专利名称：腺病毒－胸苷激酶基因构型及其获得方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因构型，特别是一种腺病毒-胸苷激酶基因构型及其获得方法和应用。
众所周知，恶性肿瘤目前是危害人类健康及生命的首要疾病，每年我国死于恶性肿瘤的患者约130万人以上。目前用于治疗肿瘤的四大方法是手术、化疗、放疗和免疫综合疗法，它们虽可部分改善病人的预后，但尚未获实质性进展，而基因治疗正以巨大的生活力和崭新的面貌出现，其发展代表了下世纪根治肿瘤的发展方向。
自1986年Moolten博士在偶然机会发现(Moolten等人，Cancer Res1986，465276)单纯疱疹病毒的胸苷激酶(TK)基因转染肿瘤细胞可使其对化疗敏感性增加以来，人们对TK基因的抗癌作用进行了研究，认识到其治疗肿瘤的基本原理在于胸苷激酶可将对哺乳动物细胞无毒的更昔洛韦代谢为细胞毒性产物，使转染了单纯疮疹病毒胸苷激酶的肿瘤细胞在更昔洛韦的参与下自发死亡，也称自杀效应。
显然，如何获得腺病毒-胸苷激酶基因以及使其在临床应用上有高的转染效率、高表达、较好的稳定性是生物学家、医学家共同关心的课题。
本发明目的是提供一种优化的腺病毒-胸苷激酶基因构型，获得该构型的方法以及利用上述基因构型得到的产品。
为达到上述目的本发明采用以下技术方案一种腺病毒-胸苷激酶基因构型，其特征在于全构件包括腺病毒载体、胸苷激酶片断和RSV-LTP启动子，全构件核苷酸长43Kb，胸苷激酶长2.8Kb，启始片断长18bp，其序列ATGGCTTCGTACCCCTGC。
一种获得上述基因构型的方法，其特征在于它包括(1)在序列为ATGGCTCGTCCCTGC启始片断诱导下，在体外与ADV载体胸苷激酶基因cDNA，经酶切、连结、共转染使RSV-LTP启动子和胸苷激酶片断插入腺病毒载体中，(2)将(1)中的初级构件与辅助质粒PJM17再次结合，连结成型后使构件能在293细胞中培养扩增。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
图1腺病毒-胸苷激酶基因构型2DNA连接及载体构建示意3TK基因核苷酸序列(之前应该含有多个A及尾带共2.8Kb)1、ADV腺病毒载体的获得ADV即致病轻微的人体腺病毒，本项目采用的ADV是经DNA重组技术去除基因组中Ela，E1b，E3编码区，全长7.5Kb，成为一种复制缺陷病毒载体。采用ADV作为基因治疗的载体具有以下明显的生物学优点(1)除淋巴细胞、骨髓基质细胞外具有广泛的感染谱，其感染无须细胞处于分裂期；(2)ADV转入细胞后以基因组外染色体的形式存在，无插入基因组导致突变，致癌的危险性；(3)病毒可在体外复制；(4)基因持续表达可达2-3个月等。
2、TK基因全长cDNA编码片断(请见附图3)3、DNA连接及载体构建(1)在序列为ATGGCTTCGTACCCCTGC启始片断的诱导下，在体外与PBR322载体、上述TK基因cDNA，经酶切，所用酶为456×bal，Bg111/BamHI，BamHI连结、共转染使RSV启动子和胸苷激酶基因插入腺病毒PBR322载体中(见图1、图2)。
(2)由于上述构件尚缺乏在体外复制扩增能力，所以将初级构件与辅助质粒(PFM17)再次结合，连结成型后使构件能在293细胞(一种人胚肾细胞)培养扩增。选用293细胞(ATCC-CRL1573)作为病毒复制细胞系，此细胞系是V型ADV的转化基因，是国际通用的繁殖分离病毒及进行ADV滴度测定的标准细胞系，此细胞系已从美国引进。
