从离子交换和分级分离树脂中除去污染物的一种酶促方法

专利名称：从离子交换和分级分离树脂中除去污染物的一种酶促方法
背景技术：
发明领域本发明涉及酶加工工艺的宽广领域。更特别地是，本发明涉及一种通过用酶处理法从树脂尤其是离子交换和分级分离树脂中除去污染物的方法。本发明还涉及利用事先用酶清洗过的树脂来生产纯化的谷物增甜剂，尤其是谷物糖浆和高果糖谷物糖浆的一种方法。
相关技术的描述在分析化学中，树脂为分离有机或无机离子或非离子样品提供了有力工具。树脂通常地包含在柱子或管道中。树脂加工自交联聚苯乙烯之类的物质，它们被化学地交联在一起，也称DVB(二乙烯基苯)，有大孔(大孔洞)和凝胶(小孔)的形式。食品加工中所用的其它树脂来自丙烯酸酯类。通过再生该树脂，树脂通常可再利用。被污染物造成去活化或污染会破坏树脂。除热不稳定性(脱磺酸基作用或丧失官能作用)之外，离子性、颗粒性沉积物和聚合性物质也会引起污染。
离子交换树脂是一种合成的有机聚合物，它常常是基于交联的聚苯乙烯，通过加入带电荷基团产生悬浮于水溶液中时将交换抗衡离子的诸材料，从而衍生出该物质。阳离子交换树脂具有固定的酸性取代基，该酸性取代基是基于诸如强酸交换剂磺酸或弱酸交换剂羧酸之类物质。阴离子交换树脂具有固定的、基于如季铵或乙氧胺基或铵类等弱碱性交换剂的取代基。其它功能基团可被附着到树脂骨架上以使其更具选择作用。树脂的衍生化程度和交联度决定了离子交换的总容量。
一种称为层析的技术是基于各物质在液相和固相间的分配能力而用来分离各种物质的混合物。离子交换层析被定义为这样一类层析，其中的固相支持物是一种用于分离带电分子或离子的混合物的离子交换材料。这可在制备级水平上进行，或作为高压液相层析的一种变更形式。
层析分离决定于交换潜力、洗脱剂、柱长度及加样量、流速、颗粒大小和温度的不同。层析分离能被用于广阔的用途中，包括谷物增甜剂，如谷物糖浆(eoru syrup,CSU)和高果糖谷物糖浆(high fructose cornsyrup,HFCS)的纯化。通过水解玉米淀粉可制得谷物增甜剂。对已制得的成分给出一葡萄糖当量(dextrose equivalent,D.E.)数，它决定于反应所允许的转化程度。此数值越低，转化的程度也越低。越高的D.E.数值表示越完全的转化，92D.E.表示完全从谷物淀粉转化成了葡萄糖(谷物糖)。高果糖谷物糖浆能用酶转化至97D.E.，并分级成97-99D.E.。多年来谷物增甜剂已被用来制备冰琪淋和酸乳酪水果。需谷物增甜剂掺入的一系列原因中有两个原因是最主要的。首先，谷物增甜剂给制成的产品以理想的形状或“口感”，这是单用蔗糖所不能达到的。其次，某些谷物增甜剂每磅比蔗糖可掺入更高的甜度，因而使用它们更便宜。显而易见，由于谷物增甜剂的重要价值，用来再生可用于制备纯化的谷物增甜剂的树脂的改进方法将是十分有益的。目前，离子交换和分级分离层析是纯化谷物增甜剂时可选择的方法，然而，装树脂的柱或管道经常会被污染，并且难于清洗。
目前选择的用来再生树脂的方法包括化学药品的使用。通常使用的化学药品包括下述但并不局限于这些盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)、氢氧化铵(NH4OH)和碳酸钠(Na2CO3)。首先，用冲洗剂(常用水)冲洗树脂，然后进行一系列化学处理步骤。然而，有时即使经化学处理或再生后，树脂仍被微生物(如细菌)所污染，这种情况并不少见。
