专利名称：复合场三维细胞培养装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养实验设备，特别是将应变场与电磁场复合作用于三维基质支架中的细胞进行细胞培养的实验装置。
在我国，因创伤、疾病而致的组织缺损病人数量越来越多，已成为最常见的临床问题，是致残的重要因素。组织缺损常用替换植入方法治疗。替换物包括异种、同种异体以及自体组织和人工合成材料。异种组织引起相当快速的排斥反应、同种异体移植排斥反应不可避免，且组织来源有限；自体组织移植会造成供区损伤以及所能供给的组织源有局限性；传统的人工合成材料植入后引起异物反应，继发感染及裸露等，这些都迫使科学工作者寻求新型组织替代物。
体外构建新型组织替代物要求将高浓度的功能相关的活细胞种植于天然或人工合成的细胞外基质中，形成与人体组织相同或类似的组织，然后移植于人体内“就地生长”，达到形成新的有功能的组织的目的。而现有的细胞培养方法不能适应体外构建新型组织替代物的需要，如传统的单层细胞贴壁培养是从体内取出组织细胞，模拟体内生理条件，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。这种方法中细胞是在二维平面内生长和增殖，要受到细胞接触抑制的影响；培养时间过长，特别是反复传代，很容易导致细胞发生变异或反分化现象(如软骨细胞)；传代时经消化处理，对细胞有一定的损伤。因此，用传统的细胞培养法其克隆形成率低，不能在体外生成三维组织结构。
为了提高克隆形成率，产生了微载体培养法，包括微囊培养法或中空纤维培养法。这些培养技术以微囊或中空纤维为载体，增加了细胞附着面积，达到大量培养细胞的目的(Jauregui HO et al Primary cultures of rat hepatocytes inhollow fiber chambers.In Vitro Cell Dev Biol，1994；30A23)。用微载体细胞培养的主要特点是需要进行适宜的搅动，以增加细胞附着的面积，但却增加了细胞与载体附着和生长的随机性，不利于体外有目的地生产具有特定形态结构和功能的组织替代物。
新近发展的细胞三维培养技术，既充分考虑到细胞与基质接触面积，又使细胞能在三维空间生长和增殖，是目前体外构建组织替代物的首选技术(Naughton GK et al.Three-dimensional cell and tissue culture system.Int.PCT.WO90/02796，1990)。但是，普通的细胞三维培养技术仍然存在着细胞生长随机性强，没有确定方向；而且细胞生长缓慢，组织形成周期长的局限性，显然不利于临床应用。
本发明的目的正是为了克服上述现有技术中的不足之处而提供一种将细胞种植在三维基质支架中，置于应变场和电磁场复合作用下，使细胞在三维基质支架中取向生长，提高细胞代谢，促进其分泌功能，以构建出具有特定形态和功能的组织替代物的装置。
本发明是由微机系统、功率放大器等组成的控制部分；由步进电机、连杆机构构成的机械部分；由电源、亥姆霍兹线圈组构成的电磁部分和由培养瓶、种植有细胞的三维基质支架构成的组织反应器部分构成。微处理系统分别控制步进电机带动连杆机构上的丝杠作周期性往复运动和控制直流电源，输出脉冲电流，使绕在固定架上的亥姆霍兹线圈组产生电磁场；组织反应器是园柱形玻璃培养瓶，两端分别开有小孔固定夹持具和供丝杠伸出，种植有细胞的三维基质支架材料置于培养液中，两端由夹持具固定，设有培养瓶盖，固定在丝杠上的三维基质支架材料随丝杠运动产生动态应变场，应变场与电磁场复合作用于支架材料中的细胞，组织反应器置于CO2培养箱中以保证细胞生长的外界条件，培养箱中设有散热器，培养箱上有专用孔作管线进出。
