专利名称：日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的克隆及在家蚕系统中的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程疫苗，具体涉及一种日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白基因的克隆及在家蚕系统中的表达。
血吸虫病是一种严重严重危害人、畜健康的寄生虫病，长期研究和实践证明，在应用已有防治技术的基础上，开展疫苗预防研究，特别是基因工程疫苗研究是防治血吸虫病的重要发展战略、1994年世界卫生组织(WHO)曾推荐几种较好的曼氏血吸虫候选抗原，例如Sm 14FABP(脂肪酸结合蛋白)，见BergquistN K，Hall B F，James S.Schistosomiasis vaceine deve lopment.The lmmunologist.1994.2(40)131-134。
本发明的目的在于对日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)基因进行克隆，并应用家蚕宿主生产重组蛋白用于制备疫苗。
本发明公开了一种日本血吸虫脂肪结合蛋白基因的克隆及在家蚕系统中的表达。
本发明所用材料如下含Sj14FABP基因的重组质粒Sj14/pGEX-2T由本实验室构建；修饰的BmNPV由中国科学院上海生物化学研究所构建；BmN细胞、转移质粒pBacPAK Hisl(为Clontench公司产品)和用于扩增重组质粒及重组转移质粒的大肠杆菌TG1均为中国科学院上海生物化学研究所保存；各种工具酶、Lipofectin、NicK Translation Kit和低熔点琼脂糖均为GIBCO BRL公司产品、硝酸纤维膜(NC)为Chleicher & Schuell或浙江黄岩产品；辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG、X-gal为Sigma公司产品。家蚕(75新×7532)由中国农业科学院蚕业研究所提供。
本发明的方法包括下列步骤1、Sj14FABP基因的克隆及序列分析用引物5’-CAGGATCCATGTCTAGTTTCTTGGGAAA-3’和引物5’-TCAGGATCCGCTTTTTTTTTTTTTTTT-3’日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中以PCR法快速克隆出Sj14FABP基因，按Sambrook实验手册中的方法将其克隆到PSK(+)质粒上，按USB T7测序试剂盒说明书操作，测定其核苷酸序列；2、重组转移质粒的构建 按Sambrook实验手册进行基因操作，筛选出含Sj14FABP基因的重组子，用Sal I酶切及按USB测序试剂盒说明书测序以确定连接方向和对码情况；
3、病毒重组 参照Summers实验手册用Lipofectin共转染法制备重组病毒。修饰的BmNPV引入了苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)多角体蛋白启动子调控下的LacZ基因，同时在多角体基因(ph)的两侧引入Bsu36 I位点，通过酶切使基因组DNA线性化。共转染混合物由2μg线性化病毒DNA、3μg重组转移质粒DNA和等体积的50μl Lipofectin组成。传染后的BmN细胞于27℃培养一周后取上清扩增一次；4、重组病毒的筛选、鉴定与纯化 取扩增共转染病毒上清作1∶10-3和1∶10-4稀释，感染1×105细胞1小时，铺上含0.2mg/mlX-gal的低熔点琼脂糖(1％)，培养4-6天后挑取多个白斑于24孔培养板(2×104细胞/孔)，27℃培养3-4天，收集细胞，用32P标记的Sj14FABP基因探针进行dot-blot DNA杂交分析，选择阳性克隆按上述方法进行第二轮空斑分析，得纯化的重组病毒Bm-Sj14FABP；5、Sj14FABP基因的表达 Bm-Sj14FABP感染2×104BmN细胞后1至6天分别收集细胞和上清用SDS-PAGE(15％分离胶)检测。5龄家蚕在环节皮下注射5μl Bm-Sj14FABP病毒上清或BmNPV上清，于次日开始逐日收集血淋巴和蚕体组织。血淋巴经PBS 1∶3稀释，组织用PBS匀浆、液氮冻融、超声、离心(11953g×10min)后收集上清，以SDS-PAGE(15％分离胶)方法进行检测；6、表达产物的纯化 表达产物为融合蛋白，含Sj14FABP和来自pBacPAK Hisl的含6个组氨酸的部分表达蛋白。参照文献方法用NiSO4-Cheling Sepherose柱纯化，上柱前血淋巴用缓冲液(PH8.0，含0.2ml Na2HPO4和0.2ml NaCl)稀释；组织用上述缓冲液匀浆、冻融、超声、离心(11953g×10min)制备上柱样品。