本发明的一个目的就是，在酶从未被利用的一个加工领域内，提供一种利用酶特别是蛋白酶、脂肪酶、糖酶和α-淀粉酶的作用来清洗树脂的方法。本发明特别适于清洗用于纯化谷物增甜剂的离子交换和分级分离树脂。
发明概述本发明涉及一种用于清洗树脂、尤其是离子交换和分级分离树脂的酶促方法。该方法可单独使用或与化学方法联合使用。对于包含了需分级分离或离子交换处理的污染物如蛋白质、糖类、脂类和残留的未转化淀粉等的液体，该方法可提高它们的产量。此发明还涉及在谷物增甜剂，尤其是谷物糖浆和高果糖谷物糖浆的生产中树脂的用途。
诸优选实施方案的描述本发明涉及从树脂尤其是离子交换和分级分离树脂中除去污染物的一种酶促方法。将诸酶暴露于已污染的树脂内，并选择性地在指定的特定时间内使酶再循环通过树脂。酶再循环的时间长短是一个生产要素。用于处理树脂的时间越短，清洗树脂所需的酶剂量就越大。
本发明可将酶的新用途与传统化学处理方法联合起来，从而从树脂中除去污染物。酶有一特征的最适pH，在此pH值时它们的活性最高。酶的pH-活性曲线反映了酶催化位点中重要的质子供体或质子受体基团处于所要求的离子化状态时的pH值。酶的最适pH不必与正常环境的pH值一致，环境pH值可稍高或稍低于最适pH。
本发明能与可在pH1-9，更优选pH6-8之间，尤其更优选pH6.5-7.5和最适温度90-180F，更优选120-130F条件下作用的诸现有蛋白酶、脂肪酶、糖酶和α-淀粉酶一起使用。
只要是本领域的技术人员就会懂得多种酶可用于本发明中，用哪一种酶取决于造成问题的污染物。以下的酶类是常规使用的，现只提供作为例子，并不希望限制了本发明的范围。以下酶的通用名后的括号中是它们的商品名。
蛋白酶/肽酶(Alcalase,Neutrase,Flavourzyme)β-葡聚糖酶(Finizym,Ceveflo)脂肪酶(Palatase,Lipozyme)α-淀粉酶(BAN,Termamyl L型)糖酶(Viscozyme)多酶复合物包括以下种类但不局限于此α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶(Ceremix)、糖酶(Viscozyme)为了本申请的诸目的，蛋白酶/肽酶被定义为可水解(断裂)蛋白质成短链、可溶性肽和氨基酸的一类酶。
β-葡聚糖酶被定义为可水解β-葡聚糖(1,4-β-葡聚糖，1,3-β葡聚糖)成为寡糖和双糖的一类酶。1,4-β和1,3-β的标示是指分子中此类酶所作用的碳原子间的化学键。
寡糖被定义为化学连接在一起的葡聚糖分子的短链。这些链的长度通常是3-5个葡萄糖单元。
双糖被定义为连接在一起的两个葡萄糖单元。这在β-葡聚糖酶作用中只少量形成。
脂肪酶被定义为可在1,3-酯化学连接位点将短链和长链脂肪酸水解成甘油单酯或甘油双酯和脂肪酸的一类酶。短链甘油三酯指具有不超过12个碳分子的侧链的甘油三酯，即十二烷酸的酯及碳原子数比它小的酯。长链脂肪酸指具有12个以上碳分子的脂肪酸，即十二烷酸以上的酯。
α-淀粉酶被定义为可随机水解直链淀粉和支链淀粉中的α-1,4糖苷键，导致形成可溶性糊精和寡糖的一类酶。α-1,4糖苷键指构成淀粉的诸葡萄糖分子间的化学联接。一个葡萄糖分子的第1号碳原子键合到毗邻分子的第4号碳原子上。正是此键被α-淀粉酶所攻击，产生淀粉的降解产物-糊精和寡糖。
有两种基本类型的淀粉直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉严格地由α-1,4糖苷键构成，可被α-淀粉酶所分解。支链淀粉是第二类淀粉，它由α-1,4-糖苷键和α-1,6糖苷键构成。α-淀粉酶不能切断1,6键，所以支链淀粉较难被α-淀粉酶水解。
