专利名称：双酶催化法合成三氮唑核苷的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种合成三氮唑核苷的方法。具体地说就是双酶催化法合成三氮唑核苷。
三氮唑核苷(Ribavirin，RBV)的商品名称为病毒唑(Virazole)。它的化学名称为1-β-D-呋喃核糖苷-1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺(1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide)。该品为白色结晶，稳定，水溶性的物质。在人体内，它能参与鸟嘌呤代谢，干扰鸟嘌呤核苷的生物合成，从而抑制病毒的扩增。它被用作广谱抗病毒药物，具有活性强、副作用小、疗效好的优点。
病毒唑的合成有三种方法。即，化学法，发酵法和酶促法。
化学合成病毒唑的方法很多。但是这类方法的操作步骤多，副产物多，所以产率低，成本高。
发酵法是将三氮唑甲酰胺(1,2,4-triazole-3-carboxamide,TcA)加到培养基中，经过2～8天的培养，从而积累病毒唑(参见Journal of The AgriculturalChemical Society,50(9),430～423(1976)，日本公开专利17830/1979)。这种方法的弊端是必须每次培养菌体；培养时间又长，生产效率低；有多种副产物的积累，产率低；病毒唑的分离纯化困难。
酶促法由Witkowski等首创(参见US Patent 3,976,545/1976)。他利用从牛脾中提取的核苷磷酸化酶，催化核糖-1-磷酸(ribose-1-phosphate,R-1-P)和三氮唑甲酰胺在0℃～50℃反应，从而产生病毒唑。这种方法需要的核糖-1-磷酸不容易买到，纯酶的价格很贵是它们的困难。
1986年Fujishima等(参见US Patent 4614719)用非增殖的完整菌体作酶源，比较了用多种核糖供体作底物，于40℃～80℃与三氮唑甲酰胺反应20～24小时，合成病毒唑。在比较了不同菌株的产率后，他指出，乙酰短杆菌(ATCC39311)是公知的具有最高的酶活的菌株。1989年Pochodylo等又发明了浓胶反应的方法。他们也用乙酰短杆菌(ATCC39311)作酶源，底物浓度提高到100mMol～200mMol,70℃反应，三次抽提，以鸟苷作底物时，病毒唑的产率达78％～80％(参见European Patent 0307853A2)。1990年Yamauchi等(参见USPatent 5384251A/1995)从嗜热脂肪芽孢杆菌中筛选到三株高产菌。在以尿苷为核糖供体时，它的产率比用乙酰短杆菌(ATCC39311)作酶源要高，反应达到平衡的时间要短。此菌在以鸟苷作底物时的产率最高。
但是，由于目前唯有肌苷的工业生产水平最高，市场价格最低(比其他底物低一倍以上)。所以在目前的生产条件下，只有用肌苷作核糖供体生产病毒唑，才具有工业价值。若以肌苷作核糖供体时进行分析。我们注意到，现有技术所达到的生产水平，相差并不大。1986年Fujishima等(参见US Patent 4614719)达到75.66％。1990年Yamauchi等(参见US Patent 5384251A/1995)，若按摩尔比1∶1投料，在67℃反应，需要48小时，病毒唑的产率也才达到83.6％。而它的代价是延长了一倍的反应时间。将肌苷与三氮唑甲酰胺的摩尔比按1.5∶1投料，在67℃反应24小时，病毒唑的产率为78.7％(参见US Patent5384251A/1995)。它的代价是多投入了50％的肌苷。而回收肌苷是要付出代价的。其次，现有的技术，在以肌苷作核糖供体时，选用的最佳反应温度都高于60℃。适宜的反应时间也都长于20小时。1986年Fujishima等(参见USPatent4614719)在45℃反应时，产率只有48％。1990年Yamauchi等(参见US Patent5384251A/1995)，将肌苷与三氮唑甲酰胺的摩尔比按1.5∶1投料，在40℃和50℃反应，病毒唑的产率分别为37％和58％。这表明，采用现有的技术，都存在的局限是病毒唑的产率已经受到了化学反应平衡常数的限制，单纯靠提高核苷磷酸化酶的活性，是不能改变化学反应平衡常数的。所以，以肌苷作核糖供体时，病毒唑的产率都低于85％。