用100mM EDTA洗脱，用紫外吸收法测蛋白含量；7、表达产物的鉴定 以大肠杆菌表达的Sj14FABP免疫Balb/c鼠制备抗血清，用该血清与蚕表达产物及纯化产物作Westernblot反应，检测蚕表达产物的抗原性；本发明方法各步骤的验证结果如下1、从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中克隆出一段大小为600bp左右的DNA片段，其核苷酸序列如下1 CAGGATCCAT GTCTTTCTTG GGAAAGTGGA AACTAAGCGA ATCACACAAC TTCGATGCTGGTCCTAGGTA CAGAAAGAAC CCTTTCACCT TTGATTCGCT TAGTGTGTTG AAGCTACGAC61 TTATGTCAAA GCTCGGTGTC TCGTGGGCGA CCCGACAAAT TGGGAACACA GTGACGCCAAAATACAGTTT CGAGCCACAG AGCACCCGCT GGGCTGTTTA ACCCTTGTGT CACTGCGGTT121 CTGTCACTTT CACAATGGAT GGGGGATACG ATGACCATGC TGACAGAGTC GACTTTCAAGGACAGTGAAA GTGTTACCTA CCCCCTATGC TACTGGTACG ACTGTCTCAG CTGAAAGTTC181 AACCTCTCAG TCACGTTCAA ATTTGGTGAG GAATTTGACG AGAAAACCAG TGATGGCAGATTGGAGAGTC AGTGCAAGTT TAAACCACTC CTTAAACTGC TCTTTTGGTC ACTACCGTCT241 AGCGTTAAGT CAGTCGTTAC CAAAGATTCA GAGTCAAAGA TAACTCAAAC TCAAAAGGATTCGCAATTCA GTCAGCAATG GTTTCTAAGT CTCAGTTTCT ATTGAGTTTG AGTTTTCCTA301 AGTAAGAACA CAACTGTAAT CGTTCGTGAA ATAGTAGGTG ATACTATGAA AACTACTGTATCATTCTTGT GTTGACATTA GCAAGCACTT TATCATCCAC TATGATACTT TTGATGACAT361 ACTGTCGATG ATGTTACGGC TATTCGGAAT TACAAACGAT TGTAACCCCT GCAAACTGATTGACAGCTAC TACAATGCCG ATAAGCCTTA ATGTTTGCTA ACATTGGGGA CGTTTGACTA421 AGACTGGTCA AATGTTTCTT GAAAGCGCTT GTATTTCAGT TGACATTATT ACGAAAATGATCTGACCAGT TTACAAAGAA CTTTCGCGAA CATAAAGTCA ACTGTAATAA TGCTTTTACT481 CCACCGGTGG ACGTATTTGG TTACTCGCGT CATCCTATAT TTAATTAATC AGCTCCACTTGGTGGCCACC TGCATAAACC AATGAGCGCA GTAGGATATA AATTAATTAG TCGAGGTGAA541 TTGGTTCAAT AAACATTGCT TATTATTTAA AAAAAAAACCAAGTTA TTTGTAACGA ATAATAAATT TTTTTT
2、重组转移质粒的构建转移质粒的构建过程如
图1所示。转移载体pBacPAK Hisl是带多角体基因启动子的融合蛋白转移载体。用BamH I酶切Sj14/pGEX-2T，分离得Sj14FABP基因片段。该片段大小为600bp左右，内含Sj14FABP基因，该基因ORF为399bp，编码132个氨基酸，其160bp处有一个Sal I位点。将该基因片段与同样酶切的pBacPAKHisl连接、转化。重组质粒经Sal I酶切及测序表明插入方向和对码均正确。
3、重组病毒Bm-Sj14FABP的筛选与鉴定第一轮空斑挑出的23个白斑经dot-blot检测，基中22个白斑能被32P标记的Sj14FABP基因探针识别。选择其中的17#强阳性斑进行第二轮空斑分析，挑取23个空斑同法进行检测，全部为阳性斑(图2)。选择其中的强阳性斑1#、8#、17#和19#作表达用。
4、Sj14FABP在家蚕细胞及幼虫中的表达Bm-Sj14FABP感染BmN细胞和幼虫后的表达产物Sj14FABP(his)为Sj14FABP与载体的融合蛋白，分子量为18KD，其中Sj14FABP为14.8KD，载体部分为3.2KD。