糖酶被定义为一类范围较广的、可水解非淀粉类多糖(β-1,4-α-1,4-α-1,5)的酶。这类酶包括阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶和木聚糖酶。阿拉伯聚糖酶将阿拉伯聚糖水解成寡阿拉伯聚糖和阿拉伯糖(arabanose)。纤维素酶将纤维素水解成寡纤维素和cellubiose。半纤维素酶将半纤维素水解成寡戊聚糖和戊聚糖。木聚糖酶将木聚糖水解成寡木聚糖和木糖。
如果鉴别出了两种或更多污染物，应核对所用每一种酶的最适pH和温度，如果有可能，这些酶可作为多酶复合物一起加入。当两种酶联合使用时，很少有可能两种酶都在它们的最适pH和温度条件下被使用。在这种情况下，可采用两种酶均具有相对高活性的一个共有的重叠区域。如果该两种或多种酶的pH和温度最适值有很大差异，那么可将它们逐次加入。通常，该两种或多利酶使用比率大约与污染物比率相同。多酶复合物的例子包括下述但并不局限于这些糖酶，包括阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶和木聚糖酶(Viscozyme)α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、蛋白酶(Ceremix)本领域技术人员懂得，随着研究的进展及具有更大耐受性(特别是在低pH范围内)的酶的鉴定出来，本领域技术人员会将这些酶用于本发明中。
在本发明的另一优选实施方案中，在酶促处理前进行污染物的鉴定。尽管此步骤并非清洗所绝对必需的，但它可节省钱和时间，避免无效酶的使用和不成功的清洗。因为通常酶对它们的底物都具有高度的专一性，所以理想的情况是，在污染物被鉴定后，才挑选用来处理该树脂的酶或酶混合物。然而，本领域技术人员知道，确定树脂中污染物的来源有时比较困难，或者是不可能的。因此，酶的选择有时必须在对污染物不了解的情况下进行。
在本发明的另一个优选实施方案中，在用一种或多种酶处理之前，将树脂的pH调到所选酶的最适pH范围内。
如果要处理的是阳离子树脂，树脂的容量应用NaOH或Na2CO3完全耗尽直至pH达到6-8的水平，最适为6.5-7.5。如果用Na2CO3来耗尽树脂，必须多加小心，因为在该单元内会形成CO2，从而提高了管内的总压力。
在去甜(sweetening off)后，就可对弱或强碱性阴离子树脂进行处理。如果管内pH大于7.5，应用HCl来完成树脂的耗尽。
在本发明的另一个优选实施方案中，在用一种或多种酶除去仍在进行反应(如离子交换)的污染物起始浓度前，用清洗剂(如水)彻底清洗树脂。在糖类和谷物的湿法碾磨工业中，此步骤被称为“去甜”(“sweeteningoff”)。在本申请中，去甜被定义为，在进行化学和或酶处理前，从树脂和管道中清洗掉糖浆、糖、酒或其它基于糖类的液体，直至管道或单元中的有机碳总量在百万分之3500即3500ppm以下，更优选2500ppm以下。残余糖浆被定义为在“去甜”后保留在管道中的糖浆。在本申请中，“污染物的起始浓度”被限定为污染物含量大于2500ppm，更优选1000ppm，还要更优选100ppm。本申请中，“污染物的残余量”被限定为污染物量少于2500ppm，更优选1000ppm，还要更优选100ppm。
该清洗剂即水并不要求是可饮用的，尽管优选最纯的水。任选地，可将盐加入水中以协助该“去甜”过程。优选地，水应被软化，或者，有可能的话，应该使用回收自蒸发器的冷凝水。在糖类和谷类湿法碾磨工业中，选用的是冷凝水。
