专利名称：一种新的人神经分化因子的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和神经生物学专业领域，涉及一种新的人神经分化因子(neuronal differentiation factor-1，NDF-1)的cDNA序列和蛋白质序列，以及该基因的功能线索。
目前已经发现具有神经营养作用的细胞因子，构成了神经营养因子家族，其作用主要是对神经元的存活、生长、分化和功能维持起调控作用。主要包括神经生长因子(NGF)在内的神经营养素(NT)家族、睫状神经营养因子(CNTF)及近年发现的胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)等。在脑内寻找具有神经分化作用的因子是目前的主要工作，但是研究发现，在神经系统之外的组织中所发现的一些细胞因子也同时能够在脑内表达而发挥作用，例如成纤维细胞生长因子(FGFs)、胰岛素样生长因子(IGFs)、转化生长因子β(TGF-β)等都具有神经营养活性。它们也具有一定的促进神经细胞分化作用。
本发明的目的是提供一种新的人神经分化因子。该发明有可能为临床上治疗脑肿瘤提供新的治疗途径。
肝脏所分泌的细胞因子的种类繁多，尤其在胚胎时期的肝脏中更是如此。4-6月孕龄的人胎肝是造血、免疫、肝脏系统干祖细胞的主要来源，表达基因在各类组织中最为丰富，表明其中存在大量具有医学价值的活性成分。因此，本发明以4-6月孕龄的人胎肝为研究材料，按照分子生物学的常规技术，通过富集未知低丰度的mRNA，利用耐高温反转录酶获得全长cDNA并构建文库，对该文库进行大规模、长序列测定，最终对表达序列片段(EST)及新基因进行功能预测与验证。在此基础上，发现了一条新的基因序列，其cDNA序列见说明书附1。该基因的表达产物序列见说明书附2。计算机分析表明，该序列所编码的蛋白质产物与鼠源神经分化因子TA20有50.8％的同源性，提示此二者的功能可能是相关的。计算机分析还发现，人神经生长因子蛋白质的分子量为22.423千道尔顿，等电点为12.58。
以4～6月孕龄的人胎肝为研究材料，通过富集未知低丰度的mRNA，利用耐高温反转录酶获得全长cDNA并构建文库，对该文库进行大规模、长序列测定，对表达序列片段(EST)通过Internet网使用BLAST软件进行同源性比较。具有功能线索的新基因进行功能预测和实验验证。该发明有可能为临床上治疗脑肿瘤提供新的治疗途径。
以下为结合附图进一步说明本发明
图1人神经分化因子的cDNA序列图2人神经生长因子的蛋白质序列图3人神经分化因子的cDNA序列与GenBank数据库全序列同源性比较结果图4人神经分化因子的cDNA序列与GenBank EST库同源性比较结果图5人神经分化因子的氨基酸序列与GenBank数据库同源性比较结果图6人神经分化因子蛋白质序列与鼠源TA20蛋白质序列的同源性比较结果图7人神经分化因子的Motif位点图3为人神经分化因子的cDNA序列与GenBank数据库全序列同源性比较结果，说明该基因的cDNA序列与线粒体基因具有较高的同源性。但是，并不能由此推断NDF-1基因的功能与线粒体基因组功能相关。因为NDF-1基因功能的发挥有赖于其所翻译的蛋白质产物--NDF-1蛋白质的作用。
图4为人神经分化因子的cDNA序列与GenBank EST库同源性比较结果，说明该基因的cDNA序列与线粒体基因组具有较高的同源性。同样，并不能由此推断NDF-1基因的功能与线粒体基因组功能相关。
图5为人神经分化因子的氨基酸序列与GenBank数据库同源性比较结果，说明NDF-1基因的蛋白质序列与鼠源TA20基因的具有较高的同源性，那么，提示二者的功能也可能相关或相类似。考虑到TA20基因是作为一种神经分化因子和神经瘤抑制因子被分离得到的，那么，NDF-1基因也可能有类似作用。
图6为人神经分化因子蛋白质序列与鼠源TA20蛋白质序列的同源性比较结果，说明二者的同源性有50％，提示二者有较高的同源性，在功能上也可能是相关的，从而认为该因子可能具有促神经细胞分化作用和抑制神经细胞肿瘤生长的作用。
图7为使用Omiga软件(1.10版)对NDF-1蛋白质序列进行分析的结果，发现在第94位有一个糖基化位点，在第28、42、68、121位各有一个蛋白激酶C(PKC)的磷酸化位点。
权利要求
1.本发明所提供的人神经生长因子具有如下cDNA序列10 20 30 40 50 60gcaaactttc tacagtgaat atatattgtc tttataataa ggaaaaatga ttgaaataaa70 80 90100110120ttgagaggta taaaacaaaa ctataacaaa ctttcttttg tttattacca tccaacttaa130140150160170180agactgaaaa gtccaagaga tttggaggga tgcaccagta agatccatat tgaccgtaag190200210220230240agaatacaca aggggaatgg tacgctgccc gcacgtaccg cagcccctca ccgtctcagc250260270280290300accactgagg aatcgggctc ctgcacttgg agaccagcct ctgtgaaaca caggtgtagt310320330340350360gagtcatgag atacgctgac aaacgggatg tgaatatcat ggaagctcca aaactcccag370380390400410420taaaggcaaa aagaaaccag ttccccttga cctgtctcca catatcatgg ctctacgtgt430440450460470480gagaagagtt atcactcttt cttcaaagat ttccaggagg gaaggaagga aggaaggaaa490500510520530540gaaggaagga aggaaggaag gaagggaggg agggagggag ggagggaggg aaagaaggag550560570580590600gaagggaaag aaggaggaag ggaacaaaag aaaagggaga aagggaagga gggatggaaa610620630640650660atgtaaccct cataattaaa aaaaaatcaa attgttatta