本发明与现有技术相比具有如下优点和产生的积极效果1.采用折叠或卷成的三维基质支架，为细胞生长提供三维定向生长空间，极大地增加了细胞的附着面积；同时可在支架中加入各种促进细胞粘附、生长和分化的因子，有效地模拟在体内组织中细胞生长的微环境。
2.三维基质支架中的细胞在动态应变场中，在一定程度上增加了基质支架中细胞的通透性，提高了培养体系传热传质效果，从而显著改善了细胞在基质支架中的营养条件，提高了组织生成效率。
3.细胞在动态应变场和电磁场的复合作用下大大改善了细胞在三维基质支架中的生长条件，从而加快了细胞生长过程，使细胞培养周期缩短，代谢产物含量提高，细胞分泌胶原纤维量大，并按一定方向排列。
4.本发明结构简单、使用方便，应用广泛，给组织缺损病人带来福音。
以下是本发明附图的图面说明
图1是本发明的结构示意图。
图2是本发明控制部分、机械部分、电磁部分、组织反应器部分连接框图。
图3是本发明控制部分的电路原理图。
图4是本发明控制部分的软件工作流程图。
图5是本发明机械部分主视示意图。
图6是本发明机械部分俯视示意图。
图7是本发明三维基质支架构成示意图。
本发明以下将结合附图和实施例作进一步详述实施例1一种复合场三维细胞培养装置(见附图1-7)由微处理器系统1分别控制步进电机2带动连杆机构3上的丝杠4作周期性往复运动和控制直流电源5，输出脉冲电流，使绕在固定架6上的亥姆霍兹线圈组7、8、9、10产生脉冲电磁场；组织反应器11是园柱形玻璃培养瓶，两端分别开有小孔固定夹持具12和供丝杠伸出，种植有细胞13的三维基质支架材料14置于培养液15中，两端由夹持具12和16固定，17为培养瓶盖，固定在丝杠上的三维基质支架材料随丝杠运动产生动态应变场，应变场与电磁场复合作用于支架材料中的细胞，组织反应器置于CO2培养箱18中以保证细胞生长的外界条件，培养箱中设有散热器19，培养箱上有专用孔20供管线进出，其具体的控制部分、机械部分、电磁部分和组织反应器部分分述如下(1)控制部分是由硬件部分和软件部分组成(1.1)硬件部分是由一片低功耗8位单片微处理器，一个LCD液晶显示器，一个键盘监控接口，一个过零检测位置的光电信号检测电路，步进电机各相细分值锁存器，功率放大器；以及脉冲信号驱动电路，VMOS开关管，直流电源及亥姆霍兹线圈组成，(1.2)软件工作原理如下开机后执行初始化程序，随后在LCD上显示开机初始状态，等待键盘输入电机工作参数设定值和电磁场参数设定值，此后启动微处理器发出启动脉冲驱动步进电机及触发VMOS开关管，分别使电机按预设转速转动和使直流电源输出脉冲电流，电机工作时间结束后，由过零检测光电开关电路发出位置检测脉冲与设定位置比较，使电机停到预设位置，停机时间结束，电机又重新开始工作，直至总工作时间和电磁场作用时间结束后，程序结束，其工作流程图见说明书附图4。
(2)机械部分是由位于密封腔21内的步进电机2带动转动圆盘22上的滑槽23使连接的驱动臂24和连杆25驱动带有运动轴承26的推动杆27作周期性往复运动，固定在推动杆上的丝杠4及其连接的支架材料14与推动杆一起运动，设有标尺28指示伸缩长度，转动园盘上有偏心孔29，由偏心距调节钮30调节偏心距，滑槽的支点31位于驱动臂上，各部件由紧固螺钉32固定，33为滑动轴，34为绝热垫，35为机座，进气管36有两个，排气管37有一个，进、排气管连同控制步进电机的导线一