将树脂暴露于该清洗剂中，直至进行离子交换的残留的污染物起始量被清除掉。在糖类和谷类湿法碾磨工业中，这种用清洗剂进行的清洗或“去甜”过程必须持续到留在该单元中的可检测到的总有机碳(total organiccarbon,TOC)含量最大不超过2000ppm，更优选含量少于1000ppm，还要更优选含量少于100ppm。为了本申请的目的，“总有机碳”(TOC)被定义为样品中所有有机碳的测量值。因为是以二氧化碳的形式测量有机碳的最终氧化，所以在燃烧舱中燃烧一个小样品，测量散出的二氧化碳含量，再从中减去无机碳导致的量，就可以确定总有机碳含量。保留在该单元中的总有机碳或残余糖的这些含量应不会干扰清洗过程。含量大于2000ppm就有可能干扰此过程。清洗剂的使用也使得本领域技术人员在用一种或多种酶处理污染物前可调节树脂的温度。所用清洗剂的温度应在或稍高于所选酶的最适温度范围，因为pH的调节会降低管道内温度。
在本发明的另一优选实施方案中，在处理完成后，用一种溶液(通常是水)来冲洗该酶溶液直至管中酶浓度被冲洗干净。
在本发明的另一优选实施方案中，用熟知的化学步骤对树脂进行再生。用于再生的典型浓度和化学药品包括对弱碱性阴离子类型树脂，用4％NaOH溶液(96-112kg/m3)和5％Na2CO3溶液(112-118kg/m3)在40℃再循环30-60分钟。对强碱性阴离子树脂，用4％氢氧化钠溶液(112-120kg/m3)和7％碳酸钠溶液(80-96kg/m3)在40℃再循环30-60分钟。
上面是对本发明的综合描述，其内容可参照某些实施例而更好地理解，本文中所包括的这些实施例仅用来举例说明本发明，不应理解为限定本发明。
实施例实施例1．树脂中污染物的测定程序如果在选择用于处理污染物的酶及进行处理之前就鉴定出树脂中污染物的类型，就可以节省不必要花费的时间和金钱。用常规方法进行污染物的分析。通常地，本领域技术人员会认识到有诸如下述的树脂污染物蛋白质；脂类如脂肪和油；纤维如纤维素、半纤维素；β-葡聚糖；淀粉如直链淀粉、支链淀粉；或其它糖类，如arabose或xylanose。本领域技术人员常用以下步骤来鉴定树脂中所存在的污染物。应在瓶中过滤树脂后对所有污染物进行分析。仅对溶液进行测定。测定通常是严格的，且包含将与树脂反应的强氧化剂。
将2克树脂样品放于烧杯中，烧杯内已有一磁力搅拌棒，加入水至总体积200ml。调节溶液的pH和温度到所选酶的最适pH范围内。该酶已事先称重以使其在溶液中的总百分率相当于该溶液总重量的3-5％。这一步的目的是要确定污染物的成份。每一样品仅用一种酶进行检查。将该溶液混合30-60分钟，然后恰当地分析污染的来源。
可用许多种方法过行分析，其中大部分方法均为特殊工业中的“标准方法”。对于谷类湿法碾磨厂或糖类提炼厂中所用的树脂来说，最可能的污染物是蛋白质、淀粉、β-葡聚糖、脂肪和脂类，其中蛋白质最多。
蛋白质的分析能用凯氏方法完成，该方法来自谷类精制者协会公司成员的标准分析方法谷类淀粉(未修饰)，方法B-48。凯氏法有许多变更方法，但这一方法是适当的，并且很灵敏。
脂肪和脂类的分析可用天然脂肪(可用已烷抽提)方法完成，该方法来自谷类精制者联合协会公司诸成员的标准分析法；饲料，方法G-11。该程序有其它变更程序，但这一方法是最适用的。
β-葡聚糖(谷类纤维)的分析可用该天然纤维方法完成，该方法来自谷类精制者联合协会公司诸成员的标准分析法；饲料，方法G-12。该程序有其它变更程序，但这一方法是最适用的。