Bm-Sj14FABP感染BmN细胞后2天开始有Sj14FABP(his)表达，感染后3-6天表达量基本持平。在细胞培养上清中，Sj14FABP(his)自感染后3天开始逐日增加(图3)。1×106细胞的得量为约100μg(第4天)，培养上清中的得量为约33μg/ml。
Bm-Sj14FABP感染家蚕幼虫后3天出现发病症状，4天病情加重，蚕体皱缩，4天半后蚕体出现死亡。SDS-PAGE显示Sj14FABP(his)在血淋巴和组织中均自感染后3天出现，4天达高峰(图4)，此时Sj14FABP(his)的产量经GDS8000凝胶扫描分析软件分析约占血淋巴总蛋白的33％(图5)。在空白对照蚕及BmNPV感染的血淋巴和组织中均无此蛋白条带。感染Bm-Sj14FABP病毒4天的血淋巴及组织经NiSO4-Cheling Sepherose柱纯化后，每毫升血淋巴可得4mg纯化蛋白，每克蚕组织可得4.6mg纯化蛋白，按每条蚕得0.25ml血淋巴、0.6g蚕组织计，每条蚕可得约3.5mg表达产物。图6所示为纯化蛋白的SDS-PAGE图谱。
5、表达产物的免疫特性以大肠杆菌表达的Sj14FABP免疫的小鼠血清进行western blot实验，图谱如图6所示。感染BmSj14FABP病毒4天的血淋巴及纯化的rSj14FABP(his)在18kD处有明显杂交条带(图7)，说明该重组蛋白有较好的抗原性。用BmNPV感染4天的蚕血淋巴在30kD处有一条较弱反应条带。
用本发明方法获得的日本血吸虫脂肪酸结合蛋白Sj14FABP(his)分子大小为18kD。
用rSj14FABP的动物免疫试验如下材料与方法一、寄生虫试验用日本血吸虫尾蚴由本所钉螺房提供，血吸虫生活史循环由新西兰大白兔和中国大陆湖北钉螺维持。
二、实验动物6-8周龄的昆明系小鼠和Wistar大鼠购自中国科学院上海实验动物中心；1.0-1.5岁雄性绵羊都是血吸虫阴性，试验前两周所有绵羊都用Closantel(比利时扬森公司)治疗，驱除羊体内可能存在的其他寄生虫。
三、基因表达、重组抗原的纯化和抗原性测定见蔡学忠等的报道。
四、动物免疫先后进行了一批昆明系小鼠、Wistar大白鼠和绵羊免疫试验。
五、动物攻击和剖杀第三次免疫后两周，小鼠、大白鼠和绵羊分别用40、600和300条尾蚴玫击，小鼠和大白鼠于玫击后6-8周剖杀，绵羊于玫击后11周剖杀，通过门静脉灌洗法收集虫体，用以下公式计算减虫率
六、绵羊粪便、组织虫卵计数绵羊于玫击感染后第6至第22周每周采集一次粪便，剖杀时采集肝、大肠、小肠组织样品，按文献方法计算每克粪便/组织虫卵数(EPG)，用以下公式计算减虫率
结果一、rSj14FABP在小鼠、大鼠，绵羊中诱导的减虫效果在小鼠、大鼠，绵羊中分别获得33％、31.85％和59.2％的减虫率。二、rSj14FABP在绵羊中诱导的减卵效果观察和对照组相比，rSj14FABP免疫绵羊自攻击感染后第6周至第11周，粪便中平均每克虫卵数(EPG)分别减少23.6％、35.0％、63.3％、43.8％、34.9％和57.6％，平均减少42.97％。肝组织EPG减少44.9％；小肠EPG减少69.6％；但大肠EPG未见减少。三、又据文献报道Tendler M等报道应用重组曼氏血吸虫FABP(rSmFABP)免疫小鼠和家兔，分别诱导了51.4％-67.8％和56.7％-72.1％的减虫率。
上述试验结果表明，Sj14FABP有较好的免疫原性，并能诱导较强的抗玫击感染作用，它在家蚕幼虫中得量很高，在感染BmSj14FABP病毒4天的家蚕血淋巴中，Sj14FABP(his)占血淋巴总蛋白的33％，每毫升血淋巴可得4mg纯化的Sj14FABP(his)，而且每克蚕体组织中亦可获得4.6mg纯化的Sj14FABP(his)，这对未来的疫苗生产极具实用价值。家蚕易于饲养，生产成本低，目前已有家蚕人工饲养技术，本发明的方法宜于规模型工业化无菌生产疫苗。实施例一1、Sj14FABP基因的克隆及序列分析用引物5’-CAGGATCCATGTCTAGTTTCTTGGGAAA-3’和引物5’-TCAGGATCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中以PCR法快速克隆出Sj14FABP基因，按Sambrook实验手册中的方法将其克隆到PSK(+)质粒上，按USB T7测序试剂盒说明书操作，测定其核苷酸序列；2、重组转移质粒的构建 按Sambrook实验手册进行基因操作，筛选出含Sj14FABP基因的重组子，用Sal I酶切及按USB测序试剂盒说明书测序以确定连接方向和对码情况；3、病毒重组 参照Summers实验手册用Lipofectin共转染法制备重组病毒。修饰的BmNPV引入了苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)多角体蛋白启动子调控下的LacZ基因，同时在多角体基因(ph)的两侧引入Bsu36 I位点，通过酶切使基因组DNA线性化。