attgccaatt agatcaaagt670680690700710720ttctcacagt tacatttata taggaaaaaa atttaagtag cctaaatgcc caacagcatg730740750760770780agactgacag agaaaatctg ggagactgcc accaactggg gaacggggat accccaagtt790800810820830840tccatactac aagaagaacc agaaatctat gtgatctgtt ccattgagct gttatttctg850860870880890900ggccatgtat gagccagctt taataaaatt aattaaccac tcattcatcg acctccccac910920930940950960cccatccaac atctccgcAT GATGAAACTT CGGCTCACTC CTTGGCGCCT GCCTGATCCT970980990 1000 1010 1020CCAAATCACC ACAGGACTAT TCCTAGCCAT GCACTACTCA CCAGACGCCT CAACCGCCTT1030 1040 1050 1060 1070 1080TTCATCAATC GCCCACATCA CTCGAGACGT AAATTATGGC TGAATCATCC GCTACCTTCA1090 1100 1110 1120 1130 1140CGCCAATGGC GCCTCAATAT TCTTTATCTG CCTCTTCCTA CACATCGGGC GAGGCCTATA1150 1160 1170 1180 1190 1200TTACGGATCA TTTCTCTACT CAGAAACCTG AAACATCGGC ATTATCCTCC TGCTTGCAAC1210 1220 1230 1240 1250 1260TATAGCAACA GCCTTCATAG GCTATGTCCT CCCGTGAGGC CAAATATCAT TCTGAGGGGC1270 1280 1290 1300 1310 1320CACAGTAATT ACAAACTTAC TATCCGCCAT CCCATACATT GGGACAGACC TAGTTCAATG1330 1340 1350 1360 1370 1380AATCTGAGGA GGCTACTCAG TAGACAGTCC CACCCTCACA CGATTCTTTA CCTTTCACTT1390 1400 1410 1420 1430 1440CATCTTGCCC TTCATTATTA CAGCCCTAGC AGCACTCCAC CTCCTATTCT TGCACGAAAC1450 1460 1470 1480 1490 1500GGGATCAAAC AACCCCCTAG GAATCACCTC CCATTCCGAT AAaatcacct tccaccctta1510 1520 1530 1540 1550 1560ctacacaatc aaagacgccc tcggcttact tctcttcctt ctctccttaa tgacattaac1570 1580 1590 1600 1610 1620actattctca ccagacctcc taggcgaccc agacaattat accctagcca accccttaaa1630 1640 1650 1660 1670 1680cacccctccc cacatcaagc ccgaatgata tttcctattc gcctacacaa ttctccgatc1690 1700 1710 1720 1730 1740cgtcccnaac aaactaggag gcgtccttgc cctattacta tccatcctca tcctagcaat1750 1760 1770 1780 1790 1800aatccccatc ctccatatat ccaaacaaca aagcataata tttcgcccac taagccaatc1810 1820 1830 1840 1850 1860actttattga ctcctagccg cagacctcct cattctaacc tgaatcggag gacaaccagt1870 1880 1890 1900 1910 1920aagctaccct tttaccatca ttggacaagt agcatccgta ctatacttca caacaatcct1930 1940 1950 1960 1970 1980aatcctaata ccaactatct ccctaattga aaacaaaata ctcaaatgag cctaaaaaaa1990 2000 2010 2020 2030 2040aaaaaaaaaa
2.根据权利要求1所述的人神经生长因子具有如下蛋白质序列10 20 30 40 50 60MMKLRLTPWR LPDPPNHHRT IPSHALLTRR LNRLFINRPH HSRRKLWLNH PLPSRQWRLN70 80 90100110120ILYLPLPTHR ARPILRIISL LRNLKHRHYP PACNYSNSLH RLCPPVRPNI ILRGHSNYKL130140150160170180TIRHPIHWDR PSSMNLRRLL SRQSHPHTIL YLSLHLALHY YSPSSTPPPI LARNGIKQPP190200210220230240RNHLPFR
3.根据权利要求1所述的人神经生长因子具有以下生物学特性人神经生长因子蛋白质的分子量为22.423千道尔顿，等电点为12.58。该因子具有促神经细胞分化作用和抑制神经细胞肿瘤生长的作用。
全文摘要
本发明提供了一种新的人神经分化因子的cDNA序列及其所编码的蛋白质序列。其cDNA序列全长为1990个碱基。其蛋白质序列全长为187个氨基酸。人神经分化因子可能具有促神经细胞分化和抑制神经细胞肿瘤生长的作用。
文档编号C12N15/12GK1247897SQ9811778
公开日2000年3月22日 申请日期1998年9月14日 优先权日1998年9月14日
发明者贺福初, 鱼咏涛, 张成岗, 张绍文, 欧阳曙光, 罗凌, 刘孟珉, 魏汉东, 吴祖泽 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所