方法用于合成EspA核酸的PCR法，用于检测样品中存在EspA核酸的方法，用于鉴别编码新EspA家族成员核酸的筛查法以及治疗方法。
本发明还包括用于鉴别某种核酸分子的方法，这种核酸分子除了编码图1和4中所示的EspA之外，还编码其它的EspA多肽家族成员。在这些方法中，是用EspA-特异性探针如EspA-特异性核酸探针，对含有编码EspA多肽核酸的样品，例如cDNA核酸文库进行筛查。EspA-特异性核酸探针是特异性地与编码EspA多肽的核酸，或者与其互补序列杂交的核酸分子(例如含有DNA或RNA核苷酸分子，或其组合或修饰形式)。名词“EspA-特异性探针”，据本发明的方法指的是可与编码EspA多肽的核酸，或者其互补序列结合的探针，这种结合比与编码其它多肽的核酸，或者其互补的序列结合具有更大的可检测程度。因此名词“EspA特异性探针”包括可以同编码EspA多肽的核酸(或其互补序列)结合的探针。
本发明有助于方便地产生EspA-特异性核酸探针。可根据图1-3中所示的氨基酸序列顺序设计获得这种探针的方法。可以使用任何标准的方法(参见例如Ausubel,et al，同上)产生此探针，它可以含有至少12个，或者至少15,25,35,50,100，或150个核苷酸。例如，优选地此探针可用PCR扩增法产生。在这种方法中，需设计与EspA-保守序列相对应的引物，此保守序列可以包含有EspA-特异性氨基酸，产生的PCR产物可用作筛查核酸文库如cDNA文库的探针。通常在此过程之后，根据对图1和4中EspA序列的分析，可对编码EspA的核苷酸序列进行鉴定。
如本领域专业人员所知，PCR引物典型地应被设计成含有至少15个核苷酸，例如15-30个核苷酸。下面将阐述对EspA-特异性引物的设计，此引物含有编码7个氨基酸EspA肽的21个核苷酸。优选的情况是，这种探针中的绝大多数或全部的核苷酸都编码EspA-保守性氨基酸，包括EspA-特异性氨基酸。例如，可使用的引物其所含序列编码的肽至少应含有40％EspA-保守性氨基酸。含有21个核苷酸的这样一种引物，可包括至少编码3个EspA-保守性氨基酸的序列。这样，该引物可含有编码至少1个，例如7个EspA特异性氨基酸的序列。一旦EspA-特异性氨基酸序列，作为针对它设计引物序列的模板被选定，就可以应用例如标准的化学方法合成这种引物。如上所述，由于遗传密码的简并性，这种引物应该被设计包括适当简并的序列，这样本领域的技术人员可容易地进行测定。
在此使用的名词“espA”代表编码EspA多肽的多核苷酸。这些多核苷酸包括编码EspA的DNA、cDNA和RNA序列。在此还包括编码全部或部分EspA的所有多核苷酸。这种多核苷酸包括天然存在的，人工合成的，和被特定处理的多核苷酸。例如，可使espA多核苷酸遭受定位诱变。此epsA多核苷酸序列还包括其反义序列。所有简并的核苷酸序列都包括在本发明中，只要由此核苷酸序列所编码的EspA肽氨基酸序列未发生功能改变。
本发明还包括可与本发明多核苷酸杂交的核酸分子。在此使用的名词“核酸”包括RNA以及单链和双链的DNA和cDNA。编码EspA的多核苷酸包括图1和4中的核苷酸序列，以及与此序列互补的核酸序列。互补序列可能包括反义核苷酸。当该序列是RNA时，图1和4中的脱氧核苷酸，A,G,C和T，将分别被核苷酸A,G,C和U代替。上述核酸序列的片段也包括在本发明中，其长度至少为15个碱基，这足以使此片段在生理条件下能选择性地与编码图1或4中蛋白质的DNA杂交。
在核酸杂交反应中，用于达到特定严紧性水平的条件将各不相同，这取决于待杂交核酸的性质。例如，在选择杂交条件时，核酸杂交区的长度，互补程度，核苷酸序列的构成(例如GC对AT的含量)，以及核酸的类型(例如RNA或DNA)都可能被考虑到。进一步的考虑是其中的一个核酸是否被固相化在例如滤膜上。
下面是逐渐提高严紧性条件的实例大致在室温下的2×SSC/0.1％SDS(杂交条件)，大致在室温下0.2×SSC/0.1％SDS(低度严紧性条件)；在大约42℃下的0.2×SSC/0.1％SDS(中度严紧性条件)；在大约68℃的0.1×SSC(高度严紧性条件)。漂洗可以只用其中一种条件进行，例如用高度严紧性条件，或者可用其中每种条件，例如按上面列举的顺序，每种条件10-15分钟，重复所列举的任何一步或所有的步骤。但是，如上面所述，最佳的条件将各不相同，这取决于所包含的特定杂交反应，可以凭经验决定。
可以通过几种方法获得本发明的DNA序列。例如，该DNA可以用本领域熟知的杂交技术分离出。这些技术包括，但不局限于(1)使文库与探针杂交，以便检测同源核苷酸序列，(2)使用能够与所需DNA序列退火的引物，对DNA进行聚合酶链反应(PCR)，以及(3)对表达文库进行抗体筛选，以便检测具有同样结构特征的克隆化DNA片段。
依赖于核酸杂交的筛选程序使之有可能从任何生物体分离出任何基因序列，只要有适合的探针可以利用。与编码所需蛋白质的部分序列相对应的寡核苷酸探针，可以被化学合成，或者通过裂解天然序列产生。化学合成需要知道短寡肽片段的氨基酸序列。编码该蛋白质的DNA序列可以根据遗传密码推导出，但是必须考虑到密码的简并性。当此序列是简并性的，就有可能进行混合加成反应。这包括变性双股DNA的不均一混合物。为了这种筛选，优选地是对单股DNA或变性的双股DNA进行杂交。当与聚合酶链反应技术结合应用，即使是稀少的表达产物也能被克隆。
本发明提供了编码EspA多肽的核酸序列，含有它们的载体和宿主细胞，以及表达方法。分离出EspA肽之后，就可以借助于本领域熟知的方法分离出编码此肽的核酸。可以将这些分离的核酸连接进入载体，并导入适合的宿主细胞进行表达。核酸的连接和在细胞内表达的方法是本领域熟知的(参见Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,1989，在此引入作为参考)。
在此使用的名词“espB”和“eaeA”，指的是编码致肠道病大肠杆菌分泌蛋白质的不同于espA的基因。在此使用的名词“EspB”和“EaeA”，指的是分别由espB和eaeA基因编码的蛋白质。
本发明提供了包含有编码EspA多肽的多核苷酸的载体。例如，带有完整espA的质粒(pMSD2)在espA缺陷菌株内可使其恢复分泌EspA蛋白质。在此使用的“载体”包括本领域技术人员熟知的质粒，DNA和RNA病毒载体，杆状病毒载体，用于酵母的载体以及其它载体。几种类型的载体可以购得，并可用于实现本发明。用于实现本发明的载体的实例包括那些广泛改变如低拷贝载体pMW118的载体，正选择自杀载体pCVD442，以及可购得的pBluescriptⅡ SK(+)(Stragene,La Jolle,CA)。
当此载体是质粒时，如本领域技术人员所知，它通常包含有多种成分，包括启动子，信号序列，表型选择基因，复制起点，以及其它必要的成分。最普遍地用于原核生物载体的启动子包括LacZ启动子系统，碱性磷酸酶phoA启动子，噬菌体λPL启动子(一种温度敏感的启动子)，tac启动子(一个由lac阻抑物调节的杂合trp-lac启动子)，色氨酸启动子，和噬菌体T7启动子。例如，在LacZ启动子控制下的低拷贝载体pMW118。
信号序列一般被发现以5′端直接地与编码此肽的核酸连接，因此将被转录在融合蛋白的氨基端。
典型的表型选择基因是那些编码这样一种蛋白质的基因，此蛋白质能使宿主细胞具有抗生素抗性。例如，氨苄青霉素抗性基因(amp)和四环素抗性基因(tet)易于用于此目的。另一个例子是，为了在卡那霉素平板上选择载体，可以将编码卡那霉素抗性基因(kan)的aphA-3盒克隆进入一个载体区域，此区域含有编码EspA多肽的多核苷酸。
用本领域的技术人员熟知的规范化重组DNA程序，构建适合的载体，使之含有编码EspA多肽的多核苷酸。将要被组合形成载体的，编码EspA多肽的分离多核苷酸断开，并按特定的顺序和取向连接在一起产生所需的载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，它含有携带编码EspA多肽的多核苷酸的载体。为了提高表达EspA的产量，可将本发明的多核苷酸用于产生转化的或转染的细胞。借助于本领域技术人员熟知的标准方法，可从转化的细胞中分离出EspA。例如可应用免疫亲和纯化作用分离此蛋白质。
通过将DNA转移进入适合的宿主细胞，编码EspA的DNA序列可在体外进行表达。“宿主细胞”是在其中载体可以增殖，载体的DNA可表达的细胞。此名词还包括目标宿主细胞的任何子代。应该认识到，所有的子代都可能与亲代细胞不相同，因为在复制过程中可能发生突变。但是，当使用名词“宿主细胞”时，也包括这种子代。稳定的转移意味着外来的DNA被继续保留在宿主细胞中，本领域建立了这种稳定转移的方法。