现有的技术都存在上述局限的原因是上述方法都忽视了黄嘌呤氧化酶(包括/或黄嘌呤脱氢酶)的作用。
牛奶黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase)已经有试剂销售。在合成病毒唑的反应液中添加牛奶黄嘌呤氧化酶的工作，尚未见报道。此外，试剂牛奶黄嘌呤氧化酶的价格不菲。要在工业生产中使用，就有必要重新寻找廉价的替代酶源。
公知的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ATCC7256和公知的球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)ATCC8010，以及大肠杆菌(Escherichia coli)等，具有高的黄嘌呤氧化酶活性已有报告。但是，将它们用作批量生产黄嘌呤氧化酶的菌株，并且用它的完整菌体作酶源，以提高产率，这样的工作尚未报道。
关于用具有黄嘌呤氧化酶活性的细菌合成病毒唑的工作，已经有报告。但是，现有技术都是单独使用这些细菌合成病毒唑的，而且产率都很低。它们存在的问题是忽视了核苷磷酸化酶的作用。将它们与具有高核苷磷酸化酶活性的细菌联合作用的研究，尚未报道。
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种催化法合成病毒唑的新方法，即双酶催化法合成病毒唑。采用该方法应能进一步缩短反应时间，提高产物得率，而且所用的酶源应该便宜易得，操作处理容易，便于储存和重复使用。
为了实现上述的目的，本发明所采取的技术方案如下1)一种双酶催化法合成病毒唑的新方法，该方法是在磷酸缓冲液(pH7～pH8)中，以肌苷和三氮唑甲酰胺作为反应底物，以黄嘌呤氧化酶和核苷磷酸化酶作为催化酶，在40℃～50℃下，摇床反应6～20小时。反应结束后，离心分离菌体，从上清反应液中收集产物病毒唑。产率可达到95.7％。
2)按本发明的技术方案，反应底物的浓度为10～200mMol，其投料比为肌苷三氮唑甲酰胺=1∶1～1∶1.5。
3)按本发明的技术方案，所述的黄嘌呤氧化酶和核苷磷酸化酶，可以是经过初步抽提的粗酶，甚至可以是源自细菌的非增殖的完整的细胞作黄嘌呤氧化酶或核苷磷酸化酶的酶源。其制备方法如下3.1)核苷磷酸化酶的酶源将乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylicum)ATCC39311，菌种振荡培养于100ml,2％的营养肉汤(pH7.2)中。培养温度为28℃。培养时间为24小时。
培养结束后，用离心法收集菌体。再用0.9％KCl溶液洗涤菌体一次。用离心法收集菌体。再加10mMol的磷酸缓冲液(pH7.2～pH7.5)，使成5ml细胞悬液。置65℃过夜。次日，用离心法收集菌体。加10mMol的磷酸缓冲液(pH7.2～pH7.5)，使成5ml细胞悬液。备作核苷磷酸化酶用。
3.2)黄嘌呤氧化酶的酶源将阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ATCC7256菌种振荡培养于100ml，诱导培养基(pH7.2)中。培养温度为28℃。培养时间为16小时。
诱导培养基的配方为0.1％黄嘌呤(或0.1％次黄嘌呤)，10％基础盐培养基XS,0.01％酵母膏。
其中，基础盐培养基XS的配方为68g KH2PO4,87g K2HPO4,100mgCaCl2,2g MgSO4·7H2O,5mg Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O，用KOH调pH7.2。