β-葡聚糖(谷类纤维)的分析可用该天然纤维方法完成，该方法来自谷类精制者联合协会公司诸成员的标准分析法；饲料，方法G-12。该程序有其它变更程序，但这一方法是最适用的。
β-葡聚糖(谷类纤维)的分析可用该天然纤维方法完成，该方法来自谷类精制者联合协会公司诸成员的标准分析法；饲料，方法G-12。该程序有其它变更程序，但这一方法是最适用的。
淀粉的分析可通过将几滴标准碘溶液加入该树脂溶液中而完成。如果加入碘溶液后，烧瓶中形成紫色、绿色或蓝色，那么其中存在天然形式的淀粉。实施例2．酶处理条件污染物可任意选择性地用实施例1的方法进行鉴定。尽管这并不必需，但它使得能对处理污染物的酶进行适当选择，并可选用合适的化学处理方法。污染总量用占树脂加污染物总重的百分比来估算和表示。用清洗剂，如水清洗对该离子交换管道中的树脂进行去甜，直至残余污染物或污染物浓度(经历离子交换的物质)，如谷物糖浆或高糖谷物糖浆已降低到可接受的水平，通常是1000-2500ppm总有机碳。尽管更低的水平是更理想的。
调节树脂的pH至所选酶的pH范围内。例如，若选择细菌蛋白酶，则该pH范围是5-9，更优选pH5.5-7.5，且温度范围是20-75℃，更优选40-60℃。若选择植物蛋白酶，如木瓜蛋白酶，则pH范围是2.5-10，优选pH3-9.5，且温度范围是30-60℃，更优选38-55℃。
用于调节pH的化学药品包括但并不局限于氢氧化钠、盐酸、氨和碳酸钠。将合适的酶与水混合再加入污染物中。其剂量取决于污染的类型和程度。该酶通过离子交换管道再循环一段适当的时间。再循环时间取决于所用的酶、与最适酶条件的接近程度以及污染程度。循环时间通常是1-24小时。完成处理后，用一种溶液(通常是水)冲洗该酶溶液，直至管中酶含量已被冲尽。此时树脂可选择性地用标准的化学步骤进行再生。用于再生树脂的典型浓度和化学药品包括对弱碱性阴离子型树脂，用4％氢氧化钠溶液(96-112kg/m3)和5％碳酸钠溶液(112-118kg/m3)，在40℃再循环30-60分钟。对强碱性阴离子树脂，用4％氢氧化钠(112-120kg/m3)和7％碳酸钠溶液(80-96kg/m3)，在40℃再循环30-60分钟。实施例3．谷物谷蛋白污染物的酶促处理本实施例阐述了用于从阳离子或阴离子交换树脂中除去谷物谷蛋白污染物的方法，该蛋白质不能用化学药品处理或水除去。
首先将树脂用传统化学方法处理。此化学试验性冲洗的步骤是，用7％盐酸(1N)循环通过阴离子树脂(Dowex88)和4％(1N)的氢氧化钠环流通过阴离子树脂(Dowex66)，时间为4小时，温度为120F，这与植物条件相似。冲洗掉柱中的化学药品，随后进行适当调整以备酶的冲洗试验。
用水冲洗(去甜)树脂，调节至最适酶作用温度。用5％碳酸钠溶液调节管道内pH至6.8，这接近酶的最适pH。
所用酶是0.5L肽酶(Neutrase)。每1500ft3树脂中加30kg肽酶。这一酶含量估计为污染物总量的1％。该酶通过吸入阳离子和阴离子管道而被加入。该溶液再循环通过此管道，总循环时间长4小时。随后从管中冲洗掉该酶。用标准方法分析冲洗下来的酶样品中的总蛋白质含量。〖凯氏分析(谷物精制者协会成员的标准分析方法，方法B-48)〗。每循环1小时收集分析溶液，得到以下结果。已减去了样品中会被检测为蛋白质的酶的蛋白质量。时间溶液中的蛋白质％溶液中的蛋白质％(只用HCl和NaOH洗) (用酶清洗)1 0.2％ 0.5％2 0.3％ 0.8％3 0.7％ 1.1％4 0.7％ 1.4％