根据本发明，EspA多核苷酸序列可被插入进重组表达载体中。名词“重组表达载体”指的是通过插入或掺入EspA基因序列处理的本领域熟知的质粒，病毒或其它运载体。这种表达载体含有的启动子序列可促进宿主细胞有效地转录插入的基因序列。此表达载体通常含有复制起点，启动子，以及使之有可能对转化的细胞进行表型选择的特异性基因。
编码EspA的多核苷酸序列可以在原核生物或真核生物中进行表达。宿主可以是微生物，酵母，昆虫和哺乳动物。在原核生物中表达带有真核生物序列或病毒列序的DNA序列的方法，是本领域熟知的。能够在宿主中表达和复制的生物功能性病毒和质粒DNA载体，也是本领域熟知的。将这些载体用于掺入本发明的DNA序列。
可借助于本领域技术人员熟知的常规技术以重组DNA对宿主细胞进行转化。当宿主是原核生物，如大肠杆菌，能摄取DNA的感受态细胞可以从指数生长期收获的细胞中制备，随后可用本领域熟知的程序，通过CaCl2法进行处理。或者，也可使用MgCl2或RbCl。如果需要，转化也可以在形成宿主细胞原生质体之后进行。另一个例子是可应用三亲结合作用，将载体遗传导入大肠杆菌特别是致肠道病大肠杆菌或者兔致肠病大肠杆菌。通过生长在抗生素上对转化的细胞进行选择，抗生素通常是四环素(tet)或氨苄青霉素(amp)，由于载体上存在tet或amp抗性基因，转化细胞对抗生素有抗性。在特定的实施方案中，是根据对卡那霉素和蔗糖的抗性进行细胞选择。
当宿主是真核生物时，可应用像磷酸钙共沉淀，常规的机械处理技术如显微注射，电穿孔，插入包装在脂质体内的质粒，或者插入病毒载体等的DNA转染法。也可以用编码本发明EspA的DNA序列，以及编码可选择表型的第二种外来的DNA分子如单纯胞疹胸苷激酶基因，转化真核细胞。另一种方法是使用真核生物的病毒载体，如猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒，瞬时感染或转化真核细胞，并表达此蛋白质(参见例如，Eucaryotic ViralVectors(真核生物的病毒载体)，Cold Spring Harbor Laboratory,Gluzman ed,1982)。
可借助于常规的方法对微生物表达的本发明的多肽或其片段进行分离和纯化，包括制备层析和应用单克隆抗体或多克隆抗体的免疫分离。
可能用作宿主细胞的原核生物有大肠杆菌；JM101株，大肠杆菌K12294株(ATCC号31,446)，大肠杆菌W3110株(ATCC号27,325)，大肠杆菌X1776(ATCC号31,537)，大肠杆菌XL-1 Blue(Stratagene)，和大肠杆菌B；但是，还可以使用很多其它的大肠杆菌菌株，如HB101,NM522,NM538,NM539及原核生物的其它许多种和属。除了上面列举的大肠杆菌菌株之外，杆菌如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtillis)，其它肠杆菌科细菌如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimunium)或粘质沙雷氏菌(Serratiamarcesans)，以及各种假单胞菌都可用作宿主细胞。在一个特定的实施方案中，原核宿主细胞是致肠道病大肠杆菌。在另一个特定的实施方案中，原核宿主细胞是兔致肠道病大肠杆菌。
可用作宿主细胞的真核生物有酵母菌株如PS23-6A,W301-18A,LL20,D234-3,INVSC1,INVSC2,YJJ337。启动子序列和增强子序列如ga11和pEFT-1也是有用的。Vra-4也可提供适合的增强子序列。用作功能性复制起点的序列包括ars1和2μ环形质粒。
革兰氏阴性菌是一组多样性的微生物，包括螺旋体属(Spirochaetes)如密螺旋体属和疏螺旋体属，革兰氏阴性杆菌如假单胞杆菌科，军团菌科，肠杆菌科，弧菌科，巴斯德氏菌科，革兰氏阴性球菌如奈瑟氏球菌科，厌氧拟杆菌属，以及其它革兰氏阴性菌如立克次氏体，衣原体，支原体。
革兰氏阴性杆菌对临床医学是很重要的。它们包括(1)肠杆菌科，这是一个由许多主要的病原菌属组成的菌科，(2)弧菌，弯曲杆菌和螺杆菌属，(3)机会致病微生物(例如假单胞菌，黄杆菌和其它一些菌)以及(4)嗜血杆菌和博德特氏菌属。革兰氏阴性杆菌是在腹部内脏，腹膜和尿道感染中，以及在呼吸道，灼伤或创伤的皮肤，和宿主抵抗力减弱部位的继发性入侵菌中发现的主要微生物。目前，它们是威胁生命的败血症的最常见原因。致病性革兰氏阴性杆菌的例子有大肠杆菌(腹泻，尿道感染，新生儿脑膜炎)，志贺氏菌属菌(痢疾)，伤寒沙门氏菌(伤寒热)，鼠伤寒沙门氏菌(胃肠炎)，结肠炎耶尔森氏菌(结肠炎)，鼠疫耶尔森氏菌(黑鼠疫)，霍乱弧菌(霍乱)，空肠炎弯曲菌(结肠炎)，空肠炎螺杆菌(胃炎，胃溃疡)，绿脓假草胞菌(机会感染，包括烧伤，尿道，呼吸道，伤口感染，以及原发性皮肤，眼，耳感染)，流感嗜血杆菌(儿童脑膜炎，会厌炎，中耳炎，窦炎和支气管炎)，以及百日咳博德特氏菌(百日咳)。弧菌是能动的革兰氏阴性杆形菌属(弧菌科)。霍乱弧菌引起人霍乱，其它种弧菌引起动物疾病。大肠杆菌宿主在人和温血动物的肠内，它们是肠内共栖菌群的一部分，但是存在引起人和动物肠道疾病的大肠杆菌种类。它们包括肠内集结大肠杆菌(enteroaggregative大肠杆菌)(EaggEC)，肠出血大肠杆菌(EHEC)，肠侵入大肠杆菌(enteroinvasive大肠杆菌)(EIEC)，致肠道病大肠杆菌(EPEC)和产肠毒素大肠杆菌(ETEC)。致尿道感染大肠杆菌(Uropathogenic大肠杆菌)(UPEC)引起尿道感染。还有新生儿胞膜炎大肠杆菌(NMEC)。除了对动物引起与人类某些感染类似的感染之外，还存在一些特殊的动物疾病，包括小牛败血症，牛乳腺炎，猪水肿病，以及家禽肺泡病。
奈瑟氏球菌属(Neisseria)的种类包括灰质奈瑟氏球菌，淋病奈瑟氏球菌，淋病奈瑟氏球菌Kochii亚种，乳糖奈瑟氏球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，多糖奈瑟氏球菌，粘膜奈瑟氏球菌，干燥奈瑟氏球菌，淡黄色奈瑟氏球菌，金黄色奈瑟氏球菌非糖解种，豚鼠奈瑟氏球菌，兔奈瑟氏球菌以及羊奈瑟氏球菌，某些分类学家认为粘膜炎摩拉氏菌(布兰汉氏菌)也属于奈瑟氏球菌属。其它相关的菌种包括金氏菌，艾肯氏菌，西蒙斯氏菌，小链菌，CDCEF-4群，和CDC M-5群。韦荣氏球菌是革兰氏阴性球菌，属于奈瑟氏球菌属的厌氧相似菌。这些非能动双球菌是口腔正常菌群的一部分。
革兰氏阴性好氧球菌群中的致病菌包括奈瑟氏球菌，摩拉氏菌(布兰汉氏菌)和不动杆菌。奈瑟氏球菌属包括二个重要的人类病原菌，淋病奈瑟氏球菌(尿道炎，子官颈炎，输卵管炎，直肠炎，咽炎，结膜炎，骨盆炎症性病，关节炎，传播性疾病)，和脑膜炎奈瑟氏球菌(脑膜炎，败血症，肺炎，关节炎，尿道炎)。以前认为是无害的其它一些革兰氏阴性球菌，最近又发现是人类感染的常见原因，包括粘膜炎摩拉氏菌(布兰汉氏菌)(慢性肺病病人的支气管炎和支气管肺炎，窦炎，中耳炎)。
本发明的EspA多肽还可以用于产生对EspA多肽表位具有免疫活性或与之结合的抗体。提供了基本上由具有不同表位特异性的混合单克隆抗体组成的抗体，以及不同的单克隆抗体制剂。单克隆抗体可借助于本领域熟知的方法由含有抗原的蛋白质片段制备(Kohler,et a1,Nature,256:495,1975；Current Protocols in Molecular Biology,Auswbel,et al.ed,1989)。
在本发明中使用的名词“抗体”包括能结合表位的完整分子以及其片段，如Fab,Fab′,F(ab′)2，和Fv。这些抗体片段保留了某些选择性地与其抗原或受体结合的能力，被定义如下(1)Fab，包含有抗体分子单价抗原结合部分的片段，可通过以木瓜蛋白酶消化完整的抗体而产生完整的轻链和一条重链的一部分来制备；(2)Fab′，抗体分子的此片段可通过以胃蛋白酶处理完整的抗体，然后还原，产生完整的轻链和部分重链来获得，每个抗体分子可得到二个Fab′片段；(3)(Fab′)2，通过以胃蛋白酶处理完整的抗体，未进行随后的还原作用可得到抗体的该片段，F(ab′)2是由二个二硫键结合在一起的二个Fab′片段的二聚体；(4)Fv，定义为作为双链被表达的含有轻链可变区和重链可变区的遗传工程构建片段；(5)单链抗体，定义为含有轻链可变区，重链可变区的遗传工程构建分子，此二个可变区由适当的肽接头连接，为遗传融合的单链分子。
制备这些片段的方法是本领域已知的(参见例如，Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual，(抗体实验手册)，Cold Spring HarborLaboratory,New York(最新版)，在此引入作为参考)。