培养结束后，用离心法收集菌体。再用0.9％KCl溶液洗涤菌体一次。用离心法收集菌体。再加10mMol的磷酸缓冲液(pH7.2～pH7.5)，使成5ml细胞悬液。置40℃过夜。次日，用离心法收集菌体。加10mMol的磷酸缓冲液(pH7.2～pH7.5)，使成5ml细胞悬液。备作黄嘌呤氧化酶用。
球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)ATCC8010的培养与制备方法与阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ATCC7256相同。
3.3)“非增殖”的含义指的是(1)合成病毒唑的反应温度比细菌的培养温度要高，此时细菌已不再增殖。
(2)本发明提示，用离心法收集到的菌体，要再把菌体悬浮在pH7.0～pH7.5的磷酸缓冲液中，置于比细菌的培养温度要高的温度环境中处理过夜，再用离心法收集菌体，备用。以达到钝化对反应有害的杂酶的目的。此时细菌已不再增殖。
至于钝化有害的杂酶所选取的温度，是依所用的细菌和酶的性质不同而异的。对于用作核苷磷酸化酶酶源的乙酰短杆菌，本发明用65℃处理过夜。对于用作黄嘌呤氧化酶酶源的阴沟肠杆菌和球形节杆菌，本发明用40℃处理过夜。
3.4)“完整的细胞”的含义指的是细菌都不必经过破细胞提取酶的处理。用离心法收集到的菌体，可以直接投入到反应体系中作酶源使用。
4)产物的分析测定方法反应结束后，离心分离菌体。取上清反应液，用高效液相色谱法检测。其工作条件C-18柱；流动相水∶甲醇=95∶5(V/V)；柱温室温；流速1ml/min；监测波长220nm。并用三氮唑甲脂做内标准。
各组份的保留时间为三氮唑甲酰胺2.05min；病毒唑2.51min；次黄嘌呤4.53min；三氮唑甲脂6.66min；肌苷9.29min。
病毒唑的产率定义为
5)黄嘌呤氧化酶粗酶的制备方法细菌的培养方法同技术方案3.2)。培养结束后，离心收集菌体，用10mMol的磷酸缓冲液(pH7.5)洗涤菌体一次。用离心法收集菌体。再加10mMol的磷酸缓冲液(pH7.5)，使成细胞悬液。用超声波破碎仪(KMS-50)于0℃～4℃破碎细胞10min。用冷冻离心机于0℃～4℃,10000g离心15min。取上清液，即为粗酶制剂，备用。
6)黄嘌呤氧化酶活性的测定方法标准尿酸购自Sigma公司。用标准浓度的尿酸绘制工作曲线。尿酸的浓度在分光光度计上，用293nm波长的光吸收检测。
黄嘌呤氧化酶活性的定义为pH7.5,40℃反应，1min内催化产生1μMol尿酸的酶量。
本发明与现有的发明的不同之处本发明的特点就在于同时注重核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶的作用。用核苷磷酸化酶催化合成病毒唑。同时用黄嘌呤氧化酶(包括/或黄嘌呤脱氢酶)消化反应的副产物次黄嘌呤，使反应向多产生病毒唑的方向倾斜。
本发明的第二个特点就在于采用了源自细菌的黄嘌呤氧化酶作为替代酶源。它可以用工业发酵法大量制备。
本发明的第三个特点就在于在合成病毒唑的过程中，采用了细菌的非增殖的完整的细胞作酶源，用于降解次黄嘌呤。而不必破细胞提纯酶。
本发明与现有的技术相比，具有如下的优点(1)采用本发明的技术，用肌苷和三氮唑甲酰胺作底物，合成病毒唑的产率明显提高了。
(2)反应所需要的时间缩短了。
(3)由于添加进反应体系的黄嘌呤氧化酶酶源，也是来自细菌的非增殖的完整的细胞，而不是比细胞小许多的酶分子，所以它和用作核苷磷酸化酶的酶源细胞，大小相当。这样酶源的处理方法容易统一，酶的储存和重复利用、产物的分离都比添加纯酶方便。
以下结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1核苷磷酸化酶酶源的制备同技术方案31)。
用ATCC7256制备黄嘌呤氧化酶酶源。方法同技术方案3.2)。
在20mMol磷酸缓冲液(pH7.5)中，加入肌苷20mMol和三氮唑甲酰胺30mMol，加入5％(w/v)的乙酰短杆菌湿菌体和1％(w/v)的阴沟肠杆菌湿菌体。置摇床上100rpm,43℃反应6小时。