起从CO2培养箱的专用出孔20引出，(2.1)连杆机构作周期性往复运动的幅度和频率由电机驱动的圆盘的偏心距和转速决定，电机驱动园盘的偏心距0、2、4、6、8、10、15、20mm，共8档，电机的转速为0～300转/分，应变场强度0～100％，频率0～5Hz，应变场强度和频率独立变化，(3)电磁部分是微处理器输出触发脉冲信号，控制电源输出电流驱动绕在固定架上的亥姆霍兹线圈组，以产生电磁场，电磁场的强度与流过亥姆霍兹线圈的电流成正比，通过调节直流电源输出电流大小来调节电磁场强度，通过调节触发脉冲信号的频率来调节电磁场频率，(3.1)电源为直流电源，其输出电流I与亥姆霍兹线圈产生的电磁场强度B的关系是B=2μ04RnI]]>R、n分别为亥姆霍兹线圈半径和匝数，R＝40mm，nI＝0～10000安匝，μ0＝0.4π×10-6牛顿/米2，电磁场强度0～0.1特斯拉(T)，频率0～1kHz，电磁场强度与频率无依赖性，(4)组织反应器是园柱形培养瓶，培养瓶盖盖于培养瓶上，培养瓶两端分别开有小孔固定夹持具12和供丝杠4伸出，丝杠与小孔的缝隙用封口膜作动态密封，种植有细胞的三维基质支架置于培养液中，两端由夹持具12和16固定，三维基质支架是由直径为5～100μm的聚合物纤维编织成网孔为4～1000μm2的纤维网构成，组织反应器置于CO2培养箱中以保持适于细胞生长的CO2浓度和有湿度的空气环境，电磁场和应变场复合作用于组织反应器的支架材料中的细胞，(4.1)培养条件CO2浓度5～10％，温度35～37℃，相对湿度90％以上，三维基质支架材料为聚合物，包括可降解聚合物、不可降解聚合物和用可降解聚合物包埋不可降解聚合物(1)可降解聚合物有聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸与聚羟基乙酸按90～10∶10～90比例共聚的无规共聚物；不可降解聚合物有聚乙烯醇、聚己内酰胺、聚氨酯、聚甲基丙烯酸羟乙基酯，(2)用可降解聚合物包埋不可降解聚合物有聚乳酸包埋聚乙烯醇、聚羟基乙酸包埋聚氨酯、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物包埋聚己内酰胺，聚合物纤维网可以卷成长方体支架、园柱体支架、棱柱体支架、椭园柱体支架或其它形态。
在连杆机构的推动杆上并联有两套以上的组织反应器及亥姆霍兹线圈组，以提高工作效率。
上述(2.1)、(3)、(3.1)、(4)中的参数设置、三维基质支架材料(1)、(2)的改变是根据所培养的细胞特点不同进行选择的。
实施例2.一种复合场三维细胞培养装置(见附图1-7)其装置的结构同实施例1，三维基质支架材料是由直径为5μm的可降解聚合物聚乳酸纤维编织成网孔为4μm2的纤维网卷成长方体支架，在支架中种植软骨细胞后，在无应变场(强度为0％)和无电磁场(场强为0特斯拉)的情况下进行静态三维细胞培养。
实施例3.一种复合场三维细胞培养装置(见附图1-7)其装置的结构同实施例1，三维基质支架材料使用可降解聚合物，如聚乳酸与聚羟基乙酸按10∶90比例共聚的无规共聚物，聚合物纤维网可以卷成六棱柱体支架，在支架中种植软骨细胞后，在强度为1％、频率为0.5Hz的应变场和场强为0.05特斯拉、频率为500Hz的电磁场复合作用下进行三维细胞培养。
实施例4.一种复合场三维细胞培养装置(见附图1-7)其装置的结构同实施例1，三维基质支架材料由直径为20μm的可降解聚合物纤维，如聚乳酸与聚羟基乙酸按90∶10比例共聚的无规共聚物纤维编织成网孔为20μm2的纤维网卷成园柱体支架，在支架中种植肌腱细胞后，在强度为5％、频率为5Hz的应变场和场强为0.01特斯拉、频率为1kHz的电磁场复合作用下进行三维细胞培养。