表位是抗原上抗体的抗原旁位与之结合的任何抗原决定簇。表位通常由例如氨基酸或糖侧链分子的化学活性表面基团组成，并且通常具有特异性的三维结构特征，以及特异性的电荷特征。
如有需要，多克隆抗体或单克隆抗体可被进一步纯化，例如通过结合于一个基质，并从其中洗脱出，此基质上结合了一种肽，或者一种该抗体针对它产生的肽。本领域的技术人员都熟悉用于纯化和/或浓缩多克隆抗体以及单克隆抗体的免疫学技术中常用的各种技术(参见例如Coligan等，Unit9,Current Protocols in Immunology,Wiley Interscience，最新版，在此引入作为参考)。
本发明还提供了用于设计espA特异性核苷酸探针或抗-EspA抗体的肽表位。这种探针或抗体可用于鉴定可能与其它病原体毒力有关的蛋白质或基因，包括但不局限于来自革兰氏阴性菌的多肽或多核苷酸。
本发明的抗体，包括多克隆和单克隆抗体，嵌合抗体，单链抗体等，具有以高度免疫特异性结合于本发明的EspA蛋白质，肽或核苷酸序列或其片段的能力。这些抗体可以不被标记，或者被适当地标记。本发明的抗体可被用于对例如EspA进行亲和性纯化。本发明的抗体可以按已知的免疫学方法，用于定性或定量检测细胞，组组样品，样品制剂或液体中的这些蛋白质或肽。本发明的抗体还可以按已知的免疫学方法，用于定性或定量检测核苷酸序列或其蛋白质。
本发明提供了一种用于检测样品中EspA多肽的方法，包括使来自待检对象的样品与针对EspA多肽的抗体接触；并检测抗体对EspA多肽的结合。结合是样品中存在EspA多肽的指示。在此使用的名词“样品”包括来自哺乳动物或人对象，或者其它动物的材料。这种样品包括但不局限于毛发，皮肤样品，组织样品，培养细胞，培养细胞的培养基，和生物液体。例如，可以在HeLa细胞(例如人)培养物中检测EspA多肽。
在此所用的名词“组织”指的是来自人或其它动物的连接的细胞块(例如CNS组织，神经组织或眼组织)，包括与该细胞有关的连接材料和液体材料。例如，兔致肠道病大肠杆菌可在兔胃，肓肠和结肠中找到。在此使用的名词“生物液体”指的是来自人或其它动物的液体材料。这些生物液体包括但不局限于血液，血浆，血清，血清衍生物，胆汁，粘液，唾液，汗液，羊水，以及脑脊液(CSF)，如腰部或脑室CSF。
在此使用的名词“样品”还包括含有该分离多肽的溶液，该多肽被分泌至其中的培养基，以及含有产生此EspA多肽的宿主细胞的培养基。例如，样品可能是将被SDS-PAGE分辨，并转移至硝酸纤维素膜进行Western免疫印迹分析的蛋白质样品。本领域的技术人员可借助于标准的实验技术确定获得某一反应所需要的样品量。最佳样品量可通过系列稀释来确定。
在一个实施方案中，样品中存在EspA多肽是被致肠道病大肠杆菌感染的指示。在另一个实施方案中，样品中存在EspA多肽是被致肠出血大肠杆菌感染的指示。
预计本发明的蛋白质，蛋白质片段，和合成的肽具有多种用途，包括预测，治疗，诊断或药物设计等应用。本发明的蛋白质，蛋白质片段和合成的肽，将为制备与本发明的蛋白质具有特异性免疫反应的单克隆和多克隆抗体提供基础。在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，用于对由产生EspA的大肠杆菌引起的疾病敏感的宿主，通过对宿主给予权利要求1的多肽进行免疫；并且诱导宿主对EspA多肽产生保护性免疫应答。因此可预防产生EspA的微生物对宿主的感染。在更特定的实施方案中，产生EspA的微生物是大肠杆菌菌株。在更加特定的实施方案中，该大肠杆菌菌株是致肠道病大肠杆菌或致肠出血大肠杆菌。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，用于缓解由产生EspA的微生物引起的疾病，是通过以EspA多肽免疫宿主，诱导宿主对EspA多肽的免疫应答。在更特定的实施方案中，产生EspA的微生物是大肠杆菌菌株。在更加特定的实施方案中，该大肠杆菌菌株是致肠道病大肠杆菌或致肠出血大肠杆菌。本发明提供了一种检测样品中espA多核苷酸的方法，是通过使怀疑含有espA多核苷酸的样品与能同espA多核苷酸杂交的核探针相接触；并检测此探针与espA多核苷酸的杂交作用。发现杂交作用是样品中存在espA多核苷酸的指示。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种带有espA突变基因的微生物。其中的espA基因可被突变的优选微生物包括但不局限于细菌。其中的espA基因可被突变的细菌是大肠杆菌。其中的espA基因可被突变的大肠杆菌是致肠道病大肠杆菌和致肠出血大肠杆菌。
本发明提供了用于产生重组espA多核苷酸的方法，包括将编码选择性标记的核酸插入编码EspA多肽的多核苷酸中。产生的多核苷酸编码含有选择性标记的重组EspA多肽。例如，选择性标记可以是单纯疮疹病毒(HSV)标志，市场上可购得针对此标志的抗体。
本发明提供了用于产生重组EspA多肽的方法，是通过使含有编码EspA多肽的多核苷酸的宿主细胞，在允许其表达和分泌EspA多肽的条件下生长再分离出此多肽。以重组技术产生多肽和肽的方法在本发明的范围之内。在此使用的“允许其表达和分泌的条件”指的是这样适合的条件，以致于核酸可能转录和翻译，并可分离出这样产生的多肽。所产生的多肽可能是被分泌进培养基中的蛋白质。培养基包括微生物可在其中生长或者微生物可在其中生存的液体，物质或有机体。这样的环境可以是例如，动物组织或体液，水和其它液体，食物，食物产品或食品提取液，以及某些无生命的物体。例如，微生物可生长在Luria-Bertani(LB)培养基中。不必要此环境能促进微生物生长，只要它允许其生存。
本发明提供了一种鉴定抑制细菌Ⅲ型分泌系统的化合物的方法，是通过将编码选择性标记的多核苷酸，引入具有Ⅲ型分泌系统的细菌；使细菌在允许细菌生长并分泌由此多核苷酸编码的多肽的条件下生长；再使推测抑制细菌Ⅲ型分泌系统的化合物与此细菌接触；诱导此多肽的表达；然后检测此多肽的分泌。在实施本方法中，分泌缺乏指示对细菌Ⅲ型分泌系统的抑制作用。在发明中使用的名词“Ⅲ型分泌”和“Ⅲ型分泌途径”指的是排出分子跨越细胞膜的特殊机构。排出分子跨越细胞膜，对将毒力因子转移到能够与宿主成分相互作用的表面是关链性的过程。Ⅲ型分泌路径使用三磷酸腺苷(ATP)作能源。Ⅲ型分泌路径不同于革兰氏阴性菌中发现的其它分泌路径，虽然它具有与鞭毛和丝状噬菌装配基因同源的基因。它不同于任何的哺乳动物路径。它经常与疾病的发生有关。由Ⅲ型分泌路径分泌的毒力因子，在各种病原菌之间各不相同，虽然Ⅲ型分泌机构的部件，至少对沙门氏菌，志贺氏菌和耶尔森氏菌是可以互换的。
而且，本发明的多肽或核苷酸序列，可用于鉴定与它们相互作用(例如结合)并影响它们生物活性的化合物或组合物。这种作用包括抑制或激活EspA活性或分泌。
本发明提供了一种方法，通过在编码EspA多肽的核苷酸中引起突变，而产生非致病性微生物，将编码选择性标记物的核酸序列插入突变位点；将突变的espA多核苷酸导入一种微生物的染色体espA基因，引导在染色体espA基因中发生突变；然后选择具有突变的微生物。在此使用的名词“突变”指的是在基因核苷酸序列，特别是在编码EspA多肽的多核苷酸中的改变。突变包括产生具有不同氨基酸序列EspA多肽的突变，错义突变(包括移码突变)，无义突变(包括敲除突变)，以及产生含有部分EspA多肽的融合蛋白的基因重组技术。在一个实施方案中，编码选择性标记的核酸序列能编码对卡那霉素的抗性。例如，可将编码卡那霉素抗性基因(Kan)的aphA-3盒克隆进入编码EspA多肽的多核苷酸，用于在产生敲除突变的卡那霉素培养板上选择突变的espA多核苷酸。
在其中实施本发明的优选微生物包括但不局限于细菌。在另一个实施方案中，用于在编码EspA多肽的多核苷酸中产生突变的微生物是大肠杆菌。在大肠杆菌中可被转化的是致肠道病大肠杆菌和致肠出血大肠杆菌。
本发明提供了一种激活宿主细胞中酪氨酸激酶活性的方法，是通过将表达Eae多肽的espA缺陷型突变细菌和表达EspA多肽的eaeA-缺陷型突变细菌都加入到宿主细胞中，使细菌与宿主细胞结合，因而激活宿主细胞中酪氨酸激酶的活性。在一个实施方案中，宿主细胞中酪氨酸激酶活性的激活，引起了90千道尔顿的宿主膜蛋白Hp90的酪氨酸磷酸化，并导致细胞内磷酸肌醇(IP3)和钙流出。例如，当此二个突变体株被用于共感染HeLa细胞时，eaeA突变体可用于补充espA突变体的侵染作用。因此，本发明提供了一种有用的科学方法，借助于细胞生物学研究致病机理。