共转染混合物由2μg线性化病毒DNA、3μg重组转移质粒DNA和等体积的50μl Lipofectin组成。传染后的BmN细胞于27℃培养一周后取上清扩增一次；4、重组病毒的筛选、鉴定与纯化 取扩增共转染病毒上清作1∶10-3稀释，感染1×105细胞1小时，铺上含0.2mg/ml X-gal的低熔点琼脂糖(1％)，培养4天后挑取多个白斑于24孔培养板(2×104细胞/孔)，27℃培养3天，收集细胞，用32P标记的Sj14FABP基因探针进行dot-blot DNA杂交分析，选择阳性克隆按上述方法进行第二轮空斑分析，得纯化的重组病毒Bm-Sj14FABP；5、Sj14FABP基因的表达 Bm-Sj14FABP感染2×104BmN细胞后1至6天分别收集细胞和上清用SDS-PAGE(15％分离胶)检测。5龄家蚕在环节皮下注射5μl Bm-Sj14FABP病毒上清或BmNPV上清，于次日开始逐日收集血淋巴和蚕体组织。血淋巴经PBS 1∶3稀释，组织用PBS匀浆、液氮冻融、超声、离心(11953g×10min)后收集上清，以SDS-PAGE(15％分离胶)方法进行检测；6、表达产物的纯化 表达产物为融合蛋白，含Sj14FABP和来自pBacPAK Hisl的含6个组氨酸的部分表达蛋白。参照文献方法用NiSO4-Cheling Sepherose柱纯化，上柱前血淋巴用缓冲液(PH8.0，含0.2ml Na2HPO4和0.2ml NaCl)稀释；组织用上述缓冲液匀浆、冻融、超声、离心(11953g×10min)制备上柱样品。用100mM EDTA洗脱，用紫外吸收法测蛋白含量；7、表达产物的鉴定 以大肠杆菌表达的Sj14FABP免疫Balb/c鼠制备抗血清，用该血清与蚕表达产物及纯化产物作Westernblot反应，检测蚕表达产物的抗原性。
权利要求
1.一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因序列，其特征在于该序列用下式表示1 CAGGATCCAT GTCTTTCTTG GGAAAGTGGA AACTAAGCGA ATCACACAAC TTCGATGCTGGTCCTAGGTA CAGAAAGAAC CCTTTCACCT TTGATTCGCT TAGTGTGTTG AAGCTACGAC61 TTATGTCAAA GCTCGGTGTC TCGTGGGCGA CCCGACAAAT TGGGAACACA GTGACGCCAAAATACAGTTT CGAGCCACAG AGCACCCGCT GGGCTGTTTA ACCCTTGTGT CACTGCGGTT121 CTGTCACTTT CACAATGGAT GGGGGATACG ATGACCATGC TGACAGAGTC GACTTTCAAGGACAGTGAAA GTGTTACCTA CCCCCTATGC TACTGGTACG ACTGTCTCAG CTGAAAGTTC181 AACCTCTCAG TCACGTTCAA ATTTGGTGAG GAATTTGACG AGAAAACCAG TGATGGCAGATTGGAGAGTC AGTGCAAGTT TAAACCACTC CTTAAACTGC TCTTTTGGTC ACTACCGTCT241 AGCGTTAAGT CAGTCGTTAC CAAAGATTCA GAGTCAAAGA TAACTCAAAC TCAAAAGGATTCGCAATTCA GTCAGCAATG GTTTCTAAGT CTCAGTTTCT ATTGAGTTTG AGTTTTCCTA301 AGTAAGAACA CAACTGTAAT CGTTCGTGAA ATAGTAGGTG ATACTATGAA AACTACTGTATCATTCTTGT GTTGACATTA GCAAGCACTT TATCATCCAC TATGATACTT TTGATGACAT361 ACTGTCGATG ATGTTACGGC TATTCGGAAT TACAAACGAT TGTAACCCCT GCAAACTGATTGACAGCTAC TACAATGCCG ATAAGCCTTA ATGTTTGCTA ACATTGGGGA CGTTTGACTA421 AGACTGGTCA AATGTTTCTT GAAAGCGCTT GTATTTCAGT TGACATTATT ACGAAAATGATCTGACCAGT TTACAAAGAA CTTTCGCGAA CATAAAGTCA ACTGTAATAA TGCTTTTACT481 CCACCGGTGG ACGTATTTGG TTACTCGCGT CATCCTATAT TTAATTAATC AGCTCCACTTGGTGGCCACC TGCATAAACC AATGAGCGCA GTAGGATATA AATTAATTAG TCGAGGTGAA541 TTGGTTCAAT AAACATTGCT TATTATTTAA AAAAAAAACCAAGTTA TTTGTAACGA ATAATAAATT TTTTTT