(3)由于构件有可能出现缺码或反序而形成无功能构件，所以需要对构件进行筛选，筛选过程在琼脂胶上进行，随后通过酶切，RT-PCR检测DNA测序，筛选出符合设计要求的构型。
(4)筛选出的合格构件接种于293细胞中培养(37℃，CO2)，使其大量扩增，提取培养上清液，在80,000g超速离心分离出可用于治疗腺病毒-胸苷激酶产品。
(5)对产品进行CsCl氯化铯纯化，应用空斑试验测出PFU效价，在80℃保存。
可利用腺病毒-胸苷激酶基因构件扩增后的上清液制取基因产品，根据本腺病毒-胸苷激酶基因构建系统在初步临床前预实验中表明，无论在体外肿瘤细胞系或动物模型内，该基因产品具有明确、高效抗人类肿瘤活性，安全性好，应用方便，其中对卵巢癌的临床前期应用中，有效率超过70％，特别是用于多种宿主肿瘤局部直接注射，本产品对手术不能切除或切除不完全的局部病灶有独到的治疗效果。由于载体是一种缺陷的人体伴随病毒，无宿主基因插入突变的危险性，因此为应用于临床有很好的发展前景。特别是中国人实体瘤有效好效果。
机理将胸苷激酶通过腺病毒为载体转入肿瘤细胞中使之表达，继之加用更昔洛韦，在其参与下，胸苷激酶转化单磷酸核苷为三磷酸核苷，并与肿瘤新生DNA链结合，干扰DNA的合成而杀死肿瘤细胞，而且胸苷激酶基因抗肿瘤细胞效应还能通过另一原理“旁观者效应”，即使仅有10％的肿病细胞转入胸苷激酶，加入更昔洛韦后，其余90％的肿瘤细胞由于细胞间的缝隙连接也将被杀死，使其抗肿瘤效应达到放大增效作用。
本发明优点本发明通过优化设计，选择无毒腺病毒载体，选定相应功能基因片段长度等，使基因载体系统具有特异性，可转染多种人体实体瘤，例如卵巢癌，宫颈癌，前列腺癌，胃肠道癌皮肤黑色素瘤及软组织肿瘤，而且具有高抗癌作用，对卵巢癌的临床前期应用中，有效率超过70％，本产品的表达率达95％以上。
权利要求
1.一种腺病毒-胸苷激酶基因构型，适用于人体肿瘤局部转染，其特征在于全构件包括腺病毒载体，胸苷激酶片断和RSV-LTP启动子，全构件核苷酸长43Kb，胸苷激酶长2.8Kb，启始片断为18bp，其序列ATGGCTTCGTACCCCTGC。
2.一种获得权利要求1所述基因构型的方法，其特征在于它包括(1)在序列为ATGGCTCGTCCCTGC启始片断的诱导下，在体外与ADV载体、TK基因cDNA，经酶切、连结、共转染使RSV-LTP启动子和胸苷激酶片断插入腺病毒载体中，(2)将(1)中的初级构件与辅助质粒PJM17再次结合，连结成型后使构件能在293细胞中培养扩增。
3.根据权利要求2所述的获得基因构型的方法，其特征在于所述构件经筛选过程，筛选系在琼脂胶上进行，得到所需的正确基因构型。
4.一种利用腺病毒-胸苷激酶基因做成治疗卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、胃肠道癌、皮肤黑色素瘤及软组织肿瘤等实体癌的制剂。
全文摘要
本发明涉及一种腺病毒－胸苷激酶基因构型及其获得方法和应用。全构件包括腺病毒载体、胸苷激酶片断和RSV－LTP启动子,全构件核苷酸长43Kb,胸苷激酶长2.8Kb,启始片断为18bp,其序列ATGGCTTCGTACCCCTGC。该产品是通过对人体肿瘤特别是局部实体瘤进行转染,在更昔洛韦的参与下,能针对特异性杀灭肿瘤细胞,可转染各种人体实体瘤,特别对中国人有高抗癌作用。
文档编号C12N15/54GK1254759SQ98124960
公开日2000年5月31日 申请日期1998年11月25日 优先权日1998年11月25日
发明者马丁, 卢运萍, 王世宣, 周剑锋, 李震中 申请人:马丁