本发明包括一种包含有本发明的一种或几种抗体的试剂盒，以及一种基于核苷酸的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒可用于检测EspA多肽，它是一种被分隔的装载工具，容纳了紧密封装的容器，其中装有能与EspA多肽结合的抗体。在此使用的“包装工具”包括小药瓶，试管等，每个包装工具内装有用于本方法的一种分离的成分。在一个实施方案中，这种能与EspA多肽结合的抗体是可检测标记的。在更特定的实施方案中，此标记物选自放射性同位素，生物发光化合物，化学发光化合物，荧光化合物，金属螯合剂以及酶。
在另一个实施方案中，此试剂盒可用于检测EspA多核苷酸，它是一种被分隔的装载工具，容纳了紧密封装的容器，其中装有能与EspA多核苷酸杂交的核酸探针。在一个实施方案中，这种能与EspA多核苷酸杂交的核酸探针是可检测标记的。在更特定的实施方案中，此标记物选自放射性同位素，生物发光化合物，化学发光化合物，荧光化合物，金属螯合剂以及酶。
因为EspA是一种分泌蛋白，所以它可以作为融合配偶体用于克隆和表达其它的肽和蛋白质，例如，融合于所研究蛋白质的EspA，可通过重组技术在宿主细胞如大肠杆菌中产生，此融合蛋白被分泌到该转化的宿主细胞在其中生长的培养基中。此融合蛋白可借助于抗-EspA抗体被分离出，随后使EspA与所研究的肽或蛋白质断开。用ELISA或其它免疫亲和性方法可对此EspA融合蛋白进行鉴定。本发明提供了一种产生EspA融合蛋白的方法，包括使宿主细胞在允许其表达和分泌融合多肽的条件下生长，然后分离出融合多肽，此宿主细胞含有编码EspA的多核苷酸，此多核苷酸可操作地连接于编码所研究多肽或肽的多核苷酸。名词“可操作地连接或结合”指的是启动子序列和结构基因之间，或者在融合蛋白的情况下是被启动子核酸序列调节的基因之间的功能性连接。可操作地连接的启动子控制由结构基团编码的多肽(如融合蛋白)的表达。
打算用下面的实施例对本发明进行说明，而不是限制它。尽管所应用的那些实施方法都是典型的，但是还可以选择地应用本领域技术人员熟知的其它程序。
实施例1致肠道病大肠杆菌espA基因的DNA序列分析此实施例的目的是为了描述espA的特征，这是一个造成致肠道病大肠杆菌具有附着和表面损伤活性的基因。espA基因编码25千道尔顿的分泌蛋白，定位于致肠道病大肠杆菌染色体组，在两个为紧密粘附所需要的基因座eaeA和espB之间的肠细胞表面损伤基因座中(Locus of EnterocyteEffacement)。
对致肠道病大肠杆菌eaeA和espB之间的肠细胞表面损伤基因座的DNA序列进行了测定。DNA测序按如下进行将从eaeA中延伸至espB(5′)上游的肠细胞表面损伤基因座的SalⅠ-BglⅡDNA片段，克隆进入可购得的质粒pBluescript中，形成质粒pLCL109。从质粒pLCL109的闭合子(closer)末端到eaeB基因，形成了一系列嵌套式DNA缺失。使用按需要合成的寡核苷酸引物，[a-35S]dATP，以及测序酶，可将质粒pLCL109的这些DNA缺失用作模板，测定DNA双股的核苷酸序列。借助于由Wisconsin大学GeneticComputer Group开发的软件包对DNA序列数据进行分析。
对此DNA序列的分析显示出三个开放读框。由位于第二个开放读框(espA)5′末端的DNA序列预测的氨基酸序列，与一种蛋白质的氨基末端序列相同，此蛋白质具有由致肠道病大肠杆菌分泌的大约25千道尔顿的MR。用TEASTA检索Genbank数据库时，未检测出具有相似序列的蛋白质。因此，该espA基因编码致肠道病大肠杆菌分泌蛋白。
由espA编码的完整蛋白的预测分子量是20468道尔顿(图1)。在所报告的分泌产物的氨基末端之前，没有前导序列。强共有核糖体结合位点止于起始密码子之前7个核苷酸。在氨基末端的头19个残基中的11个被预测是丝氨酸或苏氨酸。
实施例2在质粒和染色体上的espA基因中构建突变本实施例的目的是在微生物染色体上的espA基因中构建突变。本实施例的目的是在质粒上的espA基因中构建突变。然后可将此质粒用于在其它微生物的espA基因中产生突变。构建了在espA基因中带有非极性突变的质粒。并且产生了在其染色体espA基因中带有非极性突变的突变菌株。
在图2中描述了带有非极性突变的espA基因。用聚合酶链反应(PCR)形成了带有限制性酶切位点的缺失，这样可以使编码卡那霉素抗性的aphA-3盒被克隆进入此缺失区。在所有的三个读框中，此aphA-3盒的前面(5′)是翻译终止密码子，紧接此盒后面(3′)的是共有核糖体结合位点和起始密码子。设计在espA基因插入时保留了espA 3′端的读框，因此可以不影响下游(3′)基因的转录和翻译。DNA测序证实了此突变的读框。
按如下借助于聚合酶链反应，在质粒espA基因中构建非极性突变PCR模板是质粒pLCL114，它含有被克隆进入pBluescrit的pLCL119 ClaⅠ-BglⅡ片段。使用了二对引物，带有Donne～99的通用引物和带有Donne-100的反向引物。寡核苷酸Donne-99和Donne-100分别是SalⅠ-BglⅡ片段的核苷酸4157至4140和4297至4324。为了克隆的目的，在Donne-99和Donne-100的5′端都设计了NruL限制性酶切位置。寡核苷酸是在Baltimore的Maryland大学生物聚合物实验室构建的，在小循环器内对50μl样品进行了PCR。进行了30个PCR反应循环，在94℃DNA变性1分钟，在55℃对引物退火2分钟，在72℃多核苷酸延伸3分钟。形成的2个扩增片段各自被克隆进可购得的质粒pCRscript，分别构成pLCL119和pLCL120。然后用SalⅠ和NruⅠ将pLCL120的插入片段克隆进入pLCL119，构成含有所需缺失的pLCL121。然后将在SmaⅠ位点侧面的850碱基对的aphA-3卡那霉素抗性盒插入进pLCL121的NruⅠ位点。
将突变的espA等位基因克隆进正选择自杀载体PCVD442，并通过等位基因交换被导入野生型致肠道病大肠杆菌E2348/69株。按如下构建了espA突变菌株将含有中断的espA基因的来自具有aphA-3卡那霉素抗性质粒的SalⅠ-SacⅠ片段，克隆进入DH5 apir中的正选择自杀载体pCVD442，用于通过三亲结合作用，或者通过用设定在1.8kV的大肠杆菌脉中发生器，在0.1cm的比色杯内进行电穿孔处理而导入E2348/69菌株。
在修改的LB卡那霉素培养板上对espA突变体进行选择。形成的致肠道病大肠杆菌突变株UMD872对蔗糖和卡那霉素具有抗性，对氨苄青霉素敏感。用二个突变侧翼的引物Donne-52和Donne-73进行的PCR扩增，证实了espA突变的构建。此细菌在50％LB液体培养基/50％甘油(体积/体积)中，-70℃贮存，在LB琼脂板上或LB液体培养基中培养生长，需要时加入氯霉素(20μg/ml)，氨苄青霉素(200μg/ml)，萘啶酮酸(50μg/ml)，或卡那霉素(50μg/ml)。
实施例3致肠道病大肠杆菌espA基因的破坏消除了EspA蛋白的分泌本实施例的目的是鉴别由espA基因编码的蛋白质。对EspA蛋白质的氨基末端序列数据进行比较表明，它与被翻译的espA基因序列是一致的。为了证实此结果，使espA缺失突变体UMD872在放射性标记的组织培养基中培养生长。espA基因的缺失，导致丧失了25千道尔顿的放射性标记分泌蛋白。通过用与EspA分泌蛋白反应的抗-EPEC血清进行免疫沉淀作用，证实了此结果。用抗-EPEC血清进行的Western分析显示没有25千道尔顿的分泌蛋白质。当以带有完整espA的质粒(pMSD2)转化espA缺限菌株，EspA蛋白的分泌得到恢复。该细菌增加产生由质粒编码的EspA蛋白，而使得Ⅲ型分泌路途对其它蛋白质的分泌减少了。
实施例4致肠道病大肠杆菌侵染培养的上皮细胞需要EspA本实施例的目的是测定致肠道病大肠杆菌EspA蛋白是否与对上皮细胞的侵染有关。激发宿主的信号传导通路和侵染宿主细胞都需要EspA蛋白。
以亲本野生型或espA突变型致肠道病大肠杆菌菌株感染单层上皮癌细胞(Hela)3小时。测定粘附的和细胞内的(即侵入的)致肠道病大肠杆菌菌的数目。与突变型和亲本型致肠道病大肠杆菌菌株之间不同的生长速度相对应，二株菌对Hela细胞粘附的绝对数目不相同，尽管espA突变株UMD872对上皮细胞有足够数量的粘附，但缺乏侵入的数量。但是，当通过编码了完整espA基因的质粒pMSD2，以遗传技术补充espA基因后，侵入单层HeLa细胞的UMD872的数量接近野生型的水平。
对HeLa单层细胞进行了共感染试验，用于测定在espA,espB和eaeA方面突变菌株的入侵行为缺陷，是否可以通过遗传技术反式互补，介导随后的入侵作用。eaeA突变菌株可激活信号传导，但缺乏紧密的粘附。由eaeA突变株介导的信号传导可使espB缺陷的菌株进入上皮细胞，但是反之则不能。当用eaeA和espA突变株共感染HeLa细胞时，eaeA突变株弥补了espA突变株的侵入作用，但eaeA突变株的侵入作用没有增加。确实，由较强粘附的eaeA突变株诱发的信号传导，导致增加了对espA突变株的摄入。用espA和espB缺失株共感染没有使其中任何一株增强入侵作用，表明espA和espB不能互相补充。
