专利名称：测定端粒酶活性的端粒重复扩增－微孔板杂交法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定人组织、体液中端粒酶活性的方法。
早期测定端粒酶活性的方法是通过测定细胞提取物将端粒重复片段加到一个合成的寡核苷酸、聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行放射自显影，该法敏感度极低，已被淘汰。1994年Kim等建立端粒重复扩增法，该法将端粒酶的反应产物应用聚合酶反应(PCR)大量扩增，使测定敏感度提高了104倍，是近几年来被全世界普遍采用的方法，但该法需将扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行放射自显影，方法十分繁杂。国内有作者用银染法代替同位素显影，但方法仍然繁杂，检测敏感度却有所下降。1996年德国Boehringer公司用标记地高辛探针检测端粒酶扩增产物，推出了端粒酶-ELISA检测试剂盒，该法极大地简化了PCR产物检测操作步骤，4小时内即可得出检测结果，但在检测过程中发现地高辛标记系统不稳定，提供的试剂盒不同批号间常出现较大差异，并且试剂价格极为昂贵，无法常规应用。
本发明的目的在于提供一种有较好的测定敏感度与重复性，简便快速、成本低的测定端粒酶活性的端粒重复扩增-微孔板杂交法。
本发明的目的是这样实现的一种测定端粒酶活性的端粒重复扩增-微孔板杂交法，其与现有技术的不同之处是依次包括下列步骤①样本处理、溶解细胞将组织切片磨匀，并悬浮于冷裂解液中冷冻裂解，离心分离，取上清；②逆转录、扩增用CX引物逆转录，用含Ts引物的PCR反应液对上述上清液进行扩增处理，CX引物为5’CCCT TACCCTTACCCTTACCCTTA,Ts引物序列为5’Biotin AATCCGTCGAGCAGCGTT；③固相与杂交a)包被将Streptavidin固定于微孔板上；b)变性将扩增产物用NaOH变性处理；c)杂交与呈色将经变性处理的变性混合液在微孔板上与含CF探针的杂交液混合，进行杂交反应，然后加酶标抗体，并用呈色液呈色，用酶标仪比色，探针CF为5’FITC-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAA。
样本处理时，采用的冷裂解液是1Ommol/L Tris-HCl,PH7.5,1mmol/L MgCl2,1mmol/L EGTA,0.1mmol/L PMSF,5mmol/Lβ-巯基乙醇，5g/L CHAPS,100g/L甘油。
扩增时，所用PCR反应液为10XBuffer5μl,1.5mmol/L MgCl2,0.1g/L明胶,200μmol/L dNTP,O.23μmol/L TS引物，2μTaq酶。
包被的具体步骤是将Streptavidin溶于PH10.0碳酸盐缓冲液中，10mg/L，于微孔板每孔加100μl,4℃过夜，PH7.4PBS洗，到置于干净滤纸，使干，4℃贮存备用。
变性的具体步骤是取O.6mol/LNaOH与扩增产物等量混合，室温10分钟。
杂交液为0.25gFicoll400、0.25gBSA、0.25gPVP、0.0625g牛DNA，加入20XSSC31.25ml、1mol/L HCl375ml，加H2O至1000ml，含CF探针50mmol/L。
杂交与呈色的具体步骤是于微孔板中加入100μl杂交液、25μl变性混合液，37℃1小时，PH7.4PBS洗三次，加入酶标抗体100μl,37℃30分钟，洗板，加TMB呈色液100μl,37℃10分钟，加2mol/L H2SO4100μl，分别于酶标仪450nm与690nm比色。
本发明用荧光素-抗荧光素系统建立了微孔板杂交法，用于端粒酶活性测定具有简便快速、成本低廉、重复性好敏感度高等优点，尤其适用于判断良、恶性胸腹水。
下面结合实施例对本发明作进一步说明一种测定端粒酶活性的端粒重复扩增-微孔板杂交法，依次包括下列步骤①样本处理取组织50～100mg用手术刀片切成薄片、研磨均匀，组织碎片悬浮于冷裂解液(10mmol/L Tris-HCl,PH7.5,1mmol/L MgCl2,1mmol/L EGTA,0.1mmol/L PMSF,5mmol/Lβ-巯基乙醇，5g/L CHAPS,100g/L甘油)中，冰水浴30分钟，12000rpm离心30分钟，4℃，取上清迅速置-30℃。
②逆转录、扩增于0.2ml离心管底加5.75μmol/L CX引物(5’CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTA)2μl，加10μl低熔点石蜡，(Paraffin wax,Aldrich)，在石蜡凝固后加46μl PCR反应液，其终浓度为10XBuffer5μl,1.5mmol/L MgCl2,0.1g/L明胶，200μmol/L dNTP,0.23μmol/L TS引物，2μTaq酶。其中TS引物序列为5’Biotin AATCCGTCGAGCAGCGTT。测定时加入样本处理上清液2μl,25℃30分钟，94℃5分钟，94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒，30个循环，72℃10分钟。