酶加入5分钟内，管道中溶液呈混浊褐色外观。这一作用是极其显著的，因为在进行酶处理之前，隔着管子的可视玻璃都能看到管中存在的蛋白质。在经过两种处理后，再看不到蛋白质块，且树脂单元的作用时间降低了70％，回复到正常。从此实施例中可清楚地看到，酶处理法比现有技术中所用的化学处理法有效得多。酶处理法的有效率要高100％。
权利要求
1．从树脂中除去一种或多种污染物的一种酶促方法，该方法包括用一种或多种酶处理该树脂。
2．权利要求1的酶促方法，它还包括在酶处理前，用冲洗剂从树脂中除去起始浓度的一种或多种污染物，使污染物达到残留水平。
3．权利要求1的酶促方法，它还包括调节树脂的pH以适应一种或多种酶的最适pH范围。
4．权利要求1的酶促方法，它进一步包括在酶处理后用第二种清洗剂从树脂中除去一种或多种酶。
5．权利要求2的方法，其中用清洗剂处理后存在的残留污染物的量是2500ppm或更少。
6．权利要求2的方法，其中用清洗剂处理后存在的残留污染物的量是1000ppm或更少。
7．权利要求1的方法，其中用清洗剂处理后存在的残留污染物的量是100ppm或更少。
8．权利要求2的方法，其中所述清洗试剂是水。
9．权利要求1的方法，其中的一种酶是一种蛋白酶。
10．权利要求1的方法，其中的一种酶是一种β-葡聚糖酶。
11．权利要求1的方法，其中的一种酶是一种脂肪酶。
12．权利要求1的方法，其中的一种酶是一种α-淀粉酶。
13．权利要求1的方法，其中的一种酶是一种糖酶。
14．权利要求1的方法，其中使用了两种或更多种的酶。
15．权利要求13的方法，其中用选自下述成员的两种或多种酶处理树脂蛋白酶、β-葡聚糖酶、脂肪酶、α-淀粉酶和糖酶。
16．权利要求15的方法，其中所述两种酶是α-淀粉酶和β-葡聚糖酶。
17．权利要求4的方法，其中最适pH范围在1-9.5之间。
18．权利要求4的方法，其中最适pH范围在3-8之间。
19．权利要求4的方法，其中最适pH范围在6-8之间。
20．权利要求4的方法，其中最适pH范围在6.5-7.5之间。
21．权利要求1的方法，其中所述树脂是一种阴离子树脂。
22．权利要求21的方法，其中所述阴离子树脂是一种强碱。
23．权利要求21的方法，其中所述阴离子树脂是一种强酸。
24．权利要求1的方法，其中所述树脂是一种阳离子树脂。
25．权利要求24的方法，其中所述阳离子树脂是一种强酸。
26．权利要求24的方法，其中所述阳离子树脂是一种强碱。
27．权利要求1的方法，其中所述树脂也进行了化学处理。
28．权利要求27的方法，其中所述化学处理是用盐酸、氢氧化钠或碳酸纳进行的。
29．权利要求1的方法，其中所述树脂是一种离子交换树脂。
30．权利要求1的方法，其中所述树脂是一种分级分离树脂。
31．一种生产谷物增甜剂的方法，其中将所述谷物增甜剂过一种已用酶处理的树脂，直至该谷物增甜剂已被纯化。
全文摘要
本发明涉及一种用于清洗树脂尤其是离子交换和分级分离树脂的酶促方法。该方法可单独使用或与诸化学方法联合使用。对于包含有污染物的液体,例如需要进行分级分离或离子交换处理的诸蛋白质、糖类、脂类和残余的未转化的淀粉,本方法均能提高其产量。本发明还涉及用于生产谷物增甜剂,尤其是谷物糖浆和高果糖谷物糖浆的树脂的用途。
文档编号A23L1/22GK1226843SQ97196893
公开日1999年8月25日 申请日期1997年7月3日 优先权日1996年7月30日
发明者J·斯莱德 申请人:诺沃挪第克生物化学北美公司