共感染实验证明，像espB那样，espA突变株的入侵行为被eaeA弥补了，但是反之则不能。确实，由较强粘附的eaeA突变株引起的信号传导，导致增加了表达intimin的espA突变株的摄入。相反，espA或espB突变株都不能相互弥补，意味着这二种蛋白质可能共同对诱发上皮细胞信号传导的相同步骤起作用。
实施例5EspA对诱发上皮细胞中信号传导事件是必需的本实施例的目的是测定是否EspA对诱发上皮细胞中信号传导事件是必需的。致肠道病大肠杆菌诱发宿主细胞90千道尔顿膜蛋白的酪氨酸磷酸化作用，并随后发生磷酸化的蛋白质，肌动蛋白和其它细胞骨架成分在粘附的细菌下面聚积。对缺乏侵染作用的espA突变株诱发哺乳细胞这二种信号传导事件的能力进行了测定。与野生型致肠道病大肠杆菌不同，espA突变株UMD872不能诱发宿主Hp90的磷酸化作用。通过编码EspA蛋白的质粒(pMSD2)可使诱发这种磷酸化事件的能力恢复。
粘附和侵入测定按如下进行用不同的致肠道病大肠杆菌菌株感染(m.o.i.1∶100)培养在DMEM中的105 HeLa细胞3小时。在补充了10％(体积/体积)胎牛血清的Dulbecco′s Minimal Eagles培养基(DMEM)中，以5％CO237℃培养HeLa细胞。先将单层细胞在磷酸缓冲盐水中洗三次，然后在磷酸缓冲盐水配制的1％Triton(体积/体积)中作细胞溶解，并在LB琼脂板上以系列稀释液作平板培养。为了测定侵入作用，在对细胞漂洗，溶解细胞和作平板培养之前，将洗过的单层细胞与庆大霉素(100μg/ml)共同温育1小时，以便杀死外部的细菌。
用野生型或突变型致肠道病大肠杆菌菌株感染单层HeLa细胞3小时。分离出HeLa细胞的Triton X-100可溶性和不溶性上皮蛋白。蛋白质样品通过SDS-PAGE进行分离，并转移至硝酸纤维素膜上，然后用抗-磷酸酪氨酸特异性抗体进行探测。
按如下分离出致肠道病大肠杆菌分泌蛋白和HeLa细胞蛋白以106 HeLa细胞接种组织培养板培养过夜。在感染之前，用含有放线菌酮(100μg/ml)而没有甲硫氨酸/半胱氨酸的DMEM替换此培养基。使HeLa细胞在补充了10％(vol/vol)胎牛血清的DMEM中，以5％CO2在37℃下培养生长。加入致肠道病大肠杆菌(m.o.i.100∶1)，在5％CO2孵箱内37℃培育2.5小时，然后加入200μg/ml的35S半胱氨酸/甲硫氨酸培育30分钟。分离出培养上清液，并通过离心(18000×g,10分钟)沉淀其中的细菌。通过加入冰冷的三氯醋酸(10％vol/vol)使上清液中的分泌蛋白沉淀，并在冰上孵育60分钟。同上通过离心使蛋白质沉淀，然后再混悬于Laemelli样品缓冲液中。借助于12％SDS-PAGE使样品分离，通过放射自显影技术测定蛋白质分布图，或者转移至硝酸纤维素膜，然后用抗-EPEC抗体探测。
所有的致肠道病大肠杆菌菌株都在不溶性组分中显示出了85千道尔顿的酪氨酸磷酸化蛋白Ep85，证明在单层细胞上存在致肠道病E.coli菌株。
按如下对HeLa细胞磷酸酪氨酸蛋白进行了分析先用冰冷的磷酸缓冲盐水洗感染的单层HeLa细胞3次，然后在含有蛋白酶抑制剂的1％TritonX-100中使细胞溶解。分离出Triton不溶性和可溶性组分，重新悬浮于Leamelli样品缓冲液中，用抗-磷酸酪氨酸抗体，借助于Western免疫印迹分析法，分析磷酸酪氨酸蛋白。
用荧光标记的抗-磷酸酪氨酸抗体或若丹明一次毒蕈环肽，通过免疫荧光显微镜检测感染的HeLa细胞显示，不同于野生型亲本致肠道病大肠杆菌，espA突变株不使酪氨酸磷酸化蛋白或细胞骨架肌动蛋白在粘连微菌落下聚积。但是，通过使用在质粒pMSD2上携带espA基因的菌株，可以使磷酸酪氨酸和肌动蛋白聚积作用恢复。
按如下进行免疫荧光显微镜检测对接种培养在圆形盖玻片上的HaLa细胞，以致肠道病大肠杆菌或突变菌株感染3小时。漂洗此单层细胞，并在2.5％多聚甲醛中固定，然后对丝状肌动蛋白染色(用次毒蕈环肽-若丹明)，或者以带有适当的荧光标记第二抗体的抗-磷酸酪氨酸抗体染色。
实施例6对兔致肠道病大肠杆菌(RDEC-1)分泌性毒力蛋白EspA和EspB的特征鉴定本实施例的目的是研究兔致肠道病大肠杆菌(RDEC-1)中EspA和EspB的结构。对espA和espB基因进行克隆，并将它们的序列与致肠道病大肠杆菌(EPEC)的基因序列作比较。EspA蛋白表现出一些类似性(88.5％相同)。EspB蛋白内部是异源的(69.8％相同)，但是与致肠道出血大肠杆菌(EHEC)的一个菌株相同。
按如下对espA和espB基因进行克隆和序列分析编码RDEC-1 espA和espB的DNA片段可通过PCR从RDEC-1染色体DNA得到，使用来自已公布的致肠道病大肠杆菌基因序列的引物，使用Vent DNA聚合酶进行PCR，从RDEC-1和致肠道病大肠杆菌菌株扩增染色体DNA。进行30次PCR反应循环，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，以及72℃延伸2分钟。将形成的4.3千碱基对产物连接进入购得的质粒pBluescript中，并对双链测序。按如下进行DNA测序通过PCR扩增编码espA和espB基因的此4.3千碱基对的DNA片段，使用引物AA01(+)和MSll(-)，以RDEC-l染色体DNA作为DNA模板。形成的钝末端片段用SalⅠ消化，并克隆进入购得的质粒pBluescript-IISK(+)的SalⅠ-SmaⅠ位点。应用购得的TaqDyeDeoxy试剂盒对RDEC-1 espA的DNA序列和双链进行测序(图3)。
在此克隆化区域内发现了二个开放读框，这些DNA序列类似于致肠道病大肠杆菌的espA和espB。预测的RDEC-1 EspA的分子量(192个氨基酸)是23533道尔顿，RDEC-1 EspB的分子量(314个氨基酸)是33219道尔顿。RDEC-1 EspA与致肠道病大肠杆菌的EspA有些相似，具有88.5％相同性(图4A和4B)。
一个未预料的结果是，RDEC-1 EspB蛋白与最近报导的，来自致肠出血大肠杆菌413/89-1株，026血清型的EspB相同，但在12碱基对和729碱基对位置存在二个核苷酸差异(T变为C，和G变为T)，此菌株最初是从胎牛分离出，以后也从患有溶血性尿毒综合症的病人分离出。并且，RDEC-1 EspB与致肠出血大肠杆菌0157血清型和致肠道病大肠杆菌菌株的相比较，分别显示70.3％和69.8％的相同性。当与致肠道病大肠杆菌的序列比较时，在RDEC-1和致肠出血大肠杆菌(026和0157血清型)的EspB中，在相同位置发现了小缺失序列(4A-C)。
这些结果显示RDEC-1可编码espA和espB基因，并表明预测的EspA多肽在RDEC-1和致肠道病大肠杆菌中是高度保守性的。但是，此EspB与致肠出血大肠杆菌，而不是致肠道病大肠杆菌的EspB更相似。espA下游开放读框(3′)显示与致肠道病大肠杆菌的EspD有相似性，EspD是一种调节EspB分泌的分泌蛋白，是激发宿主细胞信号传导路径所需要的(EMBL GenBank资料，查询号Y09228)。这些结果表明，espD在RDEC-1中也位于espA和espB之间。
实施例7对RDEC-1 EspA和EspB的特征鉴定本实施例的目的是研究兔致肠道病大肠杆菌(RDEC-1)中EspA和EspB的功能。RDEC-1中espA和espB的突变揭示，RDEC-1的基因产物对激发宿主信号传导路径和侵入HeLa细胞是必需的。含有致肠道病大肠杆菌espA和espB的质粒对RDEC-1突变株有弥补作用证明，它们在功能上是可以互换的，虽然致肠道病大肠杆菌蛋白介导更高水平的侵入作用。并且，RDEC-1和致肠道病大肠杆菌分泌蛋白的最大表达，是发生在它们各自宿主的体温之下，体温可能是致肠道病大肠杆菌对兔缺乏感染性的原因之一。
为了证实RDEC-1 espA和espB在宿主上皮细胞信号传导路径中的作用，在espA和espB中设计构建了非极性终止密码子突变。构建了二个自杀性载体，并通过回复结合被导入RDEC-1野生型菌株。形成的突变菌株AAF001ΔA(EspA-),AAF001ΔB(EspB-)，和双突变株AAF001ΔAB(EspA-/EspB-)，通过BgⅡ消化被证实。