实施例5.一种复合场三维细胞培养装置(见附图1-7)其装置的结构同实施例1，三维基质支架材料由直径为40μm的可降解聚合物纤维，如聚乳酸与聚羟基乙酸按50∶50比例共聚的无规共聚物纤维编织成网孔为50μm2的纤维网卷成椭园柱体支架，在支架中种植成肌细胞后，在强度为100％、频率为2Hz的应变场和场强为0.1特斯拉、频率为50Hz的电磁场复合作用下进行三维细胞培养。
实施例6.一种复合场三维细胞培养装置(见附图1-7)其装置的结构同实施例1，三维基质支架材料由直径为80μm的不可降解聚合物纤维，如聚甲基丙烯酸羟乙基酯纤维编织成网孔为1000μm2的纤维网卷成三棱柱体支架，在支架中种植成骨细胞后，在强度为0.5％、频率为0.2Hz的应变场和场强为0.08特斯拉、频率为200Hz的电磁场复合作用下进行三维细胞培养。
实施例7.一种复合场三维细胞培养装置(见附图1-7)其装置的结构同实施例1，三维基质支架材料由可降解聚合物包埋不可降解聚合物构成的直径为100μm的纤维，如聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物包埋聚己内酰胺纤维编织成网孔为1000μm2的纤维网卷成长方体支架，在支架中种植肺泡细胞后，在强度为80％、频率为1.5Hz的应变场和场强为0.06特斯拉、频率为150Hz的电磁场复合作用下进行三维细胞培养。
权利要求
1.一种复合场三维细胞培养装置，其特征在于由微处理器系统1分别控制步进电机2带动连杆机构3上的丝杠4作周期性往复运动和控制直流电源5，输出脉冲电流，使绕在固定架6上的亥姆霍兹线圈组7、8、9、10产生脉冲电磁场；组织反应器11是园柱形玻璃培养瓶，两端分别开有小孔固定夹持具12和供丝杠伸出，种植有细胞13的三维基质支架材料14置于培养液15中，两端由夹持具12和16固定，17为培养瓶盖，固定在丝杠上的三维基质支架材料随丝杠运动产生动态应变场，应变场与电磁场复合作用于支架材料中的细胞，组织反应器置于CO2培养箱18中以保证细胞生长的外界条件，培养箱中设有散热器19，培养箱上有专用孔20供管线进出，其具体的控制部分、机械部分、电磁部分和组织反应器部分分述如下(1.1)控制部分是由硬件部分和软件部分组成(1.1.1)硬件部分是由一片低功耗8位单片微处理器、一个LCD液晶显示器、一个键盘监控接口，一个过零检测位置的光电信号检测电路，步进电机各相细分值锁存器，功率放大器，以及触发脉冲信号驱动电路、VMOS开关管、直流电源及亥姆霍兹线圈组成，(1.1.2)软件工作原理如下开机后执行初始化程序，随后在LCD上显示开机初始状态，等待键盘输入电机工作参数设定值和电磁场参数设定值，此后启动微处理器发出启动脉冲驱动步进电机及触发VMOS开关管，分别使电机按预设转速转动和使直流电源输出脉冲电流，电机工作时间结束后，由过零检测光电开关电路发出位置检测脉冲与设定位置比较，使电机停到预设位置，停机时间结束，电机又重新开始工作，直至总工作时间和电磁场作用时间结束后，程序结束，(1.2)机械部分是由位于密封腔21内的步进电机2带动转动圆盘22上的滑槽23使连接的驱动臂24和连杆25驱动带有运动轴承26的推动杆27作周期性往复运动，固定在推动杆上的丝杠4及其连接的支架材料14与推动杆一起运动，设有标尺28指示材料伸缩长度，转动园盘上有偏心孔29，由偏心距调节钮30调节偏心距，滑槽