反应结束后，离心分离菌体。取上清反应液，用高效液相色谱法检测病毒唑的含量。
测定结果病毒唑的产率为95.7％。
实施例2核苷磷酸化酶酶源的制备同技术方案3.1)。
用ATCC8010制备黄嘌呤氧化酶酶源。方法同技术方案3.2)。
在40mMol磷酸缓冲液(pH7.0)中，加入肌苷40mMol和三氮唑甲酰胺40mMol，加入5％(w/v)的乙酰短杆菌湿菌体和1％(w/v)的球形节杆菌湿菌体。置摇床上100rpm,40℃反应6小时。
反应结束后，离心分离菌体。取上清反应液，用高效液相色谱法检测病毒唑的含量。
测定结果病毒唑的产率为91.7％。
实施例3核苷磷酸化酶酶源的制备同技术方案3.1)。
用ATCC7256制备黄嘌呤氧化酶酶源。方法同技术方案3.2)。
在65mMol磷酸缓冲液(pH7.5)中，加入肌苷65mMol和三氮唑甲酰胺65mMol，加入5％(w/v)的乙酰短杆菌湿菌体和1％(w/v)的阴沟肠杆菌湿菌体。置摇床上100rpm,43℃反应20小时。
反应结束后，离心分离菌体。取上清反应液，用高效液相色谱法检测病毒唑的含量。
测定结果病毒唑的产率为91.2％。
实施例4核苷磷酸化酶酶源的制备同技术方案3.1)。
用ATCC8010制备黄嘌呤氧化酶粗酶。方法同技术方案5)。
黄嘌呤氧化酶活性的测定方法同技术方案6)。
在10mMol磷酸缓冲液(pH7.5)中，加入肌苷和三氮唑甲酰胺各10mMol，加入5％(w/v)的乙酰短杆菌湿菌体和1.4U/ml的黄嘌呤氧化酶粗酶。置摇床上100rpm,40℃反应6小时。
反应结束后，离心分离菌体。取上清反应液，用高效液相色谱法检测病毒唑的含量。
测定结果病毒唑的产率为93.71％。
实施例5核苷磷酸化酶酶源的制备同技术方案3.1)。
用ATCC8010制备黄嘌呤氧化酶酶源。方法同技术方案3.2)。
在40mMol磷酸缓冲液(pH7.2)中，加入肌苷200mMol和三氮唑甲酰胺40mMol，加入5％(w/v)的乙酰短杆菌湿菌体和1％(w/v)的球形节杆菌湿菌体。置摇床上250rpm,43℃反应，以后每隔3小时加入三氮唑甲酰胺40mMol，共加5次。持续反应20小时。
反应结束后，离心分离菌体。取上清反应液，用高效液相色谱法检测病毒唑的含量。
测定结果病毒唑的产率为88.25％。
权利要求
1.一种双酶催化法合成病毒唑的方法，该方法是在pH7～pH8的磷酸缓冲液中，以肌苷和三氮唑甲酰胺作为反应底物，其特征在于以黄嘌呤氧化酶和核苷磷酸化酶作为催化酶，反应底物的适宜浓度为10mMol～200mMol，反应底物的适宜投料比为，肌苷三氮唑甲酰胺=1∶1～1∶1.5，在40℃～50℃下，摇床反应6～20小时，反应结束后，分离菌体，从反应清液收集产物病毒唑。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的黄嘌呤氧化酶是源自细菌的酶，包括细菌的非增殖的完整的细胞。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述的核苷磷酸化酶是源自细菌的酶，包括细菌的非增殖的完整的细胞。
4.按权利要求2所述的方法，其特征在于所述的细菌为，阴沟肠杆菌和球形节杆菌及其衍生菌株。
5.按权利要求3所述的方法，其特征在于所述的细菌为乙酰短杆菌及其衍生菌株。
全文摘要
本发明公开了一种双酶催化法合成三氮唑核苷的新方法。该方法是在磷酸缓冲液(pH7－pH8)中,以肌苷和三氮唑甲酰胺作为反应底物,以黄嘌呤氧化酶和核苷磷酸化酶作为催化酶,催化合成三氮唑核苷。采用该方法具有反应时间短,产物得率高,而且所用的酶源便宜易得,操作处理容易,便于存储和重复使用等优点。
文档编号C12P19/26GK1217385SQ9812166
公开日1999年5月26日 申请日期1998年11月12日 优先权日1998年11月12日
发明者陈蔚梅, 冯胜彦, 孟疆辉 申请人:武汉大学