按如下在RDEC-1 espA和espB基因中构建了非极性终止密码子突变通过PCR扩增了编码espA和espB基因的2.7千碱基对的肠细胞表面损伤基因座DNA片段，使用引物BK25(+)和MSll(-)，以pORF123B作DNA模板。用EcoRⅠ消化形成的平端片段，并被克隆进入pBluescriptll SK(+)载体的EcoRⅠ-SmaⅠ位点，得到pORF23B。将1.1千碱基对的EcoRⅠ-BglⅡ DNA片段，它是来自含有espA的pORF23B，克隆进入pBluescriptⅡSK(+)的EcoRⅠ-BamHⅠ位点，得到pORF23。
为了在espA中构建非极性突变，进行了反向PCR，使用含有BglⅡ限制性酶切位点和终止密码子的ΔespA(+)和ΔespA(-)引物，使用环状pORF23作DNA模板，然后使PCR产物平端连接得到pORF23Δ。形成的质粒含有一个终止密码子和一个espA起始密码子下游(3′)235碱基对处的BaglⅡ位点，通过DNA测序证实了这点。将含有来自pORF23A的突变espA的1.1千碱基对SalⅠ-SacⅠDNA片段插入进自杀载体pCVD442的相同位点，得到PAA23Δ，此载体pCVD442含有正选择SacB基因和氨苄青霉素抗性基因。将形成的质粒导入大肠杆菌SM10(pir，并反向结合进入携带有pACYC184的RDEC-1。
为了在espB内构造非极性突变，使用ΔespB(+)和ΔespB(-)引物，用pBxb作DNA模板进行了反向PCR。pBxb含有来自pORF23B的1.4千碱基对XbaⅠ片段，此pORF238编码被克隆进入pBluescript载体的espB。形成的PCR产物自身连接而获得pBxbΔ，它含有一个终止密码子和一个由ΔespB(-)和ΔespB(+)引物导入的BglⅡ位点。在pBxbΔ中，形成的esp基因被删除了250碱基对，始于espB起始密码子下游154碱基对(3′)将1.1千碱基对的SalⅠ-SacⅠDNA片段插入进pCVD442的相同位点，得到pAABxbΔ，其中的DNA片段含有来自pBXbA的突变espB。将形成的此质粒转导进入大肠杆菌SM10λpir，并反向结合进入携带有pACYC184的RDEC-1。为了在espA和espB中构建双突变，可将pAABxbΔ导入AAF001ΔA(EspA-)菌株。通过它们的表型保持有对蔗糖和氯霉素的抗性，以及对氨苄青霉素敏感，证明是三个RDEC-1非极性突变株。为了证实在espA和espB中插入了终止密码子，可以从每个突变株制备染色体DNA，用含有esp基因的引物进行PCR。形成的PCR产物用BglⅡ进行酶切消化，以便证实存在这种构造的限制性酶切位点。espA或/和espB中含有终止密码子的突变株分别被命名为AAF001ΔA(EspA-),AAF001ΔB(EspB-)和AAF001ΔAB(EspA-/EspB-)。
为了证实自杀载体不影响各自的侧翼区或其它基因座，可实施突变返回到野生型(“回复突变”)。通过将自杀载体pAA23和pAABxb反向结合进入AAF001ΔA(EspA-)和AAF001ΔB(EspB-)菌株，得到了二个回复突变株。通过PCR和BglⅡ酶切消化，证实了所形成的是回复突变株，AAF003和AAF004。按如下在EspA和EspB株中构造回复突变将1.1千碱基对的SalⅠ-SacⅠDNA片段插入pCVD442的SalⅠ-SacⅠ位点，得到pAA23，其中的DNA片段是来自含有espA的pORF23。将pBxb的1.4千碱基对的SalⅠ-SacⅠ片段插入pCDD422的SalⅠ-SacⅠ位点，得到pAAFBxb。将pAA23的pAABxb导入SMλpir，并反向结合进入AAF001AA和AAF001AB。如上所述证实了所形成的是回复突变株，被命名为AAF002(Esp+)和AAF003(EspB+)。
按如下对致肠道病E.coli espA和espB进行克隆通过PCR扩增编码espA和espB的2.8千碱基对DNA片段，使用引物EespA(+)和EespB(-)，以致肠道病大肠杆菌2348/69的染色体DNA为模板。用BamHⅠ和SalⅠ酶切消化此片段，并在lacZ启动子的控制下被导入低拷贝载体pMW118的Bam[HI-〕SalⅠ位点，得到pMWespAB。用BglⅡ酶切消化在espD开放读框内具有限制性酶切位点的pMWespAB，与Klenow片段平端连接，然后自身连接到了pMW6espD，还可用BglⅡ和BamHⅠ酶切消化pMWespAB，然后自身连接得到了pMWespB。用BglⅡ-SalⅡ酶切消化pMWespAB，并以Klenow片段填补，然后自身连接得到了pMWespA。
对RDEC-1和它的突变株在组织培养基中的分泌成分进行了分析。致肠道病大肠杆菌在组织培养基中分泌5种蛋白质，110千道尔顿的(EspC)，40千道尔顿的，39千道尔的，37千道尔顿的(EspB)，和25千道尔顿的(EspA)。RDEC-1显示有相似的分泌成分，不同的是它不分泌与EspC等同的蛋白质。致肠道病大肠杆菌诱发宿主信号传导路径不需要EspC。虽然有二个分泌蛋白(40和39千道尔顿的)难以分辨，但是应用不同条件的SDS-PAGE可分辨这些蛋白质。RDEC-1分泌二个与致肠道病大肠杆菌EspA和EspB具有相似迁移率的蛋白质。
可按如下制取RDEC-1分泌蛋白将培养过夜的细菌培养物在DMEM中作1∶100稀释，然后培养至在600nm的光密度(OD600)为1.0。为了对含有致肠道病大肠杆菌espA和espB重组质粒的RDEC-1突变株诱发转录，在DMEM中加入了异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。通过离心(18000xg,10分钟)除去细菌，加入10％冰冷的三氯醋酸使上清液沉淀，并在冰上放量1小时。离心之后，将沉淀重新悬浮于Lavemmli样品缓冲液中，并通过12％SDS-PAGE进行分析。
在Western免疫印迹检测中，EspA和EspB蛋白对抗-致肠道病E.coliEspA和抗-致肠道病大肠杆菌EspB抗血清都有交叉反应，表明RDEC-1也分泌EspA和EspB蛋白。在Western印迹检测中，使用了抗致肠道病大肠杆菌EspA和EspB的兔多克隆抗体。
突变株AAF001ΔA,AAF001ΔB和AAF001ΔAB，分别缺乏分泌EspA,EspB和EspA/EspB，这是根据对它们的分泌成分和Western印迹分析所作的判断。对于突变株AAF00ΔA(EspA-)仍然可分泌EspB，它的基因定位在espA下游(3′)，表明终止密码子插入突变不影响下游基因表达。这些结果也证明，RDEC-1 EspA和EspB蛋白是由我们称为espA和espB的序列编码的。而且，二个最初从AAF001ΔA(EspA-)和AAF001ΔB(EspB-)得到的回复突变株AAF002和AAF003，现在可表达亲本的分泌蛋白，表明AAF001ΔA和AAF001ΔB中的每种非极性突变正如所预测，并且不影响下游基因和其它的基因座。尽管在SDS-PAGE中RDEC-1 EspA和EspB的迁移率比致肠道病大肠杆菌的稍快些，但是计算的RDEC-1 EspA和EspB的分子量比致肠道病大肠杆菌的更大。
与野生型RDEC-1株相比较，EspA-,EspB-和EspA-/EspB-菌株中其它分泌蛋白的量减少了。并且，在EspA-/EspB-菌株中40千道尔顿和39千道尔顿蛋白质可检测分泌作用的减少，比在EspA-和EspB-菌株中发现的更大。分泌除EspC外的致肠道病大肠杆菌蛋白，是由Sep簇编码的Ⅲ型分泌系统介导的。可能通过插入终止密码子对EspA或EspB的截短会干扰此分泌路径，或者干扰此系统的反馈调节，从而影响其它Ⅲ型依赖性分泌蛋白的分泌。
Esp蛋白为激发宿主信号传导路径所需要。致肠道病大肠杆菌EspA和EspB蛋白诱发宿主信号传导路径，导致酪氨酸磷酸化蛋白，细胞骨架肌动蛋白和其它成分在粘附的细菌下面聚积。为了测定RDEC-1 EspA和EspB是否在HeLa细胞中触发这些事件，可用若丹明-次毒蕈环肽和荧光标记的抗-磷酸酪氨酸抗体对细胞骨架肌动蛋白和酪氨酸-磷酸化蛋白染色。虽然粘附着的RDEC-1细胞骨架肌动蛋白和酪氨酸磷酸化蛋白聚积水平，比致肠道病大肠杆菌的低，但是对于致肠道病大肠杆菌这些行为是不易辨别的。相反，RDEC-1 EspA-,EspB-和EspA-/EspB-菌株，在粘附的细菌下面不聚积细胞骨架肌动蛋白或酪氨酸-磷酸化蛋白。但是，回复突变株AAF003和AAF004与其亲本菌株相似，聚积了这些蛋白质。
当将含有致肠道病大肠杆菌espA或espB的质粒，或者含有此二个基因的质粒导入RDEC-1 EspA-,EspB-，和EspA-/EspB-菌株，细胞骨架肌动蛋白和酪氨酸磷酸化蛋白的聚积也可恢复。但是，当用仍然分泌EspB的致肠道病大肠杆菌EspA-株同RDEC-1 EspB共感染时，则不能恢复诱发宿主信号传导事件。在共感染中致肠道病大肠杆菌EspB也不能弥补RDEC-1 EspA。因此，对于激活宿主信号传导路径，在RDEC-1和致肠道病大肠杆菌中EspA和EspB的功能是相似的，但需要由同一菌株分泌这二种蛋白。