2.一种日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的表达产物Sj14FABP(his)，其特征在于该蛋白基因的产物是通过日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因克隆及在家蚕中表达后得到分子大小为18kD的融合蛋白。
3.一种如权利要求2所述的一日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的表达产物Sj14FABP(his)的制备方法，该方法包括下列步骤(1)、Sj14FABP基因的克隆及序列分析用引物5’-CAGGATCCATGTCTAGTTTCTTGGGAAA-3’和引物5’-TCAGGATCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库中以PCR法快速克隆出Sj14FABP基因，按Sambrook实验手册中的方法将其克隆到PSK(+)质粒上，按USB T7测序试剂盒说明书操作，测定其核苷酸序列；(2)、重组转移质粒的构建 按Sambrook实验手册进行基因操作，筛选出含Sj14FABP基因的重组子，用Sal I酶切及按USB测序试剂盒说明书测序以确定连接方向和对码情况；(3)、病毒重组 参照Summers实验手册用Lipofectin共转染法制备重组病毒。修饰的BmNPV引入了苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)多角体蛋白启动子调控下的LacZ基因，同时在多角体基因(ph)的两侧引入Bsu36 I位点，通过酶切使基因组DNA线性化，共转染混合物由2μg线性化病毒DNA、3μg重组转移质粒DNA和等体积的50μ1 Lipofectin组成，传染后的BmN细胞于27℃培养一周后取上清扩增一次；(4)、重组病毒的筛选、鉴定与纯化 取扩增共转染病毒上清作1∶10-3和1∶10-4稀释，感染1×105细胞1小时，铺上含0.2mg/mlX-gal的低熔点琼脂糖(1％)，培养4-6天后挑取多个白斑于24孔培养板(2×104细胞/孔)，27℃培养3-4天，收集细胞，用32P标记的Sj14FABP基因探针进行dot-blot DNA杂交分析，选择阳性克隆按上述方法进行第二轮空斑分析，得纯化的重组病毒Bm-Sj14FABP；(5)、Sj14FABP基因的表达 Bm-Sj14FABP感染2×104BmN细胞后1至6天分别收集细胞和上清用SDS-PAGE(15％分离胶)检测，5龄家蚕在环节皮下注射5μl Bm-Sj14FABP病毒上清或BmNPV上清，于次日开始逐日收集血淋巴和蚕体组织，血淋巴经PBS 1∶3稀释，组织用PBS匀浆、液氮冻融、超声、离心(11953g×10min)后收集上清，以SDS-PAGE(15％分离胶)方法进行检测；(6)、表达产物的纯化 表达产物为融合蛋白，含Sj14FABP和来自pBacPAK Hisl的含6个组氨酸的部分表达蛋白，参照文献方法用NiSO4-Cheling Sepherose柱纯化，上柱前血淋巴用缓冲液(PH8.0，含0.2ml Na2HPO4和0.2ml NaCl)稀释；组织用上述缓冲液匀浆、冻融、超声、离心(11953g×10min)制备上柱样品，用100mM EDTA洗脱，用紫外吸收法测蛋白含量；(7)、表达产物的鉴定 以大肠杆菌表达的Sj14FABP免疫Balb/c鼠制备抗血清，用该血清与蚕表达产物及纯化产物作Western blot反应，检测蚕表达产物的抗原性。
全文摘要
本发明旨在生产抗日本血吸虫病疫苗,它涉及一个编码日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白的基因,一个含有该基因的重组家蚕核型多角体病毒及在家蚕系统中的表达和该蛋白质的制备方法。本发明的表达产物为分子大小18kD的融合蛋白,它具有较好的免疫原性,能诱导较强的抗攻击感染作用。
文档编号C12N15/12GK1255548SQ9812204
公开日2000年6月7日 申请日期1998年11月27日 优先权日1998年11月27日
发明者林矫矫, 吴祥甫, 刘金明, 蔡学忠, 蔡幼民, 施福恢, 沈纬, 付志强 申请人:中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所, 中国科学院上海生物化学研究所