③固相与杂交a)包被将Streptavidin溶于PH10.0碳酸盐缓冲液中，10mg/L，于微孔板每孔加100μl,4℃过夜，PH7.4PBS洗三次，倒置于干净滤纸，使干，4℃贮存备用。
b)变性取0.6mol/LNaOH与扩增产物等量混合，室温10分钟。
c)杂交与呈色于微孔板中加入100μl杂交液(0.25gFicoll400、0.25gBSA、0.25gPVP、0.0625g牛DNA，加入20XSSC31.25ml、1mol/L HCl375ml，加H2O至1000ml，含CF探针50mmol/L，探针CF为5’FITC-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAA),25μl变性混合液，37℃1小时，PH7.4PBS洗三次，加入酶标抗体(临用前用PH7.4PBS1:1000稀释)100μl,37℃30分钟，洗板三次，加TMB呈色液100μl,37℃10分钟，加2mol/L H2SO4100μl，分别于酶标仪450nm与690nm比色。
权利要求
1.一种测定端粒酶活性的端粒重复扩增-微孔板杂交法，其特征在于依次包括下列步骤①样本处理、溶解细胞将组织切片磨匀，并悬浮于冷裂解液中冷冻裂解，离心分离，取上清；②逆转录、扩增用CX引物逆转录，用含Ts引物的PCR反应液对上述上清液进行扩增处理，CX引物为5’CCCT TACCCTTACCCTTACCCTTA,Ts引物序列为5’Biotin AATCCGTCGAGCAGCGTT；③固相与杂交a)包被将Streptavidin固定于微孔板上；b)变性将扩增产物用NaOH变性处理；c)杂交与呈色将经变性处理的变性混合液在微孔板上与含CF探针的杂交液混合，进行杂交反应，然后加酶标抗体，并用呈色液呈色，用酶标仪比色，CF探针为针CF5’FITC-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAAA。
2.根据权利要求1所述的测定端粒酶活性的端粒重复扩增-微孔板杂交法，其特征在于样本处理时，采用的冷裂解液是10mmol/L Tris-HCl,PH7.5,1mmol/L MgCl2,1mmol/L EGTA,0.1mmol/L PMSF,5mmol/L B-巯基乙醇，5g/LCHAPS,100g/L甘油。
3.根据权利要求1或2所述的测定端粒酶活性的端粒重复扩增-微孔板杂交法，其特征在于扩增时，所用PCR反应液为10XBuffer5μl,1.5mmol/L MgCl2,0.1g/L明胶，200μmol/L dNTP,0.23μmol/L TS引物，2μTaq酶。
4.根据权利要求1或2所述的测定端粒酶活性的端粒重复扩增-微孔板杂交法，其特征在于包被的具体步骤是将Streptavidin溶于PH10.0碳酸盐缓冲液中，10mg/L，于微孔板每孔加100μl,4℃过夜，PH7.4PBS洗，到置于干净滤纸，使干，4℃贮存备用。
5.根据权利要求1或2所述的测定端粒酶活性的端粒重复扩增-微孔板杂交法，其特征在于变性的具体步骤是取0.6mol/LNaOH与扩增产物等量混合，室温10分钟。
6.根据权利要求1所述的测定端粒酶活性的端粒重复扩增-微孔板杂交法，其特征在于杂交液为0.25gFicoll400、0.25gBSA、0.25gPVP、0.0625g牛DNA，加入20XSSC31.25ml、1mol/L HCl375ml，加H2O至1000ml，含CF探针50mmol/L。
7.根据权利要求1或6所述的测定端粒酶活性的端粒重复扩增-微孔板杂交法，其特征在于杂交与呈色的具体步骤是于微孔板中加入100μl杂交液、25μl变性混合液，37℃1小时，PH7.4PBS洗三次，加入酶标抗体100μl,37℃ 30分钟，洗板，加TMB呈色液100μl,37℃10分钟，加2mol/L H2SO4100μl，分别于酶标仪450nm与690nm比色。
全文摘要
本发明公开了一种测定端粒酶活性的端粒重复扩增—微孔板杂交法,依次包括样本处理、扩增、包被、变性、杂交与呈色等步骤,本发明用于端粒酶活性测定具有简便快速、成本低廉、重复性好、敏感度高等优点,尤其适用于判断良、恶性胸腹水。
文档编号C12Q1/00GK1230598SQ9811164
公开日1999年10月6日 申请日期1998年12月29日 优先权日1998年12月29日
发明者王惠民, 瞿晓慈, 张冬雷, 施健, 刘俊华, 杨振华 申请人:南京医学院附属医院