当用致肠道病大肠杆菌感染HeLa细胞时，借助于免疫印迹法可检测出酪氨酸-磷酸化Hp90。以RDEC-1感染的细胞不能检测出酪氨酸-磷酸化Hp90，尽管借助于免疫荧光法在粘附RDEC-1细菌细胞下面可观察到酪氨酸磷酸化蛋白。
如根据免疫荧光显微镜的观察判断，对HEp-2和T84细胞致肠道病大肠杆菌不诱发酪氨酸磷酸化。测序结果表明，与致肠道病大肠杆菌相比较，RDEC-1 EspB更类似于致肠出血大肠杆菌的EspB。本实施例中的这些结果表明，在RDEC-1感染过程中，较少的酪氨酸-磷酸化蛋白聚积是由于RDEC-1较低的粘附效率，因为粘附水平不同或Esp蛋白的异质性，或者是二者兼而有之。
粘附和侵入能力。在体外试验中，致肠道病大肠杆菌的EspA和EspB不仅与激发宿主信号传导路径有关，而且也是侵入所必需的。为了研究RDEC-1的EspA和EspB在粘附和侵入中的作用，对RDEC-1esp突变株和RDEC-1株进行了比较。EspA-,EspB-和EspA-/EspB-菌株的粘附能力与野生型RDEC-1菌株的粘附能力相似，表明粘附与EspA和EspB表达无关。虽然野生型RDEC-1的侵入能力比致肠道病大肠杆菌的侵入能力低大约90倍，但是在突变株EspA-，EspB-和EspA-/EspB-中，这种能力将进一步降低。然而，回复突变株AAF002和AAF003的侵入能力恢复了，这些结果表明，RDEC-1的侵入能力取决于EspA和EspB。
为了测定致肠道病大肠杆菌EspA和EspB对RDEC-1突变株的互补能力，将含有致肠道病大肠杆菌espA和espB基因的各种质粒导入了RDEC-1突变株，与野生型RDEC-1菌株进行了侵入效率的比较。有趣的是，携带有pMWespAB的AAF001ΔAB(RDEC-1 EspA-/EspB-)(EPECEspA+/EspB+)其侵入水平比野生型RDEC-1高4倍，尽管AAF001ΔAB株分泌致肠道病大肠杆菌EspA和EspB的量比在RDEC-1正常见到的更低。因此，在RDEC-1和致肠道病大肠杆菌株之间见到的对HeLa细胞的不同侵入水平，可归因于Esp蛋白，在这种组织培养模型中，致肠道病大肠杆菌的EspA和EspB介导侵入作用更有效。同源性比较表明，在RDEC-1和致肠道病大肠杆菌中EspA是高度保守性的，但是EspB是较异质性的，表明RDEC-1和致肠道病大肠杆菌之间侵入能力的差异可能是由于EspB蛋白。有趣的是，致肠出血大肠杆菌0157粘附于，但不侵入进入人回盲肠(HCT-8)上皮细胞。RDEC-1的EspB与致肠出血大肠杆菌的EspB，而不是致肠道病大肠杆菌的更相似，这可能更突出了EspB在侵入中的作用。这些发现有力地证明，Esp的异质性影响致肠道病大肠杆菌，RDEC-1和致肠出血大肠杆菌的侵入能力。
EspD突变也影响EspA和EspB分泌，致肠道病大肠杆菌含有一个开放读框，espD，位于espA和espB之间。为了证实espD产物在分泌中的作用，构建了编码致肠道病大肠杆菌espA,ΔespD(在BglⅡ位点的移码突变)，和espD的质粒pMWespD，并被导入进RDEC-1双突变株AAF001AAB。致肠道病大肠杆菌EspA和EspB分泌蛋白的量，在AAF001AAB〔pMWespD〕中比在AAF001AAB〔pMWespAB〕中低，后者含有编码完整致肠道病大肠杆菌espA,espD和espB基因的片段。并且侵入能力也降低了。这些结果表明，破坏espD会影响致肠道病大肠杆菌EspA和EspB蛋白的分泌。在此实施例中，我们发现，espA和/或espB突变也减少了其它分泌蛋白的量，这可能是由于它们的截短产物所致。与espA或espB突变株相比较，espA和espB双突变株的分泌水平更加降低了。因此，被截短的致肠道病大肠杆菌EspD由于干扰Ⅲ型分泌系统，可能影响AAF001AAB〔pMW6espD〕中EspA和EspB的分泌。是否EspD直接与此分泌系统有关尚不清楚。
致肠道病大肠杆菌和RDEC-1分泌蛋白受温度的密切控制，此温度与它们相关的宿主体温相对应。温度可调节致肠道病大肠杆菌和致肠出血大肠杆菌413/89-1分泌蛋白的表达。而温度从20℃提高至37℃，对EspB的表达大大增加。因为EspA和EspB蛋白受适当的宿主体温调节，可将野生型致肠道病大肠杆菌和RDEC-1株接种在DMEM中，在不同的温度下培育之后制取分泌蛋白，然后通过SDS-PAEG分析。致肠道病大肠杆菌分泌蛋白的表达在33℃就明显可见，36℃达到最大分泌水平。39℃表达降低了，42℃未见有分泌蛋白。与此不同，RDEC-1分泌蛋白的最大表达在39℃，在42℃这些蛋白仍然被表达。这些结果表明，在致肠道病大肠杆菌和RDEC-1中，Esp蛋白的最大表达是由它们相关宿主的体温人(37℃)和兔(39℃)激发的。
结论是，激发宿主信号传导路径和侵入作用需要这二种蛋白。用致肠道病大肠杆菌esp基因所作的互补实验揭示，由RDEC-1和致肠道病大肠杆菌激发的宿主信号传导事件，看来是由相同的分泌蛋白介导的。最后，RDEC-1和致肠道病大肠杆菌分泌蛋白的最佳表达，与它们天然宿主的体温相关联。这可以解释它们严格的宿主特异性，以及兔和其它动物不感染致肠道病大肠杆菌的原因。用RDEC-1 espA和espB株进行的动物感染研究，将提供有关这些分泌蛋白对毒力作用的信息，并且可能对疫苗研究有用。
实施例8二种兔致肠道病大肠杆菌(RDEC-1)分泌蛋白EspA和EspB是毒力因子本实施例的目的是证明EspA和EspB蛋白在致病机理中的作用。为了研究这些蛋白在毒力中的作用，在兔致肠道病大肠杆菌菌株RDEC-1的espA和espB中构建了突变。
通过口腔胃途径对幼年兔接种RDEC-1和其espA和espB突变株。感染1周后发现，绝大多数RDEC-1在盲肠和结肠中。但是，在这些组织中二个突变株的数量大大少于其亲本菌株。在盲肠中还观察到RDEC-1特异性地粘附于圆形小囊(囊泡相关上皮)，盲肠中也可见细菌定居，表明盲肠的圆形小囊是此病原菌的重要定居位置。EspA-和EspB-株对圆形小囊的粘附水平比亲本株小70和8000倍。这些结果表明，RDEC-1的粘附能力和组织趋向性取决于这二种Esp分泌蛋白。而且，对细菌的定居作用和致病机理，EspB比EspA似乎有更重要的作用。这首次证明，与激发宿主细胞信号传导路径有关的致肠道病大肠杆菌分泌蛋白EspA和EspB，也是其定居和毒力所需要的。
按如下对动物进行感染离心收集培养过夜的细菌，重新悬浮于1ml磷酸缓冲盐水中。使New Zealanl白兔(体重1.0-1.6kg)禁食过夜，然后用口腔胃管向胃内接种5ml无菌的2.5％碳酸氢钠和1ml RDEC-1或者espA或espB菌株(2.5×1010)。第二天对每只兔再接种同样剂量的细菌。
按如下进行临床评定对每只兔每天称体重，通过直肠棉拭子，并从粪球中收集粪便排出的细菌。将直肠棉拭子在含有萘啶酮酸的Mac Conkey培养板上滚动其一半表面。从每只兔收集5个粪球或相同量的液体粪便，悬浮于3ml磷酸缓中盐水中，每个粪便悬浮液取0.1ml在含有萘啶酮酸的MacConkey板上作平板培养。按如下对萘啶酮酸抗性菌落的生长情况评分0，无生长；1，有稀疏的菌落；2，有致密的菌落；3，有汇合生长的菌落。
按如下进行组织取样和制备在通过静脉注射氯氨酮和超剂量戊巴比妥钠给药杀死动物之后，立即切取组织。
按如下测定肠组织内细菌集群的数量取除去盲肠的肠段(10cm)，在其近端和远端作双结扎，在双结扎的部分之间切开肠段，然后用10ml冰冷的磷酸缓冲盐水冲洗。取1g粘稠的盲肠内含物，加到9ml磷酸缓冲盐水中。将形成的磷酸缓冲盐水悬液稀释，并在含有萘啶酮酸的MacConkeg板上作平板培养。
按如下测定粘附于肠组织的细菌数量用9mm直径的软木塞打孔器切取组织样品，以磷酸缓冲盐水洗3次，放入2ml冰冷的磷酸缓冲盐水中，并用匀浆器作匀浆，然后将系列稀释的样品在MacConkey板上作平板培养。按如下计算粘附在每平方厘米组织上的细菌数量CFU/cm2=每块板上的细菌数目×稀释倍数×2ml/～0.452。
实施例9建立筛选细菌Ⅲ型分泌作用抑制剂的测定法本实施例的目的是提供一种用于筛选细菌Ⅲ型分泌作用抑制剂的测定方法。
将编码EspA多肽的多核苷酸与几种熟知的分子，包括HSV标志融合。从致肠道病大肠杆菌仍然可分泌基因融合物。一种质粒含有编码EspA(介导Ⅲ型分泌作用所需要的)氨基末端部分的espA基因区，它已融合于编码标志序列的单纯疱疹病毒(HSV)序列，针对标志序列的抗体可以购得。将此质粒转化进入一个菌株，此菌株含有espA突变，但仍然分泌使用Ⅲ型分泌系统的其它致肠道病大肠杆菌分泌的蛋白质。收集含有这些融合蛋白的上清液，对ELISA检测板加样，进行标准的ELISA测定。比色计读数指示分泌了融合蛋白。