的支点31位于驱动臂上，各部件由紧固螺钉32固定，33为滑动轴，34为绝热垫，35为机座，进气管36有两个，排气管37有一个，进、排气管连同控制步进电机的导线一起从CO2培养箱的专用出孔20引出，(1.2.1)连杆机构作周期性往复运动的幅度和频率由电机驱动的圆盘的偏心距和转速决定，电机驱动园盘的偏心距0、2、4、6、8、10、15、20mm，共8档，电机的转速为0～300转/分，应变场强度0～100％，频率0～5Hz，应变场强度和频率独立变化，(1.3)电磁部分是由微处理器输出触发脉冲信号，控制电源输出电流驱动绕在固定架上的亥姆霍兹线圈组，以产生电磁场，电磁场的强度与流过亥姆霍兹线圈的电流成正比，通过调节直流电源输出电流大小来调节电磁场强度，通过调节触发脉冲信号的频率来调节电磁场频率，(1.3.1)电源为直流电源，其输出电流I与亥姆霍兹线圈产生的电磁场强度B的关系是B=2μ04RnI]]>R、n分别为亥姆霍兹线圈半径和匝数，R＝40mm，nI＝0～10000安匝，μ0＝0.4π×10-6牛顿/米2，电磁场强度0～0.1特斯拉(T)，频率0～1kHz，电磁场强度与频率无依赖性，(1.4)组织反应器是园柱形培养瓶，培养瓶盖盖于培养瓶上，培养瓶两端分别开有小孔固定夹持具12和供丝杠4伸出，丝杠与小孔的缝隙用封口膜作动态密封，种植有细胞的三维基质支架置于培养液中，两端由夹持具12和16固定，三维基质支架是由直径为5～100μm的聚合物纤维编织成网孔为4～1000μm2的纤维网构成，组织反应器置于CO2培养箱中以保持适于细胞生长的CO2浓度和有湿度的空气环境，电磁场和应变场复合作用于组织反应器的支架材料中的细胞，(1.4.1)培养条件CO2浓度5～10％，温度35～37℃，相对湿度90％以上。
2.根据权利要求1所述的复合场三维细胞培养装置，其特征在于三维基质支架材料为聚合物，包括可降解聚合物、不可降解聚合物和用可降解聚合物包埋不可降解聚合物(2.1)可降解聚合物有聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸与聚羟基乙酸按90～10∶10～90比例共聚的无规共聚物，(2.2)不可降解聚合物有聚乙烯醇、聚己内酰胺、聚氨酯、聚甲基丙烯酸羟乙基酯，(2.3)用可降解聚合物包埋不可降解聚合物有聚乳酸包埋聚乙烯醇、聚羟基乙酸包埋聚氨酯、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚物包埋聚己内酰胺。
3.根据权利要求1所述的复合场三维细胞培养装置，其特征在于聚合物纤维网可以卷成长方体支架、园柱体支架、棱柱体支架、椭园柱体支架或其它形态。
4.根据权利要求1所述的复合场三维细胞培养装置，其特征在于在连杆机构的推动杆上并联有两套以上的组织反应器及亥姆霍兹线圈组。
全文摘要
本发明是将组织细胞种植在三维基质支架中,置于应变场和电磁场中,使细胞取向生长,提高其代谢,促进其分泌功能,以构建出具有特定形态和功能的组织替代物的装置。本设计由微机系统、功率放大器等组成的控制部分,由步进电机、连杆机构构成的机械部分,由直流电源、亥姆霍兹线圈组成的电磁部分,由培养瓶、种植有细胞的三维基质支架等构成的组织反应器部分构成。结构简单、使用方便,应用广泛,给组织缺损病人带来福音。
文档编号C12M3/00GK1259568SQ98121829
公开日2000年7月12日 申请日期1998年11月5日 优先权日1998年11月5日
发明者秦廷武, 杨志明 申请人:华西医科大学附属第一医院