此质粒还被转化进入缺乏Ⅲ型分泌的菌株(即阴性对照)。当此融合蛋白在这株细菌中被表达时，此融合蛋白被表达而不被分泌。以此突变株作的ELISA测定结果证实它没有被分泌。
因此，提供了一种方便的，用于检查分泌的ELLSA测定法。此检测法简便，不需要特殊的技术。此方法也是经济的，因为不需要昂贵的试剂。此方法是自动化的，可用于筛选鉴别细菌Ⅲ型分泌作用抑制剂的试剂。
为了测定分泌作用，使细菌在存在待测化合物的组织培养液中静止培养过夜。这些条件可引发出致肠道病大肠杆菌介导的分泌。第二天通过离心除去细菌，将此上清液置于96孔微量滴定板中。对此上清液进行标准的ELLSA测定。如果此待测化合物是杀菌的，此细菌不能生长过夜。
将编码致肠道病大肠杆菌分泌的另一个多肽的多核苷酸与几个熟知的分子融合。将编码EspB多肽的多核苷酸融合于HSV标志，对此tag序列的抗体可购得。致肠道病大肠杆菌仍然可分泌基因融合产物。将此质粒转化进入一个菌株，此菌株含有espA突变，并仍然分泌使用Ⅲ型分泌系统的其它致肠道病大肠杆菌分泌蛋白。收集含有这些融合物的细菌上清液，对ELISA检测板加样，用例如抗-HSV抗体进行标准的ELISA测定。这种筛选法可用于测定来自有医疗作用植物的提取物。1/200-1/1000的稀释度(约250μg/ml)是适当的。对有希望的化合物可按此ELISA分泌测定法重复筛选，以便检查其再现性。
虽然已使用现有的优选实施方案作参考对本发明进行了描述，但是应该认识到，各种修改形式要按照本发明的精髓才能实现。因此，本发明只通过下列权利要求加以限定。
权利要求
1．一种分离的EspA多肽，其特征是a)是一种来自致肠道病大肠杆菌或致肠出血大肠杆菌的分泌性蛋白；以及b)包含如在SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列。
2．一种编码权利要求1多肽的分离的多核苷酸。
3．一种选自如下的分离的多核苷酸a)SEQ ID NO:1中列出的核酸序列；b)SEQ ID NO:1中列出的核酸序列，其中的T变为U；c)与a)互补的核酸序列，以及d)a),b)或c)的片段，其长度为至少15个核苷酸碱基，并可在严紧条件下与编码SEQ ID NO:2中列出的多肽的DNA杂交。
4．一种选自如下的分离的多核苷酸a)SEQ ID NO:3中列出的核酸序列；b)SEQ ID NO:3中列出的核酸序列，其中的T变为U；c)与a)互补的核酸序列，以及d)a),b)或c)的片段，其长度为至少15个核苷酸碱基，并可在严紧条件下与编码SEQ ID NO:4中列出的多肽的DNA杂交。
5．一种含有权利要求2多核苷酸的载体。
6．一种含有权利要求5载体的宿主细胞。
7．一种与权利要求1多肽结合的抗-EspA抗体。
8．权利要求7的抗体，其中该抗体是单克隆抗体。
9．权利要求7的抗体，其中该抗体是多克隆抗体。
10．一种检测样品中EspA多肽的方法，包括a)使样品与权利要求7的抗体接触；和b)检测权利要求7的抗体与EspA多肽的结合，其中此结合是样品中存在EspA多肽的指示。
11．权利要求10的方法，其中的样品是组织。
12．权利要求10的方法，其中的样品是生物液体。
13．权利要求10的方法，其中样品中存在EspA多肽是被致肠道病大肠杆菌感染的指示。
14．权利要求10的方法，其中样品中存在EspA多肽是被致肠出血大肠杆菌感染的指示。
15．一种免疫宿主的方法，此宿主对由产生EspA的大肠杆菌引起的疾病敏感，该方法包括a)对该宿主给予权利要求1的EspA多肽；和b)诱发宿主对EspA的保护性免疫反应。
16．权利要求15的方法，其中产生EspA的微生物是大肠杆菌。
17．权利要求16的方法，其中产生EspA的大肠杆菌是致肠道病大肠杆菌。
18．权利要求16的方法，其中产生EspA的大肠杆菌是致肠出血大肠杆菌。
19．一种缓解由产生EspA的微生物引起的疾病的方法，包括a)以权利要求1的多肽免疫宿主；和b)诱发宿主对EspA多肽的免疫应答，从而缓解由产生EspA的微生物感染宿主引起的疾病。
20．权利要求19的方法，其中产生EspA的微生物是大肠杆菌。
21．权利要求19的方法，其中产生EspA的大肠杆菌是致肠道病大肠杆菌。
22．权利要求19的方法，其中产生EspA的大肠杆菌是致肠出血大肠杆菌。
23．一种检测样品中espA多核苷酸的方法，包括a)使怀疑含有espA多核苷酸的样品与能同权利要求2的espA多核苷酸杂交的核酸探针接触；和b)检测该探针与espA多核苷酸的杂交作用，其中此杂交作用的检出是样品中存在espA多核苷酸的指示。
24．一种用于产生espA多核苷酸的重组方法，包括将编码选择性标记的核酸插入权利要求2的多核苷酸，使形成的多核苷酸编码含有选择性标记的重组EspA多肽。
25．一种通过权利要求24的方法产生的多核苷酸。
26．一种含有权利要求25的多核苷酸的宿主细胞。
27．一种用于产生EspA多肽的重组方法，包括a)使含有编码权利要求1EspA多肽的多核苷酸的宿主细胞，在允许其表达和分泌EspA多肽的条件下培养生长；和b)分离此多肽。
28．一种鉴别抑制细菌Ⅲ型分泌系统的化合物的方法，包括a)将权利要求25的多核苷酸导入具有细菌Ⅲ型分泌系统的细菌；b)使该细菌在允许细菌生长并分泌由此多核苷酸编码的多肽的条件下培养生长；c)使怀疑能抑制细菌Ⅲ型分泌系统的化合物与该细菌接触；d)诱发对该多肽的表达；和e)检测该多肽的分泌，其中缺乏分泌作用是对细菌Ⅲ型分泌系统有抑制作用的指示。
29．一种用于产生非致病性微生物的方法，包括a)在编码权利要求1的EspA多肽的多核苷酸中产生突变；b)将编码选择性标记的核酸序列插入此突变位点；c)将步骤b)中突变的espA多核苷酸导入微生物的染色体espA基因，以便在染色体espA基因中产生突变；以及d)选出具有该突变的微生物。
30．权利要求29的方法，其中编码选择性标记的核酸序列编码对卡那霉素的抗性。
31．权利要求29的方法，其中的微生物是大肠杆菌。
32．一种通过权利要求29方法产生的，具有突变espA基因的微生物。
33．一种用于检测权利要求1 EspA多肽的试剂盒，包括被分隔可容纳一个或多个紧密封装容器的装载工具，所述容器包括一个装有能与EspA多肽结合的抗体的容器。
34．权利要求33的试剂盒，其中的抗体是可检测标记的。
35．权利要求34的试剂盒，其中的标记是选自放射性同位素，生物发光化合物，化学发光化合物，荧光化合物，金属螯合剂，以及酶。
36．一种用于检测权利要求2 espA多核苷酸的试剂盒，包括被分隔可容纳一个或多个紧密封装容器的装载工具，所述容器包括一个装有能与espA多核苷酸杂交的核酸探针的容器。
37．一种通过权利要求34方法产生的，具有突变espA基因的微生物。
38．一种用于检测EspA多肽的试剂盒，包括被分隔可容纳一个或多个紧密封装容器的装载工具，所述容器包括一个装有能与EspA多肽结合的抗体的容器。
39．权利要求38的试剂盒，其中的抗体是可检测标记的。
40．权利要求39的试剂盒，其中的标记是选自放射性同位素，生物发光化合物，化学发光化合物，荧光化合物，金属螯合剂，以及酶。
41．一种用于检测espA多核苷酸的试剂盒，包括被分隔可容纳一个或多个紧密封装容器的装载工具，所述容器包括一个装有能与espA多核苷酸杂交的核酸探针的容器。
42．权利要求41的试剂盒，其中的探针是可检测标记的。
43．权利要求42的试剂盒，其中的标记是选自放射性同位素，生物发光化合物，化学发光化合物，荧光化合物，金属螯合剂，以及酶。
44．一种产生EspA融合蛋白的方法，包括a)使宿主细胞在允许其表达和分泌融合蛋白的条件下生长，此宿主细胞含有编码EspA的多核苷酸，此多核苷酸可操作地连接于编码所研究多肽或肽的多核苷酸；和b)分离出此融合蛋白。
全文摘要
本发明提供了一种EspA多肽,它是由致病性大肠杆菌如致肠道病大肠杆菌(EPEC)和致肠出血大肠杆菌(EHEC)分泌的。对于由这种致病大肠杆菌引起的疾病可借助于标准的技术进行诊断,如那些基于用能与EspA结合的抗体检测此蛋白质的技术,以及那些基于用核酸探针检测编码EspA蛋白的核酸的技术。本发明还提供了编码EspA的分离的核酸序列,EspA多肽,EspA肽,一种用于产生重组EspA的方法,能与EspA结合的抗体,以及一种用于检测产生EspA的大肠杆菌的试剂盒。本发明还提供了一种以EspA免疫宿主,以便诱发对EspA保护性免疫应答的方法。
文档编号C12N15/62GK1222937SQ97195690
公开日1999年7月14日 申请日期1997年4月23日 优先权日1997年4月23日
发明者B·B·芬莱, M·斯泰恩, B·肯奈 申请人:不列颠哥伦比亚大学